Summary
الثقافات شريحة التنميط العضوي هي أداه قويه لدراسة العمليات العصبية أو التنكسية/التجدد. هنا ، ونحن وصف البروتوكول الذي نماذج وفاه النمو العصبي للخلايا Purkinje في الثقافات شريحة الفئران المخيخ. هذا الأسلوب قد تستفيد البحوث في اكتشاف المخدرات نيوروبروتكتيف.
Abstract
ثقافة شريحة التنميط العضوي هو نموذج قوي في المختبر الذي يقلد في ظروف الجسم الآخر عن كثب من الثقافات الخلية الاوليه المنفصلة. في مرحله ما بعد الولادة المبكرة ، من المعروف ان خلايا المخيخ Purkinje تمر خلال فتره الضعف ، والتي تمر خلالها بموت الخلايا المبرمج. هنا ، ونحن نقدم بروتوكولا مفصلا لأداء الماوس الظاهرية شريحة المخيخ الثقافة خلال هذا الوقت الحرج. وتصنف الشرائح كذلك لتقييم بقاء الخلية Purkinje وفعالية العلاجات نيوروبروتكتيف. هذه الطريقة يمكن ان تكون قيمه للغاية للشاشة لجزيئات نيواكتيف جديده.
Introduction
النمذجة في المختبر هو أداه أساسيه في البحوث الطبية الحيوية. وهو يسمح للمحققين بدراسة ومراقبه أليات محدده في أنواع الخلايا المقيدة ، أو في النظم/الاجهزه المعزولة. ثقافة شريحة التنميط العضوي هي تقنيه تستخدم علي نطاق واسع في المختبر ، وخاصه في مجال علوم الأعصاب1. تاسست هذه الطريقة لأول مره من قبل Gähwiler ، الذي مثقف شرائح الدماغ باستخدام تقنيه أنبوب الاسطوانه2، وتعديلها في وقت لاحق من قبل ياماموتو وآخرون ، الذي ادخل استخدام غشاء ميكرومساميه لأداء الثقافات شريحة القشرية3. بالمقارنة مع ثقافات الخلايا الاوليه ، تقدم ثقافات الشريحة العضوية ميزه الحفاظ علي البنية الخلوية للانسجه ، فضلا عن اتصالات خلايا الخلايا الاصليه في الجزء الخاص بالانسجه.
وقد تم استزراع شرائح التنميط العضوي من أجزاء كثيره من الجهاز العصبي المركزي ، مثل الحصين4، اللحاء5، سترياتوم6، المخيخ4،7، والحبل الشوكي8،9، من بين أمور أخرى. وقد ثبت انها أداه قويه في دراسات اكتشاف المخدرات10. يمكن تقييم اثار الجزيئات العصبية بطرق عديده: البقاء علي قيد الحياة والضمور العصبي باستخدام اختبارات المناعة والكيمياء الحيوية ، وتشكيل دوائر الخلايا العصبية ، أو التعطيل باستخدام الفيزيولوجيا الكهربية والتصوير الحي.
والهدف من هذا العمل هو وصف طريقه بسيطه لأداء ثقافة شريحة المخيخ المجسمة ، والتي من المعروف انها نموذج مناسب لتقليد التطور المخيخ في المختبر. وعلي وجه الخصوص ، ركزنا علي دراسة وفاه الخلية Purkinje النمو. في الجسم المجري, خلايا Purkinje الخضوع للخلايا المبرمج خلال الأسبوع الأول بعد الولادة, ذروتها في اليوم بعد الولادة 3 (P3)11. لوحظ نفس النمط في الثقافة شريحة المخيخ ، مع الخلايا العصبية purkinje الموت من قبل المبرمج عندما تؤخذ المخيخ من الحيوانية بين P1 و P8 ، مع ذروه في P34،12. وقد سمح استخدام الثقافات شريحة المخيخ الشكل العضوي لتحديد عده جزيئات نيوروبروتكتيف7,13, فضلا عن فهم جزء من أليات المعنية في هذه الخلية المبرمجة الموت14,15,16. هنا ، ونحن وصف بروتوكول يستند إلى دراسة ستوبيني وآخرون17 في الحصين ، وتكييفها مع المخيخ من قبل dusart وآخرون4 ويشمل تشريح السريع وتقطيع المخيخ بعد الولادة. تشريح الثقافة علي الخلية الثقافة ادراج تحتوي علي غشاء ميكرومساميه ، مع أو بدون علاج نيوروبروتكتيف ؛ وتلطيخ المناعي لتقييم بقاء الخلايا العصبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأجريت جميع التجارب المتعلقة بالماشية وفقا للجنة الدراسات الحيوانية بجامعه نورث وسترن.
