Summary
Detta protokoll förklarar hur man förbereder och monterar bakteriella prover för levande tredimensionell avbildning och hur man rekonstruera den tredimensionella formen av E. coli från dessa bilder.
Abstract
Formen på en bakterie är viktig för dess fysiologi. Många aspekter av cellfysiologi såsom cellmotilitet, predation och biofilm produktion kan påverkas av cell formen. Bakterieceller är tredimensionella (3D) objekt, även om de sällan behandlas som sådana. De flesta mikroskopi tekniker resultera i tvådimensionella (2D) bilder som leder till förlust av data som rör den faktiska 3D-cellform och lokalisering av proteiner. Bestämda formar parametrar, liksom Gaussian krökning (produkten av de två främsta krökningar), kan endast mätas i 3D, därför att 2D-avbildar inte mäter båda huvudsakliga kurva. Dessutom, inte alla celler ligga plant när montering och 2D-avbildning av böjda celler kan inte exakt representera formerna av dessa celler. Noggrann mätning av protein lokalisering i 3D kan hjälpa till att bestämma rumslig reglering och funktion av proteiner. En framåt faltning teknik har utvecklats som använder oskärpa funktion mikroskopet att rekonstruera 3D-cellformer och att noggrant lokalisera proteiner. Här beskrivs ett protokoll för beredning och montering av prover för levande cell avbildning av bakterier i 3D både för att rekonstruera en korrekt cell form och för att lokalisera proteiner. Metoden är baserad på enkel provberedning, fluorescerande bild förvärv och MATLAB-baserad bildbehandling. Många högkvalitativa fluorescerande Mikroskop kan enkelt modifieras för att ta dessa mätningar. Dessa cell rekonstruktioner är beräkningsmässigt intensiva och tillgång till stora dataflöden beräkningsresurser rekommenderas, men inte nödvändigt. Denna metod har tillämpats framgångsrikt på flera bakteriearter och mutanter, fluorescerande avbildning modaliteter, och Mikroskop tillverkare.
Introduction
Celler av alla typer reglerar formerna för specifika funktioner. Till exempel, neuroner formas annorlunda än blodkroppar och har olika funktioner. Likaså bakterieceller finns i en mängd olika former och storlekar, även om syftet med dessa former är inte alltid känd1,2. Därför är det viktigt att formen på bakterieceller bestäms exakt. Den metod som beskrivs visar ett enkelt genomfört sätt att samla in data som lämpar sig för 3D-analys av de flesta levande eller fasta bakterieceller.
Metoden som beskrivs gör det möjligt att ta 3D-bilder av bakterieceller för att exakt representera 3D-cellformen av provet och att exakt lokalisera proteiner i dessa former. Traditionella mikroskopi tekniker ta 2D-bilder, vilket är problematiskt när man studerar celler som har onormala eller icke-symmetriska former, såsom mutanter av Escherichia coli, eller böjda bakterier som Vibrio cholerae och Helicobacter pylori. Medan högupplösta 3D-bilder är nyckeln indata till den här metoden, returnerar metoden inte en upplösning bättre bild. I stället rekonstruerar denna metod 3D-ytans koordinater och form av cellen med hjälp av en framåtfaltningsalgoritm med aktiva konturer och den skenbara suddigt funktion av mikroskopet3 (figur 1). Det har använts för att studera den bakteriella aktin homolog mreb i E. coli4,5,6,7, den nya periskeletala elementet crva i V. cholerae8, och den förmodade bactofilin CcmA i Helicobacter pylori9 (figur 2).
Lokaliseringen av proteiner kan ge insikt i deras funktioner. Till exempel, proteiner som är involverade i celldelning är normalt lokaliserade till midcell10,11. Höggenomflödestudier har gjorts för att lokalisera alla proteiner i en bakterie i hopp om att få insikt i deras funktioner12. Tyvärr, dessa studier utfördes med 2D-avbildning och 1D eller 2D-analys, vilket gör det omöjligt att mäta specifika aspekter av protein lokalisering, såsom lokalisering till cellulära geometriska funktioner.
Till exempel, mreb, ett dynamiskt protein som krävs för spö formen av många bakterier, är en hypotes om att arbeta genom att styra lokalisering av cellväggen syntes, och dess lokalisering speglar lokalisering av cellväggsyntes7,13. Mreb från flera arter visar geometrisk berikning4,6,7,14,15. Dynamisk yta polymerer, såsom MreB, kan par geometrin på ytan till den tid som genomsnitt anrikning profil16 och kan orientera sig till specifika geometrier genom att minimera den energi som förknippas med bindning till membranet17. Även om vikten av att vrida, bunta, böja och dynamik inte har lösts helt för MreB, är det viktigt att notera att noggranna mätningar av både huvudsakliga krökningar av en yta kräver en fullständig 3D-representation av cellen. Därför, för att mest exakt mäta krökningar som proteiner lokalisera, är det preferens att använda 3D, snarare än 2D-avbildning. 3D Imaging eliminerar behovet av att beräkningsmässigt uppskatta de krökningar som inte kan mätas i 2D, en uppskattning som kanske inte är korrekt i asymmetriska celler18.
