Summary
Denne protokol forklarer, hvordan man forbereder og monterer bakterielle prøver til levende tredimensionel billeddannelse, og hvordan man rekonstruerer den tredimensionale form af E. coli fra disse billeder.
Abstract
Formen af en bakterie er vigtig for sin fysiologi. Mange aspekter af celle fysiologi såsom celle motilitet, prædation, og biofilm produktion kan påvirkes af celle form. Bakterieceller er tredimensionale (3D) objekter, selv om de sjældent behandles som sådan. De fleste mikroskopi teknikker resulterer i to-dimensionelle (2D) billeder, hvilket fører til tab af data vedrørende den faktiske 3D-celle form og lokalisering af proteiner. Visse form parametre, såsom gaussiske krumning (produktet af de to vigtigste curvatures), kan kun måles i 3D, fordi 2D-billeder ikke måler både primære curvatures. Desuden ligger ikke alle celler fladt, når montering og 2D-billeddannelse af buede celler ikke kan repræsentere disse cellers former nøjagtigt. Præcis måling af protein lokalisering i 3D kan hjælpe med at bestemme den fysiske regulering og funktion af proteiner. Der er udviklet en Forward konvolution-teknik, som bruger mikroskopens udviskning til at rekonstruere 3D-celle former og til nøjagtigt at lokalisere proteiner. Her beskrives en protokol til klargøring og montering af prøver til levende celle billeder af bakterier i 3D både for at rekonstruere en nøjagtig celle form og for at lokalisere proteiner. Metoden er baseret på simpel prøveforberedelse, fluorescerende billed erhvervelse og MATLAB-baseret billedbehandling. Mange højkvalitets fluorescerende mikroskoper kan simpelthen ændres til at tage disse målinger. Disse celle rekonstruktioner er beregningsmæssigt intensive, og det anbefales at få adgang til beregningsressourcer med høj dataoverførselshastighed, selvom det ikke er nødvendigt. Denne metode er blevet anvendt med succes på flere bakteriearter og mutanter, fluorescerende billedbehandlings metoder, og mikroskop fabrikanter.
Introduction
Celler af alle typer regulerer deres former for specifikke funktioner. For eksempel er neuroner formet anderledes end blodlegemer og har forskellige funktioner. Tilsvarende bakterieceller kommer i en række forskellige former og størrelser, selv om formålet med disse former ikke altid er kendt1,2. Derfor er det vigtigt, at formen af bakterieceller bestemmes nøjagtigt. Den beskrevne metode viser en let implementeret måde at indsamle data egnet til 3D-analyse af de fleste levende eller faste bakterieceller.
Den beskrevne metode gør det muligt for en at tage 3D-billeder af bakterieceller for præcist at repræsentere den 3D-celle form af prøven og til præcist at lokalisere proteiner inden for disse former. Traditionelle mikroskopi teknikker tage 2D billeder, hvilket er problematisk, når man studerer celler, der har unormale eller ikke-symmetriske former, såsom mutanter af Escherichia coli, eller buede bakterier såsom Vibrio cholerae og Helicobacter pylori. Mens 3D-billeder med høj opløsning er det vigtigste input til denne metode, returnerer metoden ikke et billede med forbedret opløsning. Snarere, denne metode rekonstruer 3D-overflade koordinater og form af cellen ved hjælp af en Forward konvolution algoritme ved hjælp af aktive konturer og den tilsyneladende sløring funktion af mikroskop3 (figur 1). Det er blevet brugt til at studere den bakterielle actin ligner MREB i E. coli4,5,6,7, romanen periskelet element crva i V. cholerae8, og den formodede bactofilin CcmA i Helicobacter pylori9 (figur 2).
Lokalisering af proteiner kan give indsigt i deres funktioner. For eksempel er proteiner, der er involveret i celledeling, normalt lokaliseret til midcell10,11. High-gennemløb undersøgelser er blevet foretaget for at lokalisere alle proteinerne i en bakterie i håb om at få indsigt i deres funktioner12. Desværre blev disse undersøgelser udført med 2D Imaging og 1D eller 2D analyse, hvilket gør det umuligt at måle specifikke aspekter af protein lokalisering, såsom lokalisering til cellulære geometriske funktioner.
For eksempel, MREB, et dynamisk protein, der kræves for stang form af mange bakterier, er en hypotese at arbejde ved at dirigere lokalisering af cellevæg syntese, og dens lokalisering spejle lokalisering af cellevæg syntese7,13. MREB fra flere arter viser geometrisk berigelse4,6,7,14,15. Dynamiske overflade polymerer, såsom MreB, kan par geometrien af overfladen til den tid gennemsnitlige berigelse profil16 og kan være i stand til at orientere til specifikke geometrier ved at minimere den energi, der er forbundet med binding til membranen17. Mens vigtigheden af at vride, pakke, bøje og dynamik ikke er blevet helt løst for MreB, er det vigtigt at bemærke, at nøjagtige målinger af begge primære krumninger af en overflade kræver en fuld 3D-repræsentation af cellen. Derfor, at mest præcist måle krumninger, som proteiner lokalisere, er det præferentiel at bruge 3D, snarere end 2D Imaging. 3D imaging eliminerer behovet for beregningsmæssigt anslå disse krumninger, som ikke kan måles i 2D, et skøn, der måske ikke er nøjagtige i asymmetriske celler18.