1. الاعداد قبل الثقافات شريحة المخيخ الشكل العضوي
- في خليه الثقافة هود رش مع 70 ٪ الايثانول مسبقا ، واعداد 200 mL من الوسط الثقافي في فلتر فراغ زجاجه 250 mL تعلق علي جهاز استقبال زجاجه معقمه. أضافه 100 mL من النسر المتوسطة القاعدية (BME) ، 50 مل من الحل الملح المتوازن هانكس (HBSS) ، 50 mL من مصل الحصان الحرارة المعطلة ، 1 مل من 200 mM L-الجلوتامين (التركيز النهائي 1 ملم) ، و 5 مل من 200 g/L الجلوكوز (التركيز النهائي 5 ملغ/مل). الفراغ-تصفيه الثقافة المتوسطة والاحتفاظ بها في + 4 درجه مئوية لمده تصل إلى شهر.
- في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية تعقيمها ، وإخراج لوحه ثقافة 6-حسنا من حزمه لها. ملء كل بئر مع 1 مل من الثقافة المتوسطة. إذا تم اختبار العلاج ، أضافه عامل الدوائية إلى العلاج جيدا ، ونفس الحجم من حل السيارة للسيطرة جيدا. في هذه الدراسة ، أضفنا 1 μL من محلول معقم 3 م KCl إلى البئر المعالجة (30 ملم النهائي) و 1 μL من المياه المعقمة لآبار التحكم.
- جلب داخل الخلية الثقافة هود العدد المطلوب من الخلايا المغلفة بشكل فردي ادراج ثقافة الخلية مع تترافلوروايثيلين (PTFE) غشاء (حجم المسام = 0.4 μm). فك بعناية لهم وإخراج ادراج ثقافة الخلية مع ملقط معقمه. إسقاط لهم واحدا تلو الآخر في بئر من 6-حسنا لوحه ، وتجنب فقاعات في واجهه بين الغشاء ادراج والمتوسطة ثقافة الخلية. السماح لادراج تتوازن في الوسط في 37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2 حاضنه لمده لا تقل عن 2 ساعة قبل الثقافة.
ملاحظه: المروحية الانسجه يقيم بشكل دائم في غطاء المحرك الثقافي الخلية. - اعداد 2 200 mL الأكواب ، واحده مليئه 150 mL المياه المعقمة ، والاخر مليئه 150 mL 70 ٪ الايثانول. تراجع الاداات الجراحية في حمام الايثانول 70 ٪ ومن ثم في الماء قبل استخدامها.
ملاحظه: لا تستخدم الاداات الجراحية مباشره بعد ملامسه الايثانول. - طهر الشفرة مزدوجة الحواف في دورق الايثانول ال70%. وضعه علي حامل شفره باستخدام ملقط معقمه والاحتفاظ بها في مكان باستخدام شفره وجع المشبك. ندعه يجف حتى الاستخدام.
- تطهير القرص البلاستيكية المقدمة مع المروحية الانسجه في الكاس الايثانول 70 ٪. رش الجدول القطع مع 70 ٪ الايثانول قبل وضع القرص علي ذلك. اتركه يجف حتى الاستخدام.
2. التشريح والمخيخ الوراثية شريحة الثقافات
- جلب الجرو الماوس داخل غطاء المحرك الثقافة الخلية لأداء تشريح.
- قطع راس الجرو بسرعة باستخدام مقص التشغيل علي التوالي (الشكل 1ا).
- في حين عقد راس الجرو من الأنف مع ملقط خلع الملابس علي التوالي ، وقطع فتح فروه الراس باستخدام مقص العين علي التوالي ، بدءا من النهاية الخلفية ، والذهاب الجانبية إلى منتصف الخط.
- المضي قدما بالتماثل لجمجمة.
ملاحظه: تاكد من نقطه نصائح مقص إلى الخارج لتجنب الاضرار المخيخ اثناء تشريح. - إخراج الدماغ ونقله إلى صحن 60 ملم مليئه HBSS الباردة + 5 ملغ/مل الجلوكوز.
