Summary
Цель этого протокола заключалась в разработке модели murine низкого уровня токсичного воздействия, который не вызывает явные повреждения печени, а скорее усугубляет уже существующие повреждения печени. Эта парадигма лучше резюмирует воздействие на человека и тонкие изменения, которые происходят при воздействии токсичных концентраций, которые считаются безопасными.
Abstract
Винилхлорид (VC), обильный загрязнитель окружающей среды, вызывает стеатогепатит на высоком уровне, но считается безопасным на более низких уровнях. Хотя несколько исследований исследовали роль VC в качестве прямого гепатотоксиканта, концепция, что VC изменяет чувствительность печени к другим факторам, таким как безалкогольные жировые заболевания печени (NAFLD), вызванные высоким содержанием жира диеты (HFD) является новым. В этом протоколе описывается парадигма воздействия для оценки последствий хронического, низкого уровня воздействия VC. Мыши акклиматизированы к диете с низким содержанием жира или с высоким содержанием жира за неделю до начала ингаляционного воздействия и остаются на этих диетах на протяжении всего эксперимента. Мыши подвергаются воздействию VC (уровень sub-OSHA: lt;1 ppm) или комнатного воздуха в ингаляционных камерах в течение 6 часов/день, 5 дней в неделю, на срок до 12 недель. Еженедельно ведется наблюдение за животными в целях увеличения веса тела и потребления пищи. Эта модель воздействия VC не вызывает явных повреждений печени с вдыханием VC в одиночку. Тем не менее, сочетание VC и HFD значительно усиливает заболевания печени. Техническим преимуществом этой модели совместного воздействия является экспозиция всего тела, без ограничений. Кроме того, условия больше напоминают очень распространенную человеческую ситуацию комбинированного воздействия VC с основной безалкогольной жировой болезни печени и, следовательно, поддерживают новую гипотезу, что VC является фактором экологического риска для развития повреждения печени как осложнение ожирения (т.е. NAFLD). Эта работа бросает вызов парадигме, что нынешние пределы воздействия VC (профессиональные и экологические) являются безопасными. Использование этой модели может пролить новый свет и озабоченность по поводу рисков воздействия VC. Эта модель токсикант-индуцированной травмы печени могут быть использованы для других летучих органических соединений и для изучения других взаимодействий, которые могут повлиять на печень и другие системы органов.
Introduction
Многочисленные токсичные вещества присутствуют в воздухе, которым мы дышим на очень низком уровне. Винилхлорид (VC) является мономерный газ, используемый промышленностью для создания поливинилхлорида (ПВХ) пластиковых изделий1. Это распространенный экологический гепатотоксикант, известный канцероген, и занимает #4 в списке приоритетов ATSDR опасных веществ2. Для лучшего понимания токсического воздействия на здоровье человека и взаимодействия с существующими сопутствующими заболеваниями решающее значение имеет создание моделей воздействия, имитирующих воздействие на человека. Основной интерес этой группы заключается в изучении печеночного воздействия хронического воздействия VC при низких концентрациях. VC оказывает свое основное воздействие на печень, где было показано (при высоких концентрациях), чтобы вызвать стеатоз, и токсиканта связанных стеатогепатит (TASH) с некрозом, фиброзом, циррозомпечени 3,4, а также гепатоцеллюлярной карциномы (HCC) и в противном случае чрезвычайно редко гепатической гемангиосаркомы5. TASH, вероятно, существовали в населении в течение десятилетий, но остался uncharacterized и недооценивается следователями4,6. В результате исследований, демонстрирующих прямые проблемы токсичности для воздействия VC, Управление по охране труда и гигиене труда (OSHA) снизило допустимый порог воздействия до 1 промилле в течение 8 ч рабочий день7. Хотя порог воздействия был снижен, влияние этой концентрации VC на здоровье человека неясно7. Кроме того, влияние воздействия VC на существующие сопутствующие заболевания, такие как заболевания печени, в значительной степени неизвестно8. Этот разрыв знаний особенно важен сегодня в связи с ростом глобальной распространенности безалкогольных жировых заболеваний печени (NALFD)4,6,7,9,10,11,12. Важно отметить, что VC недавно было показано, что независимый фактор риска заболевания печени от других причин13. Таким образом, цель этого протокола заключалась в разработке соответствующей модели ингаляции для воздействия летучих экологических токсикантов, VC в контексте основной травмы печени, чтобы имитировать воздействие на человека и определить потенциальные, новые механизмы VC-индуцированной или VC-улучшенной травмы печени.
