Summary
В этом протоколе объясняется, как подготовить и смонтировать образцы бактерий для живой трехмерной визуализации и как реконструировать трехмерную форму кишечной палочки из этих изображений.
Abstract
Форма бактерии важна для ее физиологии. Многие аспекты физиологии клеток, такие как подвижность клеток, хищнизание и производство биопленки могут быть затронуты формой клеток. Бактериальные клетки являются трехмерными (3D) объектами, хотя они редко рассматриваются как таковые. Большинство методов микроскопии приводят к двумерным (2D) изображениям, что приводит к потере данных, относящихся к фактической форме 3D-клеток, и локализации белков. Некоторые параметры формы, такие как гауссийская кривизна (продукт двух основных кривизны), могут быть измерены только в 3D, потому что 2D изображения не измеряют обе основные кривизны. Кроме того, не все клетки лежат плоские, когда монтаж и 2D изображения изогнутых клеток не может точно представлять формы этих клеток. Точное измерение локализации белка в 3D может помочь определить пространственную регуляцию и функцию белков. Разработана технология переднего свертывания, которая использует функцию размытия микроскопа для восстановления форм 3D-клеток и точной локализации белков. Здесь описан протокол для подготовки и монтажа образцов для визуализации живых клеток бактерий в 3D как для восстановления точной формы клеток, так и для локализации белков. Метод основан на простой подготовке образца, приобретении флуоресцентного изображения и обработке изображений на основе MATLAB. Многие высококачественные флуоресцентные микроскопы могут быть просто изменены, чтобы принять эти измерения. Эти реконструкции клеток являются вычислительно интенсивными, и рекомендуется доступ к вычислительным ресурсам с высокой пропускной душой, хотя и не является необходимым. Этот метод был успешно применен к нескольким бактериальным видам и мутантам, флуоресцентным методам визуализации и производителям микроскопов.
Introduction
Клетки всех типов регулируют их формы для специфических функций. Например, нейроны имеют форму иначе, чем клетки крови и имеют различные функции. Аналогичным образом, бактериальные клетки бывают различных форм и размеров, хотя цель этих форм не всегда известно1,2. Поэтому важно точно определить форму бактериальных клеток. Описанный метод показывает легко реализованный способ сбора данных, подходящих для 3D-анализа большинства живых или фиксированных бактериальных клеток.
Описанный метод позволяет принимать 3D-изображения бактериальных клеток для того, чтобы точно представлять форму 3D-клеток образца и точно локализовать белки в этих формах. Традиционные методы микроскопии принимают 2D изображения, что проблематично при изучении клеток, которые имеют ненормальные или несимметричные формы, такие как мутанты кишечной палочки, или изогнутые бактерии, такие как Vibrio cholerae и Helicobacter пилори. В то время как 3D-изображения с высоким разрешением являются ключевым входном элементом этого метода, метод не возвращает изображение с разрешением. Скорее, этот метод реконструирует 3D-координаты поверхности и форму ячейки с помощью алгоритма переднего свертывания с использованием активных контуров и очевидной функции размытия микроскопа3 (Рисунок 1). Он был использован для изучения бактериального актина омолог MreB в E. coli4,5,6,7, роман перискелетный элемент CrvA в V. холеры8, и побудитель bactofilin CcmA в Helicobacter pylori9 (Рисунок 2).
Локализация белков может дать представление об их функциях. Например, белки, участвующие в делении клеток, обычно локализованы до средней клетки10,11. Высокопроизводительные исследования были проведены для локализации всех белков бактерии в надежде получить представление о своих функциях12. К сожалению, эти исследования были проведены с помощью 2D-изображения и 1D или 2D-анализа, что делает невозможным измерение конкретных аспектов локализации белка, таких как локализация к клеточным геометрическим особенностям.
Например, MreB, динамический белок, необходимый для стержня форму многих бактерий, предполагается работать, направляя локализации синтеза клеточной стенки, и его локализация отражает локализацию синтеза клеточной стенки7,13. MreB от нескольких видов показывает геометрическое обогащение4,6,7,14,15. Динамические поверхностные полимеры, такие как MreB, могут соединить геометрию поверхности с усредненным временем профиля обогащения16 и могут быть в состоянии ориентироваться на конкретные геометрии, минимизируя энергию, связанную с привязкой к мембране17. Хотя важность скручивания, комплектации, изгиба и динамики не была полностью решена для MreB, важно отметить, что точные измерения обоих основных кривизны поверхности требуют полного 3D-представления ячейки. Поэтому для наиболее точного измерения кривизны, к которым локализуются белки, предпочтительнее использовать 3D, а не 2D-изображение. 3D-изображение устраняет необходимость вычислительной оценки тех кривизны, которые не могут быть измерены в 2D, оценка, которая не может быть точной в асимметричных клетках18.
