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Neuroscience

Purkinje Zell Überleben in organotypischen Zerebellar Slice Kulturen

Published: December 18, 2019 doi: 10.3791/60353

Summary

Organotypische Scheibenkulturen sind ein leistungsfähiges Werkzeug, um neuroentwicklungsfördernde oder degenerative/regenerative Prozesse zu untersuchen. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das den neuroentwicklungsbedingten Tod von Purkinje-Zellen in Maus-Kleinhirn-Scheibenkulturen modelliert. Diese Methode kann die Forschung in neuroprotektive Arzneimittel Entdeckung profitieren.

Abstract

Organotypische Scheibenkultur ist ein leistungsfähiges In-vitro-Modell, das in vivo Bedingungen näher imitiert als dissoziierte primäre Zellkulturen. In der frühen postnatalen Entwicklung, Kleinhirn Purkinje Zellen sind dafür bekannt, durch eine anfällige Periode zu gehen, in der sie programmierten Zelltod. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Verfügung, um in dieser kritischen Zeit eine organotypische Kleinhirn-Slice-Kultur der Maus durchzuführen. Die Scheiben werden weiter gekennzeichnet, um das Überleben der Purkinje-Zellunde und die Wirksamkeit neuroprotektive Behandlungen zu bewerten. Diese Methode kann extrem wertvoll sein, um auf neue neuroaktive Moleküle zu überprüfen.

Introduction

In-vitro-Modellierung ist ein wesentliches Werkzeug in der biomedizinischen Forschung. Es ermöglicht den Forschern, spezifische Mechanismen in eingeschränkten Zelltypen oder in isolierten Systemen/Organen zu untersuchen und streng zu kontrollieren. Organotypische Scheibenkultur ist eine weit verbreitete In-vitro-Technik, vor allem im Bereich der Neurowissenschaften1. Die Methode wurde zuerst von Gähwiler etabliert, der Gehirnscheiben mit der Rollenrohrtechnik2kultivierte, und später modifiziert von Yamamoto et al., der die Verwendung einer mikroporösen Membran einführte, um kortikale Scheibenkulturen durchzuführen3. Im Vergleich zu primären Zellkulturen bieten organotypische Scheibenkulturen den Vorteil, die Zytoarchitektur des Gewebes sowie einheimische Zell-Zell-Verbindungen in der Ebene des Gewebeabschnitts zu erhalten.

Organotypische Scheiben wurden aus vielen Teilen des zentralen Nervensystems kultiviert, wie der Hippocampus4, Cortex5, Striatum6, Kleinhirn4,7, und Rückenmark8,9, unter anderem. Sie haben sich als ein leistungsfähiges Werkzeug in Drogen-Entdeckungsstudien10. Die Auswirkungen neuroaktiver Moleküle können auf vielfältige Weise bewertet werden: Überleben und Neurodegeneration mit Immunostaining- und Biochemie-Assays, neuronale Schaltungsbildung oder Unterbrechung enthoben mit Elektrophysiologie und Live-Imaging.

Das Ziel dieser Arbeit ist es, eine einfache Methode zu beschreiben, um organotypische Kleinhirn-Scheibenkultur durchzuführen, die bekanntermaßen ein relevantes Modell ist, um die Entwicklung von Kleinhirn in vitro nachzuahmen. Insbesondere konzentrierten wir uns auf die Untersuchung des Purkinje-Zellentwicklungstodes. In vivo, Purkinje-Zellen unterziehen Apoptose während der ersten postnatalen Woche, Höhepunkt am postnatalen Tag 3 (P3)11. Das gleiche Muster wird in der Kleinhirnscheibenkultur beobachtet, wobei Purkinje-Neuronen durch Apoptose sterben, wenn Kleinhirn von Tieren zwischen P1 und P8 genommen wird, mit einem Spitzenwert bei P34,12. Die Verwendung der organotypischen Kleinhirnscheibenkulturen hat es ermöglicht, mehrere neuroprotektive Moleküle7,13, sowie das Verständnis eines Teils der Mechanismen, die an diesem programmierten Zelltod beteiligt sind, zu identifizieren14,15,16. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das auf der Untersuchung von Stoppini et al.17 im Hippocampus basiert und von Dusart et al. an Kleinhirn angepasst wurde.4 Es beinhaltet eine schnelle Zerlegung und Zerkleinerung der postnatalen Kleinhirn; Kultur auf einen Zellkultureinsatz schneiden, der eine mikroporöse Membran mit oder ohne neuroprotektive Behandlung enthält; und Immunfluoreszenzfärbung zur Beurteilung des neuronalen Überlebens.