Selvom 2D billeddannelse af celler er hurtigere og ikke kræver så meget postimaging beregningsmæssige arbejde, 3D imaging giver en mere præcis gengivelse af cellen, samt evnen til at måle overflade funktioner, såsom krumning, som ikke kan måles i 2D. Derfor, som 3D imaging bliver mere hverdagskost, ny indsigt i celle form og protein lokalisering vil blive muligt.
Protocol
1. forberedelse af prøver
- Gør E. coli fluorescerende til Imaging enten ved at Engineering dem til at udtrykke en cytoplasmisk fluorescerende protein6 eller ved hjælp af en membran farvestof5. Andre bakteriearter kan anvendes i stedet for E. coli.
- Omdanne celler via elektro poration med en plasmid, der koder cytoplasmatiske mCherry fluorescerende protein.
Bemærk: Forskellige fluorescerende proteiner af andre farver kan anvendes. - Vækst transformanterne på en LB-plade med det relevante antibiotikum ved 37 °C. Opnå enkelt kolonier og identificere positive kloner ved mikroskopi. Antibiotikaresistente kolonier, der vises rødt under mikroskopet, indeholder plasmid-Bærmkirsebær.
- Omdanne celler via elektro poration med en plasmid, der koder cytoplasmatiske mCherry fluorescerende protein.
- Vokse 2 mL af natten kultur i LB flydende medier med passende antibiotika ved 37 °C i en ryste inkubator. Brug enten en koloni fra en tallerken eller en lille mængde af en fryser bestand som inoculum.
Bemærk: Brug de nødvendige medier til de bakterieceller, som er valgt til eksperimentet. - Subkultur natten kultur 1:1000 i 5 mL friske LB medier og lad cellerne vokse til eksponentiel fase ved 37 °C i en ryste inkubator for 3 − 4 h. mål OD600 af cellerne for at bekræfte, at de er i eksponentiel fase (dvs. , OD600 = 0,2 − 0,4).
Bemærk: Billeddannelse kan udføres i enhver vækstfase afhængigt af det eksperiment, der udføres.
2. klargøring af slide
Bemærk: Det er vigtigt at bruge medier med lav Auto luorescens. Ethvert medium, der har lav Auto luorescens kan anvendes. I dette eksperiment, 1% agopstået M63 minimal medie puder og forsegling med VaLaP19 er forpligtet til at billed celler i 3D.
-
Forbered en 1% opløsning af agopstået i 20 mL minimalt medie.
- Mikrobølge opløsningen indtil agoptet er helt opløst, og opløsningen synes klar.
- Opløsningen opbevares i et 60 °C-vandbad, indtil den er klar til brug.
Bemærk: Denne løsning kan størres og smeltes efter behov eller kan aliciteres i mindre mængder, der smeltes efter behov. Efter flere anvendelser kan mediet blive misfarvet og bør udskiftes.
- Smelt VaLaP fugemasse på en kogeplade ved 80 − 100 °C.
Bemærk: Forbered VaLaP, der skal anvendes som fugemasse, ved at smelte 50 g hver af petroleumsgelé, lanolin og paraffin sammen i et bægerglas på en kogeplade ved 80 − 100 °C. Denne store mængde af VaLaP kan opbevares ved stuetemperatur på ubestemt tid og vil være nok til > 500 dias. Opvarmning ved > 100 °C vil få den til at nedbrydes, og dens farve vil blive mørkere. - Placer to stakke hver af 3 20 mm x 20 mm Cover glider på de modsatte ender af et dias (seks samlede dæksedler).
- Pipetten 200 μL agrose pad-opløsning på sliden.
Bemærk: Hvis der ikke anvendes en konstrueret fluorescerende bejdsning, kan et membran farvestof tilsættes til agrose pad-opløsningen før dette trin. Resuspendér farvestoffet i vand og tilsæt farvestof til 1 mL af agrose pad-opløsningen til en slutkoncentration på 5 μg/mL. - Straks og fastsætte en anden glide ned på stakken af dække glider at flade agar og lad det størkne i 1 min ved stuetemperatur.
- Skub forsigtigt den øverste slide af.
- Brug den store ende af en 200 μL pipettespids til at klippe de enkelte puder ud af gelen (~ 5 mm i diameter) på sliden og kassere misdannede eller ikke-nødvendige gel.