Хотя 2D-изображение клеток происходит быстрее и не требует столько постизображений вычислительной работы, 3D-изображение обеспечивает более точное представление клетки, а также способность измерять поверхностные особенности, такие как кривизна, которая не может быть измерена в 2D. Поэтому, по мере того как 3D изображение будет более обычным, новые проницательности в форму клетки и локализации протеина станут по возможности.
Protocol
1. Подготовка образцов
- Сделать E. coli флуоресцентные для визуализации либо путем разработки их выразить цитоплазматический флуоресцентный белок6 или с помощью мембранного красителя5. Другие бактериальные виды могут быть использованы вместо кишечной палочки.
- Преобразуйте клетки с помощью электропорации с помощью плазмиды, которая кодирует цитоплазмический флуоресцентный белок mCherry.
ПРИМЕЧАНИЕ: Различные флуоресцентные белки других цветов могут быть использованы. - Выращивайте трансформатанты на пластине LB с соответствующим антибиотиком при 37 градусах Цельсия. Получить одиночные колонии и определить положительные клоны с помощью микроскопии. Устойчивые к антибиотикам колонии, которые появляются красными под микроскопом, содержат плазмид, несущий mCherry.
- Преобразуйте клетки с помощью электропорации с помощью плазмиды, которая кодирует цитоплазмический флуоресцентный белок mCherry.
- Выращивайте 2 мл ночной культуры в жидком носителе LB с соответствующими антибиотиками при 37 градусах Цельсия в тряся инкубаторе. Используйте либо колонию из тарелки, либо небольшое количество морозильной камеры в качестве инокулума.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте средства массовой информации, необходимые для бактериальных клеток, отобранных для эксперимента. - Субкультура ночной культуры 1:1,000 в 5 мл свежих носителей LB и пусть клетки растут до экспоненциальной фазы при 37 градусах Цельсия в тряся инкубаторе в течение 3'4 h. Измерьте OD600 клеток, чтобы подтвердить, что они находятся в экспоненциальной фазе (т.е. , OD600 и 0,2-0,4).
ПРИМЕЧАНИЕ: Изображение может быть выполнено на любой стадии роста в зависимости от проводимого эксперимента.
2. Подготовка слайдов
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно использовать средства массовой информации, которые имеют низкую автофлюоресценцию. Любая среда, которая имеет низкую автофлюоресценцию, может быть использована. В этом эксперименте, 1% агарозы M63 минимальные прокладки мультимедиа и уплотнения с VaLaP19 требуется для изображения клеток в 3D.
-
Подготовьте 1% раствор агарозы в 20 мл минимальных носителей.
- Микроволновая печь решение, пока агароза полностью растворяется и решение появляется ясно.
- Храните раствор на водяной бане 60 градусов до готовности к использованию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это решение может быть затвердевано и расплавлено по мере необходимости или может быть алицитировано в меньшие количества, которые расплавляются по мере необходимости. После нескольких применений носители могут обесцвечиваться и должны быть заменены.
- Растопить уплотнитель VaLaP на горячей тарелке при температуре 80–100 градусов по Цельсию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка VaLaP, который будет использоваться в качестве герметика, путем плавления 50 г каждого из вазелина, ланолина и парафина вместе в стакане на горячей тарелке при температуре 80-100 градусов по Цельсию. Это большое количество VaLaP может храниться при комнатной температуре на неопределенный срок и будет достаточно для слайдов. Отопление на йgt;100 КС приведет к его деградации и его цвет будет темнеть. - Поместите два стека каждый из трех 20 мм х 20 мм крышка скользит на противоположных концах слайда (шесть всего coverslips).
- Пипетка 200 л раствора агарозной площадки на горку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если не использовать инженерии флуоресцентные пятна, мембранный краситель может быть добавлен в раствор агарозы колодки до этого шага. Приостановите краситель в воде и добавить красителя в 1 мл агарозного раствора колодки до конечной концентрации 5 мкг/мл. - Немедленно и твердо поместите второй слайд вниз на стек крышки скользит, чтобы сгладить агар и дайте ему затвердеть в течение 1 мин при комнатной температуре.
- Аккуратно соскользните с верхнего слайда.
