Summary
Bu protokol, canlı üç boyutlu görüntüleme için bakteri örneklerinin nasıl hazırlanacağını ve monte edilebildiğini ve bu görüntülerden E. coli'nin üç boyutlu şeklinin nasıl yeniden yapılandırılabildiğini açıklar.
Abstract
Bir bakterinin şekli fizyolojisi için önemlidir. Hücre fizyolojisinin hücre hareketliliği, predasyon ve biyofilm üretimi gibi birçok yönü hücre şeklinden etkilenebilir. Bakteri hücreleri üç boyutlu (3D) nesnelerdir, ancak nadiren bu şekilde tedavi edilirler. Çoğu mikroskopi tekniği, gerçek 3Boyutlu hücre şekline ve proteinlerin lokalizasyonuna ilişkin veri kaybına yol açan iki boyutlu (2D) görüntülerle sonuçlanır. 2B görüntüler her iki temel eğriliği de ölçmediği için, Gaussian eğriliği (iki temel eğriliğin ürünü) gibi belirli şekil parametreleri yalnızca 3B olarak ölçülebilir. Ayrıca, montaj yaparken tüm hücreler düz yalan ve kavisli hücrelerin 2D görüntüleme doğru bu hücrelerin şekillerini temsil olmayabilir. Protein lokalizasyonunun 3Boyutlu olarak doğru bir şekilde ölçülmesi, proteinlerin mekansal düzenlemesini ve işlevini belirlemeye yardımcı olabilir. Mikroskobun bulanıklaştırma fonksiyonunu kullanan bir ileri kıvrım tekniği geliştirilmiştir. Burada, bakterilerin canlı hücre görüntülemesi için numunelerin hazırlanması ve montajı için hem doğru bir hücre şeklini yeniden oluşturmak hem de proteinleri lokalize etmek için bir protokol tanımlanmıştır. Yöntem basit numune hazırlama, floresan görüntü edinimi ve MATLAB tabanlı görüntü işleme dayanmaktadır. Birçok yüksek kaliteli floresan mikroskoplar sadece bu ölçümleri almak için değiştirilebilir. Bu hücre rekonstrüksiyonları hesaplama lı olarak yoğundur ve gerekli olmasa da yüksek işlem li hesaplama kaynaklarına erişim önerilir. Bu yöntem, birden fazla bakteri türü ve mutant, floresan görüntüleme yöntemleri ve mikroskop üreticilerine başarıyla uygulanmıştır.
Introduction
Her tür deki hücreler belirli işlevler için şekillerini düzenler. Örneğin, nöronlar kan hücrelerinden farklı şekillenir ve farklı işlevlere sahiptir. Benzer şekilde, bakteri hücreleri şekil ve boyutlarda çeşitli gelir, Bu şekillerin amacı her zaman bilinmemekle birlikte1,2. Bu nedenle bakteri hücrelerinin şeklinin doğru bir şekilde belirlenmesi önemlidir. Özetlenen yöntem, çoğu canlı veya sabit bakteri hücresinin 3Boyutlu analizine uygun verileri toplamak için kolay uygulanan bir yolu gösterir.
Açıklanan yöntem, numunenin 3Boyutlu hücre şeklini doğru bir şekilde temsil etmek ve bu şekiller içindeki proteinleri tam olarak yerelleştirmek için bakteri hücrelerinin 3Boyutlu görüntülerini almasını sağlar. Geleneksel mikroskopi teknikleri, Escherichia colimutantları veya Vibrio kolera ve Helicobacter gibi kavisli bakteriler gibi anormal veya simetrik olmayan şekillere sahip hücreleri incelerken sorunlu olan 2D görüntüler alır. pylori. Yüksek çözünürlüklü 3D görüntüler bu yöntemin anahtar girişi olsa da, yöntem çözünürlüğe sahip geliştirilmiş bir görüntü döndürmez. Bunun yerine, bu yöntem aktif konturları ve mikroskop3'ün görünür bulanıklaştırma işlevini kullanarak hücrenin 3B yüzey koordinatlarını ve şeklini yeniden yapılandırır(Şekil 1). E. coli4,5,6,7'debakteriyel aktin homolog MreB'yi incelemek için kullanılmıştır, V. kolera8'deroman periskeletal element CrvA ve putatif bactofilin CcmA helicobacter pylori9 (Şekil 2).
Proteinlerin lokalizasyonu işlevleri hakkında bilgi verebilir. Örneğin, hücre bölünmesi nde yer alan proteinler normalde10,11. Yüksek iş sahibi çalışmalar kendi işlevleri12içine fikir edinme umuduyla bir bakterinin tüm proteinleri lokalize etmek için yapılmıştır. Ne yazık ki, bu çalışmalar 2D görüntüleme ve 1D veya 2D analizi ile gerçekleştirildi, bu da protein lokalizasyonunun hücresel geometrik özelliklere lokalizasyon gibi belirli yönlerini ölçmeyi imkansız hale getirdi.
