Summary
Het doel van dit protocol was het ontwikkelen van een muriene model van laag niveau toxische blootstelling die niet leiden tot overt leverletsel, maar eerder vererveert reeds bestaande leverschade. Dit paradigma kan de blootstelling van de mens en de subtiele veranderingen die optreden bij blootstelling aan toxische concentraties die als veilig worden beschouwd, beter recapituleren.
Abstract
Vinyl chloride (VC), een overvloedige milieuverontreiniging, veroorzaakt Steatohepatitis op hoog niveau, maar wordt als veilig beschouwd op lagere niveaus. Hoewel verschillende studies de rol van VC hebben onderzocht als een directe hepatotoxicant, is het concept dat VC de gevoeligheid van de lever wijzigt naar andere factoren, zoals niet-alcoholische vette leverziekte (NAFLD) veroorzaakt door vetrijke voeding (HFD) nieuw. Dit protocol beschrijft een blootstellings paradigma om de effecten van chronische, laag-niveau blootstelling aan VC te evalueren. Muizen worden een week voorafgaand aan het begin van de inhalatie blootstelling geacclimeerd aan vetarm of vetarm dieet en blijven tijdens het experiment op deze diëten. Muizen worden blootgesteld aan VC (sub-OSHA niveau: < 1 ppm) of kamerlucht in inhalatie kamers voor 6 uur/dag, 5 dagen/week, gedurende maximaal 12 weken. Dieren worden wekelijks gecontroleerd op gewichtstoename en voedselconsumptie. Dit model van de blootstelling aan VC veroorzaakt geen overt leverletsel met VC inademing alleen. De combinatie van VC en HFD verbetert echter de leverziekte aanzienlijk. Een technisch voordeel van dit co-exposure model is de blootstelling aan het hele lichaam, zonder terughoudendheid. Bovendien lijken de omstandigheden nauwer op een zeer algemene menselijke situatie van een gecombineerde blootstelling aan VC met onderliggende niet-alcoholische vette leverziekte en ondersteunen daarom de nieuwe hypothese dat VC een milieurisico factor is voor de ontwikkeling van leverschade als een complicatie van obesitas (d.w.z. NAFLD). Dit werk daagt het paradigma uit dat de huidige blootstellingslimieten van VC (beroeps-en milieu) veilig zijn. Het gebruik van dit model kan nieuw licht en bezorgdheid werpen op de Risico's van blootstelling aan de VC. Dit model van Toxicant-geïnduceerde leverschade kan worden gebruikt voor andere vluchtige organische stoffen en om andere interacties die van invloed kunnen zijn op de lever en andere orgaansystemen te bestuderen.
Introduction
Veel toxicantia zijn aanwezig in de lucht die we inademen op zeer lage niveaus. Vinyl chloride (VC) is monomerische gas dat door de industrie wordt gebruikt om kunststof producten voor polyvinylchloride (PVC) te maken1. Het is een overwegend milieu-hepatotoxicant, bekend kankerverwekkend, en is gerangschikt #4 op de ATSDR gevaarlijke stof prioriteitslijst2. Om de toxische effecten op de menselijke gezondheid en interacties met bestaande co-morbiiteiten beter te begrijpen, is het cruciaal om modellen van blootstelling vast te stellen die menselijke blootstelling nabootsen. Het primaire belang van deze groep is het bestuderen van de hepatische effecten van chronische blootstelling van de VC bij lage concentraties. VC oefent de belangrijkste effecten op de lever uit, waar het is aangetoond (bij hoge concentraties) om steatose te veroorzaken, en Toxicant-geassocieerde Steatohepatitis (Tash) met necrose, fibrose, cirrose3,4, evenals hepatocellulaire carcinoom (HCC) en de verder uiterst zeldzame hepatische hemangiosarcoom5. TASH heeft waarschijnlijk decennia lang bestaan in de bevolking, maar bleef niet gekarakteriseerd en ondergewaardeerd door onderzoekers4,6. Als gevolg van onderzoek waaruit de directe toxiciteits problemen voor de blootstelling aan VC blijken, verlaagde de Arbeidsveiligheids-en Gezondheidsadministratie (OSHA) de acceptabele blootstellings drempel tot 1 ppm over een 8 uur werkdag7. Hoewel de blootstellings drempel is verlaagd, is het effect van deze concentratie van VC op de menselijke gezondheid onduidelijk7. Bovendien is het effect van blootstelling aan de VC op bestaande comorbiditeiten, zoals leverziekte, grotendeels onbekend8. Deze kenniskloof is vooral belangrijk vandaag vanwege de toenemende wereldwijde prevalentie van niet-alcoholische vette leverziekte (nalfd)4,6,7,9,10,11,12. Belangrijk is dat VC onlangs is aangetoond dat het een onafhankelijke risicofactor is voor leverziekte van andere oorzaken13. Het doel van dit protocol was daarom om een relevant inhalatie model te ontwikkelen voor blootstelling aan het vluchtige milieu Toxicant, VC in de context van onderliggende leverschade, om de blootstelling van de mens na te bootsen en potentiële, nieuwe mechanismen van door VC geïnduceerde of VC-verhoogde leverbeschadiging te identificeren.
