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Neuroscience

ऑर्गानोटिपिक सेरिबेलर स्लाइस संस्कृतियों में पुरकिंजे सेल सर्वाइवल

Published: December 18, 2019 doi: 10.3791/60353
Automatic Translation
1, 1
1Department of Physiology, Northwestern University, Feinberg School of Medicine

Summary

ऑर्गानोटिक स्लाइस संस्कृतियां न्यूरोडेवलपमेंटल या अपक्षयी/पुनर्योजी प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण हैं । यहां, हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो माउस सेरिबेलर स्लाइस संस्कृतियों में पुरकिंजे कोशिकाओं की न्यूरोडेवलपमेंटल डेथ को मॉडल करता है। इस विधि से न्यूरोप्रोटेक्टिव ड्रग डिस्कवरी में शोध को फायदा हो सकता है।

Abstract

ऑर्गानोटिपिक स्लाइस कल्चर एक शक्तिशाली इन विट्रो मॉडल है जो विवो स्थितियों में विवो स्थितियों में विसोसाइटेड प्राथमिक कोशिका संस्कृतियों की तुलना में अधिक निकटता से नकल करता है। प्रारंभिक प्रसवोत्तर विकास में, सेरिबेलर पुरकिंजे कोशिकाओं को एक कमजोर अवधि से गुजरने के लिए जाना जाता है, जिसके दौरान वे प्रोग्राम किए गए सेल डेथ से गुजरते हैं। यहां, हम इस महत्वपूर्ण समय के दौरान माउस ऑर्गानोटिपिक सेरिबेलर स्लाइस संस्कृति प्रदर्शन करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। स्लाइस आगे Purkinje सेल अस्तित्व और न्यूरोप्रोटेक्टिव उपचार की प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए लेबल कर रहे हैं । यह विधि नए न्यूरोएक्टिव अणुओं के लिए स्क्रीन करने के लिए बेहद मूल्यवान हो सकती है।

Introduction

इन विट्रो मॉडलिंग बायोमेडिकल रिसर्च में एक जरूरी उपकरण है। यह जांचकर्ताओं को प्रतिबंधित कोशिका प्रकारों में या अलग-थलग पड़े प्रणालियों/अंगों में विशिष्ट तंत्रों का अध्ययन करने और कसकर नियंत्रित करने की अनुमति देता है । ऑर्गानोपिक स्लाइस कल्चर विट्रो तकनीक में व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है, विशेष रूप से न्यूरोसाइंस1के क्षेत्र में। विधि को पहले Gähwiler द्वारा स्थापित किया गया था, जिन्होंने रोलर ट्यूब तकनीक2का उपयोग करके मस्तिष्क स्लाइस को सुसंस्कृत किया था, और बाद में यामामोटो एट अल द्वारा संशोधित किया गया था, जिन्होंने कॉर्टिकल स्लाइस संस्कृतियों3प्रदर्शन करने के लिए एक माइक्रोपोरस झिल्ली का उपयोग पेश किया था। प्राथमिक कोशिका संस्कृतियों की तुलना में, ऑर्गानोटिपिक स्लाइस संस्कृतियां ऊतक के साइटोआर्किटेक्चर के संरक्षण के साथ-साथ ऊतक अनुभाग के विमान में देशी सेल-सेल कनेक्शन के साथ-साथ देशी सेल-सेल कनेक्शन का लाभ प्रस्तुत करती हैं।

ऑर्गानोटिक स्लाइस को केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के कई हिस्सों से सुसंस्कृत किया गया है, जैसे हिप्पोकैम्पस4,कॉर्टेक्स5,स्ट्रेटम6,सेरिबैलम4,7,और रीढ़ की हड्डी8,9,अन्य लोगों के बीच। वे10नशीली दवाओं की खोज अध्ययन में एक शक्तिशाली उपकरण साबित हुए हैं । न्यूरोएक्टिव अणुओं के प्रभावों का कई मायनों में मूल्यांकन किया जा सकता है: इम्यूनोस्टेनिंग और बायोकेमिस्ट्री परख, न्यूरोनल सर्किट गठन, या इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और लाइव-इमेजिंग का उपयोग करके अस्तित्व और न्यूरोडिजेनरेशन।