Örneğin, MreB, birçok bakterinin çubuk şekli için gerekli dinamik bir protein, hücre duvarı sentezinin lokalizasyonu yönlendirerek çalışmak için hipotez, ve lokalizasyon hücre duvarı sentezi lokalizasyonu aynalar7,13. Birden fazla türden MreB geometrik zenginleştirme gösterir4,6,7,14,15. MreB gibi dinamik yüzey polimerleri, yüzeyin geometrisini ortalama zenginleştirme profili16'ya bağlayabilir ve membrana bağlanmaile ilişkili enerjiyi en aza indirerek belirli geometrilere yönelebilir17. Büküm, birleştirme, bükme ve dinamiğin önemi MreB için tam olarak çözülmemiş olsa da, bir yüzeyin her iki temel eğriliklerinin doğru ölçümlerinin hücrenin tam 3Boyutlu temsilini gerektirdiğini belirtmek önemlidir. Bu nedenle, proteinlerin lokalize olduğu eğrilikleri en doğru şekilde ölçmek için, 2D görüntüleme yerine 3D kullanmak tercih edilir. 3D görüntüleme hesaplamalı 2D ölçülemez bu eğrilikleri tahmin etmek ihtiyacını ortadan kaldırır, asimetrik hücrelerde doğru olmayabilir bir tahmin18.
Hücrelerin 2B görüntüleme daha hızlı olmasına rağmen ve çok postimaging hesaplama lı çalışma gerektirmez, 3D görüntüleme hücrenin daha doğru bir gösterimi yanı sıra eğrilik gibi yüzey özelliklerini ölçmek için yeteneği sağlar, hangi 2D ölçülemez. Bu nedenle, 3D görüntüleme daha olağan hale geldikçe, hücre şekli ve protein lokalizasyonu içine yeni anlayışlar mümkün olacaktır.
Protocol
1. Örnek Hazırlama
- Bir sitoplazmik floresan protein6 ifade etmek için mühendislik ya görüntüleme için E. coli floresan olun veya bir membran boya5. E. coliyerine diğer bakteri türleri kullanılabilir.
- Sitoplazmik mCherry floresan proteinini kodlayan bir plazmid ile elektroporasyon yoluyla hücreleri dönüştürün.
NOT: Farklı floresan proteinler diğer renklerde kullanılabilir. - Transformatörleri lb plakaüzerinde uygun antibiyotikle 37 °C'de büyütün. Tek koloniler edinin ve mikroskopi ile pozitif klonları tanımlayın. Mikroskop altında kırmızı görünen antibiyotiğe dirençli koloniler plazmid taşıyan mCherry içerir.
- Sitoplazmik mCherry floresan proteinini kodlayan bir plazmid ile elektroporasyon yoluyla hücreleri dönüştürün.
- Lb sıvı ortamda bir gece kültürünün 2 mL'sini uygun antibiyotiklerle 37 °C'de sallayarak bir kuvözde büyütün. Ya bir tabak ya da inoculum olarak bir dondurucu stok küçük bir miktar bir koloni kullanın.
NOT: Deney için seçilen bakteri hücreleri için gerekli ortamı kullanın. - Bir gecede kültürü 1:1.000'den 5 mL'ye kadar taze LB ortamına dönüştürün ve hücrelerin 3−4 saat sallayarak bir kuluçka makinesinde 37 °C'de üstel faza ulaşmasına izin verin. , OD600 = 0.2−0.4).
NOT: Görüntüleme, yapılan deneye bağlı olarak herhangi bir büyüme aşamasında gerçekleştirilebilir.
2. Slayt Hazırlama
NOT: Düşük otofloresansa sahip ortam kullanmak önemlidir. Düşük otofloresansa sahip herhangi bir ortam kullanılabilir. Bu deneyde, % 1 agarose M63 minimal medya pedleri ve VaLaP19 ile sızdırmazlık 3D hücreleri görüntü için gereklidir.
-
20 mL minimum ortamda %1'lik bir agarose çözeltisi hazırlayın.
- Mikrodalga çözeltiagarose tamamen çözülmüş ve çözelti net görünene kadar.
- Çözeltiyi kullanıma hazır olana kadar 60 °C'lik bir su banyosunda saklayın.
NOT: Bu çözelti gerektiği gibi katılaştırılabilir ve eritilebilir veya gerektiği gibi eritilmiş daha küçük miktarlarda aliquoted olabilir. Birden çok kullanımdan sonra ortam renksiz olabilir ve değiştirilmelidir.
- 80−100 °C'de sıcak bir tabakta VaLaP dolguererer.
NOT: 80−100 °C'de sıcak bir tabakta bir kabın içinde 50'şer gr petrol jölesi, lanolin ve parafini eriterek, bir dolgu maddesi olarak kullanılmak üzere VaLaP'ı hazırlayın. Bu büyük miktarda VaLaP oda sıcaklığında süresiz olarak saklanabilir ve >500 slayt için yeterli olacaktır. >100 °C'de ısıtma bozulmasına ve renginin kararmasına neden olur. - Bir kaydıranın ters uçlarına üç adet 20 mm x 20 mm'lik kapak fişleri (toplam altı kapak) ikişer yığın yerleştirin.
- Pipet 200 μL agarose ped çözeltisi slayt üzerine.
NOT: Bu adımdan önce, tasarlanmış floresan lekesi kullanılmazsa, agarose ped çözeltisine bir membran boyası eklenebilir. Boyayı sudaki yeniden askıya alın ve agarose ped çözeltisinin 1 mL'sine boya ekleyerek 5 μg/mL'lik son konsantrasyona ekleyin. - Hemen ve sıkıca agar düzleştirmek ve oda sıcaklığında 1 dakika katılaşmak için kapak fişleri yığını üzerinde ikinci bir slayt yerleştirin.
- Üst slayttan dikkatlice kaydırın.
- 200 μL'lik pipet ucunun büyük ucunu kullanarak slayttaki jelden (~5 mm çapında) ayrı pedleri kesip yanlış biçimlendirilmiş veya gereksiz jeli atın.