Основным маршрутом воздействия многих токсичных веществ окружающей среды и загрязняющих веществ является ингаляция. После вдыхания, соединение может войти в системное кровообращение через легкие, поездки в печень, и стать метаболически активирована печеночными ферментами до выводится14,15,16. Часто именно эти активные метаболиты вызывают токсичность и повреждения в организме. Предыдущие исследования этой группы и другие использовали VC метаболитов в качестве суррогатов для воздействия VC газа17,18. Другие группы использовали ингаляционные модели VC; однако, чрезвычайно высокие уровни воздействия (No gt;50 ppm) были реализованы, чтобы вызвать острую токсичность, тяжелые травмы печеночной железы, и развитие опухоли19. Хотя эти исследования обеспечили важную информацию и механизмы канцерогенности, вызванной VC, они не подводят итоги тонких эффектов и сложных взаимодействий с другими факторами, способствующими этому, и поэтому менее актуальны для воздействия на человека.
VC-ингаляции плюс высоким содержанием жира диеты (HFD) модель описана здесь (см. Рисунок 1 для временной шкалы), является первой моделью хронического, низких доз VC воздействия (т.е. суб-OSHA концентрации), в котором мыши подвергаются воздействию токсиканта в условиях, которые имитируют воздействие человека гораздо более тесно. Действительно, данные из этой модели резюмировал результаты наблюдается у людей, подвергающихся воздействию VC, таких как воздействие на метаболические пути20, окислительный стресс и митохондриальной дисфункции4. Другие мыши модели ингаляции, такие как голова только и нос только модели21, требуют, чтобы животное быть сдержанным, вызывая стресс для животного. Здесь этот метод воздействия всего тела не требует инъекций или ненужного стресса для животных. У животных есть доступ к пище и воде и они помещаются в большую ингаляционную камеру в течение определенного количества часов в день и дней в неделю. Кроме того, концепция, согласно которым VC изменяет чувствительность к другому гепатотоксикату, является новым выводом, впервые продемонстрированный этой группой12 и имеет последствия для воздействия VC в концентрациях значительно ниже тех, которые необходимы для непосредственной гепатотоксичности.
Этот метод ингаляции воздействия может быть использован для имитации воздействия различных газотоксичных веществ, в том числе других летучих органических соединений, присутствующих в нашей среде. Действительно, летучие органические соединения представляют собой большую группу токсичных веществ окружающей среды и более распространены в промышленно развитых районах, в результате чего некоторые группы населения подвергаются более высокому риску хронического воздействия22. Этот протокол может быть изменен в соответствии с различными экспериментальными вопросами. Продолжительность времени и концентрация вводимых соединений могут быть разными. Хотя первоначально разработан для определения повреждения печени, другие системы органов могут и были изучены с этой моделью23. Исследователи, которые стремятся изучить хронические воздействия с животными, но хотят свести к минимуму стресс животных, следует рассмотреть вопрос об использовании этой модели.
Protocol
Все эксперименты с животными/VC были одобрены Департаментом охраны окружающей среды, Ассоциацией по оценке и аккредитации лабораторных животных, а процедуры были одобрены местным Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию.
1. Экспериментальная настройка и акклиматизация к очищенным, экспериментальным диетам
- Определите общее количество мышей C56Bl/6J (минимально 6-8 мышей на группу).
ПРИМЕЧАНИЕ: животные каждой группы диеты будут дополнительно подразделены на группы воздействия. Не забудьте учесть общее количество животных, необходимых при планировании исследования. - Определите и взвесьте животных. Запишите эти данные.
- Переключите диеты от обычного чау к очищенной с низким содержанием жира (LFD) или с высоким содержанием жира диеты (HFD) за неделю до начала ингаляционных экспериментов, чтобы акклиматизировать мышей к новым диетам (см. Рисунок 1 для временной шкалы).
- Обеспечить питание и воду объявление libitum. Мониторинг потребления пищи путем взвешивания и записи пищи, которая будет предоставлена в клетку, и взвешивания и записи оставшейся части пищи в каждый день кормления. Если в корпусе 4 мышей на клетку, обеспечить 50 г пищи два раза в неделю. Если в корпусе 5 мышей на клетку, обеспечить 60 г пищи два раза в неделю.