Även 2D-avbildning av celler är snabbare och inte kräver så mycket postimaging Computational arbete, ger 3D-avbildning en mer exakt representation av cellen, samt förmågan att mäta ytan funktioner, såsom krökning, som inte kan mätas i 2D. Eftersom 3D-avbildning blir vanligare kommer därför nya insikter om cell form och protein lokalisering att bli möjliga.
Protocol
1. provberedning
- Gör E. coli fluorescerande för avbildning antingen genom att iscensätta dem för att uttrycka en cytoplasmisk fluorescerande protein6 eller använda ett membran färgämne5. Andra bakteriearter kan användas i stället för E. coli.
- Omvandla celler via elektroporation med en Plasmid som kodar cytoplasmiska mCherry fluorescerande protein.
Anmärkning: Olika fluorescerande proteiner av andra färgar av kan användas. - Odla transformanterna på en LB-platta med lämplig antibiotika vid 37 ° c. Få enstaka kolonier och identifiera positiva kloner genom mikroskopi. Antibiotikaresistenta kolonier som visas röda under mikroskopet innehåller plasmid redovisade mCherry.
- Omvandla celler via elektroporation med en Plasmid som kodar cytoplasmiska mCherry fluorescerande protein.
- Odla 2 mL av natten kulturen i LB flytande media med lämplig antibiotika vid 37 ° c i en skakande inkubator. Använd antingen en koloni från en tallrik eller en liten mängd av en fryslager som inoculum.
Anmärkning: Använd de medier som behövs för de bakterieceller som valts ut för experimentet. - Subkultur natten kultur 1:1000 i 5 mL färskt LB media och låt cellerna växa till exponentiell fas vid 37 ° c i en skakning inkubator för 3 − 4 h. Mät OD600 av cellerna för att bekräfta att de är i exponentiell fas (dvs. , OD600 = 0,2 − 0,4).
Anmärkning: Avbildning kan utföras i alla tillväxtstadier beroende på vilket experiment som utförs.
2. Skjut preparatet
Anmärkning: Det är viktigt att använda media som har låg autofluorescence. Varje medium som har låg autofluorescence kan användas. I detta experiment krävs 1% aguppstod M63 MS minimal Media Pads och tätning med VaLaP19 behövs för att bildceller i 3D.
-
Bered en 1% lösning av aguppstod i 20 mL minimal media.
- Mikrovågsugn lösningen tills aguppstod är helt upplöst och lösningen verkar klar.
- Förvara lösningen i en 60 ° c vattenbad tills den är klar att använda.
Anmärkning: Denna lösning kan stelnat och smältas efter behov eller kan aliciteras i mindre mängder som smälts efter behov. Efter flera användningar medierna kan bli missfärgade och bör bytas ut.
- Smält VaLaP-tätningsmedlet på en värmeplatta vid 80 − 100 ° c.
Anmärkning: Förbered VaLaP, som ska användas som tätningsmedel, genom smältning av 50 g vardera av vaselin, Lanolin och paraffin tillsammans i en bägare på en värmeplatta vid 80 − 100 ° c. Denna stora mängd VaLaP kan lagras i rumstemperatur på obestämd tid och kommer att räcka för > 500 diabilder. Uppvärmning vid > 100 ° c kommer att orsaka att försämra och dess färg kommer att mörkna. - Placera två staplar var och en av 3 20 mm x 20 mm täckband på motsatt ände av en glidbana (sex totala täckglas).
- Pipettera 200 μL av aguppstod pad lösning på bilden.
Anmärkning: Om du inte använder en konstruerad fluorescerande fläck, kan ett membran färgämne läggas till i aguppstod pad lösning innan detta steg. Omsuspendera färgämnet i vatten och tillsätt 1 mL av agandytslösningen till en slutlig koncentration på 5 μg/mL. - Omedelbart och stadigt placera en andra glida ner på bunten av locket glider att platta till agar och låt den stelna i 1 min vid rumstemperatur.
- Skjut försiktigt av den övre bilden.
- Använd den stora änden av en 200 μL pipett spetsen för att skära ut enskilda kuddar från gelen (~ 5 mm i diameter) på bilden och kasta missbildade eller onödiga gel.