इस काम का लक्ष्य ऑर्गानायपिक सेरिबेलर स्लाइस कल्चर करने के लिए एक सरल विधि का वर्णन करना है, जिसे विट्रो में सेरिबेलर विकास की नकल करने के लिए एक प्रासंगिक मॉडल के रूप में जाना जाता है। विशेष रूप से, हमने पुरकिंजे सेल विकासात्मक मृत्यु के अध्ययन पर ध्यान केंद्रित किया। वीवो में, पुरकिंजे कोशिकाओं को पहले प्रसवोत्तर सप्ताह के दौरान एपोप्टोसिस से गुजरना पड़ता है, जो प्रसवोत्तर दिन 3 (P3)11पर बढ़ता जा रहा है । एक ही पैटर्न सेरिबेलर स्लाइस संस्कृति में मनाया जाता है, जिसमें प्यूकिंजे न्यूरॉन्स एपोप्टोसिस द्वारा मरते हैं, जब सेरेबेला को पी 1 और पी 8 के बीच जानवरों से लिया जाता है, पी 34,12पर एक चोटी के साथ। ऑर्गानानोटिक सेरिबेलर स्लाइस संस्कृतियों के उपयोग से कई न्यूरोप्रोटेक्टिव अणुओं की पहचानकरने कीअनुमति मिली है 7,13, साथ ही इस प्रोग्राम किए गए सेल डेथ14,15,16में शामिल तंत्रों के हिस्से को समझने की अनुमति मिली है । यहां, हम हिप्पोकैम्पस में स्टॉपपिनी एट अल.17 के अध्ययन पर आधारित प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, और दुसर्ट एट अल द्वारा सेरिबैलम के अनुकूल होते हैं।4 इसमें तेजी से विच्छेदन और प्रसवोत्तर सेरेबेला का काटना शामिल है; एक कोशिका संस्कृति पर टुकड़ा करने की क्रिया संस्कृति एक माइक्रोपोरस झिल्ली युक्त डालने के साथ या न्यूरोप्रोटेक्टिव उपचार के बिना; और न्यूरोनल अस्तित्व का आकलन करने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला।

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Protocol

जानवरों से जुड़े सभी प्रयोग नॉर्थवेस्टर्न यूनिवर्सिटी एनिमल स्टडीज कमेटी के मुताबिक किए गए थे ।