- Используйте большой конец 200 qL пипетки отзыв вырезать отдельные колодки из геля (5 мм в диаметре) на слайде и отказаться от пороков или ненужных гель.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если изображение нескольких штаммов или условий, отдельная площадка будет необходима для каждого из них. Если нужно сделать только один штамм, сделайте 3х4 колодки, которые помогут поддержать обсуп. - Pipette клетки вверх и вниз несколько раз, чтобы нарушить ячейки сгустки и обеспечить культуру хорошо смешаны. Пипетка 1 л субкультуры от шага 1.3 на площадку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Реконструкция клеточной формы требует отдельных клеток, которые не касаются других клеток. При использовании стационарной фазы или культур плотности клеток может возникнуть необходимость разбавить образец 1:10, прежде чем поместить его на площадку. - Пусть проба воздуха высохнет в течение 5–10 мин. Убедитесь, что капля полностью впитается в прокладку. Если какая-либо жидкость остается, клетки будут перемещаться в жидкости и не могут быть изображены.
- Поместите крышку скольжения на верхней части колодки.
- Печать крышку скольжения с расплавленной VaLaP, мягко щеткой по краю крышки скольжения с ватным тампоном. Убедитесь в том, чтобы держать его подальше от верхней части крышки скольжения, где цель будет касаться. VaLaP затвердеет в считанные секунды, герметизировать образец.
- Немедленно изображение образца.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образец должен быть изображен, как только слайд подготовлен. Клетки могут расти на колодках, и если они разделят реконструкции будет сложнее.
3. Требования к визуализации
- Убедитесь, что z или фокусировка оси микроскопа может сделать точные движения менее 50 нм. Используйте z piezo этапы (см. Таблица материалов), доступные на микроскопах класса исследований, потому что типичные моторизованные устройства фокусировки не в состоянии обеспечить эту точность.
ПРИМЕЧАНИЕ: Предполагая, что критерий выборки Nyquist-Shannon20,нужно иметь возможность двигаться в 0,5 раза меньше желаемого размера шага, или в 2 раза желаемой пространственной частоты. Для 100 нм шаги, необходимые в этом протоколе, этап с точностью 50 нм или менее не требуется. -
Убедитесь, что микроскоп содержит 100-x цель с минимальной численной диафрагмой (NA) 1,45.
- Соберите z-стеки от 200 до 400 различных ячеек, чтобы обеспечить получение достаточного количества ячеек для применения ниже по течению.
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество необходимых клеток зависит от основной изменчивости выборки интереса. Некоторые из клеток, собранных в этот момент не будет делать это через этапы реконструкции.
- Соберите z-стеки от 200 до 400 различных ячеек, чтобы обеспечить получение достаточного количества ячеек для применения ниже по течению.
- Убедитесь, что z-stack соответствует параметрам, используемым для канала формы, если измеряется вторичный флуоресцентный канал (белок, метаболическая метка и т.д.).
4. Визуализация
- Вставьте запечатанный слайд на микроскоп и позвольте ему сидеть в течение 5 минут, чтобы уравновесить температуру с окружением, потому что комната микроскопа может быть на другой температуре, чем комната подготовки образца.
-
Возьмите флуоресцентный z-стек образца.
ПРИМЕЧАНИЕ: z-стек должен полностью покрывать образец с z-интервалом меньше, чем глубина резкости. Для 1,45 NA 100x цели и 1 мкм толщиной E. coli клетки, 40 шагов на 100 нм на шаг хорошо работать. Для больших клеток или клеток, которые не лежат совершенно плоские на поверхности, 50 или более шагов может быть необходимо. Включите достаточношагов и убедитесь, что образец полностью размыт выше и ниже.- Используйте программное обеспечение, связанное с микроскопом (см. Таблица материалов)для управления микроскопом.
- Сосредоточьтесь на середине клетки с помощью дисков фокусировки микроскопа. Под ND приобретение проверить поле для того, чтобы взять z-стек. Нажмите кнопку «Домой», чтобы установить середину ячейки в качестве отправной точки. Установите размер шага до 0,1 мкм и установите диапазон до 4 мкм. Убедитесь, что устройство q настроено на стадию пьезо.
- Установите флуоресцентные каналы под окном Lambda к настройкам для флуоресцентных молекул, образуемых. В этом эксперименте использовались GFP и mCherry.
ПРИМЕЧАНИЕ: Возьмите дополнительный z-стек с тем же размером шага и диапазоном во втором цветном канале, если 3D-распределение дополнительного флуоресцентного канала желательно. В этом эксперименте цитоплазматический mCherry был использован для определения формы клетки и MreB-GFP был использован в качестве второго цветового канала21. - Убедитесь, что Порядок эксперимента установлен на lambda (z серии), так что он будет принимать полный z-стек в каждом цветном канале перед переключением.
- Нажмите Run Now, чтобы начать приобретение изображения и сохранить файл onece один или оба z-стеки завершены.
- Перейдите в новую область на площадке и повторите шаги 4.2.2-4.2.5.