De belangrijkste blootstellingsroute voor veel milieu toxicanten en verontreinigende stoffen is via inademing. Eenmaal geïnhaleerd, de verbinding kan invoeren systemische circulatie door de longen, reizen naar de lever, en metabolisch worden geactiveerd door hepatische enzymen voorafgaand aan het wordt uitgescheiden14,15,16. Het is vaak deze actieve metabolieten die leiden tot toxiciteit en schade in het lichaam. Eerdere studies van deze groep en anderen hebben VC-metabolieten gebruikt als surrogaten voor blootstelling aan VC gas17,18. Andere groepen hebben gebruik gemaakt van inhalatie modellen van VC; echter, zeer hoge blootstellingsniveaus (> 50 ppm) werden uitgevoerd voor het opwekken van acute toxiciteit, ernstige leverschade, en tumor ontwikkeling19. Hoewel deze studies cruciale informatie en mechanismen van VC-geïnduceerde carcinogeniteit hebben verschaft, herformuleren ze de subtiele effecten en complexe interacties met andere bijdragende factoren niet en zijn daarom minder relevant voor de menselijke blootstelling.
De VC-inhalatie plus high fat Diet (Hfd) model hier beschreven (Zie Figuur 1 voor tijdlijn), is het eerste model van chronische, lage dosis VC blootstelling (d.w.z. subosha concentratie), waarbij muizen worden blootgesteld aan het toxische onder omstandigheden die de blootstelling van de mens veel nauwer nabootsen. Inderdaad, gegevens van dit model recapitgeerden resultaten waargenomen bij mensen blootgesteld aan VC, zoals de impact op metabole trajecten20, oxidatieve stress en mitochondriale disfunctie4. Andere Muismodellen van inademing, zoals alleen-kop-en alleen-neus modellen21, vereisen dat het dier wordt ingetogen, wat stress aan het dier veroorzaakt. Hier vereist de blootstellingsmethode voor het hele lichaam geen injectie of onnodige stress voor de dieren. De dieren hebben ad libitum toegang tot voedsel en water en worden geplaatst binnen de grotere inhalatie kamer voor een bepaald aantal uren per dag en dagen per week. Bovendien is het concept dat VC de gevoeligheid voor een andere hepatotoxicant wijzigt een nieuwe bevinding, die voor het eerst wordt aangetoond door deze groep12 en implicaties heeft voor de blootstelling aan VC bij concentraties die ruim onder die voor directe hepatotoxiciteit nodig zijn.
Deze methode van blootstelling aan inademing kan worden gebruikt voor het nabootsen van blootstelling aan een verscheidenheid aan gasvormige toxicantia, waaronder andere vluchtige organische stoffen, die aanwezig zijn in onze omgeving. Vluchtige organische stoffen zijn immers een grote groep milieu toxicanten en komen vaker voor in geïndustrialiseerde gebieden, waardoor bepaalde populaties een hoger risico lopen op chronische blootstelling22. Dit protocol kan worden aangepast aan verschillende experimentele vragen. De lengte van de tijd en de concentratie van samengestelde toegediend kunnen worden gevarieerd. Hoewel in eerste instantie ontwikkeld voor de bepaling van leverschade, andere orgaansystemen kunnen en zijn bestudeerd met dit model23. Onderzoekers die streven naar het bestuderen van chronische blootstellingen met dieren, maar de stress van dieren willen minimaliseren, moeten overwegen om dit model te gebruiken.
Protocol
Alle dier/VC experimenten werden goedgekeurd door het ministerie van milieu gezondheid, de veiligheids vereniging voor beoordeling en accreditatie van laboratoriumdieren verzorging en procedures werden goedgekeurd door de lokale institutionele Dierenzorg en gebruik Comité.
1. experimentele opstelling en acclimatisering voor gezuiverde, experimentele diëten
- Bepaal het totale aantal C56Bl/6J muizen (minimaal 6 − 8 muizen per groep).
Opmerking: dieren van elke dieet groep zullen verder onderverdeeld worden in blootstellings groepen. Zorg ervoor dat u rekening met het totale aantal dieren die nodig zijn bij het plannen van de studie. - Identificeer en weeg de dieren. Noteer deze gegevens.
- Schakel diëten van reguliere Chow naar gezuiverde Low-Fat (LFD) of vetrijke voeding (HFD) een week voor aanvang van de inhalatie experimenten om de muizen te acclimeren aan de nieuwe diëten (Zie Figuur 1 voor tijdlijn).
- Geef voedsel en water ad libitum. Bewaak de voedselconsumptie door weging en registratie van het voedsel dat per kooi moet worden toegediend, en weeg en registreer de rest van het voedsel op elke voederdag. Als de behuizing 4 muizen per kooi, bieden ~ 50 g voedsel tweemaal per week. Als huisvesting 5 muizen per kooi, bieden ~ 60 g voedsel twee keer per week.