Anmärkning: Om avbildning flera stammar eller villkor, en separat pad kommer att behövas för var och en. Om endast en stam ska avbildas, gör 3 − 4 Pads för att hjälpa till att stödja täckslip. - Pipettera celler upp och ner flera gånger för att störa cellklumpar och se till att kulturen är väl blandad. Pipettera över 1 μL subkultur från steg 1,3 till en pad.
Anmärkning: Omkonstruktioner av cell former kräver att enskilda celler inte vidrör andra celler. Om du använder stationär fas eller hög celltäthet kulturer, kan det vara nödvändigt att späda provet 1:10 innan du placerar den på plattan. - Låt provet lufttorka i 5 − 10 min. se till att droppet är helt absorberad i dynan. Om någon vätska återstår, kommer cellerna att flytta runt i vätskan och kan inte avbildas.
- Placera en täckslip på ovansidan av dynorna.
- Försegla täckslip med smält VaLaP genom att försiktigt borsta runt kanten av locket slip med en bomullstuss. Se till att hålla den borta från toppen av locket slip där målet kommer att beröra. VaLaP kommer att hårdna på några sekunder, tätning provet.
- Omedelbart bild provet.
Anmärkning: Provet ska avbildas så snart bilden är förberedd. Cellerna kan växa på kuddar, och om de delar rekonstruktioner kommer att bli svårare.
3. ImagingRequirements
- Se till att z eller fokuserings axel i mikroskopet kan göra exakta rörelser av mindre än 50 nm. Använd z piezo stadier (se tabell över material), finns på forskning grad Mikroskop, eftersom typiska motoriserad fokus enheter inte kan ge denna precision.
Anmärkning: Om man antar Nyquist-Shannon sampling kriterium20, måste man ha förmågan att flytta 0.5 x den minsta önskade steg storlek, eller 2x den önskade rumsliga frekvensen. För de 100 nm-steg som krävs i detta protokoll krävs en fas med en precision på 50 nm eller mindre. -
Se till att mikroskopet innehåller ett 100x mål med en minsta numerisk bländare (NA) på 1,45.
- Samla z-stackar av mellan 200 − 400 olika celler för att säkerställa tillräckligt med celler erhålls för nedströms applikationer.
Anmärkning: Antalet celler som behövs beror på den underliggande variationen i urvalet av intresse. Några av de celler som samlats in vid denna punkt kommer inte att göra det genom återuppbyggnaden steg.
- Samla z-stackar av mellan 200 − 400 olika celler för att säkerställa tillräckligt med celler erhålls för nedströms applikationer.
- Se till att z-stacken matchar de inställningar som används för form kanalen om en sekundär Lysrörs kanal (protein, metabolisk etikett, etc.) mäts.
4. Imaging
- Sätt in den förseglade bilden på mikroskopet och låt den sitta i 5 min för att jämvikt temperaturen med omgivningen, eftersom Mikroskop rummet kan vara vid en annan temperatur än provet förberedelse rummet.
-
Ta en fluorescerande z-stack av provet.
Obs: z-stacken bör helt täcka provet med ett z-avstånd mindre än skärpedjupet. För en 1,45 NA 100x mål och ~ 1 μm tjocka E. coli celler, 40 steg vid 100 nm per steg fungerar bra. För större celler eller celler som inte ligger helt plant på ytan, kan 50 eller fler steg behövas. Inkludera tillräckligt med steg och se till att provet är helt suddig över och under.- Använd programvaran i samband med mikroskopet (se tabell över material) för att styra mikroskopet.
- Fokusera på mitten av cellen med hjälp av Mikroskop fokus hjulen. Under nd förvärv kontrollera z-rutan för att ta en z-stack. Klicka på hem knappen för att ställa in cellens mitt som startpunkt. Ställ in stegstorleken till 0,1 μm och Ställ in intervallet på 4 μm. se till att Z-enheten är inställd på piezo scenen.
- Ställ in de fluorescerande kanalerna under lambda-fönstret till inställningarna för de fluorescerande molekyler som avbildas. I detta experiment användes GFP och mCherry.
Anmärkning: Ta ytterligare en z-stack med samma steg storlek och räckvidd i den andra färgkanalen om 3D-distributionen av en extra Lysrörs kanal önskas. I detta experiment, cytoplasmiska mCherry användes för att bestämma cell form och MreB-GFP användes som en andra färgkanal21. - Se till att ordningsföljden för experimentet är inställd på lambda (z-serien) så att det kommer att ta en komplett z-stack i varje färgkanal innan du växlar.
- Klicka på Kör nu för att starta bilden förvärvet och spara filen flesta en eller båda z-stackar är klar.
- Flytta till ett nytt område på dynan och upprepa steg 4.2.2-4.2.5.