1. ऑर्गानानोटिक सेरिबेलर स्लाइस संस्कृतियों से पहले तैयारी

  1. 70% इथेनॉल के साथ पहले से छिड़काव किए गए सेल कल्चर हुड में, बाँझ बोतल रिसीवर से जुड़े 250 मिलीआर बोतल-टॉप वैक्यूम फिल्टर में संस्कृति माध्यम के 200 मिलील तैयार करें। बेसल मीडियम ईगल (बीएमई), हैंक्स के 50 मिलीग्राम बैलेंस्ड साल्ट सॉल्यूशन (एचबीएसएस), 50 मिलीग्राम हीट-इनएक्टिवेटेड हॉर्स सीरम का 50 एमएल, 200 मीटर एल-ग्लूटामाइन (अंतिम एकाग्रता 1 mM) का 1 एमएल, और 200 ग्राम/एल ग्लूकोज (अंतिम एकाग्रता 5 मिलीग्राम/एमएल) का 5 मिलीग्राम जोड़ें। वैक्यूम- संस्कृति माध्यम को फ़िल्टर करें और इसे एक महीने तक +4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  2. निष्फल जैव सुरक्षा कैबिनेट में, अपने पैकेज से एक 6 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट बाहर ले लो । प्रत्येक अच्छी तरह से संस्कृति माध्यम के 1 मिलील के साथ भरें। यदि उपचार का परीक्षण किया जाता है, तो औषधीय एजेंट को अच्छी तरह से इलाज में जोड़ें, और नियंत्रण के लिए वाहन समाधान की एक ही मात्रा अच्छी तरह से। वर्तमान अध्ययन में, हमने उपचारित कुएं (30 एमएम फाइनल) के लिए बाँझ 3 एम केसीएल समाधान के 1 μL और नियंत्रण कुओं में बाँझ पानी के 1 μL जोड़ा।
  3. सेल संस्कृति हुड के अंदर लाएं हाइड्रोफिलिक पॉलीटेट्राफ्लोरोएथिलीन (पीटीएफई) झिल्ली (पोर आकार = 0.4 माइक्रोन) के साथ व्यक्तिगत रूप से लिपटे सेल कल्चर आवेषण की आवश्यक संख्या। ध्यान से उन्हें खोलना और बाँझ संदंश के साथ सेल संस्कृति आवेषण बाहर ले लो। उन्हें एक के बाद एक 6 अच्छी तरह से थाली के एक कुएं में ड्रॉप, सम्मिलित झिल्ली और सेल संस्कृति माध्यम के बीच इंटरफेस पर बुलबुले से परहेज । आवेषण को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में कम से कम 2 घंटे पहले संस्कृति में मध्यम में समतुल्य होने दें।
    नोट:ऊतक हेलिकॉप्टर स्थायी रूप से सेल संस्कृति हुड में रहता है।
  4. दो 200 मीटर बीकर तैयार करें, एक 150 मीटर बाँझ पानी से भरा हुआ है, और दूसरा 150 मीटर 70% इथेनॉल से भरा हुआ है। सर्जिकल उपकरणों को 70% इथेनॉल स्नान में डुबोएं और फिर उनका उपयोग करने से पहले पानी में।
    नोट:इथेनॉल के संपर्क के तुरंत बाद सर्जिकल उपकरणों का उपयोग न करें।
  5. 70% इथेनॉल बीकर में दोधारी ब्लेड को कीटाणुरहित करना। बाँझ संदंश का उपयोग कर ब्लेड धारक पर रखें और ब्लेड क्लैंप रिंच का उपयोग करके इसे जगह में रखें। उपयोग तक इसे सूखने दें।
  6. 70% इथेनॉल बीकर में ऊतक हेलिकॉप्टर के साथ प्रदान की प्लास्टिक डिस्क कीटाणुरहित। इस पर डिस्क रखने से पहले 70% इथेनॉल के साथ काटने की मेज स्प्रे। उपयोग तक सूखने दें।