- تشريح بعناية المخيخ باستخدام الملاقط الدقيقة المعقمة علي التوالي (الشكل 1ب). نقلها إلى القرص البلاستيكي وضعت علي طاوله القطع من المروحية النسيج باستخدام الملقط الناعمة المنحنية العقيمة.
- توجيه الانسجه عن طريق تدوير الجدول القطع لأداء أقسام التطفل.
- نقل جدول القطع عن طريق سحب مقبض الباب الإفراج عن الجدول إلى اليمين ، لذلك يتم وضع شفره علي حافه النسيج.
- ضبط سماكه شريحة إلى 350 μm وسرعه شفره إلى المتوسطة.
- أبدا المروحية مره واحده وقد تم شرائح المخيخ كله (الشكل 1ج) ، إيقاف المروحية.
- قم بازاله القرص البلاستيكي بملقط معقم.
- بعناية جلب القرص البلاستيكية بالقرب من صحن 60 مم يحتوي علي HBSS + 5 ملغ/مل الجلوكوز. ماصه الباردة HBSS + 5 ملغ/مل الجلوكوز علي الانسجه باستخدام ماصه نقل معقمه للسماح حصاد شرائح المخيخ في الطبق العازلة مملوءة.
- افصل شرائح المخيخ عن بعضها البعض باستخدام المسبار المجهري. إخراج أقسام ذات نوعيه جيده مع ماصه نقل (فمن المستحسن استخدام أقسام الانسجه التي هي قريبه من vermis) وإسقاطها في ادراج ثقافة الخلية قبل معايرتها (الشكل 1د).
- وضع شرائح المخيخ علي ادراج ثقافة الخلية باستخدام المسبار المجهري ، ثم أزاله بعناية الزائدة HBSS + 5 mg/mL محلول الجلوكوز مع ماصه النقل.
ملاحظه: في هذه المرحلة النسيج هو العطاء للغاية وعرضه للضرر المادي. الحد الأقصى لعدد شرائح المخيخ لكل خليه الثقافة ادراج يعتمد علي عمر الحيوانية المانحة. 6 – 8 شرائح يمكن زراعتها لP0-P4-القديمة الحيوانية ، و 4-6 شرائح للحيوانات الأكبر سنا من ف 5. - وضع طبق الثقافة في الحاضنة ، وتغيير المتوسطة تماما كل 2-3 أيام.
- لتقييم بقاء الخلية Purkinje ، يمكن جمع الشرائح في وقت مبكر 5 أيام في المختبر. ولأغراض أخرى ، يمكن الاحتفاظ بها في الثقافة لعده أسابيع (الشكل 1و).
ملاحظه: في حاله التجارب الخلية Purkinje البقاء علي قيد الحياة ، ليست هناك حاجه لتجديد العلاج الدوائي عند تغيير خليه ثقافة المتوسطة (الشكل 1و).
3. المناعي
- اخرج الصفيحة السادسة من الحاضنة أزاله خليه ثقافة المتوسطة ، وغسل الخلية ادراج ثقافة مع 1x تلفزيوني ، وإصلاح الشرائح مع محلول بارافورمالدهيد 4 ٪ الباردة ل 1 ح ، مع 1 مل تحت ادراج ثقافة الخلية و 500 μL علي راس ادراج ثقافة الخلية.
- غسل ادراج 4x 10 دقيقه مع 1x تلفزيوني ، مع 1 مل تحت و 500 μL علي راس ادراج ، علي شاكر المدارية.
- مع فرشاه ، ونقل شرائح المخيخ من 1 ادراج ثقافة الخلية إلى 1 بئر من 24 حسنا قبل مملوءة مع 1x تلفزيوني ، 0.25 ٪ تريتون X-100 ، و 3 ٪ بوسنيا (السل) ، 500 μL/well.
- يتخلل ويسد الشرائح بالحضانة في السل التلفزيوني لمده 1 ساعة في درجه حرارة الغرفة.
- احتضان مع الأجسام المضادة الاساسيه المخففة في محلول تلفزيوني-السل ، بين عشيه وضحيها في + 4 درجه مئوية ، علي شاكر المدارية ، 200 μL/well.
- في اليوم التالي ، وأداء أربعه يغسل من 10 دقيقه مع 1x تلفزيوني ، علي شاكر المدارية ، 500 μL/well.
- احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية المخففة في محلول تلفزيوني-السل ، ساعتين في درجه حرارة الغرفة ، علي شاكر المدارية ، ومحمية من الضوء ، 200 μL/well.
- أداء أربعه يغسل من 10 دقيقه مع 1x تلفزيوني ، علي شاكر المدارية ، 500 μL/well.
- مضاد للبقع الشرائح باستخدام Hoechst 33342 ، المخفف في 1x تلفزيوني (2 ميكروغرام/مل) ، لمده 10 دقيقه في درجه حرارة الغرفة ، محمية من الضوء ، 500 μL/well.
- قم بتركيب شرائح المخيخ علي شريحة مجهريه مع ماصه للتحويل. السماح لهم الهواء الجاف تماما ، محمية من الضوء. أعاده ترطيب لهم مع 1x تلفزيوني وتطبيق كوفيرسليب مغطاه بقطرات قليله من المتوسطة المتصاعدة (~ 80 μl). تجنب صنع اي فقاعات.
- وبمجرد ان يشفي الوسط المتصاعد ، تكون الأقسام المخيخره جاهزه لان تكون غير موجودة.
4. التصوير والقياس الكمي لبقاء الخلية
- قم بتشغيل المجهر والليزر وفقا للشركة المصنعة و/أو تعليمات مرفق التصوير الأساسي.
- بدء تشغيل برنامج الاستحواذ.
- باستخدام هدف 10X ، حدد موقع شرائح المخيخ غير المعدلة التي تقدم 9 – 10 الفصيصات (عاده المقاطع المخيخ بالقرب من vermis).
- تنشيط الاستحواذ علي المكدس z. تحديد نطاق المكدس z لتضمين جميع الخلايا Purkinje الموجودة في شريحة المخيخ. تعيين حجم الخطوة 2 μm وبدء الاستحواذ. احفظ الصورة المكتسبة بتنسيق الشركة المصنعة لبرامج الاستحواذ للمحافظة علي البيانات الوصفية المقترنة.
- فتح الملف المكتسب في ImageJ باستخدام التنسيق الحيوي المساعد18.
- انتقل إلى الصورة > مكدسات > Z-المشروع. .. (الشكل 2ا).
- اختيار اقصي كثافة في القائمة المنسدلة نوع الإسقاط وانقر OK (الشكل 2ب).
- سيتم إنشاء صوره ثنائيه الابعاد بالأرض. انقر نقرا مزدوجا فوق أداه متعددة النقاط للسماح بظهور اطار أداه النقطة . الغ تحديد خيار نقاط التسمية لتسهيل التمثيل المرئي للخلايا المحسوبة. ثم ، انقر مباشره علي سوما من خليه Purkinje للبدء في العد (الشكل 1ه). سيتم الاشاره إلى العدد الإجمالي للخلايا المحسوبة في أسفل نافذه أداه النقاط (الشكل 3).
ملاحظه: عاده ، يمكن قياس ما لا يقل عن 3 مقاطع غير تالفة تحتوي علي 9 إلى 10 فصوص لكل خليه من مواد الاستزراع الخلوي. لتقييم تاثير نيوروبروتكتيف من عامل الدوائية ، يجب اجراء ما لا يقل عن 3 تجارب مستقله.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وكما هو مبين في الشكل 4، ينتج هذا البروتوكول الثقافات المجسمة لشريحة المخيخ التي يمكن تقييم بقاء خليه Purkinje فيها بعد الخطوات المناعية والحصول علي الصورة. تم تسميه الخلايا purkinje مع مزيج من المضادة-Calbindin د-28K (تخفيف 1/200) و Alexa594 مكافحه الماوس (تخفيف 1/300) الأجسام المضادة. وقد تم خياطه الصورة تلقائيا بواسطة برنامج الحصول علي المجهر (NIS-عناصر) للحصول علي صوره لشريحة المخيخ كله. تم إدخال أرقام الخلايا purkinje لكل شريحة في برنامج بريزم 8 لتوليد الرسم البياني واجراء التحليل الإحصائي. في الرؤساء الستة ، كان بقاء الخلية Purkinje منخفضا في السيطرة ، متسقة مع نافذه الضعف المعروفة4 (الشكل 4ا ، ه). وازداد البقاء علي قيد الحياة مع نمو الماشية المتبرعة وخروجها من هذه الفترة الحرجة (الشكل 4جيم ، هاء). تم التعامل مع شرائح المخيخ مع تركيز KCl عاليه للحث بنجاح علي الاستقطاب والبقاء علي قيد الحياة14 (الشكل 4ب ، د ، ه).