NOT: Birden fazla suş veya koşulları görüntüleme, ayrı bir ped her biri için gerekli olacaktır. Yalnızca bir gerginlik görüntülenecekse, kapak kaymasını desteklemeye yardımcı olmak için 3−4 ped yapın. - Pipet hücreleri hücre kümelerini bozmak ve kültürün iyi bir şekilde karışmasını sağlamak için birden çok kez yukarı ve aşağı. Pipet 1 μL alt kültür adım 1.3 bir ped üzerine.
NOT: Hücre şekli rekonstrüksiyonları, diğer hücrelere dokunmayan tek tek hücreleri gerektirir. Sabit faz veya yüksek hücre yoğunluğu kültürleri kullanıyorsanız, ped üzerine yerleştirmeden önce örnek 1:10 seyreltmek için gerekli olabilir. - Numunenin havasının 5−10 dakika kurumasını bekleyin. Damlacık tamamen pedin içine emilir emin olun. Herhangi bir sıvı kalırsa, hücreler sıvı içinde hareket edecek ve görüntülenemez.
- Pedlerin üstüne bir kapak fişi yerleştirin.
- Kapak kapağını pamuklu bir bezle hafifçe fırçalayarak erimiş VaLaP ile kapatın. Hedefin dokunacağı kapak fişinin üstünden uzak tuttuğunızdan emin olun. VaLaP birkaç saniye içinde sertleşerek numuneyi mühürleyecek.
- Örneği hemen görüntüleyin.
NOT: Slayt hazırlanır hazırlanmaz örnek görüntülenmelidir. Hücreler pedler üzerinde büyüyebilir ve eğer bölerlerse yeniden yapılanmalar daha zor olacaktır.
3. Görüntüleme Gereksinimleri
- Mikroskobun z veya odaklama ekseninin 50 nm'den daha az hassas hareketler yapabilmesini sağlayın. Tipik motorlu odak aygıtları bu hassasiyeti sağlayamadığından, araştırma sınıfı mikroskoplarda bulunan z piezo aşamalarını (Bkz. Malzeme Tablosu'nabakın).
NOT: Nyquist-Shannon örnekleme kriteri varsayarsak20, bir 0.5x en küçük istenen adım boyutu, ya da 2x istenen mekansal frekans taşımak için yeteneğine sahip olması gerekir. Bu protokolde gereken 100 nm adım için 50 nm veya daha az hassasiyete sahip bir sahne gereklidir. -
Mikroskobun minimum sayısal diyafram açıklığına (NA) 1,45'lik 100 x'lik bir hedef içerdiğinden emin olun.
- Downstream uygulamaları için yeterli hücre elde edilmesini sağlamak için 200−400 farklı hücreden oluşan z-yığınları toplayın.
NOT: Gerekli hücre sayısı, ilgi örneğinin altta yatan değişkenliğine bağlıdır. Bu noktada toplanan bazı hücreler yeniden yapılanma adımlarından geçmeyecek.
- Downstream uygulamaları için yeterli hücre elde edilmesini sağlamak için 200−400 farklı hücreden oluşan z-yığınları toplayın.
- İkincil floresan kanal (protein, metabolik etiket vb.) ölçülürse, z-yığınının şekil kanalı için kullanılan ayarlarla eşleştiğinden emin olun.
4. Görüntüleme
- Mühürlü kaydırağı mikroskoba yerleştirin ve mikroskop odası numune hazırlama odasından farklı bir sıcaklıkta olabileceğinden, sıcaklığı çevreyle dengelemesi için 5 dakika boyunca oturmasına izin verin.
-
Numunenin floresan z-yığınını alın.
NOT: Z-yığını, numuneyi alan derinliğinden daha az bir z aralığıyla kaplamalıdır. 1,45 NA 100x nesnel ve ~1 μm kalınlığında E. coli hücreleri için adım başına 100 nm'de 40 adım iyi çalışır. Yüzeyde mükemmel bir şekilde düz olmayan daha büyük hücreler veya hücreler için 50 veya daha fazla adım gerekebilir. Yeterli adımları ekleyin ve numunenin yukarıda ve aşağıda tamamen bulanık olduğundan emin olun.- Mikroskobu kontrol etmek için mikroskopla ilişkili yazılımı kullanın (Bkz. Malzeme Tablosu).
- Mikroskop odak tekerlekleri kullanarak hücrenin ortasına odaklanın. ND edinme altında z-yığını almak için Z kutusunu işaretleyin. Hücrenin ortasını başlangıç noktası olarak ayarlamak için Ana Ekran düğmesini tıklatın. Adım boyutunu 0,1 μm olarak ayarlayın ve Aralığı 4 μm olarak ayarlayın.
- Lambda Penceresi'nin altındaki floresan kanalları, görüntüleniyor olan floresan moleküllerin ayarlarına ayarlayın. Bu deneyde GFP ve mCherry kullanılmıştır.
NOT: Ek bir floresan kanalın 3B dağılımı isteniyorsa, ikinci renk kanalında aynı Adım Boyutu ve Aralığına sahip ek bir z yığını alın. Bu deneyde hücre şeklini belirlemek için sitoplazmik mCherry, ikinci renk kanalı21olarak ise MreB-GFP kullanılmıştır. - Deneme Sırası'nın lambda (z serisi) olarak ayarlandığından emin olun, böylece geçiş yapmadan önce her renk kanalında tam bir z yığını gerekir.
- Görüntü edinmeyi başlatmak için Şimdi Çalıştır'ı tıklatın ve dosyayı kaydedin bir veya her iki z-yığınları tamamlandı.
