Summary
该协议解释了如何准备和安装细菌样本进行活的三维成像，以及如何从这些图像中重建大肠杆菌的三维形状。
Abstract
细菌的形状对其生理很重要。细胞生理学的许多方面，如细胞运动性、预检性、生物膜生产等，都会受到细胞形状的影响。细菌细胞是三维 （3D） 对象，尽管很少被视为此类对象。大多数显微镜技术导致二维 （2D） 图像导致与实际 3D 细胞形状和蛋白质定位相关的数据丢失。某些形状参数（如高斯曲率（两个主曲率的积）只能在 3D 中测量，因为 2D 图像不测量两个主曲率。此外，当弯曲细胞的安装和 2D 成像时，并非所有细胞都平放，可能无法准确表示这些细胞的形状。在 3D 中准确测量蛋白质定位有助于确定蛋白质的空间调节和功能。一种向前卷积技术已经开发出来，利用显微镜的模糊功能重建3D细胞形状并准确定位蛋白质。这里描述了一种用于制备和安装3D细菌活细胞成像样本的协议，用于重建准确的细胞形状和本地化蛋白质。该方法基于简单的样品制备、荧光图像采集和基于MATLAB的图像处理。许多高质量的荧光显微镜可以简单地修改，以进行这些测量。这些单元重建计算密集，建议访问高通量计算资源，尽管不是必需的。该方法已成功应用于多种细菌种类和突变体、荧光成像模式和显微镜制造商。
Introduction
所有类型的单元格都针对特定功能调整其形状。例如，神经元的形状与血细胞不同，并且具有不同的功能。同样，细菌细胞有各种形状和大小，虽然这些形状的用途并不总是已知的1，2。因此，准确确定细菌细胞的形状非常重要。所概述的方法显示了一种易于实现的方法，用于收集适合大多数活细菌或固定细菌细胞的 3D 分析的数据。
所述方法使人们能够拍摄细菌细胞的3D图像，以便准确表示样品的3D细胞形状，并精确定位这些形状中的蛋白质。传统的显微镜技术采用2D图像，这在研究具有异常或非对称形状的细胞时存在问题，如大肠杆菌的突变体，或弯曲的细菌，如霍乱弧菌和螺旋杆菌皮洛里。虽然高分辨率 3D 图像是此方法的关键输入，但该方法不会返回分辨率增强的图像。相反，该方法使用正向卷积算法使用有源轮廓和显微镜3的明显模糊功能重建细胞的三维表面坐标和形状（图1）。它已被用于研究大肠杆菌4、5、6、7中的细菌活性剂Mreb、霍乱弧菌8中的新型骨骼元素CrvA和假定幽门螺杆菌9中的巴氏杆菌（图2）。
蛋白质的定位可以洞察其功能。例如，参与细胞分裂的蛋白质通常被本地化为中细胞10，11。已进行高通量研究，以本地化细菌的所有蛋白质，以期深入了解其功能12。不幸的是，这些研究是使用 2D 成像和 1D 或 2D 分析进行的，因此无法测量蛋白质定位的特定方面，例如细胞几何特征的定位。
例如，MreB，一种许多细菌的棒状所需的动态蛋白质，通过指导细胞壁合成的定位来假设工作，它的定位反映了细胞壁合成7、13的定位。来自多个物种的MreB显示了几何富集4，6，7，14，15。动态表面聚合物，如MreB，可以耦合表面的几何形状到平均浓缩轮廓16，并且可以通过最小化与膜17结合相关的能量来定向到特定的几何体。虽然对 MreB 来说，扭曲、捆绑、弯曲和动力学的重要性尚未完全解决，但需要注意的是，精确测量曲面的两个主曲率都需要对像元进行完整的 3D 表示。因此，为了最准确地测量蛋白质定位的曲率，优先使用 3D 成像，而不是 2D 成像。3D成像无需计算估计那些无法用2D测量的曲率，在非对称细胞18中可能不准确。
尽管单元的 2D 成像速度更快，并且不需要太多的后成像计算工作，但 3D 成像可提供更精确的单元表示，以及测量无法以 2D 方式测量的曲面特征（如曲率）的能力。因此，随着 3D 成像变得越来越普遍，对细胞形状和蛋白质定位的新见解将成为可能。
Protocol
1. 样品制备
- 使大肠杆菌荧光成像，无论是工程他们表达细胞质荧光蛋白6或使用膜染料5。其他细菌种类可以使用代替大肠杆菌。
- 通过电穿孔对细胞进行编码，该质粒编码细胞质mCherry荧光蛋白，通过电穿孔转换细胞。
注：可以使用其他颜色的不同荧光蛋白。 - 在37°C下用适当的抗生素在LB板上生长转化剂。获得单菌落，并通过显微镜识别阳性克隆。在显微镜下出现红色的抗生素耐药菌落含有携带mCherry的质粒。