ПРИМЕЧАНИЕ: Во время кормления очищенных диет, количество пищи должно быть проверено каждый день, чтобы обеспечить мышей достаточно ели. Если есть недостаточно гранулы мышей, как правило, "копить" пищу и увеличить потребление. Кроме того, особенно HFD имеет тенденцию крошиться гораздо больше, чем LFD, вызывая аналогичный эффект. - Мониторинг животных на протяжении всего эксперимента, чтобы обеспечить здоровье животных поддерживается.
ПРИМЕЧАНИЕ: Еженедельное увеличение веса и потребление пищи, наряду с метаболическим мониторингом может быть сделано, чтобы обеспечить индекс общего здоровья животных.
2. Система ингаляции винилхлорида
ПРИМЕЧАНИЕ: Есть несколько ингаляционных систем воздействия коммерчески доступны, начиная от "нос только" на "всего тела" воздействия и руководство автоматизированных систем. Данные, ранее опубликованные этой группой, были получены из системы управления телом12,23,24. Диаграмма, описывающая автоматизированную систему ингаляционного воздействия, показана на рисунке 2.
- Убедитесь, что разбавитель воздуха в экспериментальных и контрольных камерах является высокоэффективным воздухом твердых частиц (HEPA) и активированным углеродом фильтруется, сушеные и давление регулируется перед входом их соответствующих устройств измерения потока (массовый контроллер потока »MFC Экспериментальная камера, ротаметр-управляющая камера).
ПРИМЕЧАНИЕ: В камере управления ротаметр регулирует поток воздуха к мышам. Воздух попадает в верхнюю часть камеры, проходит мимо мышей, затем истощается под мышами и проходит через фильтр HEPA перед входом в химический капот. Температура и относительная влажность (RH) измеряются в камере. В экспериментальной камере разбавительный воздух смешивается с воздухом из венчатого танка. Оба потока регулируются МФЦ. Соотношение двух смесей определяет концентрацию VC в экспериментальной камере. VC входит в верхнюю часть камеры экспозиции через разгонный с семью струями, которые указывают в разных направлениях. VC проходит мимо мышей, а затем исчерпаны через 12 отдельных портов, которые расположены под клеткой стойки. Эта конструкция камеры была показана для обеспечения однородных токсикантовых концентраций ранее25. - Убедитесь, что давление, температура и RH контролируются изнутри экспериментальных и контрольных камер.
- Подтвердите, что камерный выхлоп проходит через фильтр HEPA, зонд CO2 и активированный углеродный фильтр перед входом в выхлопную часть химического капота и что уровень CO2 контролируется, чтобы обеспечить, чтобы мыши получали приемлемую вентиляцию.
- Используйте пользовательское программное обеспечение для изменения, мониторинга и записи экологических переменных во время ингаляционных воздействий.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если используется ручная система, то переменные, описанные в шагах 2.1 и 2.4, должны контролироваться и откалибровано, когда это необходимо регулярно в течение всего периода экспозиции.
3. Предэкспозиционная настройка
- Выключите все воздушные потоки в экспериментальных и контрольных камерах для техники безопасности.
- Для каждой камеры, откройте дверь камеры и поместите абсорбирующего материала постельных принадлежностей (абсорбирующая сторона вверх) на верхней части экскрементной кастрюли. Влажный абсорбирующим материалом, чтобы обеспечить комфортный уровень влажности (40–60% RH) в течение всего периода экспозиции.
- Установите желаемый уровень экспозиции VC в камере. Для предельных концентраций суб-OSHA используйте 0,85 промилле VC. Используйте либо управляемый программным обеспечением, детектор на основе управления обратной связи доставки VC в камеру или использовать ручные корректировки системы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Последний подход требует знания объема камеры, скорости обновления камеры, воздушного потока и скорости доставки VC газа из запаса; эти расчеты должны быть впоследствии проверены и откалиброваны измерениями концентраций VC в камере при стабильном состоянии12,24. Наиболее распространенным методом измерения VC в камере является газовый хроматографический анализ образца воздуха12,24. Преимущества программного подхода в отношении точности и точности доставки VC очевидны. Тем не менее, было показано, что ручной подход также является точным и последовательным12,24.
ВНИМАНИЕ: VC является известным токсикантом и канцерогеном на высоком уровне. Упражнение надлежащего индивидуального защитного оборудования и обработки газа при включании и выключения камер.