Bemærk: Hvis billeddannelse flere stammer eller betingelser, en separat pad vil være nødvendig for hver enkelt. Hvis kun én stamme skal imældes, skal du lave 3 − 4 puder for at hjælpe med at understøtte dæksedlen. - Pipette cellerne op og ned flere gange for at forstyrre celle klumper og sikre, at kulturen er godt blandet. Der afpipetteres 1 μL subkultur fra trin 1,3 på en pude.
Bemærk: Rekonstruktioner af celle figurer kræver individuelle celler, der ikke rører ved andre celler. Hvis du bruger stationære fase eller høj celletæthed kulturer, kan det være nødvendigt at fortynde prøven 1:10 før placere den på puden. - Lad prøve luften tørre i 5 − 10 minutter. Sørg for, at dråben er helt absorberet i puden. Hvis der er væske tilbage, vil cellerne bevæge sig rundt i væsken og kan ikke imælges.
- Anbring en cover seddel på toppen af puderne.
- Forsegl dæksedlen med smeltet VaLaP ved forsigtigt at børste rundt om kanten af dæksedlen med en vatpind. Sørg for at holde det væk fra toppen af dækslet slip, hvor målet vil røre. Den VaLaP vil hærde i løbet af få sekunder, forsegling prøven.
- Straks billedet prøven.
Bemærk: Prøven skal være inddelt, så snart diaset er forberedt. Cellerne kan vokse på puderne, og hvis de deler rekonstruktioner vil være vanskeligere.
3. ImagingRequirements
- Sørg for, at z-eller fokuserings aksen i mikroskop kan foretage præcise bevægelser på mindre end 50 nm. Brug z piezo etaper (Se tabel over materialer), tilgængelig på forskning grade mikroskoper, fordi typiske motoriserede fokus enheder ikke er i stand til at give denne præcision.
Bemærk: Forudsat at Nyquist-Shannon sampling kriterium20, man har brug for at have evnen til at flytte 0,5 x den mindste ønskede trin størrelse, eller 2x den ønskede rumlige frekvens. For de 100 nm-trin, der er nødvendige i denne protokol, kræves en fase med en præcision på 50 nm eller derunder. -
Sørg for, at mikroskopet indeholder et 100x mål med et minimum numerisk blænde (NA) på 1,45.
- Saml z-stakke af mellem 200 − 400 forskellige celler for at sikre, at der opnås nok celler til downstream-applikationer.
Bemærk: Antallet af celler, der skal bruges, afhænger af den underliggende variabilitet af stikprøven af interesse. Nogle af de celler, der indsamles på dette tidspunkt, vil ikke gøre det gennem genopbygningen trin.
- Saml z-stakke af mellem 200 − 400 forskellige celler for at sikre, at der opnås nok celler til downstream-applikationer.
- Sørg for, at z-stakken svarer til de indstillinger, der bruges til Shape-kanalen, hvis der måles en sekundær fluorescerende kanal (protein, metabolisk etiket osv.).
4. billeddannelse
- Indsæt den forseglede glide på mikroskopet og lad den sidde i 5 min for at ækvibrere temperaturen med omgivelserne, fordi mikroskopet rummet kan være ved en anden temperatur end prøve forberedelses lokalet.
-
Tag en fluorescerende z-stak af prøven.
Bemærk: z-stakken bør helt dække prøven med en z-afstand mindre end dybden af feltet. For en 1,45 NA 100x mål og ~ 1 μm tykke E. coli celler, 40 trin på 100 nm per skridt arbejde godt. For større celler eller celler, der ikke ligger helt fladt på overfladen, kan 50 eller flere trin være nødvendige. Medtag nok trin og sørg for, at prøven er helt sløret over og under.- Brug den software, der er knyttet til mikroskopet (Se tabel over materialer) til at kontrollere mikroskopet.
- Fokuser på midten af cellen ved hjælp af mikroskop fokus hjulene. Under nd erhvervelse kontrollere z boksen for at tage en z-stak. Klik på knappen hjem for at indstille midten af cellen som udgangspunkt. Indstil trin størrelsen til 0,1 μm, og Indstil intervallet til 4 μm. Sørg for, at Z-enheden er indstillet til piezo-stadiet.
- Indstil de fluorescerende kanaler under lambda-vinduet til indstillingerne for de fluorescerende molekyler, der er imaged. I dette eksperiment blev GFP og mCherry anvendt.
Bemærk: Tag en ekstra z-stack med samme trin størrelse og rækkevidde i den anden farvekanal, hvis 3D-fordelingen af en ekstra fluorescerende kanal ønskes. I dette eksperiment, cytoplasmisk mCherry blev brugt til at bestemme celle form og MreB-GFP blev brugt som en anden farvekanal21. - Sørg for, at rækkefølgen af eksperimentet er indstillet til lambda (z-serien), så det vil tage en komplet z-stak i hver farvekanal, før du skifter.