- Pad üzerinde yeni bir alana taşıyın ve adımları 4.2.2-4.2.5 tekrarlayın.
5. Hücre Rekonstrüksiyonu
- Tek tek hücreleri kırpma ve dosya başına yalnızca bir hücre olacak şekilde yığılmış tiff dosyası olarak görüntüleri kaydedin. Bu hücrenin diğer hücrelerden iyi izole olduğundan emin olun (yani, xy bulanıklık fonksiyonunun tam genişlikte yarım maksimum 5 kat.
NOT: Bu serbestçe kullanılabilir görüntü analiz yazılımı kullanılarak yapılabilir (Malzeme Tablosubakınız).- Tek bir hücrenin etrafına bir kutu çizin ve her kanal için bir kez bu hücreyi 2x kopyalayın. Yinelenen hyperstack kutusunun işaretli olduğundan emin olun ve kanalları 1 veya 2 olarak değiştirerek dilimlerin tüm z yığınını içerdiğinden emin olun.
NOT: Görüntüleme sadece hücrelerin şekli değil, ek bir floresan protein, sadece bir kanal mevcut olacaktır. - Her iki yığın kullanılabilir hale geldiklerinde Görüntüler | Yığınlar | Araçlar | Birleştirme protein kanalı ilk ve şekil kanal ikinci görüntüleri birleştirmek için.
- Yeni görüntüyü tiff dosyası olarak kaydedin.
- Tek bir hücrenin etrafına bir kutu çizin ve her kanal için bir kez bu hücreyi 2x kopyalayın. Yinelenen hyperstack kutusunun işaretli olduğundan emin olun ve kanalları 1 veya 2 olarak değiştirerek dilimlerin tüm z yığınını içerdiğinden emin olun.
- Mikroskobun bulanıklaştırma fonksiyonunu subdiffraction sınırlı floresan boncuklar22kullanarak ölçün. Bu her mikroskop ve mikroskop amacı için yapılması gereken ancak önce veya ilgi örnekleri görüntüleme sonra yapılabilir.
- Mevcut yazılımları kullanarak bazı el ile müdahalelerle birlikte birden fazla bağımsız boncuk ortalaması (bkz.
NOT: Nihai ürün, ilgi örnekleri ile aynı xyz aralığı ile bulanıklaştırma fonksiyonunun 3Boyutlu bir görüntü olmalıdır.
- Mevcut yazılımları kullanarak bazı el ile müdahalelerle birlikte birden fazla bağımsız boncuk ortalaması (bkz.
- Kullanılabilir yazılımı kullanarak ileri kıvrım hücre şekli yeniden yapılandırma komut dosyalarını çalıştırın. Bu komut dosyalarının en son sürümü https://github.com/PrincetonUniversity/shae-cellshape-public'dan ücretsiz olarak indirilebilir.
- Kırpılmış görüntüleri ve shae-cellshape-public/exampleData_tri'den cell_shape_settings_tri.txt dosyasını içeren masaüstündeki bir klasörün içinde klasör yapın.
- İlgi alanı için doğru ayarlara sahip olmak için cell_shape_setting_tri.txt'yi edin. Bu deneme için ayarlar dosyası aşağıdaki satırları içerir:
nm_per_pixel 70
Z_ölçeği 0.65
stack_z_size 41
stack_t_size 1
Fstack_z_size 41
Fstack_t_boyut 1
stack_seperation_nm 100
Fstack_seperation_nm 100
psfScript -999 osuPSF20180726
degrade 1
NOT: Bu metin dosyası bölümler halinde düzenlenir ve her bölüm kendi değişkenine ayrıştırılır. Ayarların çoğunun denemeden deneye değiştirilmesi gerekmese de, z yığınının boyutunun (şekil içinstack_z_size, ilgi proteini için Fstack_z_size), z yığınının(stack_seperation_ nm, Fstack_seperation_nm), mikroskobun göreceli odak kayması (Z_scale)23, xy piksel boyutu (nm_per_pixel), ve mikroskobun bulanıklaştırma işlevini yükler komut dosyasının adı (psfScript ) denemeyle eşleşir. Şekil kanalı sitoplazmaik olarak doldurulursa degrade alanı 1, membran lekeli bir nesneise 0 olarak ayarlanmalıdır. - Cell_shape_detector3dConvTriFolder işlevini (shae-cellshape-public/CellShapeDetectorTri/) dizeyle klasör konumuna ve ardından başlayacak hücre sayısını ve çalıştırmak istediğiniz hücre sayısını çalıştırın.
NOT: Giriş için bir örnek aşağıdaki gibi görünecektir: Cell_shape_detector3dConvTriFolder ('kırpılmış görüntüler ile klasöre yol', klasörde başlangıç dizini, # hücreleri). Tipik bir hücrenin yeniden yapılanmanın yakınsaması ve bitsi için 5−20 dakika arasında sürebilir.
- Herhangi bir istatistiksel analiz için hücreleri kullanmadan önce doğru olduğundan emin olmak için hücre rekonstrüksiyonlarını tarar.
- Tek tek hücre rekonstrüksiyonlarını görsel olarak taramak için ScreenFits'i (shae-cellshape-public/shae-fitViewerGui/) çalıştırın.
- Grafik kullanıcı arabirimi (GUI) açıldığında klasörü seç düğmesini tıklatın ve ardından adım 5.3'te oluşturulan yeniden yapılandırma veri dosyalarının (TRI.mat) olduğu klasörü seçin.