- 通过电穿孔对细胞进行编码，该质粒编码细胞质mCherry荧光蛋白，通过电穿孔转换细胞。
- 在摇动的培养箱中，在37°C下用适当的抗生素在LB液体培养基中生长2 mL。使用从盘子或少量冰柜库存的菌落作为接种。
注：使用为实验选择的细菌细胞所需的介质。 - 将隔夜培养1：1，000培养成5 mL的新鲜LB培养基，让细胞在摇动培养箱中以37°C生长成指数相，持续3⁄4小时。 测量细胞的OD600，确认它们处于指数相（即。，OD600 = 0.2_0.4）。
注：成像可以在任何生长阶段执行，具体取决于所执行的实验。
2. 幻灯片准备
注：使用自荧光低的介质非常重要。任何具有低自荧光的介质都可以使用。在本实验中，需要1%的甘蔗M63最小介质垫和用VaLaP19密封才能在3D中成像细胞。
-
在 20 mL 的最小介质中制备 1% 的甘蔗溶液。
- 微波溶液，直到甘蔗完全溶解，溶液看起来清晰。
- 将溶液保存在60°C水浴中，直到随时使用。
注：此溶液可根据需要进行凝固和熔化，也可以被少量异量熔化，并根据需要熔化。多次使用后，介质可能会变色，应更换。
- 在 80~100 °C 的热板上熔化 VaLaP 密封剂。
注：将 50 g 的石油果冻、羊毛脂和石蜡分别熔化在 80~100°C 的热板上的烧杯中，制备 VaLaP，用作密封剂。大量的 VaLaP 可以无限期地在室温下存储，足以用于 >500 张幻灯片。在 >100 °C 下加热会导致其降解，其颜色将变暗。 - 将三个 20 mm x 20 mm 盖玻片各两个堆栈放在幻灯片的两端（六个总盖玻片）。
- 将200 μL的甘蔗垫溶液移液到幻灯片上。
注：如果不使用工程荧光染色剂，可以在此步骤之前将膜染料添加到甘蔗垫溶液中。将染料重新悬浮在水中，并将染料添加到 1 mL 的甘蔗甘草垫溶液中，最终浓度为 5 μg/mL。 - 立即牢固地将第二张滑轨放在盖玻片上，将琼脂压平，并在室温下凝固 1 分钟。
- 小心地滑下顶部幻灯片。
- 使用 200 μL 移液器尖端的大端从滑道上的凝胶（直径约 5 mm）切出单个焊盘，并丢弃变形或不需要的凝胶。
注：如果成像多个菌株或条件，每个菌株需要单独的垫。如果只对一个应变进行成像，则制作 3⁄4 垫以帮助支撑盖玻片。 - 移液细胞上下多次破坏细胞团块，并确保培养液很好地混合。移液器 1 μL 的亚文化从步骤 1.3 到垫上。
注：细胞形状重建需要不接触其他细胞的单个细胞。如果使用固定相或高细胞密度培养物，可能需要在将样品放在焊盘上之前稀释样品 1：10。 - 让样品空气干燥5~10分钟。确保水滴完全吸收到垫子中。如果任何液体仍然存在，细胞将在液体中移动，无法成像。
- 将盖滑放在垫盘顶部。
- 用融化的 VaLaP 轻轻刷绕盖滑道边缘，用棉签密封盖滑。确保使其远离目标将触及的盖玻片顶部。VaLaP 会在几秒钟内变硬，密封样品。
- 立即对示例进行映像。
注：一旦准备幻灯片，就应对示例进行成像。细胞可以在垫子上生长，如果它们分裂重建将更加困难。
3. 成像要求
- 确保显微镜的 z 或对焦轴能够进行小于 50 nm 的精确运动。使用 z 压电级（参见材料表），可用于研究级显微镜，因为典型的电动对焦设备无法提供这种精度。
注：假设奈奎斯特-山农采样标准为20，需要能够移动0.5倍所需的最小步长大小，或2倍所需的空间频率。对于该协议所需的 100 nm 步长，需要精度为 50 nm 或以下的阶段。 -
确保显微镜包含 100 倍物镜，最小数值孔径 （NA） 为 1.45。
- 收集 200-400 个不同单元之间的 z 堆栈，以确保为下游应用获得足够的单元。
注：所需的细胞数量取决于感兴趣样本的基本变异性。此时收集的一些单元格无法通过重建步骤。
- 收集 200-400 个不同单元之间的 z 堆栈，以确保为下游应用获得足够的单元。
- 如果测量二次荧光通道（蛋白质、代谢标签等），确保 z-stack 与形状通道的设置相匹配。
4. 成像
- 将密封的幻灯片插入显微镜，使其坐5分钟，使温度与周围环境平衡，因为显微镜室的温度可能与样品制备室的温度不同。