- Klik Kør nu for at starte billedet erhvervelse og gemme filen og en eller begge z-stakke er fuldført.
- Flyt til et nyt område på puden, og Gentag trin 4.2.2-4.2.5.
5. celle rekonstruktion
- Beskær individuelle celler, og Gem billederne som en stablet TIFF-fil, så der kun er én celle pr. fil. Sørg for, at denne celle er godt isoleret fra andre celler (dvs. groft 5x den fulde bredde halvt maksimum af sløret funktion i XY.
Bemærk: dette kan gøres ved hjælp af frit tilgængelige billedanalyse software (Se tabel over materialer).- Tegn en boks omkring en enkelt celle, og Dupliker cellen 2x, én gang for hver kanal. Sørg for, at feltet Dupliker hyperstack er markeret, og Skift kanalen til enten 1 eller 2, og sørg for, at udsnittene indeholder hele z-stakken.
Bemærk: Hvis billeddannelse kun formen af cellerne og ikke et ekstra fluorescerende protein, kun én kanal vil være til stede. - Når begge stakke er tilgængelige gå til billeder | Stakke | Værktøjer | Sammenkæde for at kombinere billederne med protein kanalen først og Shape Channel sekund.
- Gem det nye billede som en TIFF-fil.
- Tegn en boks omkring en enkelt celle, og Dupliker cellen 2x, én gang for hver kanal. Sørg for, at feltet Dupliker hyperstack er markeret, og Skift kanalen til enten 1 eller 2, og sørg for, at udsnittene indeholder hele z-stakken.
- Mål sløret funktion af mikroskopet ved hjælp af subdiffraktion begrænset fluorescerende perler22. Dette skal gøres for hvert mikroskop og mikroskopet mål, men kan udføres før eller efter Imaging prøverne af interesse.
- Gennemsnit sammen flere uafhængige perler med nogle manuelle indgreb ved hjælp af tilgængelige software (Se tabel over materialer).
Bemærk: Det endelige produkt skal være et 3D-billede af sløret funktion med samme XYZ-afstand som de prøver af interesse.
- Gennemsnit sammen flere uafhængige perler med nogle manuelle indgreb ved hjælp af tilgængelige software (Se tabel over materialer).
- Køre Forward konvolution celle Shape genopbygning scripts ved hjælp af tilgængelige software. Den seneste version af disse scripts kan downloades frit fra https://github.com/PrincetonUniversity/shae-cellshape-public.
- Lav en mappe i en mappe på skrivebordet, der indeholder de beskårne billeder og filen cell_shape_settings_tri. txt fra Shae-cellshape-Public/exampleData_tri.
- Rediger cell_shape_setting_tri. txt for at have de korrekte indstillinger for forsøget af interesse. I forbindelse med dette eksperiment indeholder indstillingsfilen følgende linjer:
nm_per_pixel 70
Z_scale 0,65
stack_z_size 41
stack_t_size 1
Fstack_z_size 41
Fstack_t_size 1
stack_seperation_nm 100
Fstack_seperation_nm 100
psfScript-999 osuPSF20180726
gradient 1
Bemærk: Denne tekstfil er organiseret i sektioner, og hver sektion parses i sin egen variabel. Mens mange af indstillingerne ikke behøver at blive ændret fra eksperiment til eksperiment, bør man sørge for, at størrelsen af z-stakken (stack_z_size for form, Fstack_z_size for protein af interesse), afstanden af z-stakken (stack_seperation_ nm, Fstack_seperation_nm), relativ fokal forskydning af mikroskopet (Z_scale)23, pixelstørrelsen i XY (nm_per_pixel) og navnet på det script, der indlæser mikroskopens udviskning (psfscript ) matche eksperimentet. Forløbs feltet skal indstilles til 1, hvis form kanalen er cytoplasmatisk udfyldt og 0, hvis den er en membran farvet genstand. - Kør Cell_shape_detector3dConvTriFolder -funktion (Shae-cellshape-Public/CellShapeDetectorTri/) med strengen til mappens placering efterfulgt af nummeret på den celle, du vil starte på, og det antal celler, du ønsker at køre.
Bemærk: Et eksempel på input vil se ud som følger: Cell_shape_detector3dConvTriFolder (' sti til mappe med beskårne billeder ', start indeks i mappe, # af celler). En typisk celle kan tage mellem 5 − 20 min for genopbygningen at konvergere og finish.
- Screene celle rekonstruktioner for at sikre, at de er korrekte, før du bruger cellerne til enhver statistisk analyse.
- Kør Screenfits (Shae-cellshape-Public/Shae-fitViewerGui/) for visuelt at screene individuelle celle rekonstruktioner.
- Klik på knappen Vælg mappe, når den grafiske brugergrænseflade (GUI) åbnes, og vælg derefter mappen med de genopbygnings datafiler (TRI. mat), som blev oprettet i trin 5,3.