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Protocol

Alle Versuche mit Tieren wurden in Übereinstimmung mit dem Northwestern University Animal Studies Committee durchgeführt.

1. Zubereitung vor organotypischen Kleinhirnscheibenkulturen

  1. In einer Zellkulturhaube, die vorher mit 70% Ethanol besprüht wurde, 200 ml Kulturmedium in einem 250 ml Flaschen-Top-Vakuumfilter vorbereiten, der an einem sterilen Flaschenempfänger befestigt ist. Fügen Sie 100 ml Basal Medium Eagle (BME), 50 ml Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS), 50 ml hitzeinaktiviertes Pferdeserum, 1 ml 200 ml L-Glutamin (Endkonzentration 1 mM) und 5 ml 200 g/l Glukose (Endkonzentration 5 mg/ml) hinzu. Vakuumfiltern Sie das Kulturmedium und halten Sie es bis zu einem Monat bei +4 °C.
  2. Nehmen Sie im sterilisierten Biosicherheitsschrank eine 6-Well-Kulturplatte aus der Verpackung heraus. Füllen Sie jeden gut mit 1 ml Kulturmedium. Wenn eine Behandlung getestet wird, fügen Sie das pharmakologische Mittel in den behandelten Brunnen und das gleiche Volumen der Fahrzeuglösung für den Kontrollbrunnen hinzu. In der vorliegenden Studie haben wir dem behandelten Brunnen (30 mM Endwasser) und 1 l sterilem Wasser 1 l sterile 3 M KCl-Lösung zu den Kontrollbrunnen hinzugefügt.
  3. Bringen Sie die benötigte Anzahl individuell umwickelter Zellkultureinsätze mit hydrophiler Polytetrafluorethylen (PTFE)-Membran (Porengröße = 0,4 m) in die Zellkulturhaube. Sie vorsichtig auspacken und die Zellkultureinsätze mit steriler Zange herausnehmen. Lassen Sie sie eins nach dem anderen in einem Brunnen einer 6-Well-Platte fallen, wodurch Blasen an der Schnittstelle zwischen der Insert-Membran und dem Zellkulturmedium vermieden werden. Lassen Sie die Einsätze im Medium in einem 37 °C, 5%CO2-Inkubator für mindestens 2 h vor der Kultur ausdemieren.
    HINWEIS: Der Gewebechopper befindet sich dauerhaft in der Zellkulturhaube.
  4. Bereiten Sie zwei 200 ml Becher vor, von dem einer mit 150 ml sterilem Wasser und der andere mit 150 ml 70% Ethanol gefüllt ist. Tauchen Sie die chirurgischen Werkzeuge in das 70% Ethanol-Bad und dann in Wasser, bevor Sie sie verwenden.
    HINWEIS: Verwenden Sie keine chirurgischen Werkzeuge unmittelbar nach dem Kontakt mit Ethanol.
  5. Desinfizieren Sie die zweischneidige Klinge im 70% EthanolBecher. Legen Sie ihn mit sterilen Zangen auf den Klingenhalter und halten Sie ihn mit dem Klingenklemmenschlüssel ein. Lassen Sie es trocknen, bis es verwendet wird.
  6. Desinfizieren Sie die mit dem Tissue-Chopper im 70% Ethanolbecher gelieferte Kunststoffscheibe. Sprühen Sie den Schneidtisch mit 70% Ethanol, bevor Sie die Scheibe darauf legen. Trocknen lassen, bis es verwendet wird.