2. विच्छेदन और सेरिबैलर ऑर्गानोटिपिक स्लाइस संस्कृतियां

  1. विच्छेदन करने के लिए कोशिका संस्कृति हुड के अंदर माउस पिल्ला लाओ।
  2. पिल्ला जल्दी से सीधे ऑपरेटिंग कैंची का उपयोग कर decapitate(चित्रा 1ए)।
  3. जबकि सीधे ड्रेसिंग संदंश के साथ नाक से पिल्ला के सिर पकड़, सीधे आंख कैंची का उपयोग कर खोपड़ी खुला काट, पीछे के अंत से शुरू, और मिडलाइन के लिए पार्श्व जा रहा है ।
  4. खोपड़ी के लिए हूबहू आगे बढ़ें।
    नोट:विच्छेदन के दौरान सेरिबैलम को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए कैंची युक्तियों को बाहर की ओर इंगित करना सुनिश्चित करें।
  5. मस्तिष्क को बाहर निकालकर कोल्ड एचबीएस + 5 एमजी/एमएल ग्लूकोज से भरे 60 एमएम डिश में ट्रांसफर करें।
  6. बाँझ सीधे ठीक संदंश(चित्रा 1बी)का उपयोग करके सेरिबैलम को सावधानीपूर्वक विच्छेदन करें। बाँझ घुमावदार ठीक संदंश का उपयोग कर ऊतक हेलिकॉप्टर की काटने की मेज पर रखा प्लास्टिक डिस्क पर इसे स्थानांतरित करें।
  7. पैरासिग्टल सेक्शन करने के लिए कटिंग टेबल घुमाकर टिश्यू ओरिएंट करें।
  8. टेबल रिलीज नॉब को दाईं ओर खींचकर कटिंग टेबल को मूव करें, इसलिए ब्लेड टिश्यू के किनारे पर तैनात है।
  9. स्लाइस मोटाई को 350 माइक्रोन और ब्लेड की गति को मध्यम तक समायोजित करें।
  10. हेलिकॉप्टर शुरू करें। एक बार जब पूरे सेरिबैलम को कटा दिया गया है(चित्रा 1सी),हेलिकॉप्टर बंद कर दें।
  11. बाँझ संदंश के साथ प्लास्टिक डिस्क निकालें।
  12. ध्यान से प्लास्टिक डिस्क को 60 एमएम की डिश के करीब लाएं जिसमें एचबीएसएस + 5 मिलीग्राम/एमएल ग्लूकोज होता है। बफर से भरे पकवान में सेरिबैलर स्लाइस की कटाई की अनुमति देने के लिए बाँझ हस्तांतरण पिपेट का उपयोग कर ऊतक पर पिपेट ठंडा एचबीएसएस + 5 मिलीग्राम/एमएल ग्लूकोज।
  13. माइक्रोप्रोब का उपयोग करके सेरिबेलर स्लाइस को एक दूसरे से अलग करें। स्थानांतरण पिपेट के साथ अच्छी गुणवत्ता वाले वर्गों को लें (ऊतक वर्गों का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है जो वर्मिस के करीब हैं) और उन्हें पूर्व-समतुल्य कोशिका संस्कृति डालने(चित्रा 1डी)में छोड़ दें।
  14. माइक्रोप्रोब का उपयोग करके सेल कल्चर डालने पर सेरिबैलर स्लाइस की स्थिति रखें, फिर स्थानांतरण पिपेट के साथ अतिरिक्त एचबीएस + 5 मिलीग्राम/एमएल ग्लूकोज समाधान को ध्यान से हटा दें।
    नोट:इस स्तर पर ऊतक बेहद निविदा और शारीरिक क्षति के लिए प्रवण है। सेल संस्कृति डालने प्रति सेरिबेलर स्लाइस की अधिकतम संख्या दाता जानवर की उम्र पर निर्भर करती है। 6-8 स्लाइस एक P0-P4 पुराने जानवर के लिए सुसंस्कृत किया जा सकता है, और P5 से पुराने जानवरों के लिए 4-6 स्लाइस ।
  15. कल्चर डिश को इनक्यूबेटर में रखें, मीडियम को पूरी तरह से हर 2-3 दिन में बदल दें।
  16. पुरकिंजे सेल अस्तित्व का आकलन करने के लिए, स्लाइस को विट्रो में 5 दिनों के रूप में जल्दी एकत्र किया जा सकता है। अन्य उद्देश्यों के लिए, उन्हें कई हफ्तों तक संस्कृति में बनाए रखा जा सकता है(चित्र ा 1एफ)।
    नोट:Purkinje सेल अस्तित्व प्रयोगों के मामले में, सेल संस्कृति माध्यम बदलते समय औषधीय उपचार को नवीनीकृत करने की कोई आवश्यकता नहीं है(चित्रा 1एफ)।