- Markér afkrydsningsfeltet ud for celle genopbygningen, hvis en celle vises forkert eller ikke er fuldt konvergerer (figur 3). Dette kunne ligne en celle med et hul, en flad side, eller en gren, der kommer ud af det. Dette vil tilføje 'flag' til filnavnet, så det kan udelukkes fra enhver downstream-analyse.
Bemærk: Den rekonstruerede celle kan sammenlignes med de originale billeder. Dette kan især være vigtigt, hvis dine celler kommer fra en forskellig heterogene population af former.
- Run Berimentsmoothingspline (Shae-cellshape-public/) at skabe en berigelse profil af den relative koncentration af det protein af interesse som en funktion af Gaussian krumning på overfladen.
- Vælg hver mappe med TRI. mat filer oprettet i trin 5.3.3.
- Vælg den nyoprettede (5.5.1) Curve. mat-fil.
Bemærk: En Curve. mat-fil vil blive oprettet for hver mappe, der blev valgt i 5.5.1. Alle berigelses profilerne vil blive præsenteret på én graf. Hvis der kræves individuelle grafer end Kør 5,5 for hver mappe.
Bemærk: Ud over den præcise geometriske lokalisering af et fluorescerende protein er der mange andre måder at analysere dataene fra den sekundære kanal, herunder tælle antallet, størrelsen og retningen af objekter4.
Representative Results
Bakterier kommer i en bred vifte af former og størrelser, der kan bestemme deres funktioner i naturen1. Resultatet af denne procedure er en nøjagtig 3D-repræsentation af celler fra den fremadgående konvolution af en z-stak af billeder (figur 1). Denne metode er især vigtigt, når der beskæftiger sig med buede celler (figur 2), eller med unormalt formede celler (figur 4A), som en 2D repræsentation ikke afspejler krumningen af cellerne præcist. For at kunne anvende Forward konvolution-metoden (figur 1A) skal cellerne enten være perifert farvede eller have en cytoplasmisk plet (figur 2B venstre vs. højre).
Figur 4 viser MREB-lokalisering i cellen. En GFP fusion blev foretaget til bakteriel actin protein MreB21 for at studere sin præcise lokalisering i både vildtype og mutant E. coli celler4. Da MreB er forbundet med membranen, kræves 3D-billeddannelse for at gengive sin position i cellen trofast. Ved at foretage disse målinger i 3D var vi i stand til at rekonstruere figurerne af både vildtype og Rodz mutant celler (figur 4A). Lokalisering af MreB blev vist at være beriget ved små gaussiske curvatures, en geometrisk funktion, der kun kan måles i 3D, på en RodZ-afhængig måde (figur 4B).
Figur 1: Forward konvolution-metoden rekonstruer celler uden forudgående kendskab til celle form. (A) den endelige udgang af metoden er en 3D-celle rekonstruktion afledt ved at sammenligne en test form med den kalibrerede sløring funktion af mikroskopet. Dette sammenlignes med den observerede z-stak, indtil det observerede 3D-billede matcher det hypotetiske. Det viste billede er en gengivelse af genopbygningen af en C. crescentus -celle. (B) genopbygnings rørledningen opdaterer iterativt de anslåede positioner af overflade elementerne baseret på den observerede billedstak. For fuld algoritmisk information om metoden, se Nguyen3. (C) genopbygnings rørledningen starter uden forudgående kendskab til cellens form og opdaterer positionen og antallet af overflade knuderne, så den svarer til den observerede z-stak. Repræsentative billeder fra hver 30 trin under 3D-genopbygningen vises fra tre forskellige vinkler af en V. cholerae -celle. Overflade positionerne for denne figur opdateres for at minimere forskellen mellem de simulerede og observerede stakke. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: repræsentative 3D rekonstruktioner af tre forskellige formede bakteriearter. Tredimensionale rekonstruktioner kan laves af celler med deres membran farvede (venstre) eller fyldt med en cytoplasmisk fluoroforet (højre). Den form og krumning af startcellen er ikke vigtigt, som en bøjet stang, snoet stang, eller lige stang er alle i stand til at blive præcist rekonstrueret. De rekonstruerede flader er farvet baseret på den lokale Gaussian krumning af overfladen. Skala bjælke = 1 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: rekonstruktioner kan mislykkes af flere årsager. Cellerne skal screenes for at sikre, at genopbygnings algoritmen konvergeres til et fornuftigt resultat. Venstre = repræsentativ vildtype (top) og Rodz mutant (nederst) E. coli -celler, der har bestået kvalitetskontrol. Right = celler, der ikke rekonstruere korrekt og ikke bestået kvalitetskontrol. Fem klasser af mislykket konvergens vises: (i) celler, der er for tæt på kanten af beskæringsområdet, hvilket fører til en skarp afgrænsning, (II) celler, der er for tæt på en anden celle, (III) celler, der producerede en Divot, (IV) celler, der ikke gik videre forbi den oprindelige s punkt, og (v) andre ukendte fejl. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: repræsentative data, der viser protein lokalisering til specifikke cellulære geometrier. A) tredimensionale rekonstruerede celler af vildtype og Rodz E. coli -celler med Gaussian-krumning og MREB-fluorescens intensitet vist. Scale bar = 1 μm.B) berignings parceller med MREB fra vildtype og Rodz E. coli -celler. Værdier > 1 viser berigelse og værdier < 1 viser udtømning af MreB fra disse cellulære regioner i forhold til ensartet dækning af cellen. Skraverede områder indikerer middelværdien ± 90% bootstrap konfidensinterval for middelværdien. Kurven for hver stamme er en kubisk udjævning spline og afkortes ved hjælp af en Sandsynligheds tærskel for ekstreme krumninger af p > 5 x 10-3. Dette tal er blevet ændret fra (Bratton et al.) 4. Klik venligst her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Et kritisk skridt i denne protokol er erhvervelsen af billeder af høj kvalitet. For at rekonstruere cellerne korrekt skal der være nok sløring over og under cellen. Derfor er det bydende nødvendigt, at z-stakken taget dækker en stor nok afstand. Antallet af trin, der er taget under billed anskaffelsen, kan justeres for hver stamme. For eksempel, E. coli celler slettet for Rodz er bredere og kræver flere trin, og derfor en større afstand, end Wild type celler. Hvis eksemplet driver under billed anskaffelse, kan genopbygningen have store fejl. Derfor er det vigtigt at lade diaset komme til termisk ligevægt med mikroskopet før billeddannelse for at undgå drift under z-stack erhvervelse. Celler skal indrettes på puder med lav Auto luorescens. Mediekomponenter som dem, der findes i det fælles LB-medium, har Autofilter, der kan give problemer, når de forsøger at rekonstruere cellerne. Tætheden af celler på billed blokken er vigtig, fordi genopbygningsprocessen udføres uafhængigt på hver celle. For få celler vil øge den tid, det kræver at få billeder af et tilstrækkeligt antal celler, mens for mange celler vil resultere i billedbehandlings felter, der er for tætte til nemt at beskære individuelle celler. Da ikke alle celler rekonstruerer korrekt, bør ekstra celler imældes under anskaffelses trinnet, og alle udgange bør screenes, før de bevæger sig fremad med statistisk analyse (figur 3).
Mange af begrænsningerne for denne metode er tekniske. På mikroskopet, der skal anvendes, skal man have et mål, som har en høj numerisk blænde (typisk > 1.4), fordi dette muliggør optisk skæring på størrelsesskalaen af bakterier. Desuden mikroskop skal udstyres med en piezo fase, der kan tage små, præcise trin i z-retningen. Desuden, selv om det ikke er nødvendigt, adgang til high-gennemløb beregningsmæssige ressourcer til at køre billedanalyse software er stærkt anbefales, fordi det vil reducere behandlingstiden til at rekonstruere celler.
En begrebsmæssig begrænsning til metoden er, at den korrekte energi skalaer til vægtning af glathed af genopbygningen i forhold til signal-til-støj-forholdet af billederne skal vælges. For at validere et valg af parametre, skal størrelserne og formerne af celler måles ved hjælp af uafhængige metoder såsom transmission elektronmikroskopi (tem) eller atomic force mikroskopi (AFM). Som et princip bevis blev 3D-rekonstruktioner af celler udført enten på en AFM for at teste for z-nøjagtighed (< 50 nm) eller på et TEM-net for at teste for XY-nøjagtighed (< 30 nm)3. En sådan korreleret tilgang er tidskrævende og bekostelig. En enklere tilgang kan være at billed standard prøver såsom vildtype celler eller 1 μm sfæriske perler. Rekonstruktions diameteren og sfæiciteten kan anvendes til at sikre, at den størrelse og de energi skalaer, der anvendes i genopbygningen, er korrekte.