5. Реконструкция клеток
- Урожай отдельных ячеек и сохранить изображения в виде сложенного файла tiff так, что есть только одна ячейка на файл. Убедитесь, что эта ячейка хорошо изолирована от любых других ячеек (т.е. примерно в 5 раз в 5 раз полширина полумаксимум функции размытия в xy.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это может быть сделано с помощью свободно доступного программного обеспечения анализа изображений (см. Таблица материалов).- Нарисуйте коробку вокруг отдельной ячейки и дублируйте эту ячейку 2x, один раз для каждого канала. Убедитесь, что дубликат гиперстек поле проверяется и изменить канал либо 1 или 2, убедившись, что ломтики включают весь z-стек.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если визуме только форма клеток, а не дополнительный флуоресцентный белок, только один канал будет присутствовать. - После того, как оба стека доступны перейти к изображениям Стеки Инструменты Concatenate объединить изображения с протеиновым каналом первый и канал формы второй.
- Сохранить новое изображение в виде файла tiff.
- Нарисуйте коробку вокруг отдельной ячейки и дублируйте эту ячейку 2x, один раз для каждого канала. Убедитесь, что дубликат гиперстек поле проверяется и изменить канал либо 1 или 2, убедившись, что ломтики включают весь z-стек.
- Измерьте функцию размытия микроскопа с помощью субдифракции ограниченного флуоресцентногобисера 22. Это должно быть сделано для каждого микроскопа и микроскопа цели, но может быть выполнена до или после изображения образцов, представляющих интерес.
- В среднем вместе несколько независимых шариков с некоторыми ручного вмешательства с использованием доступного программного обеспечения (см. Таблица материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Конечным продуктом должно быть 3D-изображение функции размытия с тем же интервалом xyz, что и образцы, представляющие интерес.
- В среднем вместе несколько независимых шариков с некоторыми ручного вмешательства с использованием доступного программного обеспечения (см. Таблица материалов).
- Запустите сценарии реконструкции формы ячейки передних свертывателей с помощью доступного программного обеспечения. Последнюю версию этих скриптов можно свободно скачать с https://github.com/PrincetonUniversity/shae-cellshape-public.
- Сделайте папку внутри папки на рабочем столе, которая содержит обрезанные изображения, а также файл cell-shape-settings-tri.txt из shae-cellshape-public/exampleData-tri.
- Отменяйте cell-shape-setting-tri.txt, чтобы иметь правильные настройки для интересуемого эксперимента. Для этого эксперимента файл настроек включает следующие строки:
нм-пер-пиксель 70
Шкала 0,65
стек-заразмер 41
стек-т-размер 1
Фстак-заразмер 41
Фстак-тзразмер 1
stack-seperation-nm 100
Фстак-сеперация 100
psfScript -999 osuPSF20180726
градиент 1
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот текстовый файл организован в разделы, и каждый раздел разбирается в свою собственную переменную. В то время как многие из параметров не нужно менять от эксперимента к эксперименту, следует убедиться, что размер z-стек(стек-образ для формы, Fstack'z'size для белка интереса), расстояние от z-стек (stack'seperation нм, Fstack'seperation'nm, относительный фокусный сдвиг микроскопа(шкала )23, размер пикселей в xy(nm'per'pixel), и название скрипта, который загружает размытую функцию микроскопа(psfScript ) соответствуют эксперименту. Поле градиента должно быть установлено до 1, если канал формы цитоплазмически заполнен и 0, если это мембрано-окрашенный объект. - Запустите функцию Cell-detector3dConVTri5older (shae-cellshape-public/CellShapeDetectorTri/) со строкой к местоположению папки с последующим числом ячейки для запуска и числом ячеек, которые вы хотите запустить.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пример для ввода будет выглядеть следующим образом: Cell-shape-detector3dConvTriFolder ('путь к папке с обрезанными изображениями', стартовый индекс в папке, q клеток). Типичная ячейка может занять от 5 до 20 минут для реконструкции, чтобы сблизиться и закончить.
- Экран реконструкций клеток, чтобы убедиться, что они верны перед использованием клеток для любого статистического анализа.
- Выполнить ScreenFits (shae-cellshape-public/shae-fitViewerGui/) для визуального экрана отдельных реконструкций клеток.
- Нажмите кнопку выбора папки, когда графический пользовательский интерфейс (GUI) открывается, а затем выберите папку с файлами данных реконструкции (TRI.mat), созданными в шаге 5.3.
- Выберите поле рядом с реконструкцией ячейки, если ячейка выглядит деформированной или не полностью сходятся(рисунок 3). Это может выглядеть как ячейка с отверстием, плоской стороной или ветвью, выходящимизизся из нее. Это придатит 'FLAG'к имени файла, чтобы его можно было исключить из любого анализа ниже по течению.
