Summary
Ce protocole explique comment préparer et monter des échantillons bactériens pour l'imagerie tridimensionnelle vivante et comment reconstruire la forme tridimensionnelle d'E. coli à partir de ces images.
Abstract
La forme d'une bactérie est importante pour sa physiologie. De nombreux aspects de la physiologie cellulaire tels que la motilité cellulaire, la prédation et la production de biofilms peuvent être affectés par la forme cellulaire. Les cellules bactériennes sont des objets tridimensionnels (3D), bien qu'elles soient rarement traitées comme telles. La plupart des techniques de microscopie donnent lieu à des images bidimensionnelles (2D) entraînant la perte de données relatives à la forme réelle des cellules 3D et à la localisation des protéines. Certains paramètres de forme, tels que la courbure gaussienne (le produit des deux courbures principales), ne peuvent être mesurés qu'en 3D parce que les images 2D ne mesurent pas les deux courbures principales. En outre, toutes les cellules ne sont pas à plat lors du montage et l'imagerie 2D des cellules courbes peut ne pas représenter avec précision les formes de ces cellules. La mesure précise de la localisation des protéines en 3D peut aider à déterminer la régulation spatiale et la fonction des protéines. Une technique de convolution vers l'avant a été développée qui utilise la fonction floue du microscope pour reconstruire les formes des cellules 3D et localiser avec précision les protéines. Ici, un protocole pour la préparation et le montage d'échantillons pour l'imagerie cellulaire vivante des bactéries en 3D à la fois pour reconstruire une forme cellulaire précise et pour localiser les protéines est décrit. La méthode est basée sur la préparation d'échantillons simples, l'acquisition d'images fluorescentes et le traitement d'images basé sur MATLAB. De nombreux microscopes fluorescents de haute qualité peuvent être simplement modifiés pour prendre ces mesures. Ces reconstructions cellulaires sont intensives sur le plan du calcul et l'accès à des ressources de calcul à haut débit est recommandé, mais pas nécessaire. Cette méthode a été appliquée avec succès à de multiples espèces bactériennes et mutants, aux modalités d'imagerie fluorescente et aux fabricants de microscopes.
Introduction
Les cellules de tous types régulent leurs formes pour des fonctions spécifiques. Par exemple, les neurones sont formés différemment des cellules sanguines et ont des fonctions différentes. De même, les cellules bactériennes viennent dans une variété de formes et de tailles, bien que le but de ces formes n'est pas toujours connu1,2. Par conséquent, il est important que la forme des cellules bactériennes soit déterminée avec précision. La méthode décrite montre un moyen facile à mettre en œuvre pour recueillir des données appropriées pour l'analyse 3D de la plupart des cellules bactériennes vivantes ou fixes.
La méthode décrite permet de prendre des images 3D de cellules bactériennes afin de représenter avec précision la forme des cellules 3D de l'échantillon et de localiser précisément les protéines dans ces formes. Les techniques traditionnelles de microscopie prennent des images 2D, ce qui est problématique lors de l'étude de cellules qui ont des formes anormales ou non symétriques, telles que les mutants d'Escherichia coli, ou des bactéries courbes telles que Vibrio cholerae et Helicobacter pylori. Bien que les images 3D haute résolution soient l'entrée clé de cette méthode, la méthode ne renvoie pas une image améliorée par résolution. Cette méthode reconstitue plutôt les coordonnées et la forme de la surface 3D à l'aide d'un algorithme de convolution vers l'avant à l'aide de contours actifs et de la fonction floue apparente du microscope3 (Figure 1). Il a été utilisé pour étudier l'actine bactérienne homolog MreB dans E. coli4,5,6,7, le nouvel élément périsquelettique CrvA dans V. cholerae8, et le putatif bactofilin CcmA dans Helicobacter pylori9 (Figure 2).
La localisation des protéines peut donner un aperçu de leurs fonctions. Par exemple, les protéines impliquées dans la division cellulaire sont normalement localisées à la cellulemédiane 10,11. Des études à haut débit ont été entreprises pour localiser toutes les protéines d'une bactérie dans l'espoir d'obtenir un aperçu de leurs fonctions12. Malheureusement, ces études ont été réalisées avec l'imagerie 2D et l'analyse 1D ou 2D, ce qui rend impossible de mesurer des aspects spécifiques de la localisation des protéines, tels que la localisation aux caractéristiques géométriques cellulaires.
Par exemple, MreB, une protéine dynamique nécessaire à la forme de la tige de nombreuses bactéries, est présumée fonctionner en dirigeant la localisation de la synthèse de la paroi cellulaire, et sa localisation reflète la localisation de la synthèse de la paroi cellulaire7,13. MreB de plusieurs espèces montre l'enrichissement géométrique4,6,7,14,15. Les polymères de surface dynamiques, tels que MreB, peuvent coupler la géométrie de la surface au profil d'enrichissement moyen de temps16 et peuvent être en mesure de s'orienter vers des géométries spécifiques en minimisant l'énergie associée à la liaison à la membrane17. Bien que l'importance de la torsion, du regroupement, de la flexion et de la dynamique n'ait pas été entièrement résolue pour MreB, il est important de noter que les mesures précises des deux courbures principales d'une surface nécessitent une représentation 3D complète de la cellule. Par conséquent, pour mesurer le plus précisément les courbures auxquelles les protéines se localisent, il est préférable d'utiliser la 3D, plutôt que l'imagerie 2D. L'imagerie 3D élimine la nécessité d'estimer par calcul les courbures qui ne peuvent pas être mesurées en 2D, une estimation qui pourrait ne pas être exacte dans les cellules asymétriques18.