-
取样品的荧光z堆栈。
注： z 堆栈应完全覆盖小于景深的 z 间距。对于 1.45 NA 100x 目标和 ±1 μm 厚的大肠杆菌细胞，每步 100 nm 处 40 步可正常工作。对于表面上不完全平坦的较大细胞或细胞，可能需要 50 个或更多步骤。包括足够的步骤，并确保样品在上方和下方完全模糊。- 使用与显微镜相关的软件（参见材料表）来控制显微镜。
- 使用显微镜聚焦轮聚焦细胞中间。在ND 采集下，选中 Z框以采用 z 堆栈。单击"主页"按钮将单元格的中间设置为起点。将步长大小设置为 0.1 μm 并将范围设置为 4 μm。确保 Z 设备设置为压电阶段。
- 将Lambda 窗口下的荧光通道设置为正在成像的荧光分子的设置。在这个实验中使用了GFP和mCherry。
注：如果需要附加荧光通道的 3D 分布，在第二个颜色通道中采用具有相同步长大小和范围的附加 z 堆栈。在这个实验中，细胞质mCherry用于确定细胞形状，MreB-GFP用作第二色通道21。 - 确保实验顺序设置为 lambda（z 系列），以便在切换之前在每个颜色通道中采用完整的 z 堆栈。
- 单击"立即运行"以启动图像采集并保存文件，其中一个或两个 z 堆栈已完成。
- 移动到焊盘上的新区域，然后重复步骤 4.2.2-4.2.5。
5. 细胞重建
- 裁剪单个单元格并将图像另存为堆叠的 tiff 文件，以便每个文件只有一个单元格。确保此单元格与任何其他单元格完全隔离（即，xy 中模糊功能的全宽半最大值约为 5 倍）。
注：这可以使用免费的图像分析软件完成（见材料表）。- 在单个单元格周围绘制一个框，并复制该单元格 2x，每个通道复制一次。确保选中重复的超堆栈框，并将通道更改为 1 或 2，确保切片包含整个 z 堆栈。
注：如果成像只有细胞的形状，而不是额外的荧光蛋白，将只存在一个通道。 - 两个堆栈都可用后，转到映像 |堆栈 |工具 |串联，将图像与蛋白质通道第一和形状通道第二结合。
- 将新映像另存为 tiff 文件。
- 在单个单元格周围绘制一个框，并复制该单元格 2x，每个通道复制一次。确保选中重复的超堆栈框，并将通道更改为 1 或 2，确保切片包含整个 z 堆栈。
- 测量显微镜的模糊功能使用亚衍有限荧光珠22。这需要为每个显微镜和显微镜物镜进行，但可以在成像感兴趣的样品之前或之后进行。
- 使用可用软件手动干预，将多个独立磁珠平均在一起（参见材料表）。
注：最终产品应该是模糊函数的 3D 图像，其 xyz 间距应与感兴趣的样本相同。
- 使用可用软件手动干预，将多个独立磁珠平均在一起（参见材料表）。
- 使用可用软件运行正向卷积单元形状重建脚本。这些脚本的最新版本可以从https://github.com/PrincetonUniversity/shae-cellshape-public免费下载。
- 在桌面上的文件夹中创建一个文件夹，其中包含裁剪后的图像和来自 shae-cell-xshape-public/exampleData_tri 的单元格_shape_settings_tri.txt文件。
- 编辑单元格_形状_设置_tri.txt，以具有感兴趣的实验的正确设置。对于此实验，设置文件包括以下行：
纳米=每像素 70
Z_比例 0.65
堆栈_z_大小 41
堆栈_t_大小 1
Fstack_z_size 41
Fstack_t_大小 1
堆栈_分化\nm 100
Fstack_seperation_nm 100
psfScript -999 osuPSF20180726
渐变 1
注：此文本文件被组织成多个部分，每个部分被解析为自己的变量。虽然许多设置不需要从实验更改为实验，但应确保 z 堆栈的大小（形状为stack_z_size，Fstack_z_size为感兴趣的蛋白质），z 堆栈的间距（堆栈_seperation_________________）的间距nm， Fstack_seperation_nm），显微镜的相对焦移（Z_scale）23，xy 的像素大小（nm_per_像素），以及加载显微镜模糊功能的脚本名称（psfScript） 匹配实验。如果形状通道是细胞质填充的，则梯度场应设置为 1;如果是膜染色对象，则梯度场应设置为 0。 - 运行Cell_shape_探测器3dConvTriFolder函数（shae-cellshape-public/CellShapeDetectorTri/），将字符串与文件夹位置后跟要启动的单元格数以及要运行的单元格数。