4. Клетка выдержки и подготовка животного
- Удалите мышей из их жилых камер и поместите их в отдельные клетки ингаляционной камеры клетки стойки (одна клетка стойки для контрольных мышей, один для подвергаются мышей). Рандомизуйте размещение каждой мыши в клетке стойки ежедневно, чтобы убедиться, что каждая мышь подвергается однородно в камере экспозиции. Отметьте номер каждого животного и положение места расположения клетки в лабораторной тетрадке.
- Поместите каждую стойку клетки в свою соответствующую камеру и закройте двери камеры.
5. Проведение экспозиции
- Убедитесь, что клапан для бензобака VC находится в открытом положении. Убедитесь, что разбавительный поток для экспериментальной камеры установлен на 25 л/мин.
- Запустите разбавительный поток в экспериментальной камере. Убедитесь, что ротаметр на камере управления установлен до 25 л/мин.
- Убедитесь, что все датчики (потоки, температура, влажность, давление камеры, уровень CO2) работают правильно и отображают ожидаемые результаты как в экспериментальных, так и в камерах управления.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поток VC рассчитывается и устанавливается на основе разбавительного потока и желаемой концентрации VC. - Убедитесь, что на протяжении всего воздействия, в экспериментальной камере, время экспозиции, разбавитель потока, VC потока, температура, влажность, давление камеры, CO2 уровне, и теоретической концентрации VC отображаются, графики и записи. Подтвердите, что температура и влажность для контрольной камеры также отображаются, нагнетаются и регистрируются.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если используется ручная система, поток VC должен быть проверен и скорректирован, когда это необходимо, в течение всего периода экспозиции. - Если какие-либо проблемы возникают во время экспозиции, установите поток VC до нуля и увеличьте разбавитель ный поток до максимального значения, чтобы быстро очистить камеру.
- После достижения продолжительности экспозиции (т.е. 6 ч/день) программное обеспечение автоматически выключает поток VC. 15 мин таймер безопасности затем начинается на время после продолжительности для экспериментальной камеры, чтобы очистить VC. Как только это безопасно удалить животных, нажмите на кнопку OK в диалоговом поле. Система прекратит запись измерений в файл и экспозиция окончена.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если используется ручная система, пользователь должен вручную отключить vc поток в конце продолжительности экспозиции и время для VC оформления в конце экспозиции должны быть рассчитаны.
6. Постэкспозиция
- Поверните стоп-кок на клапан ездовый бак VC в замкнутое положение и выключите все воздушные потоки в камере экспозиции. Поверните ротаметр до тех пор, пока не будет течь воздухопоток через камеру управления.
- Удалите двери из каждой камеры, чтобы обеспечить вентиляцию мышей. Удалите стеллажи клетки из камер. Под капотом, удалить мышей из их воздействия клетки и поместить их обратно в свои клетки жилья. Транспорт всех мышей обратно в их жилой комнате для ночлега в обычных клетках.
- Утилизировать любые отходы из экскрементной кастрюли в утвержденный Департаментом охраны окружающей среды и безопасности (DEHS) контейнер для биоопасности, поскольку они могут рассматриваться институциональными службами охраны окружающей среды как химическая опасность. Очистите двери камеры, экскременты кастрюлю, экспозиция клетки стойку и экспозиции камеры для экспериментальных и систем управления.
7. Проверка концентрации VC в камерах во время воздействия
- Проведение измерения концентрации VC в экспериментальной камере на полпути через каждую экспозицию (3 ч).
- Разбейте стеклянные наконечники на трубке детектора VC и предлечивой трубке. Прикрепите кончик трубки детектора VC к насосу трубки детектора. Прикрепите протока в конце трубки детектора VC к проточному концу трубки предварительной обработки с коротким куском труб. Прикрепите короткий кусок трубки к концу трубки.
- Удалите штепсельную вилку из одного из портов выборки, который находится рядом с зоной дыхания мышей. Прикрепите трубку из проточного конца предопроточной трубки к порту отбора проб.
- От полного положения, расширить ручку на поршнене насоса детектор трубки в полном положении. Это позволит вытащить 100 мл пробного газа из камеры в трубку детектора VC в течение 90 с. После ожидания 90-х годов, нажмите на ручку обратно дюйма
- Повторите шаг 7.4 еще три раза, так что в общей сложности 400 мл вытащил в трубку детектора VC.
- Удалите трубку из порта выборки камеры и повторно вставьте вилку в порт. Осмотрите изменение цвета трубки детектора VC, чтобы установить концентрацию VC в камере.