ПРИМЕЧАНИЕ: Реконструированные ячейки можно сравнить с исходными изображениями. Это может быть особенно важно, если ваши клетки приходят из различных неоднородных популяций форм.
- Выполнить обогащениеSmoothingSpline (ша-клетки-общественные/) для создания профиля обогащения относительной концентрации белка интерес в качестве функции гауссианской кривизны на поверхности.
- Выберите каждую папку с файлами TRI.mat, созданными в шаге 5.3.3.
- Выберите вновь созданный (5.5.1) файл curve.mat.
ПРИМЕЧАНИЕ: Файл curve.mat будет создан для каждой папки, выбранной в 5.5.1. Все профили обогащения будут представлены на одном графике. Если требуются отдельные графики, чем запустить 5,5 для каждой папки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Помимо точной геометрической локализации флуоресцентного белка, существует множество других способов анализа данных из вторичного канала, включая подсчет количества, размера и ориентации объектов4.
Representative Results
Бактерии бывают самых разных форм и размеров, которые могут определять их функции в природе1. Результатом этой процедуры является точное 3D-представление ячеек из переднего свертка z-стек изображений(рисунок 1). Этот метод особенно важен при работе с изогнутыми клетками(рисунок 2),или с аномально формы клеток (Рисунок 4A), как 2D представление не отражает кривизны клеток точно. Для того, чтобы использовать метод переднего свертывания(Рисунок 1А),клетки должны быть либо периферийно окрашены или цитоплазматического пятна(Рисунок 2B слева против справа).
На рисунке 4 показана локализация MreB в ячейке. Слияние GFP было сделано для бактериального белка актина MreB21 для того, чтобы изучить его точную локализацию как в диком типе, так и в мутантных клетках кишечной палочки 4. Поскольку MreB связан с мембраной, 3D-изображение требуется для точного воспроизведения своего положения в клетке. Делая эти измерения в 3D, мы смогли реконструировать формы как диких типов, так и стержней мутантных клеток(рисунок 4A). Локализация MreB была показана, чтобы быть обогащенным на небольших гауссианских кривизны, геометрические особенности, которые могут быть измерены только в 3D, в Роде зависимым образом (Рисунок 4B).
Рисунок 1: Метод свертывания вперед реконструирует клетки без предварительного знания формы клетки. (A) Окончательный выход метода является реконструкция 3D-клеток, полученных путем сравнения тестовой формы с откалиброванные функции размытия микроскопа. Это сравнивается с наблюдаемым z-стеком до тех пор, пока наблюдаемое 3D-изображение не соподостоит гипотетическому. Показано здесь изображение является визуализацией реконструкции одной ячейки C. crescentus. (B) Конвейер реконструкции итеративно обновляет расчетные позиции поверхностных элементов на основе наблюдаемого стека изображений. Для получения полных алгоритмических деталей метода, см. Nguyen3. (C) Реконструкция трубопровода начинается без априорного знания формы ячейки и обновляет положение и количество поверхностных вершин, чтобы соответствовать наблюдаемым z-стек. Репрезентативные изображения с каждых 30 шагов во время 3D-реконструкции отображаются с трех разных ракурсов клетки V. cholerae. Поверхностные положения этой формы обновляются, чтобы свести к минимуму разницу между смоделированным и наблюдаемым стеками. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Представитель 3D реконструкций трех различных форм бактериальных видов. Трехмерные реконструкции могут быть сделаны из клеток с их мембраны окрашенных (слева) или заполнены цитоплазматического флюорофора (справа). Форма и кривизна стартовой ячейки не имеет значения, так как изогнутый стержень, витой стержень или прямой стержень все способны быть точно реконструированы. Реконструированные поверхности окрашены на основе местной гауссианской кривизны поверхности. Шкала бар No 1 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Реконструкция может вывести из строя по нескольким причинам. Ячейки должны быть проверены, чтобы убедиться, что алгоритм реконструкции сходился с разумным результатом. Слева - представительный дикий тип (вверху) и стержень мутант (внизу) E. coli клетки, которые прошли контроль качества. Правые ячейки, которые не удалось восстановить должным образом и не прошли контроль качества. Показаны пять классов неудачной конвергенции: i) клетки, которые находятся слишком близко к краю области обрезки, что приводит к резкой демаркации, (ii) клетки, которые находятся слишком близко к другой клетке, (iii) клетки, которые произвели divot, (iv) клетки, которые не проследовали мимо первоначального s пункт tarting, и (v) другие неизвестные ошибки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Репрезентативные данные, показывающие локализацию белка в конкретных клеточных геометриях. (A) Трехмерные реконструированные клетки дикого типа и стержня E. coli клетки с гауссианской кривизны и Мреб флуоресценции интенсивности отображается. Шкала бар No 1 мкм. (B) Обогащение участков MreB от дикого типа и стержня E. coli клеток. Значения, которые показывают обогащение и значения, которые показывают, что MreB из этих клеточных регионов является единым покрытием клетки. Затененные области указывают на средний интервал доверия загрузки 90% среднего. Кривая для каждого штамма является кубической сглаживания сплайдинга и усеченс спомощью порога вероятности для экстремальных кривизны р Эта цифра была изменена с (Bratton et al.) 4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Discussion