注：输入的示例如下所示：Cell_shape_探测器3dConvTriFolder（"带有裁剪图像的文件夹的路径"，文件夹中的起始索引，单元格的 *）。一个典型的细胞可能需要5~20分钟，重建才能收敛和完成。
- 在使用单元格进行任何统计分析之前，筛选单元格重建，以确保它们正确无误。
- 运行ScreenFits（shae-cell 形状-公共/shae-fitViewerGui/），以可视方式筛选单个单元格重建。
- 打开图形用户界面 （GUI） 时单击"选择文件夹"按钮，然后选择在步骤 5.3 中创建的重建数据文件 （TRI.mat） 的文件夹。
- 如果单元格出现畸形或未完全收敛，请选择单元格重建旁边的框（图 3）。这可能看起来像一个带孔的细胞，一个平坦的一面，或者一个分支从它出来。这将在文件名中附加"FLAG"，以便可以从任何下游分析中排除它。
注：重建的单元格可以与原始图像进行比较。如果您的细胞来自各种形状异构群体，这一点尤其重要。
- 运行浓缩平滑Spline（shae-cell形状-公共/），以创建感兴趣的蛋白质的相对浓度的富集轮廓，作为高斯曲率在表面的函数。
- 选择在步骤 5.3.3 中创建的 TRI.mat 文件的每个文件夹。
- 选择新创建的 （5.5.1） 曲线.mat 文件。
注：将为 5.5.1 中选择的每个文件夹创建一个 curve.mat 文件。所有扩充配置文件都将显示在一个图形上。如果每个文件夹需要单个图形比运行 5.5。
注：除了荧光蛋白的精确几何定位外，还有许多其他方法可以分析来自二次通道的数据，包括计算对象4的数量、大小和方向。
Representative Results
细菌有各种各样的形状和大小，可能决定其功能在性质1。此过程的结果是从 z 堆栈图像的正向卷积中准确表示单元格的 3D 表示（图 1）。这种方法在处理弯曲的细胞（图2）或处理形状异常的细胞（图4A）时尤其重要，因为2D表示法不能准确反映细胞的曲率。为了使用正向卷积方法（图1A），细胞需要边缘染色或有细胞质染色（图2B左与右）。
图 4显示了单元格中的 MreB 本地化。对细菌活性蛋白MreB21进行了GFP融合，以研究其在野生型和突变大肠杆菌细胞4中的精确定位。由于 MreB 与膜相关，因此需要 3D 成像才能忠实地再现其在细胞中的位置。通过3D测量，我们能够重建野生型和棒Z突变细胞的形状（图4A）。MreB的定位被证明在小高斯曲率上得到丰富，这是一种几何特征，只能以3D方式以RodZ依赖方式测量（图4B）。
图1：正向卷积法重建细胞，事先对细胞形状一无所知。（A） 该方法的最终输出是将测试形状与显微镜的校准模糊功能进行比较得出的三维细胞重建。这与观察到的 z 堆栈进行比较，直到观察到的 3D 图像与假设图像匹配。此处显示的图像是重建一个C. 新月细胞的渲染。（B） 重建管道根据观察到的图像堆栈迭代更新表面元素的估计位置。有关该方法的完整算法详细信息，请参阅 Nguyen3。（C） 重建管道开始时对单元格的形状一无所知，并更新曲面顶点的位置和数量，以匹配观察到的 z 堆栈。在 3D 重建过程中，每 30 个步骤的代表性图像从霍乱弧细胞的三个不同角度显示。此形状的曲面位置将更新，以最小化模拟堆栈和观测堆栈之间的差异。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：三个不同形状的细菌物种的代表性3D重建。三维重建可以从细胞的膜染色（左）或填充细胞质荧光（右）。起始单元的形状和曲率并不重要，因为弯曲杆、扭杆或直杆都能准确重建。重建的曲面根据曲面的局部高斯曲率进行着色。比例尺 = 1 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