- Запишите показания трубки детектора VC в лабораторном блокноте и сравните с теоретическим значением. Утилизировать трубку детектора VC и предлечивую трубку в подходящем контейнере.
8. Прекращение эксперимента по воздействию ингаляций
ПРИМЕЧАНИЕ: После желаемой временной точки воздействия, например, 6, 8 и/или через 12 недель после начала ингаляционного воздействия, эксперименты прекращаются и животные будут усыплены (см. рисунок 1 для временной шкалы).
- Быстро мышей 4 ч до времени эвтаназии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура позволяет определить уровень глюкозы в крови и инсулина натощак для метаболического анализа. - Используйте эвтаназию подход в соответствии с Американской ветеринарной медицинской ассоциации (AVMA) руководящие принципы, такие как анестезия с последующим exsanguination.
- Администрирование кетамина/ксилазина (100/15 мг/кг) путем интраперитонеальной инъекции каждой мыши, чтобы вызвать анестезию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте пентобарбитала натрия в качестве анестетики до эвтаназии, так как воздействие виниловых хлорида может препятствовать его эффективности. - Сбор крови из нижней полы вены в раствор цитрата натрия (окончательный, 0,38%), чтобы предотвратить свертывание крови и для сохранения образца.
- Удалите печень и/или любой другой желаемый орган. Вскрыть печень и оснастки заморозить части в жидком азоте, вставлять в замороженных средних образцов, и исправить в 10% буферизированных формалин для гистологии.
- Отделить плазму от крови через центрифугацию и перенести цитированную плазму в подходящую трубку и хранить при -80 градусов по Цельсию до тех пор, пока не потребуется для анализа.
- Для оценки гистологических показателей повреждения печени, выполнить гематоксилин и эозин (H и E) окрашивание с 5 мкм формалина фиксированного парафинвстроенных секций печени и получить изображения с ярко-поля микроскоп.
- Для получения плазменной трансаминазы уровни, выполнять как аланина аминотрансферазы (ALT) и аспартат аминотрансферазы (АСТ) кинетические анализы на цитированную плазму с использованием коммерчески доступных комплектов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для контроля качества, плазменные трансаминазы для мышей C57Bl/6J должны быть в нормальном диапазоне (35-45 МЕ/Л) для группы LFD-VC, в то время как значения должны быть повышены (150 МЕ/Л) для группы HFD-VC(рисунок 3C).
Representative Results
В ходе эксперимента еженедельно отслеживались вес тела животных и потребление пищи для обеспечения здоровья животных и оценки метаболизма vivo. На рисунке 3А изображены масса тела и потребление пищи для 12-недельного эксперимента. Вес тела измерялся один раз в неделю, а потребление пищи измерялось два раза в неделю для всех групп. Все мыши набрали вес на протяжении всего исследования. В то время как, как и ожидалось, мыши в группах HFD получили больший вес, как мыши в группах LFD, мыши подвергаются VC не получить больший вес, чем мыши в соответствующей контрольной группе. Потребление продуктов питания не отличалось между всеми группами12,24.
На рисунке 3B изображены репрезентативные фотомикрографы секций печени, окрашенных Н И Е для анализа общей морфологии. В группе LFD VC не вызвал явных патологических изменений. HFD кормления значительно увеличилось стеатоз (накопление жира) и VC воздействия увеличилэтот эффект. Кроме того, vc воздействия в группе HFD привело к некоторым воспалительным очагов12,24.
Уровни плазменной трансаминаза (ALT и AST) измерялись как показатели повреждения печени, а повышенный уровень трансаминаза является показателем повреждения печени. В группе LFD VC не повысил уровень трансаминаза. HFD только несколько увеличилось трансаминаза уровнях и важно VC значительно усилил этот эффект(Рисунок 3C)12,24.
Для каждой группы были рассчитаны коэффициенты веса печени к массе тела. HFD значительно увеличил соотношение печени к массе тела. Тем не менее, VC не значительно увеличить этот эффект(Рисунок 3D)12.