Opmerking: tijdens het voederen van de gezuiverde diëten moet de hoeveelheid voedsel elke dag worden gecontroleerd om ervoor te zorgen dat de muizen voldoende pellets hebben. Als er onvoldoende pellets zijn, hebben de muizen de neiging om voedsel te ' Hoard ' en de inname te verhogen. Bovendien, vooral de HFD neigt te verkruimel veel meer dan de LFD, waardoor een soortgelijk effect. - Bewaak dieren gedurende het experiment om ervoor te zorgen dat de diergezondheid wordt gehandhaafd.
Opmerking: wekelijkse gewichtstoename en voedselconsumptie, samen met metabole monitoring kan worden gedaan om een index van de algehele diergezondheid te bieden.
2. Vinyl chloride inhalatie blootstellings systeem
Opmerking: er zijn meerdere inhalatie blootstelling systemen in de handel verkrijgbaar, variërend van ' alleen in de neus ' tot ' hele lichaam ' blootstelling en handmatige tot geautomatiseerde systemen. Gegevens die eerder door deze groep zijn gepubliceerd, zijn afgeleid van een handmatig systeem12,23,24. In Figuur 2wordt een diagram weergegeven waarin het automatische blootstellings systeem voor inhalatie wordt beschreven.
- Ervoor zorgen dat de lucht verdunningsmiddel in zowel de experimentele als de controlekamers hoogrenderende deeltjes lucht (HEPA) en actieve kool gefilterd, gedroogd en druk gereguleerd is voordat zij hun respectieve stroom meetapparatuur invoeren (massastroom regelaar [MFC ] – experimentele kamer, rotameter – controlekamer).
Opmerking: in de controlekamer regelt de rotameter de luchtstroom naar de muizen. De lucht komt de bovenkant van de kamer binnen, passeert de muizen, is uitgeput onder de muizen en passeert een HEPA-filter voordat hij de chemische kap binnengaat. Temperatuur en relatieve vochtigheid (RH) worden gemeten in de kamer. In de experimentele kamer wordt de verdunningslucht gemengd met lucht uit een VC-tank. Beide stromen worden gereguleerd met Mfc's. De verhouding tussen de twee mengsels bepaalt de concentratie van VC in de experimentele kamer. De VC komt de bovenkant van de belichtings kamer binnen door een verspreider met zeven stralen die in verschillende richtingen wijzen. De VC passeert de muizen en wordt vervolgens uitgeput door 12 afzonderlijke poorten die onder het kooi rack zijn geplaatst. Aangetoond is dat dit kamer ontwerp homogene toxicaatconcentraties eerder dan25biedt. - Zorg ervoor dat de druk, temperatuur en RV worden bewaakt vanuit de experimentele en de controlekamers.
- Bevestig dat de uitlaat van de kamer wordt doorgegeven via een HEPA-filter, een CO2 -sonde en een actief koolstoffilter voordat u het uitlaat gebied van de chemische afzuigkap binnengaat en dat het co2 -niveau wordt bewaakt om ervoor te zorgen dat de muizen een acceptabele ventilatie krijgen.
- Gebruik de aangepaste software voor het wijzigen, bewaken en registreren van omgevingsvariabelen tijdens blootstelling aan inademing.
Opmerking: als een handmatig systeem wordt gebruikt, moeten de variabelen die worden beschreven in stap 2.1 − 2.4 worden bewaakt en gekalibreerd, indien nodig regelmatig gedurende de blootstellingsperiode.
3. opstelling vóór blootstelling
- Schakel alle luchtstromen in de experimentele en controlekamers uit voor de veiligheid van technici.
- Open voor elke kamer de deur van de kamer en plaats absorberend strooisel materiaal (absorberend zijde omhoog) bovenop de Uitschuif pan. Bevochtig het absorberende materiaal om gedurende de blootstellingsperiode een comfortabel vochtigheidsniveau (40 − 60% RV) te bieden.
- Stel het gewenste belichtingsniveau van VC in de kamer in. Voor subosha-grens concentraties wordt 0,85 ppm van VC gebruikt. Gebruik de door software beheerde, op een detector gebaseerde feedback besturing van de VC-bezorging aan de kamer of gebruik handmatige aanpassingen aan het systeem.
Opmerking: deze laatste benadering vereist kennis van het kamervolume, kamer vernieuwingsfrequentie, luchtstroom en leveringssnelheid van het VC-gas uit de voorraad toevoer; deze berekeningen moeten vervolgens worden gevalideerd en gekalibreerd door metingen van de VC-concentraties in de kamer bij steady state12,24. De meest gebruikte techniek voor het meten van VC in de kamer is via gaschromatografische analyse van monster lucht12,24. De voordelen van de softwaregestuurde aanpak met betrekking tot nauwkeurigheid en precisie van de levering van de VC zijn duidelijk. Echter, het is aangetoond dat de handmatige aanpak is ook nauwkeurig en consistent12,24.