2. Dissektion und Zerebellar Organotypische Scheibenkulturen

  1. Bringen Sie den Mauswelpen in die Zellkulturhaube, um die Sezierung durchzuführen.
  2. Enthaupten Sie den Welpen schnell mit geraden Bedienscheren (Abbildung 1A).
  3. Während Sie den Kopf des Welpen an der Nase mit geraden Ankleidezangen halten, schneiden Sie die Kopfhaut mit einer geraden Augenschere auf, beginnend vom hinteren Ende, und gehen Sie seitlich zur Mittellinie.
  4. Gehen Sie identisch für den Schädel.
    HINWEIS: Achten Sie darauf, Scherenspitzen nach außen zu zeigen, um zu vermeiden, dass das Kleinhirn während der Zerlegung beschädigt wird.
  5. Nehmen Sie das Gehirn heraus und übertragen Sie es auf eine 60-mm-Schale, gefüllt mit kaltem HBSS + 5 mg/ml Glukose.
  6. Sezieren Sie das Kleinhirn vorsichtig mit sterilen geraden FeinenZangen (Abbildung 1B). Übertragen Sie es mit sterilgekrümmten FeinenZangen auf die Aufdruckscheibe des Tissue-Choppers.
  7. Richten Sie das Gewebe aus, indem Sie den Schneidtisch drehen, um parasagittale Abschnitte durchzuführen.
  8. Bewegen Sie den Schneidtisch, indem Sie den Tischfreigabeknopf nach rechts ziehen, sodass die Klinge am Rand des Gewebes positioniert ist.
  9. Passen Sie die Scheibendicke auf 350 m und die Klingengeschwindigkeit auf mittel an.
  10. Starten Sie den Chopper. Sobald das ganze Kleinhirn in Scheiben geschnitten wurde (Abbildung 1C), schalten Sie den Chopper aus.
  11. Entfernen Sie die Kunststoffscheibe mit steriler Zange.
  12. Bringen Sie die Kunststoffscheibe vorsichtig in die Nähe einer 60-mm-Schale, die HBSS + 5 mg/ml Glukose enthält. Pipette kalt HBSS + 5 mg/ml Glukose auf das Gewebe mit einer sterilen Transferpipette, um die Ernte von Kleinhirnscheiben in der puffergefüllten Schale zu ermöglichen.
  13. Trennen Sie die Kleinhirnscheiben mit einer Mikrosonde voneinander. Nehmen Sie mit der Transferpipette hochwertige Abschnitte heraus (es wird empfohlen, Gewebeabschnitte zu verwenden, die in der Nähe der Vermis liegen) und legen Sie sie in einem vorausgeglichenen Zellkultureinsatz ab (Abbildung 1D).
  14. Positionieren Sie die Kleinhirnscheiben mit der Mikrosonde auf dem Zellkultureinsatz und entfernen Sie dann vorsichtig die überschüssige HBSS + 5 mg/ml Glukoselösung mit der Transferpipette.
    HINWEIS: In diesem Stadium ist das Gewebe extrem zart und anfällig für körperliche Schäden. Die maximale Anzahl von Kleinhirnscheiben pro Zellkultureinsatz hängt vom Alter des Spendertiers ab. 6–8 Scheiben können für ein P0-P4-altes Tier und 4–6 Scheiben für Tiere, die älter als P5 sind, kultiviert werden.
  15. Legen Sie das Kulturgericht in den Inkubator und wechseln Sie das Medium alle 2–3 Tage komplett.
  16. Um das Überleben der Purkinje-Zell zu beurteilen, können Scheiben bereits 5 Tage in vitro gesammelt werden. Für andere Zwecke können sie in kultur für mehrere Wochen aufrechterhalten werden (Abbildung 1F).
    ANMERKUNG: Bei Purkinje-Zell-Überlebensexperimenten besteht keine Notwendigkeit, die pharmakologische Behandlung zu erneuern, wenn das Medium der Zellkultur verändert wird (Abbildung 1F).