- Hücre şekilsiz görünüyorsa veya tam olarak yakınsamazsa hücre rekonstrüksiyonundaki kutuyu seçin (Şekil 3). Bu delikli bir hücre gibi görünebilir, düz bir tarafı, ya da bir dal dışarı çıkan. Bu, dosya adına 'FLAG' ekler, böylece herhangi bir alt akış çözümlemesi dışında tutulabilir.
NOT: Yeniden yapılandırılan hücre orijinal görüntülerle karşılaştırılabilir. Hücreleriniz çeşitli heterojen şekil popülasyonundan geliyorsa, bu özellikle önemli olabilir.
- Yüzeydeki Gauss eğriliği bir fonksiyonu olarak ilgi proteinin göreceli konsantrasyonu bir zenginleştirme profili oluşturmak için zenginleştirmeSmoothingSpline (shae-cellshape-public /) çalıştırın.
- Adım 5.3.3'te oluşturulan TRI.mat dosyaları olan her klasörü seçin.
- Yeni oluşturulan (5.5.1) curve.mat dosyasını seçin.
NOT: 5.5.1'de seçilen her klasör için curve.mat dosyası oluşturulur. Tüm zenginleştirme profilleri tek bir grafikte sunulacaktır. Her klasör için 5,5'ten daha ayrı grafikler gerekiyorsa.
NOT: Floresan proteinin kesin geometrik lokalizasyonuna ek olarak, nesnelerin sayısını, boyutunu ve yönünü saymak da dahil olmak üzere ikincil kanaldan gelen verileri analiz etmenin başka birçok yolu vardır4.
Representative Results
Bakteriler doğada işlevlerini belirleyebilir şekil ve boyutlarda geniş bir yelpazede gelir1. Bu yordamın sonucu, bir z-görüntü yığınının ileri kıvrımından hücrelerin doğru bir 3B gösterimidir(Şekil 1). Bu yöntem özellikle kavisli hücrelerle uğraşırken(Şekil 2),ya da anormal şekilli hücrelerle(Şekil 4A),2B gösterimi hücrelerin eğriliğini doğru yansıtmadığı için önemlidir. İleri kıvrım yöntemini kullanabilmek için(Şekil 1A),hücrelerin ya periferik olarak boyanmış olması ya da sitoplazmik bir lekeye sahip olması gerekir(Şekil 2B sola vs. sağa).
Şekil 4 hücredeki MreB yerelleştirmesini gösterir. Bir GFP füzyon bakteriyel aktin protein MreB21 hem yabani tip ve mutant E. coli hücreleri4kesin lokalizasyonu çalışma için yapıldı. MreB membran ile ilişkili olduğundan, 3D görüntüleme sadakatle hücredeki konumunu çoğaltmak için gereklidir. Bu ölçümleri 3Boyutlu olarak yaparak hem yabani tip hem de rodZ mutant hücrelerinin şekillerini yeniden yapılandırabildik (Şekil 4A). MreB'nin lokalizasyonunun, rodz'a bağımlı bir şekilde sadece 3Boyutlu olarak ölçülebilen geometrik bir özellik olan küçük Gauss eğrilerinde zenginleştirilmiş olduğugösterilmiştir( Şekil 4B).
Şekil 1: İleri kvolürsiyon yöntemi, hücre şekli hakkında önceden bilgisi olmayan hücreleri yeniden oluşturur. (A) Yöntemin nihai çıktısı, bir test şekli ile mikroskobun kalibre edilmiş bulanıklaştırma fonksiyonu karşılaştırılarak elde edilen 3Boyutlu hücre rekonstrüksiyonudur. Bu, gözlenen 3D görüntü varsayımsal olanla eşleşene kadar gözlenen z-yığınıyla karşılaştırılır. Burada gösterilen resim bir C. crescentus hücresinin yeniden yapılandırılmasının bir tasviridir. (B) Yeniden yapılanma boru hattı, gözlenen görüntü yığınına göre yüzey elemanlarının tahmini konumlarını yinelemeli olarak günceller. Yöntemin tüm algoritmik ayrıntıları için, Bkz. Nguyen3. (C) Yeniden yapılanma boru hattı hücrenin şekli hakkında hiçbir priori bilgisi olmadan başlar ve gözlenen z-yığınına uyacak şekilde yüzey tepelerinin konumunu ve sayısını günceller. 3D rekonstrüksiyon sırasında her 30 adımdan temsili görüntüler V. kolera hücresinin üç farklı açıdan gösterilir. Bu şeklin yüzey konumları, benzetilen ve gözlenen yığınlar arasındaki farkı en aza indirmek için güncelleştirilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Üç farklı şekilli bakteri türünün temsili 3Boyutlu rekonstrüksiyonları. Üç boyutlu rekonstrüksiyonlar, zarı lekeli (solda) veya sitoplazmik florofor (sağda) ile doldurulmuş hücrelerden yapılabilir. Bükümlü çubuk, bükülmüş çubuk veya düz çubuk doğru bir şekilde yeniden inşa edilebildiğinden, başlangıç hücresinin şekli ve eğriliği önemli değildir. Yeniden inşa edilen yüzeyler, yüzeyin yerel Gauss eğriliği temel alıngan renklidir. Ölçek çubuğu = 1 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Rekonstrüksiyonlar birden fazla nedenden dolayı başarısız olabilir. Yeniden yapılandırma algoritmasının makul bir sonuca yakındığından emin olmak için hücreler taranmalıdır. Sol = temsili yabani tip (üst) ve rodZ mutant (alt) Kalite kontrolü geçti E. coli hücreleri. Right = düzgün yeniden inşa etmek için başarısız ve kalite kontrolü geçmedi hücreleri. Beş sınıf başarısız yakınsama gösterilir: (i) kırpma bölgesinin kenarına çok yakın olan hücreler keskin bir sınır çizimine, (ii) başka bir hücreye çok yakın hücreler, (iii) divot üreten hücreler, (iv) ilk s'den geçmeyen hücreler tarting noktası ve (v) diğer bilinmeyen hatalar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Protein lokalizasyonunu belirli hücresel geometrilere gösteren temsili veriler. (A) Gausseğriliği ve MreB floresan yoğunluğu ile yaban tipi ve rodZ E. coli hücrelerinin üç boyutlu yeniden yapılandırılan hücreleri görüntülenir. Ölçek çubuğu = 1 μm. (B) Yabani tip ve rodZ E. coli hücrelerinden MreB zenginleştirme çizimleri. Değerler >1 zenginleştirme ve değerleri gösterir <1 hücrenin tek düze kapsama göre bu hücresel bölgelerden MreB tükenmesi göstermektedir. Gölgeli alanlar ortalama ±%90 bootstrap güven aralığı anlamına gelir. Her suşun eğrisi kübik yumuşatma spline'dır ve p > 5 x 10-3'ünaşırı eğrilikleri için bir olasılık eşiği kullanılarak kesilir. Bu rakam (Bratton ve ark.) 4. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Bu protokolde kritik bir adım yüksek kaliteli görüntülerin elde edilmesidir. Hücreleri düzgün bir şekilde yeniden oluşturmak için, hücrenin üstünde ve altında yeterli bulanıklık olmalıdır. Bu nedenle, alınan z-yığınının yeterince geniş bir mesafeyi kapsaması zorunludur. Görüntü edinimi sırasında atılan adımların sayısı her zorlanma için ayarlanabilir. Örneğin, rodZ için silinen E. coli hücreleri daha geniştir ve daha fazla adım gerektirir ve bu nedenle, vahşi tür hücrelere göre daha büyük bir mesafe gerektirir. Örnek görüntü edinimi sırasında sürükleniyorsa, yeniden yapılandırmada büyük hatalar olabilir. Bu nedenle, z-yığın edinimi sırasında sürüklenme önlemek için görüntüleme önce slayt mikroskop ile termal dengeye gelmesine izin önemlidir. Hücreler düşük otofloresansa sahip pedlerde görüntülenmelidir. Ortak LB ortamında bulunanlar gibi ortam bileşenleri, hücreleri yeniden oluşturmaya çalışırken sorunlara neden olabilecek otofloresansa sahiptir. Rekonstrüksiyon işlemi her hücrede bağımsız olarak gerçekleştirildiği için görüntüleme defterindeki hücrelerin yoğunluğu önemlidir. Çok az sayıda hücre yeterli sayıda hücrenin görüntülerini elde etmek için gereken süreyi artırırken, çok fazla hücre tek tek hücreleri kolayca kırpmak için çok yoğun görüntüleme alanlarına neden olur. Tüm hücreler düzgün bir şekilde yeniden yapılanmadığından, kazanım adımı sırasında ekstra hücreler görüntülenmeli ve istatistiksel analizle ilerlemeden önce tüm çıktılar taranmalıdır(Şekil 3).
Bu yöntem için sınırlamaların çoğu tekniktir. Kullanılacak mikroskopta, yüksek sayısal diyafram açıklığına (genellikle >1.4) sahip bir amaca sahip olmak gerekir, çünkü bu bakterilerin boyut ölçeğinde optik kesit sağlar. Ayrıca, mikroskop z yönünde küçük, hassas adımlar atabilir bir piezo sahne ile donatılmış olması gerekir. Ayrıca, gerekli olmasa da, görüntü çözümleme yazılımını çalıştırmak için yüksek işlemli hesaplama kaynaklarına erişim, hücreleri yeniden oluşturmak için işlem süresini azaltacağı için şiddetle önerilir.
Yöntemin kavramsal sınırlamalarından biri, görüntülerin sinyal-gürültü oranına göre yeniden yapılandırmanın düzgünlüğünü nisbeten ağırlıklandırmak için doğru enerji ölçeklerinin seçilmesi gerektiğidir. Bir seçim parametrelerini doğrulamak için, hücrelerin boyutları ve şekilleri iletim elektron mikroskobu (TEM) veya atomik kuvvet mikroskobu (AFM) gibi bağımsız yöntemlerkullanılarak ölçülmelidir. Prensip kanıtı olarak, hücrelerin 3D rekonstrüksiyonları ya z-doğruluk (<50 nm) veya xy-doğruluk (<30 nm)3test etmek için TEM ızgarasına test etmek için Bir AFM üzerinde gerçekleştirilmiştir. Böyle bir ilişkili yaklaşım zaman alıcı ve pahalı. Daha basit bir yaklaşım, yabani tip hücreler veya 1 μm küresel boncuklar gibi standart örnekleri görüntülemek olabilir. Rekonstrüksiyonların çapı ve büyüklüğü, rekonstrüksiyonda kullanılan boyut ve enerji ölçeklerinin doğru olmasını sağlamak için kullanılabilir.