Bien que l'imagerie 2D des cellules soit plus rapide et ne nécessite pas autant de travail de calcul post-imagerie, l'imagerie 3D fournit une représentation plus précise de la cellule, ainsi que la capacité de mesurer les caractéristiques de surface, telles que la courbure, qui ne peut pas être mesurée en 2D. Par conséquent, à mesure que l'imagerie 3D deviendra plus courante, de nouvelles connaissances sur la forme cellulaire et la localisation des protéines deviendront possibles.
Protocol
1. Préparation de l'échantillon
- Faire e. coli fluorescent pour l'imagerie soit en les ingénierie pour exprimer une protéine fluorescente cytoplasmique6 ou en utilisant un colorant membranaire5. D'autres espèces bactériennes peuvent être utilisées à la place d'E. coli.
- Transformez les cellules par électroporation avec un plasmide qui code la protéine fluorescente mCherry cytoplasmique.
REMARQUE: Différentes protéines fluorescentes d'autres couleurs de peuvent être utilisées. - Cultivez les transformateurs sur une plaque LB avec l'antibiotique approprié à 37 oC. Obtenir des colonies uniques et identifier les clones positifs par microscopie. Les colonies résistantes aux antibiotiques qui apparaissent en rouge sous le microscope contiennent le plasmide porteur de mCherry.
- Transformez les cellules par électroporation avec un plasmide qui code la protéine fluorescente mCherry cytoplasmique.
- Cultivez 2 ml de la culture de nuit dans les médias liquides LB avec les antibiotiques appropriés à 37 oC dans un incubateur secouant. Utilisez une colonie à partir d'une assiette ou une petite quantité d'un bouillon de congélation comme inoculum.
REMARQUE: Utilisez les supports nécessaires pour les cellules bactériennes sélectionnées pour l'expérience. - Sous-culture de la culture de nuit 1:1,000 à 5 ml de médias LB frais et laisser les cellules se développer à la phase exponentielle à 37 oC dans un incubateur secouant pour 3-4 h. Mesurer l'OD600 des cellules pour confirmer qu'ils sont dans la phase exponentielle (c.-à-d. , OD600 0,2 à 0,4).
REMARQUE: L'imagerie peut être réalisée à n'importe quel stade de croissance en fonction de l'expérience en cours.
2. Préparation de diapositives
REMARQUE: Il est important d'utiliser des médias qui ont une faible autofluorescence. Tout milieu à faible autofluorescence peut être utilisé. Dans cette expérience, 1% agarose M63 pads médias minimaux et l'étanchéité avec VaLaP19 est nécessaire pour l'image des cellules en 3D.
-
Préparer une solution de 1% d'agarose dans 20 ml de supports minimaux.
- Micro-ondes la solution jusqu'à ce que l'agarose soit complètement dissoute et que la solution semble claire.
- Gardez la solution dans un bain d'eau de 60 oC jusqu'à ce qu'elle soit prête à l'emploi.
REMARQUE: Cette solution peut être solidifiée et fondue au besoin ou peut être aliquoted en plus petites quantités qui sont fondues au besoin. Après plusieurs utilisations, les supports peuvent se décolorer et être remplacés.
- Faire fondre le scellant VaLaP sur une plaque chaude à 80'100 'C.
REMARQUE: Préparer le VaLaP, qui sera utilisé comme scellant, en faisant fondre 50 g chacun de gelée de pétrole, de lanolin et de paraffine ensemble dans un bécher sur une plaque chaude à 80'100 'C. Cette grande quantité de VaLaP peut être stockée à température ambiante indéfiniment et sera suffisante pour les diapositives de 500 euros. Le chauffage à l'adresse suivante : 100 oC, il se dégradera et sa couleur s'assombrit. - Placez deux piles chacune de trois feuillets de couverture de 20 mm x 20 mm aux extrémités opposées d'une glissière (six couvertures totales).
- Pipette 200 l de solution de tampon d'agarose sur la glissière.
REMARQUE: Si vous n'utilisez pas une tache fluorescente modifiée, un colorant membranaire peut être ajouté à la solution de tampon d'agarose avant cette étape. Resuspendre le colorant dans l'eau et ajouter le colorant à 1 ml de la solution de tampon d'agarose à une concentration finale de 5 g/ml. - Placez immédiatement et fermement une deuxième diapositive vers le bas sur la pile de feuillets de couverture pour aplatir l'agar et laissez-la solidifier pendant 1 min à température ambiante.
- Glissez soigneusement la glissière supérieure.