3. इम्यूनोफ्लोरेसेंस

  1. इनक्यूबेटर से 6-अच्छी तरह की प्लेट निकाल लें। सेल कल्चर मीडियम निकालें, सेल कल्चर डालने को 1x पीबीएस से धोएं, और स्लाइस को 1 घंटे के लिए ठंडे 4% पैराफॉर्मलडिहाइड सॉल्यूशन के साथ ठीक करें, सेल कल्चर डालने के तहत 1 मिलील और सेल कल्चर डालने के शीर्ष पर 500 माइक्रोन के साथ।
  2. एक कक्षीय शेखर पर, डालने के शीर्ष पर 1 mL के तहत और 500 μL के साथ 1x पीबीएस के साथ आवेषण 4x 10 min धो लें।
  3. ब्रश के साथ, 1 सेल कल्चर से सेरिबेलर स्लाइस को 1x पीबीएस, 0.25% ट्राइटन एक्स-100, और 3% बीएसए (पीबीएस-टीबी), 500 माइक्रोन/वेल से भरे 24-वेल में डालें 1 अच्छी तरह से डालें।
  4. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए पीबीएस-टीबी में ऊष्मायन द्वारा स्लाइस को परमीबिलाइज और ब्लॉक करें।
  5. पीबीएस-टीबी समाधान में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट, रातोंरात + 4 डिग्री सेल्सियस पर, एक कक्षीय शेखर पर, 200 μL/well।
  6. अगले दिन, 1x पीबीएस के साथ 10 मिन के चार वॉश, एक कक्षीय शेखर, ५०० μL/अच्छी तरह से प्रदर्शन करते हैं ।
  7. पीबीएस-टीबी समाधान में पतला माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट, कमरे के तापमान पर दो घंटे, कक्षीय शेखर पर, और प्रकाश से संरक्षित, २०० μL/well ।
  8. 1x पीबीएस के साथ 10 मिन के चार वॉश, एक कक्षीय शेखर पर, ५०० μL/well प्रदर्शन करें ।
  9. Hoechst ३३३४२ का उपयोग कर स्लाइस प्रतिदाग, 1x PBS (2 μg/mL) में पतला, कमरे के तापमान पर 10 किमी के लिए, प्रकाश से संरक्षित, ५०० μL/
  10. एक स्थानांतरण पिपेट के साथ एक माइक्रोस्कोपी स्लाइड पर सेरिबैलर स्लाइस माउंट। उन्हें पूरी तरह से हवा-सूखी होने दें, प्रकाश से संरक्षित करें। उन्हें 1x पीबीएस के साथ फिर से ह्यूमिडिफाई करें और बढ़ते माध्यम (~ 80 माइक्रोन) की कुछ बूंदों के साथ कवर किए गए कवरस्लिप लागू करें। कोई भी बुलबुला बनाने से बचें।
  11. एक बार बढ़ते माध्यम ठीक हो जाने के बाद, सेरिबैलर वर्गों को इमेजड करने के लिए तैयार किया जाता है।

4. इमेजिंग और सेल सर्वाइवल की मात्रा

  1. निर्माता और/या इमेजिंग कोर सुविधा के निर्देशों के अनुसार माइक्रोस्कोप और लेजर चालू करें ।
  2. अधिग्रहण सॉफ्टवेयर शुरू करें।
  3. 10X उद्देश्य का उपयोग करके, गैर-परिवर्तित सेरिबेलर स्लाइस का पता लगाएं जो 9-10 लोबुल (आमतौर पर वर्मिस के करीब सेरिबेलर सेक्शन) पेश करते हैं।
  4. जेड-स्टैक अधिग्रहण को सक्रिय करें। सेरिबैलर स्लाइस में मौजूद सभी पुरकिंजे कोशिकाओं को शामिल करने के लिए जेड-स्टैक की सीमा को परिभाषित करें। एक 2 μm कदम आकार सेट और अधिग्रहण शुरू करते हैं। संबद्ध मेटाडेटा को संरक्षित करने के लिए अधिग्रहण सॉफ्टवेयर निर्माता के प्रारूप में अधिग्रहीत तस्वीर को सहेजें।
  5. बायो-फॉर्मेट प्लगइन18का उपयोग करके इमेजजे में अधिग्रहीत फ़ाइल खोलें।
  6. इमेज एंड जीटी; स्टैक एंड जीटी;जेड-प्रोजेक्ट पर जाएं... (चित्रा 2ए)।
  7. प्रोजेक्शन टाइप ड्रॉपडाउन मेनू में अधिकतम तीव्रता चुनें और ओके (चित्रा 2बी)पर क्लिक करें।
  8. एक चपटा 2-डी छवि उत्पन्न की जाएगी। प्वाइंट टूल विंडो को दिखाई देने के लिए मल्टी-पॉइंट टूल पर डबल क्लिक करें। गिने गए कोशिकाओं के दृश्य को कम करने के लिए लेबल पॉइंट्स विकल्प को अनचेक करें। फिर, गिनती शुरू करने के लिए एक Purkinje सेल के एक सोमा पर सीधे क्लिक करें(चित्रा 1ई)। गणना की गई कोशिकाओं की कुल संख्या बिंदु उपकरण खिड़की(चित्रा 3)के तल पर इंगित की जाएगी।
    नोट:आमतौर पर, सेल संस्कृति डालने के प्रति 9-10 लोबुल युक्त कम से कम 3 गैर-क्षतिग्रस्त खंडों को निर्धारित किया जा सकता है। फार्माकोलॉजिकल एजेंट के न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव का आकलन करने के लिए, कम से कम 3 स्वतंत्र प्रयोग किए जाने चाहिए।