Dette er ikke den eneste metode, der søger at udtrække høj opløsning rumlige oplysninger fra fluorescens mikroskopi billeder. Mange review artikler beskriver de seneste fremskridt inden for Super-resolution mikroskopi24,25. Opløsnings fremmende teknikker såsom dekoncentrering mikroskopi26, spinning disk confokal mikroskopi27, pixel gentildeling28, og struktureret belysning mikroskopi (SIM)29 søger at forbedre opløsningen af billeder, som mikroskop har erhvervet. Disse metoder er ikke uforenelige med den fremlagte fremgangsmåde. For nylig blev denne metode tilpasset til at tillade SIM-baserede billeder som indgange9. Mens Forward konvolution-metoden deler nogle af dens funda heder med devolution mikroskopi, har den en helt anden udgang. Der henviser til, at tilgange såsom dekoncentrering mikroskopi søger at forbedre opløsningen af billedet, denne fremgangsmåde ikke genererer et billede, men snarere en celle form rekonstruktion med groft 50 nm præcision. Single-molekyle aktiv-Control mikroskopi teknikker baseret på tyndt mærkede prøver kan give endnu højere niveauer af rumlig præcision end denne metode. I mange tilfælde, disse enkelt molekyle tilgange kræver optimering af fluorescerende konstruktioner og kan kræve lange anskaffelses tider, hvilket gør dem vanskelige at bruge med levende eller dynamiske prøver. Hver af disse metoder kommer med en eller flere forbehold, at denne metode ikke. For eksempel, de fordele annonceret ved spinning disk confokal mikroskopi er ikke så anvendelig på monolag af bakterieceller, hvor der ikke er meget ud af flyet lys. Desuden giver denne metode en rørledning til at erhverve nøjagtige 3D-celle former og protein lokalisering uden behov for nogen specialiserede fluorophorer. Denne metode har minimal hardwarekrav (dvs., z piezo, høj NA mål) og kræver kun snesevis af billeder per tidspunkt, så man let kan undersøge dynamiske 3D-strukturer6.
Der har været et stigende antal tilgange til at studere organiseringen af bakterieceller i 3D-strukturer. Disse omfatter tilgange begrebsmæssigt ligner dette, at drage fordel af høj kvalitet, 3D fluorescensbilleder30,31,32. Denne fremgangsmåde kræver godt isolerede celler og gør ingen priori antagelser om cellulære geometri. Men for at bevæge sig ind i tætte cellulære aggregater eller biofilms, antages cellerne at være stang lignende. Denne visning med lavere opløsning gør det stadig muligt at undersøge paknings ordninger for cellerne, selv om den høje densitet af celler i biofilm forhindrer analyse af den subcellulære lokalisering af specifikke faktorer.
I fremtiden kan det være interessant at udvikle en ramme for at integrere det enkelte molekyle og brede felt tilgange med denne 3D-genopbygnings teknik. Desuden kan det være muligt at inkludere denne Forward konvolution tilgang med Machine vision segmenterings værktøjer32 for at muliggøre rekonstruktioner af mere tætte celle klynger.
Hvorfor celler udviklet sig til bestemte former er et komplekst spørgsmål, der skal afspejle det komplekse miljø, de lever. Forståelse af udvikling og funktion af celle former kræver at tage præcise og præcise målinger af disse former, hvilket er, hvad denne metode giver.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Jeffrey Nguyen og Joshua Shaevitz for at hjælpe med at udvikle denne metode.
Finansiering: RMM-NIH F32 GM103290-01A1, BPB-Glenn centre for aging Research og National Science Foundation PHY-1734030.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 nm fluorescent beads | Invitrogen | F8795 | these are used to measure the blurring function of the microscope |
| Agarose | sigma-Aldrich | A9539 | |
| Cotton Swab | Puritan Medical Products Company LLC | S304659 | used to appy VaLaP |
| Cover Slips | VWR | 16004-302 | |
| Fiji | ImageJ | https://fiji.sc | used to cro cells |
| FM4-64 | Invitrogen | LST3166 | membrane dye used to stain cells |
| Huygens Software | Scientific Volume Imaging | Huygens essential or professional | Use to measure blurring function of microscope |
| Lanolin | Sigma-Aldrich | L7387 | combine with paraffin and petroleum jelly to make VaLaP |
| LB growth medium | BD Difco | DF0446173 | |
| M63 medium | US Biological | M1015 | |
| MATLAB | Mathworks | Needed to run forward convolution scripts | |
| Microscope Slides | Fisher | 12-550-133 | |
| NIS Elements | Nkon | ||
| Paraffin | Sigma-Aldrich | 327212 | |
| Petroleum Jelly | Equate | 49035-038-27 | |
| Piezo z stage | Nikon | 77011589 | |
| Pipet tips -p200 | USA Scientific | 1111-0730 | |
| Pipet tips- p10 | USA Scientific | 1111-3730 |
References
- Young, K. D. The Selective Value of Bacterial Shape. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 70 (3), 660-703 (2006).
- Persat, A., Stone, H. A., Gitai, Z. The Curved Shape of Caulobacter crescentus Enhances Surface Colonization in Flow. Nature Communications. 5, 3824 (2014).
- Nguyen, J. P., Bratton, B. P., Shaevitz, J. W. Bacterial Cell Wall Homeostasis: Methods and Protocols. Hong, H. J. , Springer. New York. 227-245 (2016).
- Bratton, B. P., Shaevitz, J. W., Gitai, Z., Morgenstein, R. M. MreB Polymers and Curvature Localization are Enhanced by RodZ and Predict E. coli's Cylindrical Uniformity. Nature Communications. 9 (1), 2797 (2018).
- Ouzounov, N., et al. MreB Orientation Correlates with Cell Diameter in Escherichia coli. Biophysical Journal. 111 (5), 1035-1043 (2016).