Let op: VC is een bekend toxische en kankerverwekkend op hoge niveaus. Gebruik de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen en de handling van het gas bij het in-en uitschakelen van de kamers.
4. blootstellings kooi en dier voorbereiding
- Verwijder de muizen uit hun behuizings kamers en plaats ze in de individuele kooien van het kooi rack van de inhalatie kamer (één kooi rack voor de controle muizen, één voor de blootgestelde muizen). Willekeurig de plaatsing van elke muis in het kooi rack dagelijks om ervoor te zorgen dat elke muis wordt blootgesteld homogenously binnen de belichtings kamer. Markeer het nummer van elk dier en de positie van de kooi in de laboratorium notebook.
- Plaats elk kooi rack in de betreffende kamer en sluit de kamerdeuren.
5. het uitvoeren van een blootstelling
- Zorg ervoor dat de klep voor de VC-gastank in de open positie staat. Zorg ervoor dat de verdunnings vloeistofstroom voor de experimentele kamer is ingesteld op 25 L/min.
- Start de verdunnings vloeistofstroom in de experimentele kamer. Zorg ervoor dat de rotameter op de controlekamer is ingesteld op 25 L/min.
- Zorg ervoor dat alle sensoren (stromen, temperatuur, vochtigheid, kamer druk, CO2 -niveau) correct werken en de verwachte resultaten in zowel de experimentele als de controlekamers weergeven.
Opmerking: de VC-stroom wordt berekend en ingesteld op basis van de verdunnings vloeistofstroom en de gewenste VC-concentratie. - Zorg ervoor dat tijdens de blootstelling, in de experimentele kamer, de blootstellingstijd, de stroom van het verdunningsmiddel, de VC-stroom, temperatuur, vochtigheid, kamer druk, CO2 -niveau en theoretische VC-concentratie worden weergegeven, gegrapheerd en geregistreerd. Bevestig dat de temperatuur en vochtigheid voor de controlekamer ook worden weergegeven, grafisch en opgenomen.
Opmerking: als een handmatig systeem wordt gebruikt, moet de VC-stroom tijdens de blootstellingsperiode worden gecontroleerd en aangepast, indien nodig. - Als er zich problemen voordoen tijdens de belichting, stelt u de VC-stroom in op nul en verhoogt u de stroom van het verdunningsmiddel tot de maximale waarde om de kamer snel te zuiveren.
- Zodra de belichtingsduur (d.w.z. 6 h/dag) is bereikt, schakelt de software automatisch de VC-stroom uit. De 15 min veiligheidstimer begint dan voor de tijd na de duur van de experimentele kamer om de VC te wissen. Zodra het veilig is om de dieren te verwijderen, klikt u op de OK knop in het dialoogvenster. Het systeem zal stoppen met het opnemen van metingen naar het bestand en de belichting is voorbij.
Opmerking: als een handmatig systeem wordt gebruikt, moet de gebruiker de VC-stroom handmatig uitschakelen aan het einde van de belichtingsduur en de tijd voor de klaring van de VC aan het einde van de belichting moet worden berekend.
6. na de blootstelling
- Zet kraantje op de klep voor de VC-gastank naar de gesloten positie en schakel alle luchtstromen in de belichtings kamer uit. Draai de rotameter totdat er geen luchtstroom door de controlekamer stroomt.
- Verwijder de deuren van elke kamer om de muizen ventilatie te geven. Verwijder de kooi rekken van de kamers. Onder een kap, verwijder de muizen uit hun blootstellings kooien en plaats ze terug in hun kooien. Vervoer alle muizen terug in hun woonkamer voor een overnachting in gewone kooien.
- Verwijder afvalstoffen uit de uitschuifbare pan naar een departement voor milieu gezondheid & veiligheid (DEHS)-goedgekeurde Biohazard container, aangezien deze kunnen worden beschouwd als een chemisch gevaar door institutionele milieuzorg diensten. Reinig de deuren van de kamer, de uitwerpselen pan, de blootstellings kooi en de belichtings kamer voor de experimentele en controlesystemen.
7. validering van de VC-concentratie in kamers tijdens blootstelling
- Een meting van de VC-concentratie binnen de experimentele kamer halverwege elke blootstelling (3 uur) uitvoeren.
- Breek de glazen uiteinden op een VC detector buis en een voorbehandelen buis. Bevestig het uitstroom uiteinde van de VC-detector buis aan de detector buis pomp. Bevestig het stroom-in-uiteinde van de VC-detector buis aan het uitstroom uiteinde van de voorbehandelen buis met een kort stukje slang. Bevestig een kort stukje slang aan het doorstroom uiteinde van de voorbehandelen buis.
- Verwijder een stekker uit een van de bemonsterings poorten in de buurt van de Ademhalings zone van de muizen. Bevestig de slang van het stroom-in-uiteinde van de voorbehandelen buis naar de bemonsteringspoort.