- Utilisez la grande extrémité d'une pointe de pipette de 200 l l pour découper les tampons individuels du gel (5 mm de diamètre) sur la glissière et jetez le gel mal formé ou inutile.
REMARQUE: Si l'imagerie de plusieurs souches ou conditions, un tampon séparé sera nécessaire pour chacun. Si une seule souche doit être image, faire des tampons de 3 à 4 pour aider à soutenir le bordereau de couverture. - Les cellules pipettes de haut en bas plusieurs fois pour perturber les amas cellulaires et s'assurer que la culture est bien mélangée. Pipette 1 l de sous-culture de l'étape 1.3 sur un pad.
REMARQUE: Les reconstructions de forme cellulaire exigent des cellules individuelles qui ne touchent pas d'autres cellules. Si vous utilisez des cultures de phase stationnaire ou de haute densité cellulaire, il peut être nécessaire de diluer l'échantillon 1:10 avant de le placer sur le coussinet. - Laisser sécher l'échantillon à l'air pendant 5 à 10 min. Assurez-vous que la gouttelette est complètement absorbée dans le tampon. S'il reste un liquide, les cellules se déplaceront dans le liquide et ne pourront pas être représentées.
- Placez un bordereau de couverture sur le dessus des garnitures.
- Scellez la feuille de couverture avec le VaLaP fondu en brossant doucement autour du bord de la glissière de couverture avec un coton-tige. Assurez-vous de le garder loin du haut de la feuille de couverture où l'objectif touchera. Le VaLaP durcira en quelques secondes, scellant l'échantillon.
- Image immédiate de l'échantillon.
REMARQUE: L'échantillon doit être photographié dès que la diapositive est préparée. Les cellules peuvent se développer sur les coussinets, et si elles divisent les reconstructions sera plus difficile.
3. Exigences d'imagerie
- Assurez-vous que l'axe z ou focalisé du microscope peut faire des mouvements précis de moins de 50 nm. Utilisez z étapes piezo (voir tableau des matériaux), disponible sur les microscopes de qualité de recherche, parce que les dispositifs de mise au point motorisés typiques ne sont pas en mesure de fournir cette précision.
REMARQUE: En supposant que le critère d'échantillonnage Nyquist-Shannon20, il faut avoir la capacité de déplacer 0,5 x la plus petite taille d'étape désirée, ou 2 fois la fréquence spatiale souhaitée. Pour les 100 nm nécessaires à ce protocole, une étape d'une précision de 50 nm ou moins est nécessaire. -
Assurez-vous que le microscope contient un objectif 100x avec une ouverture numérique minimale (NA) de 1,45.
- Recueillir des z-piles de 200 à 400 cellules différentes pour s'assurer que suffisamment de cellules sont obtenues pour les applications en aval.
REMARQUE: Le nombre de cellules nécessaires dépend de la variabilité sous-jacente de l'échantillon d'intérêt. Certaines des cellules recueillies à ce stade ne passeront pas par les étapes de reconstruction.
- Recueillir des z-piles de 200 à 400 cellules différentes pour s'assurer que suffisamment de cellules sont obtenues pour les applications en aval.
- Assurez-vous que la pile z correspond aux paramètres utilisés pour le canal de forme si un canal fluorescent secondaire (protéine, étiquette métabolique, etc.) est mesuré.
4. Imagerie
- Insérez la glissière scellée sur le microscope et laissez-la reposer pendant 5 min pour équilibrer la température avec l'environnement, parce que la salle de microscope peut être à une température différente de la salle de préparation de l'échantillon.
-
Prenez un z-pile fluorescent de l'échantillon.
REMARQUE : La pile z doit couvrir entièrement l'échantillon d'un espacez z inférieur à la profondeur de champ. Pour un objectif de 1,45 NA 100x et de cellules E. coli d'une épaisseur de 1 m d'épaisseur, 40 pas à 100 nm par étape fonctionnent bien. Pour les cellules plus grandes ou les cellules qui ne se trouvent pas parfaitement plat sur la surface, 50 étapes ou plus peuvent être nécessaires. Inclure suffisamment d'étapes et s'assurer que l'échantillon est complètement flou au-dessus et en dessous.- Utilisez le logiciel associé au microscope (voir Tableau des matériaux) pour contrôler le microscope.
- Concentrez-vous sur le milieu de la cellule à l'aide des roues de mise au point au microscope. Sous l'acquisition ND, cochez la case Z pour prendre une z-stack. Cliquez sur le bouton Accueil pour définir le milieu de la cellule comme point de départ. Définir la taille de l'étape à 0,1 m et définir la plage à 4 m. Assurez-vous que l'appareil Z est réglé sur l'étape piezo.
- Définir les canaux fluorescents sous la fenêtre Lambda aux paramètres des molécules fluorescentes en cours d'image. Dans cette expérience GFP et mCherry ont été utilisés.
REMARQUE: Prenez un z-stack supplémentaire avec la même taille d'étape et la même portée dans le deuxième canal de couleur si la distribution 3D d'un canal fluorescent supplémentaire est désirée. Dans cette expérience, mCherry cytoplasmique a été utilisé pour déterminer la forme des cellules et MreB-GFP a été utilisé comme un canal de deuxième couleur21. - Assurez-vous que l'Ordre d'Expérience est réglé sur lambda (série z) de sorte qu'il faudra un z-pile complet dans chaque canal de couleur avant de passer.