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Representative Results

जैसा कि चित्र4में दिखाया गया है, यह प्रोटोकॉल ऑर्गानोटिक सेरिबेलर स्लाइस संस्कृतियों का उत्पादन करता है जिसमें अशुद्धि सेल अस्तित्व का आकलन प्रतिरक्षण और छवि अधिग्रहण चरणों के बाद किया जा सकता है। पुरकिंजे कोशिकाओं को एंटी-कैल्बिंदिन डी-28K (कमजोर पड़ने 1/200) और एलेक्सा594 एंटी-माउस (कमजोर पड़ने 1/300) एंटीबॉडी के संयोजन के साथ लेबल किया गया था। इमेज सिलाई माइक्रोस्कोप अधिग्रहण सॉफ्टवेयर (एनआईएस-एलिमेंट्स) द्वारा स्वचालित रूप से पूरे सेरिबेलर स्लाइस की तस्वीर प्राप्त करने के लिए की गई थी। चार्ट उत्पन्न करने और सांख्यिकीय विश्लेषण करने के लिए प्रति स्लाइस पुरकिंजे सेल नंबर चश्मे 8 सॉफ्टवेयर में दर्ज किए गए थे। P6 में, Purkinje सेल अस्तित्व नियंत्रण में कम था, उनके ज्ञात भेद्यता खिड़की4 (चित्रा 4ए, ई)के अनुरूप । जीवित रहने के रूप में दाता जानवर बड़ी हो गई और इस महत्वपूर्ण अवधि से बाहर निकल(चित्रा 4सी, ई)में वृद्धि हुई । सेरिबेलर स्लाइस को उच्च केसीएल एकाग्रता के साथ इलाज किया गया ताकि उनके ध्रुवीकरण और अस्तित्व को सफलतापूर्वक प्रेरित किया जासके 14 (चित्रा 4बी, डी, ई)।

Figure 1
चित्रा 1: विच्छेदन से पुरकिंजे सेल अस्तित्व मात्राीकरण के लिए प्रोटोकॉल का चित्रण।
माउस पिल्ला जल्दी से decapitated है(ए)। मस्तिष्क विच्छेदन के बाद, सेरिबैलम अलग-थलग पड़ जाता है(बी),और फिर 350 माइक्रोन-चौड़ाई स्लाइस(सी)में कटा हुआ है। सेरिबैलर वर्गों को नियंत्रण या उपचारित सेल कल्चर डालने(डी)पर रखा जाता है और विट्रो में कम से कम 5 दिनों के लिए संस्कृति में बनाए रखा जाता है। ऊतक को तब 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में तय किया जाता है, इम्यूनोस्टेनिंग की जाती है, और चित्रों को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ प्राप्त किया जाता है। अंत में, इमेजजे(ई)में मल्टीपॉइंट टूल का उपयोग करके प्रत्येक स्लाइस में पुरकिंजे सेल संख्या की मात्रा निर्धारित की जाती है। (एफ)संस्कृति के दौरान केसीएल उपचार के समय पाठ्यक्रम की योजनाबद्ध । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: इमेजजे सेटिंग्स का उपयोग क्वांटिफिकेशन से पहले 3डी-स्टैक को समतल करने के लिए किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: सेवियों को सेरिबेलर स्लाइस का एक उदाहरण के साथ इमेजजे में मल्टीपॉइंट टूल का उपयोग करके पुरकिंजे सेल नंबर गिनने के लिए उपयोग किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: उच्च केसीएल उपचार के बाद ऑर्गानोटिक सेरिबेलर स्लाइस संस्कृति में पुरकिंजे सेल अस्तित्व।
प्रसवोत्तर दिन 6(ए, बी)या 8(सी, सी', डी, डी'में ली गई सेरिबेलर स्लाइस की प्रतिनिधि छवि, या तो अनुपचारित(ए, सी, सी')या 30 एमएम केसीएल(बी, डी, डी'के साथ इलाज किया जाता है। (सी' और डी) सी और डीमें सफेद बॉक्स्ड क्षेत्रों का उच्च आवर्धन दृश्य । फिक्सेशन से पहले स्लाइस को विट्रो में 5 दिन रखा गया था । पुरकिंजे कोशिकाओं को लाल रंग में कैल्बिनिन डी-28K के साथ चिह्नित किया जाता है। स्केल बार = 500 माइक्रोन(ए-डी),और 100 माइक्रोन(सी' और डी')। (ई)पी 6 और पी 8 संस्कृतियों से पुरकिंजे सेल अस्तित्व का परिमाणीकरण, नियंत्रण में या 30 एमएम केसीएल के साथ इलाज किया गया, उपचार के साथ एक उच्च अस्तित्व दिखाता है (मान-व्हिटनी परीक्षण, एन = 3 से 5 स्लाइस)। डेटा मतलब ± SEM के रूप में व्यक्त कर रहे हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