3. Immunfluoreszenz

  1. Nehmen Sie die 6-Well-Platte aus dem Inkubator. Entfernen Sie das Zellkulturmedium, waschen Sie den Zellkultureinsatz mit 1x PBS, und fixieren Sie die Scheiben mit kalter 4% Paraformaldehydlösung für 1 h, mit 1 ml unter dem Zellkultureinsatz und 500 l über dem Zellkultureinsatz.
  2. Waschen Sie die Einsätze 4x 10 min mit 1x PBS, mit 1 ml unter und 500 l auf der Oberseite des Einsatzes, auf einem Orbital-Shaker.
  3. Mit einem Pinsel die Kleinhirnscheiben von 1 Zellkultureinsatz auf 1 Brunnen eines 24-well vorgefüllten mit 1x PBS, 0,25% Triton X-100 und 3% BSA (PBS-TB), 500 l/well übertragen.
  4. Permeabilisieren und blockieren Sie die Scheiben durch Inkubation in PBS-TB für 1 h bei Raumtemperatur.
  5. Inkubieren Sie mit primär in der PBS-TB-Lösung verdünnten Primärantikörpern über Nacht bei + 4 °C auf einem Orbital-Shaker, 200 l/well.
  6. Führen Sie am nächsten Tag vier Wälzungen von 10 min mit 1x PBS, auf einem Orbital-Shaker, 500 l/well.
  7. Inkubieren Sie mit sekundären Antikörpern, die in der PBS-TB-Lösung verdünnt sind, zwei Stunden bei Raumtemperatur, auf einem Orbital-Shaker und vor Licht geschützt, 200 l/well.
  8. Führen Sie vier Wässen von 10 min mit 1x PBS, auf einem Orbital-Shaker, 500 l/well.
  9. Gegenbeflecken Sie die Scheiben mit Hoechst 33342, verdünnt in 1x PBS (2 g/ml), für 10 min bei Raumtemperatur, geschützt vor Licht, 500 l/well.
  10. Montieren Sie die Kleinhirnscheiben auf einem Mikroskopschlitten mit einer Transferpipette. Lassen Sie sie vollständig lufttrocknen, vor Licht geschützt. Befeuchten Sie sie mit 1x PBS und tragen Sie einen Deckelschlupf auf, der mit wenigen Tropfen Montagemedium bedeckt ist. Vermeiden Sie Blasen.
  11. Sobald das Montagemedium ausgehärtet ist, sind Kleinhirnabschnitte bereit, abgebildet zu werden.

4. Bildgebung und Quantifizierung des Zellüberlebens

  1. Schalten Sie das Mikroskop und die Laser gemäß den Anweisungen des Herstellers und/oder der Bildaufnahmeeinrichtung ein.
  2. Starten Sie die Erfassungssoftware.
  3. Mit einem 10-fachen Objektiv, lokalisieren Sie nicht veränderte Kleinhirnscheiben, die 9–10 Lobulen präsentieren (in der Regel Kleinhirnabschnitte in der Nähe der Vermis).
  4. Aktivieren Sie die Z-Stack-Erfassung. Definieren Sie den Bereich des Z-Stacks, um alle Purkinje-Zellen im Kleinhirnbereich einzuschließen. Legen Sie eine Schrittgröße von 2 m fest und starten Sie die Erfassung. Speichern Sie das erworbene Bild im Format des Herstellers der Erfassungssoftware, um die zugehörigen Metadaten beizubehalten.
  5. Öffnen Sie die erworbene Datei in ImageJ mit dem Bio-Format-Plugin18.
  6. Gehen Sie zu Bild > Stapel > Z-Projekt... (Abbildung 2A).
  7. Wählen Sie Max Intensität im Dropdown-Menü Projektionstyp und klicken Sie auf OK (Abbildung 2B).
  8. Es wird ein abgeflachtes 2D-Bild generiert. Doppelklicken Sie auf das Multi-Point-Werkzeug, um das Fenster Punktwerkzeug erscheinen zu lassen. Deaktivieren Sie die Option Beschriftungspunkte, um die Visualisierung gezählter Zellen zu vereinfachen. Klicken Sie dann direkt auf ein Soma einer Purkinje-Zelle, um mit der Zählung zu beginnen (Abbildung 1E). Die Gesamtzahl der gezählten Zellen wird am unteren Rand des Fensters Punktwerkzeug angezeigt (Abbildung 3).
    HINWEIS: In der Regel können mindestens 3 nicht beschädigte Abschnitte mit 9–10 Lobulen pro Zellkultureinsatz quantifiziert werden. Um die neuroprotektive Wirkung eines pharmakologischen Wirkstoffs zu bewerten, sollten mindestens 3 unabhängige Experimente durchgeführt werden.

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Representative Results

Wie in Abbildung 4dargestellt, produziert dieses Protokoll organotypische Kleinhirnscheibenkulturen, in denen das Überleben von Purkinje-Zellen nach den Immunfluoreszenz- und Bildaufnahmeschritten beurteilt werden kann. Purkinje-Zellen wurden mit einer Kombination von Anti-Calbindin D-28K (Verdünnung 1/200) und Alexa594 Anti-Maus-Antikörper (Verdünnung 1/300) Anti-Maus-Antikörper gekennzeichnet. Die Bildnähte wurden automatisch von der Mikroskoperfassungssoftware (NIS-Elemente) durchgeführt, um ein Bild der gesamten Kleinhirnscheibe zu erhalten. Purkinje-Zellenzahlen pro Slice wurden in die Prism 8-Software eingegeben, um das Diagramm zu generieren und statistische Analysen durchzuführen. Bei P6 war das Überleben der Purkinje-Zellen in der Kontrolle gering, was mit ihrem bekannten Verwundbarkeitsfenster4 (Abbildung 4A,E) übereinstimmte. Das Überleben nahm zu, als das Spendertier älter wurde und diese kritische Periode beendete (Abbildung 4C,E). Kleinhirnscheiben wurden mit hoher KCl-Konzentration behandelt, um ihre Depolarisation und ihr Überleben erfolgreich zu induzieren14 (Abbildung 4B,D,E).