Bu floresan mikroskop görüntüleri yüksek çözünürlüklü mekansal bilgi ayıklamak istiyor tek yöntem değildir. Birçok inceleme makaleleri süper çözünürlüklü mikroskopi alanında son gelişmeler açıklar24,25. Dekonvolution mikroskopi26, dönen disk konfokal mikroskobu27, piksel yeniden atama28ve yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM)29 gibi çözünürlük arttırıcı teknikler çözünürlüğünü artırmak için aramak mikroskop tarafından elde edilen görüntüler. Bu yöntemler sunulan yaklaşımla uyumsuz değildir. Son zamanlarda bu yöntem girişleri9olarak SIM tabanlı görüntüler için izin vermek için uyarlanmıştır. İleri kvolution yöntemi deconvolution mikroskopisi ile bazı temellerini paylaşırken, tamamen farklı bir çıktıya sahiptir. Dekonvolution mikroskopisi gibi yaklaşımlar görüntünün çözünürlüğünü iyileştirmeye çalışırken, bu yaklaşım bir görüntü değil, kabaca 50 nm hassasiyetle hücre şekli rekonstrüksiyonu oluşturur. Seyrek etiketli numunelere dayanan tek moleküllü aktif kontrol mikroskobu teknikleri, bu yöntemden daha yüksek düzeyde uzamsal hassasiyet sağlayabilir. Birçok durumda, bu tek molekül yaklaşımları floresan yapılar optimizasyonu gerektirir ve uzun edinim süreleri gerektirebilir, onları canlı veya dinamik örnekler ile kullanımı zor hale. Bu yöntemlerin her biri, bu yöntemin olmadığı bir veya daha fazla uyarıyla birlikte gelir. Örneğin, dönen disk konfokal mikroskobu ile reklamı faydaları bakteri hücrelerinin monolayers için geçerli değildir, düzlem ışık dışında çok yok nerede. Ayrıca, bu yöntem herhangi bir özel florofor gerek kalmadan doğru 3D hücre şekilleri ve protein lokalizasyonu elde etmek için bir boru hattı sağlar. Bu yöntem en az donanım gereksinimlerine sahiptir (örneğin, z piezo, yüksek NA hedefi) ve zaman noktası başına sadece onlarca görüntü gerektirir, dinamik 3B yapıları kolayca araştırmak için izin6.
Bakteri hücrelerinin 3Boyutlu yapılarda örgütlenmesini incelemek için giderek artan sayıda yaklaşım olmuştur. Bu yaklaşımlar kavramsal olarak bu yüksek kaliteli yararlanmak benzer, 3D floresan görüntüleri30,31,32. Bu yaklaşım iyi izole hücreleri gerektirir ve hücresel geometri hakkında hiçbir priori varsayımlar yapar. Ancak, yoğun hücresel agregalar veya biyofilmler içine taşımak için, hücrelerin çubuk gibi olduğu varsayılır. Bu düşük çözünürlük görünümü hala hücrelerin ambalaj düzenlemeleri araştırılmasını sağlar, biyofilm hücrelerinin yüksek yoğunluklu belirli faktörlerin hücre altı lokalizasyonu analizini engeller rağmen.
Gelecekte, bu 3D rekonstrüksiyon tekniği ile tek molekül ve geniş alan yaklaşımları entegre etmek için bir çerçeve geliştirmek ilginç olabilir. Ayrıca, daha yoğun hücre kümelerinin yeniden yapılandırılmasına olanak sağlamak için bu ileri kıvrım yaklaşımını yapay görme segmentasyon araçları32 ile eklemek mümkün olabilir.
Hücrelerin belirli şekillere evrimleşmelerinin nedeni yaşadıkları karmaşık ortamı yansıtması gereken karmaşık bir konudur. Hücre şekillerinin evrimini ve işlevini anlamak, bu şekillerin kesin ve doğru ölçümlerini almayı gerektirir, bu yöntem insa ettiği şey budur.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Jeffrey Nguyen ve Joshua Shaevitz'e bu yöntemin geliştirilmesine yardımcı olan lara teşekkür ederiz.
Finansman: RMM - NIH F32 GM103290-01A1, BPB - Glenn Merkezleri Yaşlanma Araştırma ve Ulusal Bilim Vakfı PHY-1734030 için.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 nm fluorescent beads | Invitrogen | F8795 | these are used to measure the blurring function of the microscope |
| Agarose | sigma-Aldrich | A9539 | |
| Cotton Swab | Puritan Medical Products Company LLC | S304659 | used to appy VaLaP |
| Cover Slips | VWR | 16004-302 | |
| Fiji | ImageJ | https://fiji.sc | used to cro cells |
| FM4-64 | Invitrogen | LST3166 | membrane dye used to stain cells |
| Huygens Software | Scientific Volume Imaging | Huygens essential or professional | Use to measure blurring function of microscope |
| Lanolin | Sigma-Aldrich | L7387 | combine with paraffin and petroleum jelly to make VaLaP |
| LB growth medium | BD Difco | DF0446173 | |
| M63 medium | US Biological | M1015 | |
| MATLAB | Mathworks | Needed to run forward convolution scripts | |
| Microscope Slides | Fisher | 12-550-133 | |
| NIS Elements | Nkon | ||
| Paraffin | Sigma-Aldrich | 327212 | |
| Petroleum Jelly | Equate | 49035-038-27 | |
| Piezo z stage | Nikon | 77011589 | |
| Pipet tips -p200 | USA Scientific | 1111-0730 | |
| Pipet tips- p10 | USA Scientific | 1111-3730 |
References
- Young, K. D. The Selective Value of Bacterial Shape. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 70 (3), 660-703 (2006).
- Persat, A., Stone, H. A., Gitai, Z. The Curved Shape of Caulobacter crescentus Enhances Surface Colonization in Flow. Nature Communications. 5, 3824 (2014).