सेरिबेलर स्लाइस संस्कृति प्रसवोत्तर विकास के दौरान प्रोग्राम किए गए पुरकिंजे सेल डेथ का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। इस तकनीक का उपयोग उम्मीदवार अणुओं को उनकी न्यूरोप्रोटेक्टिव क्षमता के लिए तेजी से स्क्रीन करने के लिए किया जा सकता है। मुख्य लाभ यह है कि सेटअप सरल और बहुत लागत प्रभावी है, और केवल उपकरणों में मामूली निवेश की आवश्यकता होती है (एक वाइब्रेटोम ऊतक हेलिकॉप्टर की तुलना में 3 गुना अधिक खर्च कर सकता है)। इसके अलावा, 10 से 15 स्वस्थ स्लाइस एक माउस पिल्ला से उत्पन्न किया जा सकता है, जिससे विभिन्न परखों को केवल एक जानवर का उपयोग करके समानांतर रूप से प्रदर्शन करने की अनुमति मिलती है।

लगातार और प्रजनन योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए, संस्कृति को यथासंभव कुशलता पूर्वक करने और स्वस्थ सेरिबैलर वर्गों को सुसंस्कृत करने के लिए चुनना महत्वपूर्ण है। यह विधि दीर्घकालिक संस्कृति (कई महीनों तक) के लिए भी उपयुक्त है। इसलिए, संदूषण से बचने और एंटीबायोटिक दवाओं के साथ संस्कृतियों को पूरक करने की आवश्यकता के लिए विच्छेदन और काट प्रक्रिया के दौरान अच्छी असेप्टिक तकनीक का उपयोग करना आवश्यक है।

सेरिबेलर स्लाइस कल्चर मॉडल ऊतक अनुभाग के विमान में मौजूदा सेल-सेल इंटरैक्शन को बरकरार रखता है, और क्षेत्र में सुसंस्कृत है। यह एक चेतावनी के साथ आता है: सुसंस्कृत क्षेत्र के बाहर लक्ष्यों के साथ कनेक्शन कटे हो सकता है । मिलनसार फाइबर द्वारा प्रदान किए गए न्यूरोट्रोफिक कारकों में आपूर्ति को भी बंद किया जा सकता है और न्यूरोनल अस्तित्व को ख़राब कर सकता है। इसे ऑर्गानोटिपिक स्लाइस सह-संस्कृतियों को निष्पादित करके आंशिक रूप से दरकिनार किया जा सकता है। यह दिखाया गया है कि चढ़ाई फाइबर प्रसवोत्तर सेरिबैलर स्लाइस संस्कृतियों में प्रवेश कर सकते हैं जब अवर जैतून का टुकड़ा संस्कृतियों14,19के साथ सह-संस्कारी । इससे भी दिलचस्प बात यह है कि फाइबर पर चढ़ने से संपर्क करने वाली पुरकिंजे कोशिकाएं14बच गईं ।