Figure 1
Abbildung 1: Abbildung des Protokolls von der Zerlegung bis zur Purkinje-Zellüberlebensquantifizierung.
Der Maus-Welpen wird schnell enthauptet (A). Nach der Hirnsektion wird das Kleinhirn isoliert (B) und dann in 350 m breite Scheiben gehackt (C). Die Kleinhirnabschnitte werden auf einen Kontroll- oder behandelten Zellkultureinsatz (D) gelegt und in der Kultur für mindestens 5 Tage in vitro beibehalten. Das Gewebe wird dann in 4% Paraformaldehyd fixiert, Immunfärbung wird durchgeführt und Bilder werden mit einem konfokalen Mikroskop aufgenommen. Schließlich wird die Purkinje-Zellnummer in jedem Slice mit dem Multipoint-Tool in ImageJ (E) quantifiziert. (F) Schematic des Zeitverlaufs der KCl-Behandlung während der Kultur. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: ImageJ-Einstellungen, die verwendet werden, um den 3D-Stack vor der Quantifizierung zu verflachen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Einstellungen zum Zählen der Purkinje-Zellennummer mithilfe des Multipoint-Werkzeugs in ImageJ mit einem Beispiel für die Quantifizierung eines Kleinhirnschnitts. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Purkinje-Zell-Überleben in der organotypischen Kleinhirnscheibenkultur nach hoher KCl-Behandlung.
Repräsentatives Bild von Kleinhirnscheiben, die am postnatalen Tag 6 (A, B) oder 8 (C, C', D, D'genommen wurden , entweder unbehandelt (A, C, C') oder mit 30 mM KCl (B, D, D'behandelt wurden). (C' und D') Höhere Vergrößerungsansicht der weiß geschachtelten Bereiche in C und D. Scheiben wurden 5 Tage in vitro vor der Fixierung aufbewahrt. Purkinje-Zellen sind rot mit Calbindin D-28K gekennzeichnet. Skala bar = 500 m (AD) und 100 m (C' und D'). (E) Die Quantifizierung des Purkinje-Zellüberlebens aus P6- und P8-Kulturen, die mit 30 mM KCl kontrolliert oder behandelt werden, zeigt ein höheres Überleben mit der Behandlung (Mann-Whitney-Test, n = 3 bis 5 Scheiben). Die Daten werden als Mittelwert -SEM ausgedrückt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Cerebellar Slice Kultur ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um programmiertpuren Zelltod während der postnatalen Entwicklung zu studieren. Diese Technik kann verwendet werden, um Kandidatenmoleküle schnell auf ihr neuroprotektives Potenzial zu untersuchen. Der Hauptvorteil ist, dass die Einrichtung einfach und sehr kostengünstig ist und nur eine bescheidene Investition in die Ausrüstung erfordert (ein Vibratome kann bis zu 3-mal mehr kosten als ein Gewebe-Chopper). Darüber hinaus können 10 bis 15 gesunde Scheiben aus einem Mauswelpen erzeugt werden, so dass verschiedene Assays parallel mit nur einem Tier durchgeführt werden können.

Um konsistente und reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen, ist es wichtig, die Kultur so effizient wie möglich durchzuführen und gesunde Kleinhirnabschnitte zu wählen, die kultiviert werden sollen. Diese Methode eignet sich auch für Langzeitkulturen (bis zu mehreren Monaten). Daher ist es wichtig, während des Zerlegungs- und Zerkleinerungsprozesses eine gute aseptische Technik zu verwenden, um Kontaminationen und die Notwendigkeit, Kulturen mit Antibiotika zu ergänzen, zu vermeiden.