- Uit de volledige in positie, Verleng de hendel op de zuiger van de detector buis pomp naar de volledige out positie. Dit zal 100 mL bemonsterd gas uit de kamer in de VC-detector buis trekken gedurende een periode van 90 s. Na het wachten op de 90 s, duw de hendel terug in.
- Herhaal stap 7,4 nog drie keer zodat in totaal 400 mL in de VC detector buis wordt getrokken.
- Verwijder de buis van de bemonsteringspoort van de kamer en plaats de stekker opnieuw in de poort. Inspecteer de kleurverandering van de VC-detector buis om de VC-concentratie binnen de kamer vast te stellen.
- Noteer de VC detector buis lezing in de laboratorium notebook en vergelijken met de theoretische waarde. Gooi de VC detector buis en voorbehandelen buis in een geschikte container.
8. beëindiging van inhalatie blootstelling experiment
Opmerking: na het gewenste tijdpunt van blootstelling, bijvoorbeeld 6, 8 en/of 12 weken na het begin van de blootstelling aan inademing, worden de experimenten beëindigd en worden de dieren geëtaliseerd (Zie Figuur 1 voor tijdlijn).
- Snel de muizen 4 h voorafgaand aan de tijd van euthanasie.
Opmerking: deze procedure maakt bepaling van vasten bloedglucose en insulineniveaus voor metabole analyse. - Gebruik een euthanasie benadering die consistent is met de richtlijnen van de American Veterinary Medical Association (AVMA), zoals anesthesie gevolgd door exsanguination.
- Dien ketamine/xylazine (100/15 mg/kg) door intraperitoneale injectie toe aan elke muis om anesthesie te induceren.
Opmerking: Vermijd natriumpentobarbital als een pre-euthanasie anestheticum, aangezien blootstelling aan vinylchloride de effectiviteit ervan kan belemmeren. - Verzamel bloed van de inferieure Vena Cava in Natriumcitraat oplossing (Final, 0,38%), om bloedstolling te voorkomen en voor monster conservering.
- Verwijder de lever en/of een ander gewenst orgaan. Ontleden de lever en snap-Freeze porties in vloeibare stikstof, insluiten in bevroren specimen medium, en Fix in 10% gebufferde formaline voor histologie.
- Scheid plasma van bloed via centrifugeren en breng het citrated plasma over in een geschikte buis en bewaar bij-80 °C totdat het nodig is voor analyse.
- Om histologische indices van leverletsel te evalueren, voert u HEMA oxylin en eosine (H & E) kleuring uit met 5 μM formaline vaste-paraffine-ingesloten lever secties en verkrijgt u beelden met een brightfield-Microscoop.
- Om plasma transaminasespiegels te verkrijgen, voert u zowel alanineaminotransferase (ALAT) als aspartaataminotransferase (AST) kinetische testen uit op het citrated plasma met behulp van commercieel verkrijgbare Kits.
Opmerking: voor kwaliteitscontrole moeten plasma transaminasen voor C57Bl/6J muizen zich in het normale bereik (35 − 45 IU/L) voor de LFD + VC groep bevinden, terwijl waarden moeten worden verhoogd (~ 150 IU/L) voor de HFD + VC groep (Figuur 3C).
Representative Results
In de loop van het experiment werden het dierlijk lichaamsgewicht en de voedselconsumptie wekelijks gecontroleerd om de diergezondheid te waarborgen en in vivo metabolisme te evalueren. Figuur 3a toont het lichaamsgewicht en de voedselconsumptie voor een experiment van 12 weken. Het lichaamsgewicht werd eenmaal per week gemeten en de voedselconsumptie werd tweemaal per week gemeten voor alle groepen. Alle muizen kregen gewicht in de loop van de studie. Terwijl, zoals verwacht, de muizen in de HFD-groepen meer gewicht kregen als de muizen in de LFD-groepen, kregen de muizen die werden blootgesteld aan VC niet meer gewicht dan de muizen in de respectieve controlegroep. De voedselconsumptie was niet verschillend tussen alle groepen12,24.
Figuur 3B toont representatieve photomicrografen van de lever secties gekleurd met H & E voor analyse van de algemene morfologie. In de LFD-groep veroorzaakte VC geen overt pathologische veranderingen. HFD-voeding significant verhoogde steatose (vetophoping) en blootstelling aan VC verhoogde dit effect. Bovendien resulteerde de blootstelling van de VC in de Hfd-groep in een aantal inflammatoire Foci12,24.
Plasma transaminase (ALT en AST) niveaus werden gemeten als indicatoren van leverschade en een verhoogde transaminase niveau is een indicator van leverschade. In de LFD-groep heeft VC de transaminasespiegels niet verhoogd. Hfd alleen iets verhoogde transaminase niveaus en belangrijker VC aanzienlijk verbeterd dit effect (Figuur 3C)12,24.