5. cell rekonstruktion
- Beskär enskilda celler och spara bilderna som en staplad TIFF-fil så att det bara finns en cell per fil. Se till att denna cell är väl isolerad från alla andra celler (dvs ungefär 5x hela bredden halv-maximum av oskärpa funktion i XY.
Obs: detta kan göras med hjälp av fritt tillgänglig bildanalysprogram vara (se tabell över material).- Rita en ruta runt en enskild cell och duplicera den cellen 2x, en gång för varje kanal. Kontrollera att kryssrutan duplicera hyperstack är markerad och ändra kanalen till antingen 1 eller 2, och se till att skivorna innehåller hela z-stacken.
Anmärkning: Endast en kanal kommer att förekomma om man bara avbildar cellernas form och inte ett ytterligare fluorescerande protein. - När båda stackarna är tillgängliga gå till bilder | Stackar | Verktyg | Sammanfoga för att kombinera bilderna med protein kanalen först och formen kanal andra.
- Spara den nya bilden som en TIFF-fil.
- Rita en ruta runt en enskild cell och duplicera den cellen 2x, en gång för varje kanal. Kontrollera att kryssrutan duplicera hyperstack är markerad och ändra kanalen till antingen 1 eller 2, och se till att skivorna innehåller hela z-stacken.
- Mät mikroskopet oskärpa funktion med subdiffraktion Limited fluorescerande pärlor22. Detta måste göras för varje Mikroskop och Mikroskop mål men kan utföras före eller efter avbildning av prover av intresse.
- Medel tillsammans flera oberoende pärlor med några manuella ingrepp med hjälp av tillgänglig programvara (se tabell över material).
Anmärkning: Slutprodukten ska vara en 3D-bild av funktionen för oskärpa med samma XYZ-avstånd som intresse exemplen.
- Medel tillsammans flera oberoende pärlor med några manuella ingrepp med hjälp av tillgänglig programvara (se tabell över material).
- Kör den vidarebefordra faltning cell form återuppbyggnads skript med hjälp av tillgänglig programvara. Den senaste versionen av dessa skript kan laddas ner fritt från https://github.com/PrincetonUniversity/shae-cellshape-public.
- Skapa en mapp i en mapp på skrivbordet som innehåller de beskurna bilderna och filen cell_shape_settings_tri. txt från Shae-cellshape-Public/exampleData_tri.
- Redigera cell_shape_setting_tri. txt för att ha rätt inställningar för experimentet av intresse. För det här experimentet innehåller inställningsfilen följande rader:
nm_per_pixel 70
Z_scale 0,65
stack_z_size 41
stack_t_size 1
Fstack_z_size 41
Fstack_t_size 1
stack_seperation_nm 100
Fstack_seperation_nm 100
psfScript-999 osuPSF20180726
lutning 1
Anmärkning: Den här textfilen är uppdelad i avsnitt och varje avsnitt tolkas i sin egen variabel. Även om många av inställningarna inte behöver ändras från experiment till experiment, bör man se till att storleken på z-stacken (stack_z_size för form, Fstack_z_size för protein av intresse), avståndet mellan z-stacken (stack_seperation_ nm, Fstack_seperation_nm), relativ fokusförskjutning av mikroskopet (Z_scale)23, pixelstorleken i XY (nm_per_pixel), och namnet på det skript som laddar mikroskopets oskärpa funktion (psfscript ) matchar experimentet. Övertoningsfältet ska anges till 1 om form kanalen är cytoplasmiskt fylld och 0 om det är ett membran-målat objekt. - Kör funktionen Cell_shape_detector3dConvTriFolder (Shae-cellshape-Public/CellShapeDetectorTri/) med strängen till mappens plats följt av numret på cellen som ska startas och antalet celler som du vill köra.
Anmärkning: Ett exempel för input kommer att se ut så här: Cell_shape_detector3dConvTriFolder (' sökväg till mapp med beskurna bilder ', startIndex i mappen, # av celler). En typisk cell kan ta mellan 5 − 20 minuter för återuppbyggnaden att konvergera och finish.
- Screen cell rekonstruktioner för att säkerställa att de är korrekta innan du använder cellerna för någon statistisk analys.
- Kör Screenfits (Shae-cellshape-Public/Shae-fitViewerGui/) för att visuellt skärmen enskilda cell rekonstruktioner.
- Klicka på knappen Välj mapp när det grafiska användargränssnittet (GUI) öppnas och välj sedan mappen med rekonstrueringsdatafiler (TRI. mat) som skapades i steg 5,3.
- Markera rutan bredvid cell rekonstruktion om en cell verkar missbildade eller inte helt konvergerar (figur 3). Detta kan se ut som en cell med ett hål, en platt sida, eller en gren som kommer ut av det. Detta kommer att lägga till "flagga" till filnamnet så att den kan uteslutas från någon nedströms analys.