شكل 1: صوره إيضاحيه من البروتوكول من تسلخ إلى [بوركينيي] خليه بقاء كميه.
يتم قطع راس الجرو الفار بسرعة (A). بعد تشريح المخ ، يتم عزل المخيخ (B) ، ثم يتم تقطيعه إلى شرائح بعرض 350 ميكرومتر (C). يتم وضع أقسام المخيخ علي عنصر تحكم أو الخلية المعالجة الثقافة ادراج (د) والحفاظ عليها في الثقافة لمده لا تقل عن 5 أيام في المختبر. ثم يتم إصلاح النسيج في 4 ٪ بارافورمالدهيد ، يتم تنفيذ المناعي ، ويتم الحصول علي الصور مع المجهر البؤري. وأخيرا ، يتم قياس رقم الخلية Purkinje في كل شريحة باستخدام أداه متعددة النقاط في ImageJ (E). (و) تخطيط الدورة الزمنيه لعلاج الكلور اثناء الثقافة. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: إعدادات ImageJ المستخدمة لتسطيح المكدس ثلاثي الابعاد قبل التحديد الكمي. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: الإعدادات المستخدمة لحساب رقم الخلية Purkinje باستخدام الاداه متعددة النقاط في ImageJ مع مثال لشريحة المخيخ يجري قياسه كميا. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: بقاء الخلية Purkinje في الثقافة شريحة المخيخ الوراثية بعد العلاج KCl عاليه.
الصورة التمثيلية لشرائح المخيخ الماخوذه في اليوم التالي للولادة 6 (ا، ب) أو 8 (ج، ج، د، د ') ، اما غير معالجه (ا، ج، ج) أو تعامل مع 30 مم ككل (ب، د، د '). (ج ' و د ') ارتفاع عرض التكبير من المناطق المحاصرة الأبيض في C و D. تم الاحتفاظ بالشرائح 5 أيام في المختبر قبل التثبيت. يتم تسميه الخلايا purkinje مع Calbindin د-28K باللون الأحمر. شريط مقياس = 500 μm (A-d) ، و 100 μm (C ' و d '). (ه) القياس الكمي لبقاء الخلية Purkinje من الثقافات الستة و P8 ، في السيطرة أو التعامل مع 30 ملم kcl ، يظهر بقاء اعلي مع العلاج (اختبار مان ويتني ، ن = 3 إلى 5 شرائح). يتم التعبير عن البيانات كمتوسط ± SEM. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الثقافة شريحة المخيخ هو أداه قويه لدراسة الموت المبرمجة الخلية Purkinje اثناء التنمية بعد الولادة. يمكن استخدام هذه التقنية لفحص الجزيئات المرشحة بسرعة لإمكاناتها المحصنة. الميزة الرئيسية هي ان الاعداد بسيط وفعال من حيث التكلفة جدا ، ويتطلب فقط استثمار متواضع في المعدات (يمكن ان تكلف الذبذبات ما يصل إلى 3 مرات أكثر من المروحية النسيجية). وعلاوة علي ذلك ، يمكن توليد 10 إلى 15 شرائح صحية من الجرو الماوس واحد ، مما يسمح لاختبارات مختلفه ليتم تنفيذها في نفس الوقت باستخدام واحد فقط الحيوانية.
من أجل الحصول علي نتائج متسقة وقابله للتكرار ، فمن الاهميه بمكان لأداء الثقافة بأكبر قدر ممكن من الكفاءة واختيار المقاطع المخيخ صحية لتكون مثقف. هذا الأسلوب هو أيضا مناسبه للثقافة علي المدى الطويل (تصل إلى عده أشهر). لذلك ، فمن الضروري استخدام تقنيه العقيم جيده خلال تشريح وتقطيع عمليه لتجنب تلوث والحاجة إلى تكمله الثقافات مع المضادات الحيوية.