- Morgenstein, R. M., et al. RodZ links MreB to Cell Wall Synthesis to Mediate MreB rotation and Robust Morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences. , 12510-12515 (2015).
- Ursell, T. S., et al. Rod-Like Bacterial Shape is Maintained by Feedback Between Cell Curvature and Cytoskeletal Localization. Proceeding of the National Academy of Science U.S.A. 111 (11), E1025-E1034 (2014).
- Bartlett, T. M., et al. A Periplasmic Polymer Curves Vibrio cholerae and Promotes Pathogenesis. Cell. 168 (1-2), 172-185 (2017).
- Taylor, J. A., et al. Distinct Cytoskeletal Proteins Define Zones of Enhanced Cell Wall Synthesis in Helicobacter pylori. bioRxiv. , 545517 (2019).
- Egan, A. J. F., Vollmer, W. The Physiology of Bacterial Cell Division. Annals of the New York Academy of Science. 1277 (1), 8-28 (2013).
- Adams, D. W., Errington, J. Bacterial Cell Division: Assembly, Maintenance and Disassembly of the Z ring. Nature Reviews Microbiology. 7 (9), 642-653 (2009).
- Werner, J. N., Gitai, Z., Melvin, I. S., Brian, R. C., Alexandrine, C. High-Throughput Screening of Bacterial Protein Localization. Methods in Enzymology. 471, 185-204 (2010).
- de Pedro, M. A., Quintela, J. C., Höltje, J. V., Schwarz, H. Murein Segregation in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 179 (9), 2823-2834 (1997).
- Hussain, S., et al. MreB Filaments Align Along Greatest Principal Membrane Curvature to Orient Cell Wall Synthesis. eLife. 7, e32471 (2018).
- Wong, F., et al. Mechanical Strain Sensing Implicated in Cell Shape Recovery in Escherichia coli. Nature Microbiology. 2, 17115 (2017).
- Wong, F., Garner, E. C., Amir, A. Mechanics and Dynamics of Translocating MreB Filaments on Curved Membranes. eLife. 8, e40472 (2019).
- Quint, D. A., Gopinathan, A., Grason, G. M. Shape Selection of Surface-Bound Helical Filaments: Biopolymers on Curved Membranes. Biophysical Journal. 111 (7), 1575-1585 (2016).
- Colavin, A., Shi, H., Huang, K. C. RodZ Modulates Geometric Localization of the Bacterial Actin MreB to Regulate Cell Shape. Nature Communications. 9 (1), 1280 (2018).
- Valap Sealant. , Cold Spring Harbor Protocols. http://cshprotocols.cshlp.org/content/2015/2/pdb.rec082917 (2015).
- Shannon, C. E. Communication in the Presence of Noise. Proceedings of the IRE. 37 (1), 10-21 (1949).
- Billings, G., et al. De Novo Morphogenesis in L-Forms Via Geometric Control of Cell Growth. Mol Microbiol. 93 (5), 883-896 (2014).
- Sturrman, N. Measuring a Point Spread Function. , iBiology. https://www.ibiology.org/talks/measuring-a-point-spread-function (2012).
- Bratton, B. P., Shaevitz, J. W. Simple Experimental Methods for Determining the Apparent Focal Shift in a Microscope System. PLOS ONE. 10 (8), e0134616 (2015).
- Moerner, W. E., Shechtman, Y., Wang, Q. Single-molecule Spectroscopy and Imaging over the decades. Faraday Discussions. 184, 9-36 (2015).
- Sahl, S. J., Hell, S. W., Jakobs, S. Fluorescence Nanoscopy in Cell Biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18, 685 (2017).
- Sarder, P., Nehorai, A. Deconvolution Methods for 3-D Fluorescence Microscopy Images. IEEE Signal Processing Magazine. 23 (3), 32-45 (2006).
- Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Methods in Cell Biology. Waters, J. C., Wittman, T. 123, Academic Press. 153-175 (2014).
- Huff, J. The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution. Nature Methods. 12, 1205 (2015).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the Lateral Resolution Limit by a Factor of Two Using Structured Illumination Microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Lee, M. K., Rai, P., Williams, J., Twieg, R. J., Moerner, W. E. Small-Molecule Labeling of Live Cell Surfaces for Three-Dimensional Super-Resolution Microscopy. Journal of the American Chemical Society. 136 (40), 14003-14006 (2014).
- Yan, J., Sharo, A. G., Stone, H. A., Wingreen, N. S., Bassler, B. L. Vibrio cholerae Biofilm Growth Program and Architecture Revealed by Single-Cell Live Imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (36), E5337-E5343 (2016).
- Wang, J., et al. Bact-3D: A level set segmentation approach for dense multi-layered 3D bacterial biofilms. 2017 IEEE International Conference on Image Processing (ICIP). , 330-334 (2017).