- Cliquez sur Run Now pour démarrer l'acquisition d'image et enregistrer le fichier onece une ou les deux z-stacks sont complets.
- Déplacez-vous vers une nouvelle zone sur le pad et répétez les étapes 4.2.2-4.2.5.
5. Reconstruction cellulaire
- Recadrez des cellules individuelles et enregistrez les images sous forme de fichier tiff empilé afin qu'il n'y ait qu'une cellule par fichier. Assurez-vous que cette cellule est bien isolée de toutes les autres cellules (c.-à-d., environ 5fois la pleine largeur demi-maximum de la fonction de flou dans xy.
REMARQUE : Cela peut être fait à l'aide d'un logiciel d'analyse d'image librement disponible (voir Tableau des matériaux).- Dessinez une boîte autour d'une cellule individuelle et Duplicate cette cellule 2x, une fois pour chaque canal. Assurez-vous que la boîte hyperpile en double est cochée et changez le canal en 1 ou 2, en vous assurant que les tranches incluent l'ensemble de la z-pile.
REMARQUE: Si l'imagerie seulement la forme des cellules et non pas une protéine fluorescente supplémentaire, un seul canal sera présent. - Une fois que les deux piles sont disponibles, allez à Images Piles ( Outils (fr) Concatenate pour combiner les images avec le canal protéique d'abord et le canal de forme deuxième.
- Enregistrer la nouvelle image comme un fichier tiff.
- Dessinez une boîte autour d'une cellule individuelle et Duplicate cette cellule 2x, une fois pour chaque canal. Assurez-vous que la boîte hyperpile en double est cochée et changez le canal en 1 ou 2, en vous assurant que les tranches incluent l'ensemble de la z-pile.
- Mesurez la fonction floue du microscope à l'aide de perles fluorescentes limitées à subdiffraction22. Cela doit être fait pour chaque microscope et microscope objectif, mais peut être effectuée avant ou après l'imagerie des échantillons d'intérêt.
- Moyenne ensemble plusieurs perles indépendantes avec une intervention manuelle à l'aide du logiciel disponible (voir tableau des matériaux).
REMARQUE: Le produit final doit être une image 3D de la fonction de flou avec le même espacement xyz que les échantillons d'intérêt.
- Moyenne ensemble plusieurs perles indépendantes avec une intervention manuelle à l'aide du logiciel disponible (voir tableau des matériaux).
- Exécutez les scripts de reconstruction de forme de cellule de convolution avant à l'aide du logiciel disponible. La dernière version de ces scripts peut être téléchargée librement à partir de https://github.com/PrincetonUniversity/shae-cellshape-public.
- Faites un dossier à l'intérieur d'un dossier sur le bureau qui contient les images recadrées et le fichier cell-shape-settings-tri.txt à partir de shae-cellshape-public/exampleData-tri.
- Modifier les paramètres de l'expérience d'intérêt pour l'expérience d'intérêt. Pour cette expérience, le fichier paramètres inclut les lignes suivantes :
nm-per-pixel 70
Z-scale 0,65
stack-z-taille 41
stack-t-taille 1
Fstack-z-taille 41
Fstack-t-taille 1
stack-seperation-nm 100
Fstack-seperation-nm 100
psfScript -999 osuPSF20180726
gradient 1
REMARQUE: Ce fichier texte est organisé en sections et chaque section est parsemée dans sa propre variable. Bien qu'il n'est pas nécessaire de changer un grand nombre de paramètres d'expérience à expérience, il faut s'assurer que la taille de la z-stack(stack-z-size pour la forme, la taille de Fstackz pour les protéines d'intérêt), l'espacement de la z-stack(stack-seperation nm, Fstack-seperation-nm), décalage focal relatif du microscope (Z-scale)23, la taille des pixels en xy (nm-per-pixel), et le nom du script qui charge la fonction floue du microscope (psfScript ) correspondent à l'expérience. Le champ de gradient doit être réglé à 1 si le canal de forme est rempli cytoplasmement et 0 s'il s'agit d'un objet taché de membrane. - Exécutez la fonction Cell-shape-detector3dConvTriFolder (shae-cellshape-public/CellShapeDetectorTri/) avec la chaîne à l'emplacement du dossier suivie du nombre de cellules pour démarrer et du nombre de cellules que vous souhaitez exécuter.
REMARQUE: Un exemple pour l'entrée se traduira comme suit: Cell-shape-detector3dConvTriFolder ('path to folder with cropped images', starting index in folder, 'of cells). Une cellule typique peut prendre entre 5 et 20 min pour que la reconstruction converge et se termine.
- Examinez les reconstructions cellulaires pour vous assurer qu'elles sont correctes avant d'utiliser les cellules pour toute analyse statistique.
- Exécuter ScreenFits (shae-cellshape-public/shae-fitViewerGui/) pour examiner visuellement les reconstructions cellulaires individuelles.