يحافظ نموذج الثقافة الخاص بالشريحة المخيخه علي تفاعلات خلايا الخلايا الموجودة في الجزء الخاص بالانسجه ، وفي المنطقة المستزرعة. هذا ياتي مع تحذير: قد قطعت الاتصالات مع أهداف خارج المنطقة المثقفة. العرض في العوامل العصبية المقدمة من ألياف الزبائ قد توقف كذلك ويضعف بقاء الخلايا العصبية. ويمكن التحايل علي ذلك جزئيا من خلال أداء الثقافات المشتركة لشريحة التنميط العضوي. وقد ثبت ان تسلق ألياف يمكن ان تخترق بعد الولادة المخيخ شريحة الثقافات عندما شارك في استزراع مع الثقافات شريحة الزيتون السفلي14,19. أكثر من المثير للاهتمام ، نجا خلايا Purkinje التي تم الاتصال بها من قبل تسلق ألياف14.
هنا ، ركزنا علي استخدام ثقافة شريحة الشكل العضوي للبحث عن جزيئات محصنه في المخيخ النامية. ومع ذلك ، هذا الأسلوب هو مناسبه علي قدم المساواة لظروف أخرى مثل الضمور العصبي20، التجديد محواري21، ورصد النشاط الدائرة العصبية22،23. تطبيقات ما بعد الثقافة تتجاوز المناعي. يمكن استخدام شرائح للدراسات البيوكيميائية أو الجينات التعبير ، من أجل التحقيق في أليات البيولوجية المعنية في تاثير نيوروبروتكتيف من مجمع معين. تماما, هذا النموذج يمكن وضع الأساس للعثور علي جزيئات عصبيه جديده قبل في اختبار الجسم الحيوي وتكون تكمله فعاله وموثوق بها في الدراسات اليه المجرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
Acknowledgments
وأجريت اعمال التصوير في مركز جامعه نورث وسترن لمجهر المتقدمة بسخاء بدعم من الكلية CCSG P30 CA060553 منحت لمركز روبرت H لوري الشامل للسرطان. نشكر شون ماكدرمت لمساعدته الفنية ودعمه ، ومايا ابستاين للرسوم التوضيحية المرسومة باليد المبينة في الشكل 1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti-Mouse IgG secondary antibody | ThermoFisher scientific | A21203 | |
| Basal Medium Eagle (BME) | ThermoFisher scientific | 21010046 | |
| Biosafety cabinet Class II, Type A2 | NuAire | NU-540-400 | |
| Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A2153 | |
| Brush | |||
| anti-Calbindin D-28K antibody (CB-955) | Abcam | ab82812 | |
| CO2 Incubator | NuAire | NU-5700 | |
| Corning Costar Flat Bottom 6-well Cell Culture Plates | Fisher Scientific | 07-200-83 | |
| Coverslips, 22 x 50 mm | Fisher Scientific | 12-545-E | |
| Dressing forceps, straight | Harvard Apparatus | 72-8949 | |
| Double edge blades | Fisher Scientific | 50949411 | |
| Ethanol 200 proof | Decon Labs, Inc | 2701 | |
| Eye Scissors, straight | Harvard Apparatus | 72-8428 | |
| Fine forceps | Fisher Scientific | 16-100-127 | |
| L-Glutamine 100X | ThermoFisher scientific | 25030149 | |
| Glucose solution | ThermoFisher scientific | A2494001 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution | ThermoFisher scientific | 14025092 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Fisher Scientific | H21492 | |
| Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin | ThermoFisher scientific | 26050088 | |
| ImageJ | |||
| McIlwain Tissue Chopper | Fisher Scientific | NC9914528 | |
| Microprobes | Fisher Scientific | 08-850 | |
| Millicell Cell Culture Inserts | Millipore Sigma | PICM0RG50 | |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane, 250 mL | ThermoFisher scientific | 168-0045 | |
| Nikon A1R confocal laser microscope system | Nikon | ||
| NIS-Elements Imaging Software | Nikon | ||
| Paraformaldehyde | Acros Organics | 41678-0010 | |
| Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher scientific | P10144 | |
| Operating Scissors, straight | Harvard Apparatus | 72-8403 | |
| Orbital shaker Belly Dancer | IBI Scientific | BDRLS0003 | |
| Prism 8 | GraphPad | ||
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Tissue Culture Dish, 60 mm w/ grip ring | Fisher Scientific | FB012921 | |
| Tissue culture plate, 24 well | Falcon/Corning | 353047 | |
| Transfer pipettes, sterile | ThermoFisher scientific | 13-711-21 | |
| Triton X-100 | ThermoFisher scientific | BP151-500 |
References
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Gahwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
- Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro. Science. 245 (4914), 192-194 (1989).