Рисунок 1: Обзор процедуры ингаляционной модели. Мышей кормят соответствующим низким содержанием жиров (13% насыщенных жиров) или высоким содержанием жира (42% насыщенных жиров) диеты ad libitum в течение 1 недели, чтобы акклиматизировать их к очищенной диете. Через неделю мышей вводят в режим ингаляции. Для этого мышей помещают в современные ингаляционные камеры всего тела для воздействия на суб-OSHA уровень VC концентрации lt;1 ppm (0,85 промилле и 0,1 промилле) или комнатный воздух (контроль) в течение 6 ч/день, 5 дней в неделю, в течение 12 недель. Во время ингаляционной процедуры мышам разрешается свободный доступ к пище и воде. В 12 недель мышей усылают утром. Эта модель может быть продлена до более длительных периодов хронического воздействия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Конструкция ингаляционной камеры. Показана схема автоматизированной ингаляционной системы воздействия, обеспечивающей однородные токсичные концентрации. Пользовательское программное обеспечение позволяет пользователю изменять, контролировать и записывать экологические переменные во время ингаляционных экспозиций. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Винил хлорид сам по себе не вызывает явную травму печени, но усиливает диетические заболевания печени. (A) Вес тела и потребление пищи отслеживались еженедельно. (B) Представлены репрезентативные фотомикробые графологии общей печеночной патологии по н и e окрашиванию (увеличение 200x). (C) Цитированная плазма была собрана в конце периода воздействия и проанализирована для трансаминазы ферментатической активности в качестве индекса повреждения печени. (D) Вес печени был определен в разных экспериментальных точек времени и по сравнению с всей массы тела. Результаты представлены в виде среднего значения - SEM.a, p qlt; 0,05 по сравнению с соответствующим управлением LFD; b, р Злт; 0,05 по сравнению с отсутствием VC. Размер образцов на группу n no 8-10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Discussion
Эта модель VC-улучшенной NAFLD является новым методом для оценки влияния суб-OSHA предел vc воздействия в парадигме ингаляции всего тела. Эта модель позволяет следователям изучать суб-гепатотоксических и сенсибилизирующих эффектов на низкий уровень VC в одиночку. Действительно, эта модель совместного воздействия достигает повышенной травмы печени, высота плазмы ALT и AST и умеренное воспаление, в то время как в значительной степени не влияет на другие системы органов, таких как сердце, при этой концентрации23. Эта хроническая модель требует ингаляционных камер всего тела, но сводит к минимуму стресс и концентрацию воздействия. Хотя представленный здесь протокол является программным подходом, наш опыт показал, что ручной подход также является точным и последовательным методом воздействия12,24. Кроме того, он легко применим к нескольким областям исследований, включая другие повреждения органов23, вызванные летучих органических соединений воздействия22. Примечательно, что эта модель может больше напоминать патогенез человеческого совместного воздействия на экологические химические вещества и основные заболевания5.
Для достижения аналогичных результатов необходимо предпринять определенные критические шаги по оптимизации протокола. Например, исследователи должны установить, что концентрация VC или другого токсиканта в камерах находится в пределах желаемого диапазона воздействия (т.е. низкоуровневого, суб-OSHA, или острых уровней). Оптимизация этого шага ингаляционной камеры имеет решающее значение для успешной модели человеческого воздействия интереса. Во-вторых, также может быть изменено время воздействия в день и продолжительность эксперимента. В интересах этой группы была достигнута профессиональная обстановка воздействия, а также был изучен дополнительный параметр диеты. Однако с помощью этого протокола можно также моделировать экологические и острые воздействия.
Эта работа бросает вызов парадигме, что нынешние пределы воздействия VC (профессиональные и экологические) являются безопасными. Действительно, хотя текущий предел воздействия OSHA для VC составляет 1 промилле, эта модель доказала, что концентрации VC ниже этого предела являются достаточными для повышения травмы печени, вызванные HFD у мышей. Этот протокол позволяет следователям изучить и охарактеризовать новую токсикантную парадигму воздействия и смоделировать TASH.
Это первая модель хронического, низкодозного воздействия VC. Предыдущая работа использовала очень высокие концентрации болуса, острые воздействия или активные метаболиты в качестве суррогатов для воздействия VC. Все эти подходы снижают значимость полученных результатов для воздействия на человека. Таким образом, эта новая модель взаимодействия TASH-NAFLD обеспечивает необходимую платформу для исследователей для изучения сложных взаимодействий низкого уровня воздействия VC.