Anmärkning: Den rekonstruerade cellen kan jämföras med originalbilderna. Detta kan vara särskilt viktigt om dina celler kommer från en olika heterogena population av former.
- Kör enrichmentSmoothingSpline (Shae-cellshape-public/) för att skapa en berikande profil av den relativa koncentrationen av proteinet av intresse som en funktion av Gaussisk krökning på ytan.
- Välj varje mapp med TRI. mat filer som skapats i steg 5.3.3.
- Välj den nyskapade (5.5.1) Curve. mat-filen.
Anmärkning: En Curve. mat-fil kommer att skapas för varje mapp som valdes i 5.5.1. Alla beriknings profiler kommer att presenteras i ett diagram. Om enskilda grafer krävs än kör 5,5 för varje mapp.
Anmärkning: Förutom den exakta geometriska lokalisering av ett fluorescerande protein, det finns många andra sätt att analysera data från den sekundära kanalen, inklusive räkna antalet, storlek, och orientering av objekt4.
Representative Results
Bakterier kommer i en mängd olika former och storlekar som kan bestämma deras funktioner i naturen1. Resultatet av detta förfarande är en exakt 3D-representation av celler från den främre faltning av en z-stack av bilder (figur 1). Denna metod är särskilt viktig när man arbetar med böjda celler (figur 2), eller med onormalt formade celler (figur 4a), som en 2D-representation inte återspeglar krökning av cellerna korrekt. För att använda den framåt faltning metoden (figur 1A), celler måste vara antingen perifert färgade eller har en cytoplasmisk fläck (figur 2B vänster kontra höger).
Figur 4 visar MreB lokalisering i cellen. En GFP-fusion gjordes till det bakteriella aktin-proteinet mreb21 för att studera dess exakta lokalisering i både vildtyp och Mutant E. coli -celler4. Eftersom MreB är associerat med membranet krävs 3D-avbildning för att troget återge positionen i cellen. Genom att göra dessa mätningar i 3D, kunde vi rekonstruera formerna av både vildtyp och Rodz Mutant celler (figur 4a). Lokaliseringen av MreB visade sig vara berikad vid små Gaussiska krökningar, en geometrisk funktion som bara kan mätas i 3D, i ett RodZ-beroende sätt (figur 4B).
Bild 1: framåt faltningsmetoden rekonstruerar celler utan tidigare kunskaper om cell form. (A) den slutliga produktionen av metoden är en 3D-cell rekonstruktion som härleds genom att jämföra en test form med den kalibrerade oskärpa funktion av mikroskopet. Detta jämförs med den observerade z-stacken tills den observerade 3D-bilden matchar den hypotetiska. Bilden som visas här är en rendering av återuppbyggnaden av en C. crescentus -cell. (B) rekonstruktions ledningen uppdaterar iterativt de uppskattade positionerna för ytelementen baserat på den observerade bildstapeln. För full algoritmisk information om metoden, se Nguyen3. (C) återuppbyggnads ledningen börjar utan a priori kunskap om cellens form och uppdaterar positionen och antalet ythörn för att matcha den observerade z-stacken. Representativa bilder från varje 30 steg under 3D-rekonstruktion visas från tre olika vinklar av en V. cholerae cell. Ytan positionerna för den här formen uppdateras för att minimera skillnaden mellan de simulerade och observerade stackarna. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: representativa 3D-rekonstruktioner av tre olika formade bakteriearter. Tredimensionella rekonstruktioner kan göras från celler med deras membran färgade (vänster) eller fylld med en cytoplasmisk fluorophore (höger). Den form och krökning av startcellen är inte viktigt, som en böjd stav, vriden stav, eller raka spö är alla kunna rekonstrueras korrekt. De rekonstruerade ytorna färgas utifrån den lokala Gaussiska krökningen av ytan. Scale bar = 1 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: rekonstruktioner kan misslyckas av flera anledningar. Celler måste screenas för att säkerställa att återuppbyggnads algoritmen konvergerat till ett rimligt resultat. Left = representativ Wild Type (överst) och Rodz Mutant (Bottom) E. coli -celler som har genomgått kvalitetskontroll. Right = celler som misslyckats med att rekonstruera ordentligt och inte passera kvalitetskontroll. Fem klasser av misslyckad konvergens visas: (i) celler som ligger för nära beskärnings regionens kant och som leder till en skarp avgränsning, (II) celler som är för nära en annan cell, (III) celler som producerade en Divot, (IV) celler som inte gick förbi den initiala s och (v) andra okända fel. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: representativa data som visar protein lokalisering till specifika cellulära geometrier. (A) tredimensionella rekonstruerade celler av vildtyp och Rodz E. coli -celler med Gaussisk krökning och mreb-fluorescensintensitet visas. Skalstapel = 1 μm.Banriknings områden av MreB från vildtyp och Rodz E. coli -celler. Värden > 1 Visa berikning och värden < 1 Visa utarmning av MreB från dessa cellulära regioner i förhållande till en enhetlig täckning av cellen. Skuggade områden indikerar medelvärdet ± 90% bootstrap konfidensintervall för medelvärdet. Kurvan för varje stam är en kubisk utjämning spline och trunkeras med hjälp av en sannolikhet tröskel för extrema krökningar av p > 5 x 10-3. Denna siffra har modifierats från (Bratton et al.) 4. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Ett kritiskt steg i detta protokoll är förvärvet av bilder av hög kvalitet. För att korrekt rekonstruera cellerna måste det finnas tillräckligt med oskärpa över och under cellen. Därför är det viktigt att z-stacken tas täcker ett tillräckligt stort avstånd. Antalet steg som tas under bild anskaffningen kan justeras för varje stam. Till exempel E. coli -celler som tagits bort för Rodz är bredare och kräver fler steg, och därför ett större avstånd, än vilda typ celler. Om provet driver under bild förvärv, kan återuppbyggnaden ha stora fel. Därför är det viktigt att låta bilden komma till termisk jämvikt med mikroskopet före avbildning för att undvika avdrift under z-stacken förvärvet. Celler bör avbildas på kuddar med låg autofluorescence. Media komponenter, såsom de som finns i common LB medium, har autofluorescence som kan orsaka problem när man försöker rekonstruera cellerna. Tätheten av celler på Imaging pad är viktigt eftersom återuppbyggnadsprocessen utförs självständigt på varje cell. För få celler kommer att öka den tid som behövs för att få bilder av ett tillräckligt antal celler, medan alltför många celler kommer att resultera i bild fält som är för täta för att enkelt beskära enskilda celler. Eftersom inte alla celler rekonstruera ordentligt, extra celler bör avbildas under förvärvet steg och alla utgångar bör granskas innan du går vidare med statistisk analys (figur 3).
Många av begränsningarna för denna metod är tekniska. På mikroskopet som ska användas, måste man ha ett mål som har en hög numerisk bländare (typiskt > 1.4), eftersom detta möjliggör optisk snittning på storleks skalan av bakterier. Dessutom måste mikroskopet utrustas med en piezo skede som kan ta små, exakta steg i z-riktning. Dessutom, även om det inte är nödvändigt, tillgång till hög datakapacitet beräkningsresurser för att köra bildanalysprogram vara rekommenderas starkt eftersom det kommer att minska bearbetningstiden att rekonstruera celler.
En begreppsmässig begränsning av metoden är att de korrekta energi skalor för vägning av jämnhet i återuppbyggnaden i förhållande till signal-brus förhållandet av bilderna måste väljas. För att validera ett val av parametrar bör cellernas storlek och form mätas med hjälp av oberoende metoder som transmissionselektronmikroskopi (TEM) eller Atom krafts Mikroskop (AFM). Som ett bevis på princip, 3D rekonstruktioner av celler utfördes antingen på en AFM att testa för z-noggrannhet (< 50 nm) eller på ett TEM rutnät för att testa för XY-noggrannhet (< 30 Nm)3. Ett sådant korrelerat tillvägagångssätt är tidskrävande och kostsamt. Ett enklare tillvägagångssätt kan vara att avbilda standardprover såsom vilda typ celler eller 1 μm sfäriska pärlor. De rekonstruktioners diameter och sfäricitet kan användas för att säkerställa att den storlek och de energi skalor som används i återuppbyggnaden är korrekta.
Detta är inte den enda metod som syftar till att extrahera högupplöst rumslig information från fluorescens mikroskopi bilder. Många översyn artiklar beskriver de senaste framstegen inom området super-resolution mikroskopi24,25. Upplösningsförbättrande tekniker som deconvolution mikroskopi26, spinning disk konfokalmikroskopi27, pixel omställning28, och strukturerad belysningsmikroskopi (SIM)29 sträva efter att förbättra upplösningen av bilder förvärvade av mikroskopet. Dessa metoder är inte oförenliga med den metod som presenteras. Denna metod har nyligen anpassats för att möjliggöra SIM-baserade bilder som ingångar9. Medan Forward faltning metoden delar några av dess underbyggnad med deconvolution mikroskopi, den har en helt annan utgång. Medan metoder som defaltningsmikroskopi försöker förbättra bildens upplösning, genererar denna metod inte en bild utan snarare en cell form rekonstruktion med ungefär 50 nm precision. Single-molekylen Active-Control mikroskopi tekniker baserade på glest märkta prover kan ge ännu högre nivåer av rumslig precision än denna metod. I många fall, dessa enda molekyl metoder kräver optimering av fluorescerande konstruktioner och kan kräva långa förvärvs tider, vilket gör dem svåra att använda med levande eller dynamiska prover. Var och en av dessa metoder levereras med en eller flera varningar som den här metoden inte. Till exempel, de fördelar som annonseras av spinning disk konfokalmikroskopi är inte lika tillämpliga på enskiktslager av bakterieceller, där det inte finns mycket ur planet ljus. Dessutom ger denna metod en pipeline för att förvärva exakta 3D-cellformer och protein lokalisering utan behov av några specialiserade fluoroforer. Denna metod har minimala hårdvarukrav (dvs z piezo, högt NA mål) och kräver bara tiotals bilder per timepoint, vilket gör att man enkelt kan undersöka dynamiska 3D-strukturer6.