- Dusart, I., Airaksinen, M. S., Sotelo, C. Purkinje cell survival and axonal regeneration are age dependent: an in vitro study. Journal of Neuroscience. 17 (10), 3710-3726 (1997).
- Wiegreffe, C., Feldmann, S., Gaessler, S., Britsch, S. Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation. Journal of Visualized Experiments. (125), e55886 (2017).
- Daviaud, N., et al. Modeling nigrostriatal degeneration in organotypic cultures, a new ex vivo model of Parkinson's disease. Neuroscience. 256, 10-22 (2014).
- Ghoumari, A. M., et al. Mifepristone (RU486) protects Purkinje cells from cell death in organotypic slice cultures of postnatal rat and mouse cerebellum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7953-7958 (2003).
- Labombarda, F., et al. Neuroprotection by steroids after neurotrauma in organotypic spinal cord cultures: a key role for progesterone receptors and steroidal modulators of GABA(A) receptors. Neuropharmacology. 71, 46-55 (2013).
- Gao, P., et al. P2X7 receptor-sensitivity of astrocytes and neurons in the substantia gelatinosa of organotypic spinal cord slices of the mouse depends on the length of the culture period. Neuroscience. , 195-207 (2017).
- Sundstrom, L., Morrison, B., Bradley, M., Pringle, A. Organotypic cultures as tools for functional screening in the CNS. Drug Discovery Today. 10 (14), 993-1000 (2005).
- Jankowski, J., Miething, A., Schilling, K., Baader, S. L. Physiological purkinje cell death is spatiotemporally organized in the developing mouse cerebellum. Cerebellum. 8 (3), 277-290 (2009).
- Ghoumari, A. M., Wehrle, R., Bernard, O., Sotelo, C., Dusart, I. Implication of Bcl-2 and Caspase-3 in age-related Purkinje cell death in murine organotypic culture: an in vitro model to study apoptosis. European Journal of Neuroscience. 12 (8), 2935-2949 (2000).
- Ghoumari, A. M., Wehrle, R., De Zeeuw, C. I., Sotelo, C., Dusart, I. Inhibition of protein kinase C prevents Purkinje cell death but does not affect axonal regeneration. Journal of Neuroscience. 22 (9), 3531-3542 (2002).
- Ghoumari, A. M., et al. Neuroprotective effect of mifepristone involves neuron depolarization. FASEB Journal. 20 (9), 1377-1386 (2006).
- Repici, M., Wehrle, R., Antoniou, X., Borsello, T., Dusart, I. c-Jun N-terminal kinase (JNK) and p38 play different roles in age-related Purkinje cell death in murine organotypic culture. Cerebellum. 10 (2), 281-290 (2011).
- Rakotomamonjy, J., Ghoumari, A. M. Brain-Derived Neurotrophic Factor Is Required for the Neuroprotective Effect of Mifepristone on Immature Purkinje Cells in Cerebellar Slice Culture. International Journal of Molecular Sciences. 20 (2), (2019).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
- Uesaka, N., et al. Organotypic coculture preparation for the study of developmental synapse elimination in mammalian brain. Journal of Neuroscience. 32 (34), 11657-11670 (2012).
- Falsig, J., et al. Prion pathogenesis is faithfully reproduced in cerebellar organotypic slice cultures. PLoS Pathogens. 8 (11), 1002985 (2012).
- Bouslama-Oueghlani, L., Wehrle, R., Sotelo, C., Dusart, I. The developmental loss of the ability of Purkinje cells to regenerate their axons occurs in the absence of myelin: an in vitro model to prevent myelination. Journal of Neuroscience. 23 (23), 8318-8329 (2003).
- Apuschkin, M., Ougaard, M., Rekling, J. C. Spontaneous calcium waves in granule cells in cerebellar slice cultures. Neuroscience Letters. 553, 78-83 (2013).
- Audinat, E., Knopfel, T., Gahwiler, B. H. Responses to excitatory amino acids of Purkinje cells' and neurones of the deep nuclei in cerebellar slice cultures. Journal of Physiology. 430, 297-313 (1990).