- Cliquez sur le bouton sélectionnez lorsque l'interface utilisateur graphique (GUI) s'ouvre, puis sélectionnez le dossier avec les fichiers de données de reconstruction (TRI.mat) créés à l'étape 5.3.
- Sélectionnez la boîte à côté de la reconstruction cellulaire si une cellule semble déformée ou n'a pas complètement converger (Figure 3). Cela pourrait ressembler à une cellule avec un trou, un côté plat, ou une branche qui en sort. Cela permettra d'annexer 'FLAG' au nom du fichier afin qu'il puisse être exclu de toute analyse en aval.
REMARQUE: La cellule reconstruite peut être comparée aux images originales. Cela peut être particulièrement important si vos cellules proviennent d'une population hétérogène de formes diverses.
- Exécution enrichmentSmoothingSpline (shae-cellshape-public/) pour créer un profil d'enrichissement de la concentration relative de la protéine d'intérêt en fonction de la courbure gaussienne à la surface.
- Sélectionnez chaque dossier avec des fichiers TRI.mat créés à l'étape 5.3.3.
- Sélectionnez le nouveau fichier curve.mat (5.5.1).
REMARQUE: Un fichier curve.mat sera créé pour chaque dossier sélectionné en 5.5.1. Tous les profils d'enrichissement seront présentés sur un graphique. Si des graphiques individuels sont nécessaires que d'exécuter 5,5 pour chaque dossier.
REMARQUE: En plus de la localisation géométrique précise d'une protéine fluorescente, il existe de nombreuses autres façons d'analyser les données du canal secondaire, y compris le comptage du nombre, la taille et l'orientation des objets4.
Representative Results
Les bactéries viennent dans une grande variété de formes et de tailles qui peuvent déterminer leurs fonctions dans la nature1. Le résultat de cette procédure est une représentation 3D précise des cellules de la convolution avant d'une z-pile d'images (Figure 1). Cette méthode est particulièrement importante lorsqu'il s'agit de cellules courbes (Figure 2), ou avec des cellules de forme anormale (Figure 4A), car une représentation 2D ne reflète pas la courbure des cellules avec précision. Afin d'utiliser la méthode de convolution vers l'avant (figure 1A),les cellules doivent être tachées périphériquement ou avoir une tache cytoplasmique(figure 2B à gauche contre droite).
La figure 4 montre la localisation De MreB dans la cellule. Une fusion de GFP a été faite à la protéine bactérienne d'actine MreB21 afin d'étudier sa localisation précise dans le type sauvage et les cellules mutantes d'E. coli 4. Parce que MreB est associé à la membrane, l'imagerie 3D est nécessaire pour reproduire fidèlement sa position dans la cellule. En effectuant ces mesures en 3D, nous avons pu reconstruire les formes des cellules mutantes de type sauvage et de rodZ (Figure 4A). La localisation de MreB s'est avérée enrichie à de petites courbures gaussiennes, une caractéristique géométrique qui ne peut être mesurée qu'en 3D, d'une manière dépendante de RodZ (Figure 4B).
Figure 1 : La méthode de convolution avancée reconstitue les cellules sans aucune connaissance préalable de la forme cellulaire. (A) La sortie finale de la méthode est une reconstruction cellulaire 3D dérivée en comparant une forme d'essai avec la fonction de flou calibré du microscope. Ceci est comparé à la z-pile observée jusqu'à ce que l'image 3D observée corresponde à l'image hypothétique. L'image montrée ici est un rendu de la reconstruction d'une cellule de C. crescentus. (B) Le pipeline de reconstruction met à jour itérativement les positions estimées des éléments de surface en fonction de la pile d'images observée. Pour des détails algorithmiques complets de la méthode, voir Nguyen3. (C) Le pipeline de reconstruction commence sans connaissance a priori de la forme de la cellule et met à jour la position et le nombre de vertices de surface pour correspondre à la z-pile observée. Des images représentatives de chaque 30 étapes au cours de la reconstruction 3D sont montrées sous trois angles différents d'une cellule De V. cholerae. Les positions de surface de cette forme sont mises à jour pour minimiser la différence entre les piles simulées et observées. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Reconstructions 3D représentatives de trois espèces bactériennes de forme différente. Les reconstructions tridimensionnelles peuvent être faites à partir de cellules dont la membrane est tachée (à gauche) ou remplies d'un fluorophore cytoplasmique (à droite). La forme et la courbure de la cellule de départ n'est pas importante, car une tige pliée, une tige tordue ou une tige droite peuvent toutes être reconstruites avec précision. Les surfaces reconstruites sont colorées en fonction de la courbure gaussienne locale de la surface. Barre d'échelle de 1 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Les reconstructions peuvent échouer pour de multiples raisons. Les cellules doivent être examinées pour s'assurer que l'algorithme de reconstruction a convergé vers un résultat raisonnable. Gauche - type sauvage représentatif (en haut) et rodZ mutant (en bas) cellules E. coli qui ont passé le contrôle de la qualité. Droite - cellules qui n'ont pas réussi à reconstruire correctement et n'a pas passé le contrôle de la qualité. Cinq classes de convergence défaillante sont montrées : (i) cellules trop proches du bord de la région de culture menant à une démarcation pointue, (ii) cellules qui sont trop proches d'une autre cellule, (iii) cellules qui ont produit un divot, (iv) cellules qui n'ont pas procédé au-delà de l'initial s point de tarting, et (v) d'autres erreurs inconnues. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Données représentatives montrant la localisation des protéines dans des géométries cellulaires spécifiques. (A) Cellules reconstruites tridimensionnelles de type sauvage et cellules de rodZ E. coli avec la courbure de Gaussian et l'intensité de fluorescence de MreB montrées. Barre d'échelle de 1 m. (B) Parcelles d'enrichissement de MreB à partir de cellules de type sauvage et de rodZ E. coli. Les valeurs de l'enrichissement et des valeurs de l'indice 1 montrent l'épuisement de MreB de ces régions cellulaires par rapport à la couverture uniforme de la cellule. Les zones ombragées indiquent un intervalle de confiance moyen de 90 % de bootstrap de la moyenne. La courbe pour chaque souche est un lissage lissant cubique et est tronqué en utilisant un seuil de probabilité pour les courbures extrêmes de p 'gt; 5 x 10-3. Ce chiffre a été modifié à partir de (Bratton et al.) 4. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Discussion
Une étape cruciale de ce protocole est l'acquisition d'images de haute qualité. Pour reconstruire correctement les cellules, il doit y avoir assez de flou au-dessus et au-dessous de la cellule. Par conséquent, il est impératif que le z-stack pris couvre une distance assez grande. Le nombre de mesures prises lors de l'acquisition d'image peut être ajusté pour chaque souche. Par exemple, les cellules E. coli supprimées pour rodZ sont plus larges et nécessitent plus d'étapes, et donc, une plus grande distance, que les cellules de type sauvage. Si l'échantillon dérive lors de l'acquisition d'images, la reconstruction peut comporter des erreurs majeures. Par conséquent, il est important de laisser la diapositive arriver à l'équilibre thermique avec le microscope avant l'imagerie pour éviter la dérive lors de l'acquisition z-stack. Les cellules doivent être représentées sur des coussinets à faible autofluorescence. Les composants des médias, tels que ceux trouvés dans le milieu commun de LB, ont l'autofluorescence qui peut causer des problèmes en essayant de reconstruire les cellules. La densité des cellules sur le tampon d'imagerie est importante parce que le processus de reconstruction est effectué indépendamment sur chaque cellule. Trop peu de cellules augmenteront le temps nécessaire pour obtenir des images d'un nombre suffisant de cellules, tandis que trop de cellules se traduira par des champs d'imagerie qui sont trop denses pour facilement cultiver des cellules individuelles. Étant donné que toutes les cellules ne se reconstruisent pas correctement, les cellules supplémentaires doivent être représentées au cours de l'étape d'acquisition et toutes les sorties doivent être examinées avant d'aller de l'avant avec l'analyse statistique (figure 3).
Bon nombre des limitations de cette méthode sont techniques. Sur le microscope à utiliser, il faut avoir un objectif qui a une ouverture numérique élevée (typiquement 1,4), car cela permet la section optique sur l'échelle de taille des bactéries. En outre, le microscope doit être équipé d'une étape piezo qui peut prendre de petites étapes précises dans la direction z. En outre, bien qu'il ne soit pas nécessaire, l'accès à des ressources de calcul à haut débit pour exécuter le logiciel d'analyse d'image est fortement recommandé, car il permettra de réduire le temps de traitement pour reconstruire les cellules.
Une limitation conceptuelle à la méthode est que les échelles d'énergie correctes pour pondérer la douceur de la reconstruction par rapport au rapport signal-bruit des images doivent être choisies. Pour valider un choix de paramètres, les tailles et les formes des cellules doivent être mesurées à l'aide de méthodes indépendantes telles que la microscopie électronique de transmission (TEM) ou la microscopie par force atomique (AFM). Comme preuve de principe, des reconstructions 3D de cellules ont été effectuées soit sur un AFM pour tester la précision de la z (lt;50 nm) ou sur une grille TEM pour tester la xy-exactitude (lt;30 nm)3. Une telle approche corrélée prend du temps et coûte cher. Une approche plus simple peut consister à imager des échantillons standard tels que des cellules de type sauvage ou des perles sphériques de 1 m. Le diamètre et la sphénité des reconstructions peuvent être utilisés pour s'assurer que la taille et les échelles d'énergie utilisées dans la reconstruction sont correctes.