Voor elke groep zijn de verhoudingen van het lever gewicht tot het lichaamsgewicht berekend. HFD aanzienlijk toegenomen de lever naar lichaamsgewicht verhoudingen. VC heeft dit effect echter niet significant verhoogd (Figuur 3D)12.
Figuur 1: overzicht van de procedure van het inhalatie model. Muizen worden gevoed met de respectieve laag vetgehalte (13% verzadigde vetten) of vetrijke (42% verzadigde vetten) diëten ad libitum voor 1 week om ze te acclimatiseren aan het gezuiverde dieet. Na een week worden muizen geïntroduceerd in het inhalatie regime. Hiervoor worden muizen in State-of-the-art inhalatie kamers in het hele lichaam geplaatst voor blootstelling aan een subosha niveau VC concentratie van < 1 ppm (0,85 ppm ± 0,1 ppm) of kamerlucht (controle) voor 6 h/dag, 5 dagen/week, gedurende 12 weken. Tijdens de inhalatie procedure zijn de muizen vrij toegang tot voedsel en water toegestaan. Na 12 weken worden muizen in de ochtend geëerd. Dit model kan worden verlengd tot langere perioden van chronische blootstelling. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: ontwerp van de inhalatie kamer. Er wordt een diagram weergegeven van een geautomatiseerd blootstellings systeem voor inhalatie dat homogene toxicerende concentraties biedt. Met aangepaste software kan de gebruiker omgevingsvariabelen wijzigen, bewaken en registreren tijdens blootstelling aan inademing. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Vinyl chloride alleen veroorzaakt geen overt leverletsel maar verbetert dieet-geïnduceerde leverziekte. A) het lichaamsgewicht en de voedselconsumptie wekelijks werden gemonitord. B) representatieve photomicrografen van algemene lever morfologie door H & E kleuring worden getoond (vergroting = 200x). C) het citrated plasma werd aan het einde van de blootstellingsperiode verzameld en geanalyseerd op de enzymatische activiteit van de transaminase als een index van leverschade. D) het lever gewicht werd bepaald op verschillende experimentele tijdstippen en vergeleken met het gehele lichaamsgewicht. De resultaten worden gepresenteerd als de gemiddelde ± SEM.a, p < 0,05 in vergelijking met de respectieve LFD-besturing; b, p < 0,05 vergeleken met afwezigheid van VC. Grootte van de monsters per groep n = 8 − 10. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Discussion
Dit model van VC-Enhanced NAFLD is een nieuwe methode om het effect van subosha limiet VC blootstelling in een Whole-Body inhalatie paradigma te evalueren. Dit model stelt onderzoekers in staat om de sub-Hepatotoxische en sensibiliserende effecten te bestuderen door lage niveaus van VC alleen. Inderdaad, dit co-exposure model bereikt verbeterde leverschade, verhoging van plasma ALT en AST en matige ontsteking, terwijl het grotendeels niet van invloed op andere orgaansystemen, zoals hart, bij deze concentratie23. Dit chronische model vereist hele lichaam inhalatie kamers, maar minimaliseert stress en blootstellingsconcentraties. Hoewel het hier gepresenteerde protocol een softwaregestuurde aanpak is, heeft onze ervaring aangetoond dat de handmatige aanpak ook een nauwkeurige en consistente blootstellingsmethode is van12,24. Bovendien is het gemakkelijk toepasbaar op meerdere onderzoeksgebieden, waaronder andere orgaanschade23 veroorzaakt door blootstelling aan vluchtige organische stof22. Met name kan dit model meer lijken op de pathogenese van menselijke co-blootstellingen aan milieu chemicaliën en onderliggende ziekte5.
Om vergelijkbare resultaten te verkrijgen, moeten bepaalde kritieke stappen van protocol optimalisatie worden gerealiseerd. Onderzoekers moeten bijvoorbeeld vaststellen dat de concentratie van VV of andere toxische binnen de kamers binnen het gewenste blootstellingsbereik valt (d.w.z. laag niveau, subosha of acute niveaus). Het optimaliseren van deze stap van de inhalatie kamer is van cruciaal belang voor een succesvol model van de menselijke blootstelling van belang. Ten tweede kan het aanpassen van de blootstellingstijd per dag en de duur van het experiment ook worden gewijzigd. Volgens de belangen van deze groep werd een instelling voor beroepsmatige blootstelling bereikt en werd ook een aanvullende parameter van de voeding bestudeerd. Milieu-en acute blootstellingen kunnen echter ook met dit protocol worden gemodelleerd.
Dit werk daagt het paradigma uit dat de huidige blootstellingslimieten van VC (beroeps-en milieu) veilig zijn. Hoewel de huidige OSHA-blootstellingslimiet voor VC 1 ppm is, heeft dit model bewezen dat de concentraties van VC onder deze limiet voldoende zijn om leverschade veroorzaakt door HFD bij muizen te verbeteren. Dit protocol stelt onderzoekers in staat om een roman toxische exposure paradigma te bestuderen en te karakteriseren en om Tash te modelleren.