- Nguyen, J. P., Bratton, B. P., Shaevitz, J. W. Bacterial Cell Wall Homeostasis: Methods and Protocols. Hong, H. J. , Springer. New York. 227-245 (2016).
- Bratton, B. P., Shaevitz, J. W., Gitai, Z., Morgenstein, R. M. MreB Polymers and Curvature Localization are Enhanced by RodZ and Predict E. coli's Cylindrical Uniformity. Nature Communications. 9 (1), 2797 (2018).
- Ouzounov, N., et al. MreB Orientation Correlates with Cell Diameter in Escherichia coli. Biophysical Journal. 111 (5), 1035-1043 (2016).
- Morgenstein, R. M., et al. RodZ links MreB to Cell Wall Synthesis to Mediate MreB rotation and Robust Morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences. , 12510-12515 (2015).
- Ursell, T. S., et al. Rod-Like Bacterial Shape is Maintained by Feedback Between Cell Curvature and Cytoskeletal Localization. Proceeding of the National Academy of Science U.S.A. 111 (11), E1025-E1034 (2014).
- Bartlett, T. M., et al. A Periplasmic Polymer Curves Vibrio cholerae and Promotes Pathogenesis. Cell. 168 (1-2), 172-185 (2017).
- Taylor, J. A., et al. Distinct Cytoskeletal Proteins Define Zones of Enhanced Cell Wall Synthesis in Helicobacter pylori. bioRxiv. , 545517 (2019).
- Egan, A. J. F., Vollmer, W. The Physiology of Bacterial Cell Division. Annals of the New York Academy of Science. 1277 (1), 8-28 (2013).
- Adams, D. W., Errington, J. Bacterial Cell Division: Assembly, Maintenance and Disassembly of the Z ring. Nature Reviews Microbiology. 7 (9), 642-653 (2009).
- Werner, J. N., Gitai, Z., Melvin, I. S., Brian, R. C., Alexandrine, C. High-Throughput Screening of Bacterial Protein Localization. Methods in Enzymology. 471, 185-204 (2010).
- de Pedro, M. A., Quintela, J. C., Höltje, J. V., Schwarz, H. Murein Segregation in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 179 (9), 2823-2834 (1997).
- Hussain, S., et al. MreB Filaments Align Along Greatest Principal Membrane Curvature to Orient Cell Wall Synthesis. eLife. 7, e32471 (2018).
- Wong, F., et al. Mechanical Strain Sensing Implicated in Cell Shape Recovery in Escherichia coli. Nature Microbiology. 2, 17115 (2017).
- Wong, F., Garner, E. C., Amir, A. Mechanics and Dynamics of Translocating MreB Filaments on Curved Membranes. eLife. 8, e40472 (2019).
- Quint, D. A., Gopinathan, A., Grason, G. M. Shape Selection of Surface-Bound Helical Filaments: Biopolymers on Curved Membranes. Biophysical Journal. 111 (7), 1575-1585 (2016).
- Colavin, A., Shi, H., Huang, K. C. RodZ Modulates Geometric Localization of the Bacterial Actin MreB to Regulate Cell Shape. Nature Communications. 9 (1), 1280 (2018).
- Valap Sealant. , Cold Spring Harbor Protocols. http://cshprotocols.cshlp.org/content/2015/2/pdb.rec082917 (2015).
- Shannon, C. E. Communication in the Presence of Noise. Proceedings of the IRE. 37 (1), 10-21 (1949).
- Billings, G., et al. De Novo Morphogenesis in L-Forms Via Geometric Control of Cell Growth. Mol Microbiol. 93 (5), 883-896 (2014).
- Sturrman, N. Measuring a Point Spread Function. , iBiology. https://www.ibiology.org/talks/measuring-a-point-spread-function (2012).
- Bratton, B. P., Shaevitz, J. W. Simple Experimental Methods for Determining the Apparent Focal Shift in a Microscope System. PLOS ONE. 10 (8), e0134616 (2015).
- Moerner, W. E., Shechtman, Y., Wang, Q. Single-molecule Spectroscopy and Imaging over the decades. Faraday Discussions. 184, 9-36 (2015).
- Sahl, S. J., Hell, S. W., Jakobs, S. Fluorescence Nanoscopy in Cell Biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18, 685 (2017).
- Sarder, P., Nehorai, A. Deconvolution Methods for 3-D Fluorescence Microscopy Images. IEEE Signal Processing Magazine. 23 (3), 32-45 (2006).
- Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Methods in Cell Biology. Waters, J. C., Wittman, T. 123, Academic Press. 153-175 (2014).
- Huff, J. The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution. Nature Methods. 12, 1205 (2015).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the Lateral Resolution Limit by a Factor of Two Using Structured Illumination Microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Lee, M. K., Rai, P., Williams, J., Twieg, R. J., Moerner, W. E. Small-Molecule Labeling of Live Cell Surfaces for Three-Dimensional Super-Resolution Microscopy. Journal of the American Chemical Society. 136 (40), 14003-14006 (2014).
- Yan, J., Sharo, A. G., Stone, H. A., Wingreen, N. S., Bassler, B. L. Vibrio cholerae Biofilm Growth Program and Architecture Revealed by Single-Cell Live Imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (36), E5337-E5343 (2016).
- Wang, J., et al. Bact-3D: A level set segmentation approach for dense multi-layered 3D bacterial biofilms. 2017 IEEE International Conference on Image Processing (ICIP). , 330-334 (2017).