Det har skett ett ökande antal metoder för att studera organisationen av bakterieceller i 3D-strukturer. Dessa inkluderar metoder begreppsmässigt liknar detta som utnyttjar hög kvalitet, 3D-fluorescens bilder30,31,32. Detta tillvägagångssätt kräver väl isolerade celler och gör ingen a priori antaganden om cellulära geometri. Men för att flytta in i täta cellulära aggregat eller biofilmer, cellerna antas vara Rod-liknande. Denna lägre upplösning gör det fortfarande möjligt att undersöka förpacknings arrangemang av cellerna, även om den höga densiteten av celler i biofilmen förhindrar analys av den subcellulära lokalisering av specifika faktorer.
I framtiden kan det vara intressant att utveckla en ram för att integrera den enda molekyl och Wide-fält metoder med denna 3D-rekonstruktion teknik. Dessutom kan det vara möjligt att inkludera denna Forward faltning strategi med Machine vision segmentering verktyg32 för att möjliggöra rekonstruktioner av tätare cell kluster.
Varför celler utvecklats till specifika former är ett komplext problem som måste återspegla den komplexa miljö som de lever i. Att förstå cell formernas evolution och funktion kräver noggranna och noggranna mätningar av dessa former, vilket är vad den här metoden ger.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi skulle vilja tacka Jeffrey Nguyen och Joshua Shaevitz för att hjälpa till att utveckla denna metod.
Finansiering: RMM-NIH F32 GM103290-01A1, BPB-Glenn Centers för åldrande forskning och National Science Foundation PHY-1734030.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 nm fluorescent beads | Invitrogen | F8795 | these are used to measure the blurring function of the microscope |
| Agarose | sigma-Aldrich | A9539 | |
| Cotton Swab | Puritan Medical Products Company LLC | S304659 | used to appy VaLaP |
| Cover Slips | VWR | 16004-302 | |
| Fiji | ImageJ | https://fiji.sc | used to cro cells |
| FM4-64 | Invitrogen | LST3166 | membrane dye used to stain cells |
| Huygens Software | Scientific Volume Imaging | Huygens essential or professional | Use to measure blurring function of microscope |
| Lanolin | Sigma-Aldrich | L7387 | combine with paraffin and petroleum jelly to make VaLaP |
| LB growth medium | BD Difco | DF0446173 | |
| M63 medium | US Biological | M1015 | |
| MATLAB | Mathworks | Needed to run forward convolution scripts | |
| Microscope Slides | Fisher | 12-550-133 | |
| NIS Elements | Nkon | ||
| Paraffin | Sigma-Aldrich | 327212 | |
| Petroleum Jelly | Equate | 49035-038-27 | |
| Piezo z stage | Nikon | 77011589 | |
| Pipet tips -p200 | USA Scientific | 1111-0730 | |
| Pipet tips- p10 | USA Scientific | 1111-3730 |
References
- Young, K. D. The Selective Value of Bacterial Shape. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 70 (3), 660-703 (2006).
- Persat, A., Stone, H. A., Gitai, Z. The Curved Shape of Caulobacter crescentus Enhances Surface Colonization in Flow. Nature Communications. 5, 3824 (2014).
- Nguyen, J. P., Bratton, B. P., Shaevitz, J. W. Bacterial Cell Wall Homeostasis: Methods and Protocols. Hong, H. J. , Springer. New York. 227-245 (2016).
- Bratton, B. P., Shaevitz, J. W., Gitai, Z., Morgenstein, R. M. MreB Polymers and Curvature Localization are Enhanced by RodZ and Predict E. coli's Cylindrical Uniformity. Nature Communications. 9 (1), 2797 (2018).
- Ouzounov, N., et al. MreB Orientation Correlates with Cell Diameter in Escherichia coli. Biophysical Journal. 111 (5), 1035-1043 (2016).
- Morgenstein, R. M., et al. RodZ links MreB to Cell Wall Synthesis to Mediate MreB rotation and Robust Morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences. , 12510-12515 (2015).