Dit is het eerste model van chronische, lage dosis VC-blootstelling. Eerdere werkzaamheden gebruikten zeer hoge bolus concentraties, acute blootstellingen of actieve metabolieten als surrogaten voor de blootstelling aan VC. Al deze benaderingen verminderen de relevantie van de bevindingen voor blootstelling van de mens. Daarom biedt dit nieuwe model van TASH-NAFLD interaction het nodige platform voor onderzoekers om complexe interacties van laag niveau VC-blootstelling te onderzoeken.
Dit model van Toxicant-geïnduceerde leverschade kan worden gebruikt voor andere vluchtige organische stoffen en ook voor het bestuderen van andere interacties die van invloed kunnen zijn op de lever en andere orgaansystemen8,22,23. Dit model is en kan verder worden gebruikt om interventie therapieën en diepgaande mechanistische studies van de werkingswijze voor deze overwegend toxische24te onderzoeken. Aangezien VC een bekend kankerverwekkend is26,27,28, kan dit blootstellings paradigma ook worden aangepast voor de studie van door VC geïnduceerde kanker. Andere co-morbiiteiten zoals alcoholische leverziekte kunnen ook worden versterkt door VC co-exposure. Daarnaast zou het interessant zijn om verschillende soorten vet te bestuderen, zoals meervoudig onverzadigde vetten18,29,30of verschillende soorten koolhydraten31 en hun co-Exposure met VC in dit model. Inderdaad, al deze factoren zijn bekend dat differentiële effecten op de ontwikkeling van leverschade en kunnen een rol spelen bij VC-geïnduceerde hepatische ziekte.
Concluderend, dit is een roman inhalatie model van milieu Toxicant-geïnduceerde leverschade en stelt een blootstellings paradigma voor chronische, laag niveau VC blootstelling. De concentratie van VC gebruikt in dit model is sub-Hepatotoxische door zelf, terwijl het verbetert leverschade veroorzaakt door een andere factor (HFD) in muizen. Dit model zal onderzoekers in staat stellen om mechanismen en interventies voor chronische VC-toxiciteit te bestuderen en kan nuttig zijn voor translationele studies die kijken naar blootgestelde menselijke proefpersonen en met het hoogste risico op blootstelling.
Disclosures
WT Goldsmith heeft financiële belangen in IEStechno, dat is de sjabloon voor het beschreven systeem. De overige auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Deze studie werd gefinancierd door Awards van de National Institutes of Health (K01 DK096042 en R03 DK107912) aan Juliane Beier. Het onderzoek werd ook gesteund door een institutionele ontwikkelings prijs (IDeA) van het National Institute of General Medical Sciences van de National Institutes of Health onder Grant Number P20GM113226 en het Nationaal Instituut voor alcoholmisbruik en alcoholisme van de National Institutes of Health onder het Awardnummer P50AA024337. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ALT/AST reagents | Thermo Fisher | TR70121, TR71121 | |
| C57Bl/6J mice | The Jackson Laboratory | 000664 | Animal studies must conform to all relevant ethics and animal welfare regulations and must be reviewed and approved by the appropriate governmental and institutional animal care and use committees. Since this is a chronic study, we recommend using male or female mice 4-6 weeks of age. |
| CO2 Monitor | IEStechno | Ex-Sens | |
| Eosin | Sigma | E6003 | |
| Hematoxylin | Sigma | HHS16 | |
| Inhalation exposure chamber system | IEStechno | GasExpo | The inhalation exposure chamber system includes custom software, interface and controller hubs |
| Saturated fat (13%) control diet | Teklad Diets | TD.120336 | |
| Saturated fat (42%) diet | Teklad Diets | TD.07511 | |
| Sodium citrate | Sigma | 71497 | |
| Vinyl Chloride | MATHESON TRI-GAS | Series 3590-CGA* | Handle gas with caution |
References
- Sass, J. B., Castleman, B., Wallinga, D. Vinyl chloride: a case study of data suppression and misrepresentation. Environmental Health Perspectives. 113 (7), 809-812 (2005).
- ATSDR. Agency for Toxic Substances and Disease Registry (ATSDR): Toxicological profile for Vinyl Chloride. , (2006).
- Wahlang, B., et al. Toxicant-associated steatohepatitis. Toxicologic Pathology. 41 (2), 343-360 (2013).
- Cave, M., et al. Toxicant-associated steatohepatitis in vinyl chloride workers. Hepatology. 51 (2), 474-481 (2010).
- Cave, M., Falkner, K. C., McClain, C. J. Occupational and Environmental Hepatotoxicity. Zakim and Boyer's Hepatology. Boyer, D. T., Manns, M. P., Sanyal, A. J. , Saunders. Philadelphia, PA. 476-492 (2012).
- Tamburro, C. H., Makk, L., Popper, H. Early hepatic histologic alterations among chemical (vinyl monomer) workers. Hepatology. 4 (3), 413-418 (1984).