图 3：重建可能由于多种原因失败。必须对单元格进行筛选，以确保重建算法收敛到合理的结果。左 = 代表野生类型（顶部）和棒Z突变（底部）大肠杆菌细胞，已通过质量控制。右 = 未能正确重建且未通过质量控制的单元格。显示五类失败的收敛：（i） 太靠近裁剪区域边缘的细胞，导致急剧分界;（ii） 与另一个细胞太近的细胞，（iii） 产生 divot 的细胞，（iv） 未通过初始 s 的细胞和 （v） 其他未知错误。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：显示蛋白质定位到特定细胞几何体的代表性数据。（A） 显示具有高斯曲率和MreB荧光强度的野生型和棒Z E.大肠杆菌细胞的三维重建细胞。刻度棒 = 1 μm （B） 从野生类型和棒 Z E. 大肠杆菌细胞的 MreB 浓缩图。值 >1 显示富集值和值 <1 显示相对于细胞均匀覆盖的这些细胞区域的 MreB 损耗。带沙区域表示均值 ±90% 引导置信区间。每个应变的曲线是立方平滑样条线，使用 p > 5 x 10-3的极端曲率的概率阈值截断。这一数字已由（布拉顿等人）修改。4.请点击此处查看此图的较大版本。
Discussion
该协议的一个关键步骤是获取高质量的图像。要正确重建细胞，细胞上方和下方必须有足够的模糊。因此，取的 z 堆栈必须覆盖足够大的距离。可以针对每个应变调整图像采集期间执行的步骤数。例如，为棒Z删除的大肠杆菌细胞比野生类型细胞更宽，需要更多的步骤，因此距离也更大。如果图像采集过程中样品漂移，则重建可能有重大误差。因此，在成像之前，让幻灯片与显微镜达到热平衡非常重要，以避免在 z 堆栈采集过程中漂移。细胞应在自荧光低的垫上成像。介质组件（如常见 LB 介质中的组件）具有自荧光，在尝试重建细胞时可能会导致问题。成像垫上的细胞密度很重要，因为重建过程是在每个细胞上独立执行的。细胞太少会增加获取足够数量的细胞图像所需的时间，而过多的细胞将导致成像场过于密集，无法轻松裁剪单个细胞。由于并非所有细胞都重建得当，因此在采集步骤期间应对额外的细胞进行成像，并且所有输出都应在进行统计分析之前进行筛选（图3）。
此方法的许多限制都是技术性的。在要使用的显微镜上，必须有一个具有高数值孔径（通常大于1.4）的目标，因为这能对细菌的大小尺度进行光学切片。此外，显微镜需要配备压电级，可以在 z 方向上采取小而精确的步骤。此外，虽然没有必要，但强烈建议访问高通量计算资源来运行图像分析软件，因为它将减少重建单元的处理时间。
该方法的一个概念限制是，必须选择正确的能量尺度来加权重建的平滑度相对于图像的信号噪比。为了验证参数的选择，应使用独立方法（如透射电子显微镜 （TEM） 或原子力显微镜 （AFM））测量细胞的大小和形状。作为原理证明，在 AFM 上对细胞进行 3D 重建，以测试 z 精度（<50 nm），或在 TEM 网格上测试 xy 精度 （<30 nm）3。这种相关方法既费时又费钱。更简单的方法可能是对标准样品（如野生型细胞或 1 μm 球珠）进行成像。重建的直径和星体可用于确保重建中使用的尺寸和能量尺度正确无误。
这不是从荧光显微镜图像中提取高分辨率空间信息的唯一方法。许多评论文章描述了超分辨率显微镜24、25领域的最新进展。分辨率增强技术，如去卷积显微镜26、旋转盘共聚焦显微镜27、像素重新分配28和结构化照明显微镜（SIM）29，力求提高显微镜获取的图像。这些方法与所介绍的方法并不矛盾。最近，这种方法被修改为允许基于SIM的图像作为输入9。虽然正向卷积方法与去卷积显微镜共享其一些基础，但它的输出却完全不同。虽然反卷积显微镜等方法寻求提高图像的分辨率，但这种方法不会生成图像，而是生成精度约为 50 nm 的细胞形状重建。基于稀疏标记样品的单分子主动控制显微镜技术可以提供比这种方法更高的空间精度水平。在许多情况下，这些单分子方法需要优化荧光结构，并且可能需要很长的采集时间，使其难以与活或动态样品一起使用。这些方法中的每一个都带有一个或多个警告，即此方法没有。例如，旋转磁盘共聚焦显微镜所宣传的好处并不适用于细菌细胞的单层，因为平面光不大。此外，该方法提供了一个管道，以获得精确的3D细胞形状和蛋白质定位，而无需任何专门的荧光管。此方法具有最小的硬件要求（即，z 压电，高 NA 目标），并且每个时间点只需要几十个图像，允许轻松调查动态 3D 结构6。