Ce n'est pas la seule méthode qui cherche à extraire des informations spatiales à haute résolution à partir d'images de microscopie fluorescence. Beaucoup d'articles d'examen décrivent les progrès récents dans le domaine de la microscopie de super-résolution24,25. Les techniques d'amélioration de la résolution telles que la microscopie deconvolution26, la microscopie confocale du disque tournant27, la réaffectation de pixels28, et la microscopie d'éclairage structurée (SIM)29 cherchent à améliorer la résolution de la images acquises par le microscope. Ces méthodes ne sont pas incompatibles avec l'approche présentée. Récemment, cette méthode a été adaptée pour permettre des images basées sur LA carte SIM comme entrées9. Bien que la méthode de convolution vers l'avant partage certains de ses fondements avec la microscopie de convolution, elle a une sortie complètement différente. Alors que des approches telles que la microscopie de déconvolution cherchent à améliorer la résolution de l'image, cette approche ne génère pas une image mais plutôt une reconstruction de forme cellulaire avec une précision d'environ 50 nm. Les techniques de microscopie à commande active à molécule unique basées sur des échantillons peu étiquetés peuvent fournir des niveaux de précision spatiale encore plus élevés que cette méthode. Dans de nombreux cas, ces approches à molécule unique nécessitent l'optimisation des constructions fluorescentes et peuvent nécessiter de longs délais d'acquisition, ce qui les rend difficiles à utiliser avec des échantillons vivants ou dynamiques. Chacune de ces méthodes est livré avec une ou plusieurs mises en garde que cette méthode n'a pas. Par exemple, les avantages annoncés par la microscopie confocale du disque tournant ne s'appliquent pas autant aux monocouches de cellules bactériennes, où il n'y a pas grand-chose de la lumière du plan. En outre, cette méthode fournit un pipeline pour acquérir des formes précises de cellules 3D et la localisation des protéines sans avoir besoin de fluorophores spécialisés. Cette méthode a des exigences matérielles minimales (c.-à-d., z piezo, objectif Élevé de NA) et ne nécessite que des dizaines d'images par point de temps, permettant d'étudier facilement les structures 3D dynamiques6.
Il y a eu un nombre croissant d'approches pour étudier l'organisation des cellules bactériennes dans les structures 3D. Il s'agit notamment d'approches conceptuellement similaires à celle-ci qui tirent parti de haute qualité, images de fluorescence 3D30,31,32. Cette approche nécessite des cellules bien isolées et ne fait aucune hypothèse a priori sur la géométrie cellulaire. Cependant, pour se déplacer dans des agrégats cellulaires denses ou des biofilms, les cellules sont supposées être rod-like. Cette vue de résolution inférieure permet toujours d'étudier les arrangements d'emballage des cellules, bien que la densité élevée des cellules dans le biofilm empêche l'analyse de la localisation subcellulaire des facteurs spécifiques.
À l'avenir, il pourrait être intéressant de développer un cadre pour intégrer la molécule unique et les approches à champ large avec cette technique de reconstruction 3D. En outre, il peut être possible d'inclure cette approche de convolution vers l'avant avec des outils de segmentation de vision de machine32 pour permettre des reconstructions des faisceaux cellulaires plus denses.
Pourquoi les cellules ont évolué en formes spécifiques est une question complexe qui doit refléter l'environnement complexe dans lequel elles vivent. Comprendre l'évolution et la fonction des formes cellulaires nécessite de prendre des mesures précises et précises de ces formes, ce qui est ce que cette méthode fournit.
Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier Jeffrey Nguyen et Joshua Shaevitz d'avoir aidé à développer cette méthode.
Financement: RMM - NIH F32 GM103290-01A1, BPB - Glenn Centers for Aging Research et National Science Foundation PHY-1734030.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 nm fluorescent beads | Invitrogen | F8795 | these are used to measure the blurring function of the microscope |
| Agarose | sigma-Aldrich | A9539 | |
| Cotton Swab | Puritan Medical Products Company LLC | S304659 | used to appy VaLaP |
| Cover Slips | VWR | 16004-302 | |
| Fiji | ImageJ | https://fiji.sc | used to cro cells |
| FM4-64 | Invitrogen | LST3166 | membrane dye used to stain cells |
| Huygens Software | Scientific Volume Imaging | Huygens essential or professional | Use to measure blurring function of microscope |
| Lanolin | Sigma-Aldrich | L7387 | combine with paraffin and petroleum jelly to make VaLaP |
| LB growth medium | BD Difco | DF0446173 | |
| M63 medium | US Biological | M1015 | |
| MATLAB | Mathworks | Needed to run forward convolution scripts | |
| Microscope Slides | Fisher | 12-550-133 | |
| NIS Elements | Nkon | ||
| Paraffin | Sigma-Aldrich | 327212 | |
| Petroleum Jelly | Equate | 49035-038-27 | |
| Piezo z stage | Nikon | 77011589 | |
| Pipet tips -p200 | USA Scientific | 1111-0730 | |
| Pipet tips- p10 | USA Scientific | 1111-3730 |
References
- Young, K. D. The Selective Value of Bacterial Shape. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 70 (3), 660-703 (2006).
- Persat, A., Stone, H. A., Gitai, Z. The Curved Shape of Caulobacter crescentus Enhances Surface Colonization in Flow. Nature Communications. 5, 3824 (2014).
- Nguyen, J. P., Bratton, B. P., Shaevitz, J. W. Bacterial Cell Wall Homeostasis: Methods and Protocols. Hong, H. J. , Springer. New York. 227-245 (2016).
- Bratton, B. P., Shaevitz, J. W., Gitai, Z., Morgenstein, R. M. MreB Polymers and Curvature Localization are Enhanced by RodZ and Predict E. coli's Cylindrical Uniformity. Nature Communications. 9 (1), 2797 (2018).