Важным шагом в этом протоколе является приобретение высококачественных изображений. Чтобы правильно реконструировать клетки, должно быть достаточно размытия выше и ниже клетки. Поэтому крайне важно, чтобы принятый z-стек преодолел достаточно большое расстояние. Количество шагов, сделанных при приобретении изображения, может быть скорректировано для каждого штамма. Например, клетки кишечной палочки, удаленные для стержня, шире и требуют большего количества шагов, а значит, и большего расстояния, чем клетки дикого типа. Если образец дрейфует во время приобретения изображения, реконструкция может иметь серьезные ошибки. Поэтому важно, чтобы слайд прийти к тепловому равновесию с микроскопом перед визуализацией, чтобы избежать дрейфа во время приобретения z-стек. Клетки должны быть изображены на колодках с низкой аутофлуоресценцией. Компоненты мультимедиа, например, в общей среде LB, имеют автофлюоресценцию, которая может вызвать проблемы при попытке реконструировать клетки. Плотность клеток на панели изображений важна, потому что процесс реконструкции выполняется независимо на каждой клетке. Слишком мало клеток увеличит время, необходимое для получения изображений достаточного количества клеток, в то время как слишком много клеток приведет к визуализации полей, которые слишком плотны, чтобы легко обрезать отдельные клетки. Поскольку не все ячейки реконструируются должным образом, дополнительные ячейки должны быть изображены во время этапа приобретения, и все выходы должны быть проверены, прежде чем двигаться вперед со статистическим анализом (Рисунок 3).
Многие ограничения для этого метода носят технический характер. На микроскоп, который будет использоваться, необходимо иметь цель, которая имеет высокую численную диафрагму (как правило, 1,4), потому что это позволяет оптического сечения на размер масштаба бактерий. Кроме того, микроскоп должен быть оснащен пьезо этап, который может принимать небольшие, точные шаги в z-направление. Кроме того, хотя это и не является необходимым, доступ к высокопроизводительным вычислительным ресурсам для запуска программного обеспечения для анализа изображений настоятельно рекомендуется, поскольку это сократит время обработки для восстановления ячеек.
Одним из концептуальных ограничений метода является то, что должны быть выбраны правильные энергетические весы для взвешивания плавности хода реконструкции относительно соотношения сигнала к шуму изображений. Для проверки выбора параметров размеры и формы клеток должны быть измерены с помощью независимых методов, таких как электронная микроскопия передачи (TEM) или атомная силовая микроскопия (AFM). В качестве доказательства принципа, 3D-реконструкции клеток были выполнены либо на AFM для проверки на z-точность (Злт;50 нм) или на сетке TEM для проверки на точность xy (Злт;30 нм)3. Такой коррелированный подход занимает много времени и обходится дорого. Более простой подход может быть к изображению стандартных образцов, таких как дикие клетки типа или 1 мкм сферические бусы. Диаметр и сферичность реконструкций могут быть использованы для обеспечения правильности размеров и энергетических масштабов, используемых в реконструкции.
Это не единственный метод, который стремится извлечь пространственную информацию высокого разрешения из флуоресцентных микроскопических изображений. Многие обзорные статьи описывают последние достижения в области супер-разрешения микроскопии24,25. Разрешение повышения методов, таких как деконволуционная микроскопия26, спиннинг диска конфокальная микроскопия27, пиксель переназначения28, и структурированная микроскопия освещения (SIM)29 стремятся улучшить разрешение изображения, полученные микроскопом. Эти методы не несовместимы с представленным подходом. Недавно этот метод был адаптирован для SIM-изображений в качестве входов9. В то время как метод переднего свертывания разделяет некоторые из его основ с микроскопией деконволуционного, он имеет совершенно другой выход. В то время как такие подходы, как микроскопия деконволюции, направлены на улучшение разрешения изображения, этот подход не генерирует изображение, а скорее реконструкцию формы клетки с точностью примерно 50 нм. Одномолекулярные методы активного контроля микроскопии, основанные на редко маркированных образцах, могут обеспечить еще более высокий уровень пространственной точности, чем этот метод. Во многих случаях эти подходы к одной молекуле требуют оптимизации флуоресцентных конструкций и могут потребовать длительного времени приобретения, что затрудняет их использование с живыми или динамическими образцами. Каждый из этих методов поставляется с одним или несколько предостережениями, что этот метод не делает. Например, преимущества, рекламируемые спиннинг диска конфокальной микроскопии не так применимы к монослойбактерии бактериальных клеток, где есть не так много из плоскости света. Кроме того, этот метод обеспечивает конвейер для получения точных форм 3D-клеток и локализации белка без необходимости каких-либо специализированных фторофоров. Этот метод имеет минимальные аппаратные требования (т.е. z piezo, высокая цель NA) и требует только десятков изображений на временную точку, что позволяет легко исследовать динамические 3D структуры6.