研究细菌细胞在3D结构中的组织的方法越来越多。这些方法在概念上与此相似，利用高质量，3D荧光图像30，31，32。这种方法需要很好的隔离细胞，并且不先验地假设细胞几何。然而，要进入密集的细胞聚集体或生物膜，细胞被假定为棒状。这种低分辨率视图仍然能够调查细胞的包装排列，尽管生物膜中细胞的高密度阻止了特定因子的亚细胞定位分析。
将来，开发一个框架来将单分子和宽场方法与这种 3D 重建技术集成可能很有趣。此外，有可能将这种正向卷积方法与机器视觉分割工具32一起，以便重建更密集的细胞群。
为什么细胞进化成特定的形状是一个复杂的问题，必须反映它们生活的复杂环境。了解细胞形状的演化和功能需要对这些形状进行精确和精确的测量，这就是此方法所提供的。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们要感谢杰弗里·纽恩和约书亚·舍维茨帮助开发这种方法。
资助： RMM - NIH F32 GM103290-01A1， BPB - 格伦老龄研究中心和国家科学基金会PHY-1734030.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 nm fluorescent beads | Invitrogen | F8795 | these are used to measure the blurring function of the microscope |
| Agarose | sigma-Aldrich | A9539 | |
| Cotton Swab | Puritan Medical Products Company LLC | S304659 | used to appy VaLaP |
| Cover Slips | VWR | 16004-302 | |
| Fiji | ImageJ | https://fiji.sc | used to cro cells |
| FM4-64 | Invitrogen | LST3166 | membrane dye used to stain cells |
| Huygens Software | Scientific Volume Imaging | Huygens essential or professional | Use to measure blurring function of microscope |
| Lanolin | Sigma-Aldrich | L7387 | combine with paraffin and petroleum jelly to make VaLaP |
| LB growth medium | BD Difco | DF0446173 | |
| M63 medium | US Biological | M1015 | |
| MATLAB | Mathworks | Needed to run forward convolution scripts | |
| Microscope Slides | Fisher | 12-550-133 | |
| NIS Elements | Nkon | ||
| Paraffin | Sigma-Aldrich | 327212 | |
| Petroleum Jelly | Equate | 49035-038-27 | |
| Piezo z stage | Nikon | 77011589 | |
| Pipet tips -p200 | USA Scientific | 1111-0730 | |
| Pipet tips- p10 | USA Scientific | 1111-3730 |
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