Das Kleinhirnschnittkulturmodell bewahrt vorhandene Zell-Zell-Interaktionen in der Ebene des Gewebeabschnitts und in der Kulturregion. Dies bringt eine Einschränkung mit sich: Verbindungen zu Zielen außerhalb der Kulturregion könnten abgebrochen werden. Die Versorgung mit neurotrophen Faktoren, die durch affete Fasern bereitgestellt werden, könnte ebenfalls eingestellt werden und das neuronale Überleben beeinträchtigen. Dies kann teilweise durch organotypische Scheibenkokulturen umgangen werden. Es hat sich gezeigt, dass Kletterfasern postnatale Kleinhirn-Scheibenkulturen durchdringen können, wenn sie mit minderwertigen Olivenscheibenkulturen14,19mitkultiviert werden. Interessanter ist, dass Purkinje-Zellen, die durch Kletterfasern kontaktiert wurden,14überlebten.

Hier konzentrierten wir uns auf die Verwendung von organotypischer Scheibenkultur, um nach neuroprotektive Molekülen im sich entwickelnden Kleinhirn zu suchen. Diese Methode eignet sich jedoch gleichermaßen für andere Erkrankungen wie Neurodegeneration20, axonale Regeneration21und Überwachung der neuronalen Kreislaufaktivität22,23. Die Postkulturanwendungen gehen über die Immunfluoreszenz hinaus. Slices können für biochemische oder Genexpressionsstudien verwendet werden, um die biologischen Mechanismen zu untersuchen, die an der neuroprotektive Wirkung einer bestimmten Verbindung beteiligt sind. Insgesamt kann dieses Modell den Grundstein für die Suche nach neuen neuroaktiven Molekülen vor in vivo-Tests legen und eine effektive und zuverlässige Ergänzung zu in vivo mechanistischen Studien sein.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Die Bildarbeiten wurden am Northwestern University Center for Advanced Microscopy durchgeführt, die von NCI CCSG P30 CA060553 großzügig an das Robert H Lurie Comprehensive Cancer Center verliehen wurde. Wir danken Sean McDermott für seine technische Unterstützung und Unterstützung und Maya Epstein für die handgezeichneten Illustrationen in Abbildung 1.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 594 Donkey anti-Mouse IgG secondary antibody ThermoFisher scientific A21203
Basal Medium Eagle (BME) ThermoFisher scientific 21010046
Biosafety cabinet Class II, Type A2 NuAire NU-540-400
Bovine serum albumin Millipore Sigma A2153
Brush
anti-Calbindin D-28K antibody (CB-955) Abcam ab82812
CO2 Incubator NuAire NU-5700
Corning Costar Flat Bottom 6-well Cell Culture Plates Fisher Scientific 07-200-83
Coverslips, 22 x 50 mm Fisher Scientific 12-545-E
Dressing forceps, straight Harvard Apparatus 72-8949
Double edge blades Fisher Scientific 50949411
Ethanol 200 proof Decon Labs, Inc 2701
Eye Scissors, straight Harvard Apparatus 72-8428
Fine forceps Fisher Scientific 16-100-127
L-Glutamine 100X ThermoFisher scientific 25030149
Glucose solution ThermoFisher scientific A2494001
Hanks’ Balanced Salt Solution ThermoFisher scientific 14025092
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate Fisher Scientific H21492
Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin ThermoFisher scientific 26050088
ImageJ
McIlwain Tissue Chopper Fisher Scientific NC9914528
Microprobes Fisher Scientific 08-850
Millicell Cell Culture Inserts Millipore Sigma PICM0RG50
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane, 250 mL ThermoFisher scientific 168-0045
Nikon A1R confocal laser microscope system Nikon
NIS-Elements Imaging Software Nikon
Paraformaldehyde Acros Organics 41678-0010
Pasteur pipets Fisher Scientific 13-678-20D
Potassium Chloride Fisher Scientific BP366-500
ProLong Gold Antifade Mountant ThermoFisher scientific P10144
Operating Scissors, straight Harvard Apparatus 72-8403
Orbital shaker Belly Dancer IBI Scientific BDRLS0003
Prism 8 GraphPad
Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Tissue Culture Dish, 60 mm w/ grip ring Fisher Scientific FB012921
Tissue culture plate, 24 well Falcon/Corning 353047
Transfer pipettes, sterile ThermoFisher scientific 13-711-21
Triton X-100 ThermoFisher scientific BP151-500

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References

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Rakotomamonjy, J., Guemez-Gamboa, A. More

Rakotomamonjy, J., Guemez-Gamboa, A. Purkinje Cell Survival in Organotypic Cerebellar Slice Cultures. J. Vis. Exp. (154), e60353, doi:10.3791/60353 (2019).

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