यहां, हमने विकासशील सेरिबैलम में न्यूरोप्रोटेक्टिव अणुओं की खोज करने के लिए ऑर्गानोटिपिक स्लाइस संस्कृति के उपयोग पर ध्यान केंद्रित किया। हालांकि, यह विधि न्यूरोडिजेनरेशन20,एक्सोनल पुनर्जनन21और न्यूरोनल सर्किट गतिविधि22,23की निगरानी जैसी अन्य स्थितियों के लिए समान रूप से उपयुक्त है। संस्कृति के बाद के अनुप्रयोग प्रतिरक्षण से परे जाते हैं । स्लाइस का उपयोग किसी दिए गए यौगिक के न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव में शामिल जैविक तंत्र की जांच करने के लिए जैव रासायनिक या जीन अभिव्यक्ति अध्ययन के लिए किया जा सकता है। कुल मिलाकर, यह मॉडल वीवो परीक्षण में पहले नए न्यूरोएक्टिव अणुओं को खोजने के लिए आधार रख सकता है और वीवो मशीनिस्ट अध्ययनों में एक प्रभावी और विश्वसनीय पूरक हो सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इमेजिंग काम उन्नत माइक्रोस्कोपी के लिए नॉर्थवेस्टर्न विश्वविद्यालय केंद्र में किया गया था उदारता से NCI CCSG P30 CA30 CA060553 रॉबर्ट एच Lurie व्यापक कैंसर केंद्र को संमानित द्वारा समर्थित । हम शॉन मैकडरमॉट को उनकी तकनीकी सहायता और समर्थन के लिए धन्यवाद देते हैं, और चित्र 1में दिखाए गए हाथ से तैयार चित्रों के लिए माया एपस्टीन ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 594 Donkey anti-Mouse IgG secondary antibody ThermoFisher scientific A21203
Basal Medium Eagle (BME) ThermoFisher scientific 21010046
Biosafety cabinet Class II, Type A2 NuAire NU-540-400
Bovine serum albumin Millipore Sigma A2153
Brush
anti-Calbindin D-28K antibody (CB-955) Abcam ab82812
CO2 Incubator NuAire NU-5700
Corning Costar Flat Bottom 6-well Cell Culture Plates Fisher Scientific 07-200-83
Coverslips, 22 x 50 mm Fisher Scientific 12-545-E
Dressing forceps, straight Harvard Apparatus 72-8949
Double edge blades Fisher Scientific 50949411
Ethanol 200 proof Decon Labs, Inc 2701
Eye Scissors, straight Harvard Apparatus 72-8428
Fine forceps Fisher Scientific 16-100-127
L-Glutamine 100X ThermoFisher scientific 25030149
Glucose solution ThermoFisher scientific A2494001
Hanks’ Balanced Salt Solution ThermoFisher scientific 14025092
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate Fisher Scientific H21492
Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin ThermoFisher scientific 26050088
ImageJ
McIlwain Tissue Chopper Fisher Scientific NC9914528
Microprobes Fisher Scientific 08-850
Millicell Cell Culture Inserts Millipore Sigma PICM0RG50
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane, 250 mL ThermoFisher scientific 168-0045
Nikon A1R confocal laser microscope system Nikon
NIS-Elements Imaging Software Nikon
Paraformaldehyde Acros Organics 41678-0010
Pasteur pipets Fisher Scientific 13-678-20D
Potassium Chloride Fisher Scientific BP366-500
ProLong Gold Antifade Mountant ThermoFisher scientific P10144
Operating Scissors, straight Harvard Apparatus 72-8403
Orbital shaker Belly Dancer IBI Scientific BDRLS0003
Prism 8 GraphPad
Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Tissue Culture Dish, 60 mm w/ grip ring Fisher Scientific FB012921
Tissue culture plate, 24 well Falcon/Corning 353047
Transfer pipettes, sterile ThermoFisher scientific 13-711-21
Triton X-100 ThermoFisher scientific BP151-500

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References

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न्यूरोसाइंस इश्यू 154 न्यूरोसाइंस सेरिबैलम ऑर्गानोटिक पुरकिंजे सेल डेवलपमेंट न्यूरोप्रोटेक्शन
ऑर्गानोटिपिक सेरिबेलर स्लाइस संस्कृतियों में पुरकिंजे सेल सर्वाइवल
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Rakotomamonjy, J., Guemez-Gamboa, A. … More

Rakotomamonjy, J., Guemez-Gamboa, A. Purkinje Cell Survival in Organotypic Cerebellar Slice Cultures. J. Vis. Exp. (154), e60353, doi:10.3791/60353 (2019).

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