Растет число подходов к изучению организации бактериальных клеток в 3D-структурах. К ним относятся подходы концептуально похожи ею, которые пользуются высоким качеством, 3D флуоресценции изображения30,31,32. Такой подход требует хорошо изолированных клеток и не делает априорных предположений о клеточной геометрии. Однако, чтобы перейти в плотные клеточные агрегаты или биопленки, клетки, как предполагается, стержня, как. Такое низкое разрешение по-прежнему позволяет исследовать расположения упаковки клеток, хотя высокая плотность клеток в биопленке предотвращает анализ субклеточной локализации конкретных факторов.
В будущем может быть интересно разработать рамки для интеграции единой молекулы и широкоугольных подходов с этой 3D-техникой реконструкции. Кроме того, можно включить этот подход к передним свертывания с инструментами сегментации машинного зрения32, позволяющие проводить реконструкции более плотных клеточных кластеров.
Почему клетки превратились в конкретные формы является сложным вопросом, который должен отражать сложную среду, в которой они живут. Понимание эволюции и функции клеточных форм требует точного и точного измерения этих форм, что и дает этот метод.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить Джеффри Нгуена и Джошуа Шаевица за помощь в разработке этого метода.
Финансирование: RMM - NIH F32 GM103290-01A1, BPB - Гленн Центры исследований старения и Национальный научный фонд PHY-1734030.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 nm fluorescent beads | Invitrogen | F8795 | these are used to measure the blurring function of the microscope |
| Agarose | sigma-Aldrich | A9539 | |
| Cotton Swab | Puritan Medical Products Company LLC | S304659 | used to appy VaLaP |
| Cover Slips | VWR | 16004-302 | |
| Fiji | ImageJ | https://fiji.sc | used to cro cells |
| FM4-64 | Invitrogen | LST3166 | membrane dye used to stain cells |
| Huygens Software | Scientific Volume Imaging | Huygens essential or professional | Use to measure blurring function of microscope |
| Lanolin | Sigma-Aldrich | L7387 | combine with paraffin and petroleum jelly to make VaLaP |
| LB growth medium | BD Difco | DF0446173 | |
| M63 medium | US Biological | M1015 | |
| MATLAB | Mathworks | Needed to run forward convolution scripts | |
| Microscope Slides | Fisher | 12-550-133 | |
| NIS Elements | Nkon | ||
| Paraffin | Sigma-Aldrich | 327212 | |
| Petroleum Jelly | Equate | 49035-038-27 | |
| Piezo z stage | Nikon | 77011589 | |
| Pipet tips -p200 | USA Scientific | 1111-0730 | |
| Pipet tips- p10 | USA Scientific | 1111-3730 |
References
- Young, K. D. The Selective Value of Bacterial Shape. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 70 (3), 660-703 (2006).
- Persat, A., Stone, H. A., Gitai, Z. The Curved Shape of Caulobacter crescentus Enhances Surface Colonization in Flow. Nature Communications. 5, 3824 (2014).
- Nguyen, J. P., Bratton, B. P., Shaevitz, J. W. Bacterial Cell Wall Homeostasis: Methods and Protocols. Hong, H. J. , Springer. New York. 227-245 (2016).
- Bratton, B. P., Shaevitz, J. W., Gitai, Z., Morgenstein, R. M. MreB Polymers and Curvature Localization are Enhanced by RodZ and Predict E. coli's Cylindrical Uniformity. Nature Communications. 9 (1), 2797 (2018).
- Ouzounov, N., et al. MreB Orientation Correlates with Cell Diameter in Escherichia coli. Biophysical Journal. 111 (5), 1035-1043 (2016).
- Morgenstein, R. M., et al. RodZ links MreB to Cell Wall Synthesis to Mediate MreB rotation and Robust Morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences. , 12510-12515 (2015).