- EPA. Toxicological review of vinyl chloride in support of summary information on the Integrated Risk Information System. EPA. , (2000).
- Lang, A. L., Beier, J. I. Interaction of volatile organic compounds and underlying liver disease: a new paradigm for risk. Biological Chemistry. 399 (11), 1237-1248 (2018).
- Abplanalp, W., et al. Benzene exposure is associated with cardiovascular disease risk. PLoS ONE. 12 (9), 0183602 (2017).
- Younossi, Z., et al. Global burden of NAFLD and NASH: trends, predictions, risk factors and prevention. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 15 (1), 11-20 (2018).
- Younossi, Z. M. Non-alcoholic fatty liver disease - A global public health perspective. Journal of Hepatology. 70 (3), 531-544 (2019).
- Lang, A. L., et al. Vinyl chloride dysregulates metabolic homeostasis and enhances diet-induced liver injury in mice. Hepatology Communications. 2 (3), 270-284 (2018).
- Lotti, M. Do occupational exposures to vinyl chloride cause hepatocellular carcinoma and cirrhosis. Liver International. 37 (5), 630-633 (2017).
- Antweiler, H. Studies on the metabolism of vinyl chloride. Environmental Health Perspectives. 17, 217-219 (1976).
- Bolt, H. M. Metabolic activation of vinyl chloride, formation of nucleic acid adducts and relevance to carcinogenesis. IARC Scientific Publications. (70), 261-268 (1986).
- Guengerich, F. P., Crawford, W. M., Watanabe, P. G. Activation of vinyl chloride to covalently bound metabolites: roles of 2-chloroethylene oxide and 2-chloroacetaldehyde. Biochemistry. 18 (23), 5177-5182 (1979).
- Anders, L. C., et al. Vinyl Chloride Metabolites Potentiate Inflammatory Liver Injury Caused by LPS in Mice. Toxicological Sciences. 151 (2), 312-323 (2016).
- Anders, L. C., et al. Role of dietary fatty acids in liver injury caused by vinyl chloride metabolites in mice. Toxicology and Applied Pharmacology. 311, 34-41 (2016).
- Morinello, E. J., Koc, H., Ranasinghe, A., Swenberg, J. A. Differential induction of N(2),3-ethenoguanine in rat brain and liver after exposure to vinyl chloride. Cancer Research. 62 (2), 5183-5188 (2002).
- Guardiola, J. J., et al. Occupational exposures at a polyvinyl chloride production facility are associated with significant changes to the plasma metabolome. Toxicology and Applied Pharmacology. 313, 47-56 (2016).
- Chen, L. C., Lippmann, M. Inhalation toxicology methods: the generation and characterization of exposure atmospheres and inhalational exposures. Current Protocols in Toxicology. 63 (1), 1-24 (2015).
- Wahlang, B., et al. Mechanisms of Environmental Contributions to Fatty Liver Disease. Current Environmental Health Reports. 6 (3), 80-94 (2019).
- Liang, Y., et al. Exposure to Vinyl Chloride and Its Influence on Western Diet-Induced Cardiac Remodeling. Chemical Research in Toxicology. 31 (6), 482-493 (2018).
- Chen, L., Lang, A. L., Poff, G. D., Ding, W. X., Beier, J. I. Vinyl chloride-induced interaction of nonalcoholic and toxicant-associated steatohepatitis: Protection by the ALDH2 activator Alda-1. Redox Biology. 24, 101205 (2019).
- Goldsmith, W. T., et al. A computer-controlled whole-body inhalation exposure system for the oil dispersant COREXIT EC9500A. Journal of Toxicology and Environmental Health. Part A. 74 (21), 1368-1380 (2011).
- IARC Working Group on the Evaluation of Carcinogenic Risk to Humans. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. International Agency for Research on Cancer. , Lyon, France. (2008).
- IARC. Chemical agents and related occupations. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. 100, Pt F 9 (2012).
- Fedeli, U., et al. Mortality from liver angiosarcoma, hepatocellular carcinoma, and cirrhosis among vinyl chloride workers. American Journal of Industrial Medicine. 62 (1), 14-20 (2019).
- Kirpich, I. A., et al. Ethanol and dietary unsaturated fat (corn oil/linoleic acid enriched) cause intestinal inflammation and impaired intestinal barrier defense in mice chronically fed alcohol. Alcohol. 47 (3), 257-264 (2013).
- Kirpich, I. A., et al. Saturated and Unsaturated Dietary Fats Differentially Modulate Ethanol-Induced Changes in Gut Microbiome and Metabolome in a Mouse Model of Alcoholic Liver Disease. American Journal of Pathology. 186 (4), 765-776 (2016).
- Spruss, A., Bergheim, I. Dietary fructose and intestinal barrier: potential risk factor in the pathogenesis of nonalcoholic fatty liver disease. Journal of Nutritional Biochemistry. 20 (9), 657-662 (2009).