- Ursell, T. S., et al. Rod-Like Bacterial Shape is Maintained by Feedback Between Cell Curvature and Cytoskeletal Localization. Proceeding of the National Academy of Science U.S.A. 111 (11), E1025-E1034 (2014).
- Bartlett, T. M., et al. A Periplasmic Polymer Curves Vibrio cholerae and Promotes Pathogenesis. Cell. 168 (1-2), 172-185 (2017).
- Taylor, J. A., et al. Distinct Cytoskeletal Proteins Define Zones of Enhanced Cell Wall Synthesis in Helicobacter pylori. bioRxiv. , 545517 (2019).
- Egan, A. J. F., Vollmer, W. The Physiology of Bacterial Cell Division. Annals of the New York Academy of Science. 1277 (1), 8-28 (2013).
- Adams, D. W., Errington, J. Bacterial Cell Division: Assembly, Maintenance and Disassembly of the Z ring. Nature Reviews Microbiology. 7 (9), 642-653 (2009).
- Werner, J. N., Gitai, Z., Melvin, I. S., Brian, R. C., Alexandrine, C. High-Throughput Screening of Bacterial Protein Localization. Methods in Enzymology. 471, 185-204 (2010).
- de Pedro, M. A., Quintela, J. C., Höltje, J. V., Schwarz, H. Murein Segregation in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 179 (9), 2823-2834 (1997).
- Hussain, S., et al. MreB Filaments Align Along Greatest Principal Membrane Curvature to Orient Cell Wall Synthesis. eLife. 7, e32471 (2018).
- Wong, F., et al. Mechanical Strain Sensing Implicated in Cell Shape Recovery in Escherichia coli. Nature Microbiology. 2, 17115 (2017).
- Wong, F., Garner, E. C., Amir, A. Mechanics and Dynamics of Translocating MreB Filaments on Curved Membranes. eLife. 8, e40472 (2019).
- Quint, D. A., Gopinathan, A., Grason, G. M. Shape Selection of Surface-Bound Helical Filaments: Biopolymers on Curved Membranes. Biophysical Journal. 111 (7), 1575-1585 (2016).
- Colavin, A., Shi, H., Huang, K. C. RodZ Modulates Geometric Localization of the Bacterial Actin MreB to Regulate Cell Shape. Nature Communications. 9 (1), 1280 (2018).
- Valap Sealant. , Cold Spring Harbor Protocols. http://cshprotocols.cshlp.org/content/2015/2/pdb.rec082917 (2015).
- Shannon, C. E. Communication in the Presence of Noise. Proceedings of the IRE. 37 (1), 10-21 (1949).
- Billings, G., et al. De Novo Morphogenesis in L-Forms Via Geometric Control of Cell Growth. Mol Microbiol. 93 (5), 883-896 (2014).
- Sturrman, N. Measuring a Point Spread Function. , iBiology. https://www.ibiology.org/talks/measuring-a-point-spread-function (2012).
- Bratton, B. P., Shaevitz, J. W. Simple Experimental Methods for Determining the Apparent Focal Shift in a Microscope System. PLOS ONE. 10 (8), e0134616 (2015).
- Moerner, W. E., Shechtman, Y., Wang, Q. Single-molecule Spectroscopy and Imaging over the decades. Faraday Discussions. 184, 9-36 (2015).
- Sahl, S. J., Hell, S. W., Jakobs, S. Fluorescence Nanoscopy in Cell Biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18, 685 (2017).
- Sarder, P., Nehorai, A. Deconvolution Methods for 3-D Fluorescence Microscopy Images. IEEE Signal Processing Magazine. 23 (3), 32-45 (2006).
- Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Methods in Cell Biology. Waters, J. C., Wittman, T. 123, Academic Press. 153-175 (2014).
- Huff, J. The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution. Nature Methods. 12, 1205 (2015).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the Lateral Resolution Limit by a Factor of Two Using Structured Illumination Microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Lee, M. K., Rai, P., Williams, J., Twieg, R. J., Moerner, W. E. Small-Molecule Labeling of Live Cell Surfaces for Three-Dimensional Super-Resolution Microscopy. Journal of the American Chemical Society. 136 (40), 14003-14006 (2014).
- Yan, J., Sharo, A. G., Stone, H. A., Wingreen, N. S., Bassler, B. L. Vibrio cholerae Biofilm Growth Program and Architecture Revealed by Single-Cell Live Imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (36), E5337-E5343 (2016).
- Wang, J., et al. Bact-3D: A level set segmentation approach for dense multi-layered 3D bacterial biofilms. 2017 IEEE International Conference on Image Processing (ICIP). , 330-334 (2017).