Эта модель токсикант-индуцированной травмы печени могут быть использованы для других летучих органических соединений, а также для изучения других взаимодействий, которые могут повлиять на печень и другие системы органов8,22,23. Кроме того, эта модель была и может быть использована для дальнейшего изучения методов лечения и углубленных механистических исследований способа действия для этого распространенного токсиканта24. Как VC является известным канцерогеном26,27,28, эта парадигма воздействия также могут быть изменены для изучения VC-индуцированного рака. Другие сопутствующие заболевания, такие как алкогольное заболевание печени, также могут быть усилены vc совместного воздействия. Кроме того, было бы интересно изучить различные виды жира, такие как полиненасыщенные жиры18,29,30, или различные виды углеводов31 и их совместное воздействие с VC в этой модели. Действительно, все эти факторы, как известно, имеют дифференцированное воздействие на развитие травмы печени и может играть определенную роль в VC-индуцированной печеночной болезни.
В заключение, это новая модель ингаляции экологических токсичных индуцированной травмы печени и устанавливает парадигму воздействия для хронического, низкого уровня воздействия VC. Концентрация VC, используемая в этой модели, сама по себе субгепатотоксична, в то время как она усиливает повреждение печени, вызванное другим фактором (HFD) у мышей. Эта модель позволит следователям изучать механизмы и мероприятия для хронической токсичности VC и может быть полезна для трансляционных исследований, глядя на открытые человеческие субъекты и на самый высокий риск воздействия.
Disclosures
WT Goldsmith имеет финансовый интерес к IEStechno, который является шаблоном для системы описано. Остальным авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Это исследование было профинансировано наградами от Национальных институтов здравоохранения (K01 DK096042 и R03 DK107912) Джулиану Бейеру. Исследования также были поддержаны премией институционального развития (IDeA) от Национального института общих медицинских наук Национальных институтов здравоохранения под грантом номер P20GM113226 и Национального института по злоупотреблению алкоголем и алкоголизмом Национальные институты здравоохранения под номером премии P50AA024337. Содержание является исключительно ответственностью авторов и не обязательно отражает официальные взгляды Национальных институтов здравоохранения.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ALT/AST reagents | Thermo Fisher | TR70121, TR71121 | |
| C57Bl/6J mice | The Jackson Laboratory | 000664 | Animal studies must conform to all relevant ethics and animal welfare regulations and must be reviewed and approved by the appropriate governmental and institutional animal care and use committees. Since this is a chronic study, we recommend using male or female mice 4-6 weeks of age. |
| CO2 Monitor | IEStechno | Ex-Sens | |
| Eosin | Sigma | E6003 | |
| Hematoxylin | Sigma | HHS16 | |
| Inhalation exposure chamber system | IEStechno | GasExpo | The inhalation exposure chamber system includes custom software, interface and controller hubs |
| Saturated fat (13%) control diet | Teklad Diets | TD.120336 | |
| Saturated fat (42%) diet | Teklad Diets | TD.07511 | |
| Sodium citrate | Sigma | 71497 | |
| Vinyl Chloride | MATHESON TRI-GAS | Series 3590-CGA* | Handle gas with caution |
References
- Sass, J. B., Castleman, B., Wallinga, D. Vinyl chloride: a case study of data suppression and misrepresentation. Environmental Health Perspectives. 113 (7), 809-812 (2005).
- ATSDR. Agency for Toxic Substances and Disease Registry (ATSDR): Toxicological profile for Vinyl Chloride. , (2006).
- Wahlang, B., et al. Toxicant-associated steatohepatitis. Toxicologic Pathology. 41 (2), 343-360 (2013).
- Cave, M., et al. Toxicant-associated steatohepatitis in vinyl chloride workers. Hepatology. 51 (2), 474-481 (2010).
- Cave, M., Falkner, K. C., McClain, C. J. Occupational and Environmental Hepatotoxicity. Zakim and Boyer's Hepatology. Boyer, D. T., Manns, M. P., Sanyal, A. J. , Saunders. Philadelphia, PA. 476-492 (2012).
- Tamburro, C. H., Makk, L., Popper, H. Early hepatic histologic alterations among chemical (vinyl monomer) workers. Hepatology. 4 (3), 413-418 (1984).
- EPA. Toxicological review of vinyl chloride in support of summary information on the Integrated Risk Information System. EPA. , (2000).
- Lang, A. L., Beier, J. I. Interaction of volatile organic compounds and underlying liver disease: a new paradigm for risk. Biological Chemistry. 399 (11), 1237-1248 (2018).
- Abplanalp, W., et al. Benzene exposure is associated with cardiovascular disease risk. PLoS ONE. 12 (9), 0183602 (2017).