- Ursell, T. S., et al. Rod-Like Bacterial Shape is Maintained by Feedback Between Cell Curvature and Cytoskeletal Localization. Proceeding of the National Academy of Science U.S.A. 111 (11), E1025-E1034 (2014).
- Bartlett, T. M., et al. A Periplasmic Polymer Curves Vibrio cholerae and Promotes Pathogenesis. Cell. 168 (1-2), 172-185 (2017).
- Taylor, J. A., et al. Distinct Cytoskeletal Proteins Define Zones of Enhanced Cell Wall Synthesis in Helicobacter pylori. bioRxiv. , 545517 (2019).
- Egan, A. J. F., Vollmer, W. The Physiology of Bacterial Cell Division. Annals of the New York Academy of Science. 1277 (1), 8-28 (2013).
- Adams, D. W., Errington, J. Bacterial Cell Division: Assembly, Maintenance and Disassembly of the Z ring. Nature Reviews Microbiology. 7 (9), 642-653 (2009).
- Werner, J. N., Gitai, Z., Melvin, I. S., Brian, R. C., Alexandrine, C. High-Throughput Screening of Bacterial Protein Localization. Methods in Enzymology. 471, 185-204 (2010).
- de Pedro, M. A., Quintela, J. C., Höltje, J. V., Schwarz, H. Murein Segregation in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 179 (9), 2823-2834 (1997).
- Hussain, S., et al. MreB Filaments Align Along Greatest Principal Membrane Curvature to Orient Cell Wall Synthesis. eLife. 7, e32471 (2018).
- Wong, F., et al. Mechanical Strain Sensing Implicated in Cell Shape Recovery in Escherichia coli. Nature Microbiology. 2, 17115 (2017).
- Wong, F., Garner, E. C., Amir, A. Mechanics and Dynamics of Translocating MreB Filaments on Curved Membranes. eLife. 8, e40472 (2019).
- Quint, D. A., Gopinathan, A., Grason, G. M. Shape Selection of Surface-Bound Helical Filaments: Biopolymers on Curved Membranes. Biophysical Journal. 111 (7), 1575-1585 (2016).
- Colavin, A., Shi, H., Huang, K. C. RodZ Modulates Geometric Localization of the Bacterial Actin MreB to Regulate Cell Shape. Nature Communications. 9 (1), 1280 (2018).
- Valap Sealant. , Cold Spring Harbor Protocols. http://cshprotocols.cshlp.org/content/2015/2/pdb.rec082917 (2015).
- Shannon, C. E. Communication in the Presence of Noise. Proceedings of the IRE. 37 (1), 10-21 (1949).
- Billings, G., et al. De Novo Morphogenesis in L-Forms Via Geometric Control of Cell Growth. Mol Microbiol. 93 (5), 883-896 (2014).
- Sturrman, N. Measuring a Point Spread Function. , iBiology. https://www.ibiology.org/talks/measuring-a-point-spread-function (2012).
- Bratton, B. P., Shaevitz, J. W. Simple Experimental Methods for Determining the Apparent Focal Shift in a Microscope System. PLOS ONE. 10 (8), e0134616 (2015).
- Moerner, W. E., Shechtman, Y., Wang, Q. Single-molecule Spectroscopy and Imaging over the decades. Faraday Discussions. 184, 9-36 (2015).
- Sahl, S. J., Hell, S. W., Jakobs, S. Fluorescence Nanoscopy in Cell Biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18, 685 (2017).
- Sarder, P., Nehorai, A. Deconvolution Methods for 3-D Fluorescence Microscopy Images. IEEE Signal Processing Magazine. 23 (3), 32-45 (2006).
- Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Methods in Cell Biology. Waters, J. C., Wittman, T. 123, Academic Press. 153-175 (2014).
- Huff, J. The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution. Nature Methods. 12, 1205 (2015).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the Lateral Resolution Limit by a Factor of Two Using Structured Illumination Microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Lee, M. K., Rai, P., Williams, J., Twieg, R. J., Moerner, W. E. Small-Molecule Labeling of Live Cell Surfaces for Three-Dimensional Super-Resolution Microscopy. Journal of the American Chemical Society. 136 (40), 14003-14006 (2014).
- Yan, J., Sharo, A. G., Stone, H. A., Wingreen, N. S., Bassler, B. L. Vibrio cholerae Biofilm Growth Program and Architecture Revealed by Single-Cell Live Imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (36), E5337-E5343 (2016).
- Wang, J., et al. Bact-3D: A level set segmentation approach for dense multi-layered 3D bacterial biofilms. 2017 IEEE International Conference on Image Processing (ICIP). , 330-334 (2017).