- Ouzounov, N., et al. MreB Orientation Correlates with Cell Diameter in Escherichia coli. Biophysical Journal. 111 (5), 1035-1043 (2016).
- Morgenstein, R. M., et al. RodZ links MreB to Cell Wall Synthesis to Mediate MreB rotation and Robust Morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences. , 12510-12515 (2015).
- Ursell, T. S., et al. Rod-Like Bacterial Shape is Maintained by Feedback Between Cell Curvature and Cytoskeletal Localization. Proceeding of the National Academy of Science U.S.A. 111 (11), E1025-E1034 (2014).
- Bartlett, T. M., et al. A Periplasmic Polymer Curves Vibrio cholerae and Promotes Pathogenesis. Cell. 168 (1-2), 172-185 (2017).
- Taylor, J. A., et al. Distinct Cytoskeletal Proteins Define Zones of Enhanced Cell Wall Synthesis in Helicobacter pylori. bioRxiv. , 545517 (2019).
- Egan, A. J. F., Vollmer, W. The Physiology of Bacterial Cell Division. Annals of the New York Academy of Science. 1277 (1), 8-28 (2013).
- Adams, D. W., Errington, J. Bacterial Cell Division: Assembly, Maintenance and Disassembly of the Z ring. Nature Reviews Microbiology. 7 (9), 642-653 (2009).
- Werner, J. N., Gitai, Z., Melvin, I. S., Brian, R. C., Alexandrine, C. High-Throughput Screening of Bacterial Protein Localization. Methods in Enzymology. 471, 185-204 (2010).
- de Pedro, M. A., Quintela, J. C., Höltje, J. V., Schwarz, H. Murein Segregation in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 179 (9), 2823-2834 (1997).
- Hussain, S., et al. MreB Filaments Align Along Greatest Principal Membrane Curvature to Orient Cell Wall Synthesis. eLife. 7, e32471 (2018).
- Wong, F., et al. Mechanical Strain Sensing Implicated in Cell Shape Recovery in Escherichia coli. Nature Microbiology. 2, 17115 (2017).
- Wong, F., Garner, E. C., Amir, A. Mechanics and Dynamics of Translocating MreB Filaments on Curved Membranes. eLife. 8, e40472 (2019).
- Quint, D. A., Gopinathan, A., Grason, G. M. Shape Selection of Surface-Bound Helical Filaments: Biopolymers on Curved Membranes. Biophysical Journal. 111 (7), 1575-1585 (2016).
- Colavin, A., Shi, H., Huang, K. C. RodZ Modulates Geometric Localization of the Bacterial Actin MreB to Regulate Cell Shape. Nature Communications. 9 (1), 1280 (2018).
- Valap Sealant. , Cold Spring Harbor Protocols. http://cshprotocols.cshlp.org/content/2015/2/pdb.rec082917 (2015).
- Shannon, C. E. Communication in the Presence of Noise. Proceedings of the IRE. 37 (1), 10-21 (1949).
- Billings, G., et al. De Novo Morphogenesis in L-Forms Via Geometric Control of Cell Growth. Mol Microbiol. 93 (5), 883-896 (2014).
- Sturrman, N. Measuring a Point Spread Function. , iBiology. https://www.ibiology.org/talks/measuring-a-point-spread-function (2012).
- Bratton, B. P., Shaevitz, J. W. Simple Experimental Methods for Determining the Apparent Focal Shift in a Microscope System. PLOS ONE. 10 (8), e0134616 (2015).
- Moerner, W. E., Shechtman, Y., Wang, Q. Single-molecule Spectroscopy and Imaging over the decades. Faraday Discussions. 184, 9-36 (2015).
- Sahl, S. J., Hell, S. W., Jakobs, S. Fluorescence Nanoscopy in Cell Biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18, 685 (2017).
- Sarder, P., Nehorai, A. Deconvolution Methods for 3-D Fluorescence Microscopy Images. IEEE Signal Processing Magazine. 23 (3), 32-45 (2006).
- Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Methods in Cell Biology. Waters, J. C., Wittman, T. 123, Academic Press. 153-175 (2014).
- Huff, J. The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution. Nature Methods. 12, 1205 (2015).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the Lateral Resolution Limit by a Factor of Two Using Structured Illumination Microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Lee, M. K., Rai, P., Williams, J., Twieg, R. J., Moerner, W. E. Small-Molecule Labeling of Live Cell Surfaces for Three-Dimensional Super-Resolution Microscopy. Journal of the American Chemical Society. 136 (40), 14003-14006 (2014).
- Yan, J., Sharo, A. G., Stone, H. A., Wingreen, N. S., Bassler, B. L. Vibrio cholerae Biofilm Growth Program and Architecture Revealed by Single-Cell Live Imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (36), E5337-E5343 (2016).
- Wang, J., et al. Bact-3D: A level set segmentation approach for dense multi-layered 3D bacterial biofilms. 2017 IEEE International Conference on Image Processing (ICIP). , 330-334 (2017).