- Younossi, Z., et al. Global burden of NAFLD and NASH: trends, predictions, risk factors and prevention. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 15 (1), 11-20 (2018).
- Younossi, Z. M. Non-alcoholic fatty liver disease - A global public health perspective. Journal of Hepatology. 70 (3), 531-544 (2019).
- Lang, A. L., et al. Vinyl chloride dysregulates metabolic homeostasis and enhances diet-induced liver injury in mice. Hepatology Communications. 2 (3), 270-284 (2018).
- Lotti, M. Do occupational exposures to vinyl chloride cause hepatocellular carcinoma and cirrhosis. Liver International. 37 (5), 630-633 (2017).
- Antweiler, H. Studies on the metabolism of vinyl chloride. Environmental Health Perspectives. 17, 217-219 (1976).
- Bolt, H. M. Metabolic activation of vinyl chloride, formation of nucleic acid adducts and relevance to carcinogenesis. IARC Scientific Publications. (70), 261-268 (1986).
- Guengerich, F. P., Crawford, W. M., Watanabe, P. G. Activation of vinyl chloride to covalently bound metabolites: roles of 2-chloroethylene oxide and 2-chloroacetaldehyde. Biochemistry. 18 (23), 5177-5182 (1979).
- Anders, L. C., et al. Vinyl Chloride Metabolites Potentiate Inflammatory Liver Injury Caused by LPS in Mice. Toxicological Sciences. 151 (2), 312-323 (2016).
- Anders, L. C., et al. Role of dietary fatty acids in liver injury caused by vinyl chloride metabolites in mice. Toxicology and Applied Pharmacology. 311, 34-41 (2016).
- Morinello, E. J., Koc, H., Ranasinghe, A., Swenberg, J. A. Differential induction of N(2),3-ethenoguanine in rat brain and liver after exposure to vinyl chloride. Cancer Research. 62 (2), 5183-5188 (2002).
- Guardiola, J. J., et al. Occupational exposures at a polyvinyl chloride production facility are associated with significant changes to the plasma metabolome. Toxicology and Applied Pharmacology. 313, 47-56 (2016).
- Chen, L. C., Lippmann, M. Inhalation toxicology methods: the generation and characterization of exposure atmospheres and inhalational exposures. Current Protocols in Toxicology. 63 (1), 1-24 (2015).
- Wahlang, B., et al. Mechanisms of Environmental Contributions to Fatty Liver Disease. Current Environmental Health Reports. 6 (3), 80-94 (2019).
- Liang, Y., et al. Exposure to Vinyl Chloride and Its Influence on Western Diet-Induced Cardiac Remodeling. Chemical Research in Toxicology. 31 (6), 482-493 (2018).
- Chen, L., Lang, A. L., Poff, G. D., Ding, W. X., Beier, J. I. Vinyl chloride-induced interaction of nonalcoholic and toxicant-associated steatohepatitis: Protection by the ALDH2 activator Alda-1. Redox Biology. 24, 101205 (2019).
- Goldsmith, W. T., et al. A computer-controlled whole-body inhalation exposure system for the oil dispersant COREXIT EC9500A. Journal of Toxicology and Environmental Health. Part A. 74 (21), 1368-1380 (2011).
- IARC Working Group on the Evaluation of Carcinogenic Risk to Humans. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. International Agency for Research on Cancer. , Lyon, France. (2008).
- IARC. Chemical agents and related occupations. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. 100, Pt F 9 (2012).
- Fedeli, U., et al. Mortality from liver angiosarcoma, hepatocellular carcinoma, and cirrhosis among vinyl chloride workers. American Journal of Industrial Medicine. 62 (1), 14-20 (2019).
- Kirpich, I. A., et al. Ethanol and dietary unsaturated fat (corn oil/linoleic acid enriched) cause intestinal inflammation and impaired intestinal barrier defense in mice chronically fed alcohol. Alcohol. 47 (3), 257-264 (2013).
- Kirpich, I. A., et al. Saturated and Unsaturated Dietary Fats Differentially Modulate Ethanol-Induced Changes in Gut Microbiome and Metabolome in a Mouse Model of Alcoholic Liver Disease. American Journal of Pathology. 186 (4), 765-776 (2016).
- Spruss, A., Bergheim, I. Dietary fructose and intestinal barrier: potential risk factor in the pathogenesis of nonalcoholic fatty liver disease. Journal of Nutritional Biochemistry. 20 (9), 657-662 (2009).
