Summary
Organotypiske skive kulturer er et kraftfuldt værktøj til at studere neuroudviklingsmæssige eller degenerative/regenerative processer. Her beskriver vi en protokol, der modeller den neuroudviklingsmæssige død af Purkinje celler i mus cerebellar skive kulturer. Denne metode kan gavne forskning i neuroprotektive Drug Discovery.
Abstract
Organotypiske skive kultur er en kraftfuld in vitro-model, der efterligner in vivo betingelser tættere end dissocierede primære cellekulturer. I den tidlige postnatal udvikling, cerebellar Purkinje celler er kendt for at gå gennem en sårbar periode, hvor de gennemgår programmeret celledød. Her giver vi en detaljeret protokol til at udføre mus organotypic cerebellar skive kultur i denne kritiske tid. Udsnittene er yderligere mærket for at vurdere Purkinje-cellens overlevelse og effekten af neuroprotektive behandlinger. Denne metode kan være yderst værdifuld at screene for nye Neuro aktive molekyler.
Introduction
In vitro modellering er et vigtigt redskab i biomedicinsk forskning. Det giver forskerne mulighed for at studere og stramt kontrollere specifikke mekanismer i begrænset celletyper, eller i isolerede systemer/organer. Organotypiske skive kultur er en meget anvendt in vitro-teknik, især inden for neurovidenskab1. Metoden blev først etableret af Gähwiler, der dyrkede hjerne skiver ved hjælp af valse røret Technique2, og senere modificeret af Yamamoto et al., der introducerede brugen af en Mikroporøs membran til at udføre kortikale skive kulturer3. Sammenlignet med primære cellekulturer, organotypiske skive kulturer præsentere fordelen ved at bevare den cytoarkitektur af vævet, samt indfødte celle-celleforbindelser i flyet af vævs sektionen.
Organotypiske skiver er blevet dyrket fra mange dele af det centrale nervesystem, såsom hippocampus4, cortex5, striatum6, cerebellum4,7, og rygmarven8,9, blandt andre. De har vist sig at være et kraftfuldt værktøj i Drug Discovery undersøgelser10. Virkningerne af Neuro aktive molekyler kan vurderes på mange måder: overlevelse og neurodegeneration ved hjælp af immun farvning og biokemiske analyser, neuronal kredsløb dannelse, eller afbrydelse ved hjælp af Elektrofysiologi og Live-imaging.
Målet med dette arbejde er at beskrive en simpel metode til at udføre organotypiske cerebellar skive kultur, som er kendt for at være en relevant model til at efterligne cerebellare udvikling in vitro. Især fokuserede vi på studiet af Purkinje Cell udviklingsmæssige død. In vivo gennemgår Purkinje celler apoptose i løbet af den første postnatale uge og toppede på postnatale dag 3 (P3)11. Det samme mønster er observeret i cerebellare skive kultur, med Purkinje neuroner dør af apoptose, når cerebella er taget fra dyr mellem P1 og P8, med et højdepunkt på P34,12. Brugen af den organotypiske cerebellare skive kulturer har gjort det muligt at identificere flere neuroprotektive molekyler7,13, samt forståelse en del af de mekanismer, der er involveret i denne programmerede celledød14,15,16. Her beskriver vi en protokol baseret på studiet af Stoppini et al.17 i hippocampus og tilpasset cerebellum af Dusart et al.4 det omfatter hurtig dissektion og hakning af postnatal cerebella; udskæring af kulturen på en cellekultur indsats, der indeholder en Mikroporøs membran, med eller uden neuroprotektive behandling; og immunofluorescens farvning for at vurdere neuronal overlevelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøg, der involverer dyr, blev udført i overensstemmelse med det nordvestlige Universitet dyreforsøg udvalg.
1. forberedelse forud for organotypiske cerebellare skive kulturer
- I en cellekultur hætte sprøjtet med 70% ethanol på forhånd, forberede 200 mL af kulturmedium i en 250 mL flaske-Top vakuum filter fastgjort til en steril flaske modtager. Tilsæt 100 mL basal medium Eagle (BME), 50 mL Hanks afbalanceret salt opløsning (HBSS), 50 mL varme inaktiveret heste serum, 1 mL 200 mM L-glutamin (slutkoncentration 1 mM) og 5 mL 200 g/L glucose (slutkoncentration 5 mg/mL). Vakuum-Filtrer kulturmediet og opbevar det ved + 4 °C i op til en måned.
- I det steriliserede biosikkerheds kabinet skal du tage en 6-brønd kultur plade ud af emballagen. Fyld hver brønd med 1 mL dyrkningsmedium. Hvis en behandling testes, tilsættes det farmakologiske middel til den behandlede brønd, og den samme volumen af køretøjets opløsning til kontrol brønd. I denne undersøgelse tilføjede vi 1 μL steril 3 M KCl-opløsning til den behandlede brønd (30 mM endelig) og 1 μL sterilt vand til kontrol brøndene.
- Bring inde i cellen kultur hætte det nødvendige antal individuelt indpakket cellekultur skær med hydrofile polytetrafluorethylen (PTFE) membran (porestørrelse = 0,4 μm). Pak dem forsigtigt ud, og tag cellekulturen ud med sterile pincet. Slip dem en efter en i en brønd af en 6-brønd plade, undgå bobler på grænsefladen mellem skærmembranen og cellekultur mediet. Lad skær ækvibrere i mediet i en 37 °C, 5% CO2 inkubator i mindst 2 h før kultur.
Bemærk: vævs chopper permanent opholder sig i cellen kultur hætte. - Forbered 2 200 mL bægre, en fyldt med 150 mL sterilt vand, og den anden fyldt med 150 mL 70% ethanol. Dyp de kirurgiske værktøjer i 70% ethanol bad og derefter i vand, før du bruger dem.
Bemærk: Brug ikke kirurgiske værktøjer umiddelbart efter kontakt med ethanol. - Desinficer det dobbelt kantede blad i 70% ethanol bæger. Anbring den på knivholderen ved hjælp af sterile pincet, og hold den på plads ved hjælp af klinge klemme nøglen. Lad det tørre indtil brug.
- Desinficer den plastik skive, der er forsynet med vævs chopper i 70% ethanol-bægerglasset. Sprøjt skærebordet med 70% ethanol, før du placerer disken på den. Lad tørre indtil brug.
2. dissektions-og cerebellar Organotypiske skive kulturer
- Bring musen pup inde i cellen kultur hætte til at udføre Dissection.
- Decapitate pup hurtigt ved hjælp af lige betjening saks (figur 1A).
- Mens du holder pup hoved ved næsen med lige dressing pincet, skæres åbne hovedbunden ved hjælp af lige øje saks, begyndende fra den bageste ende, og går lateral til midterlinjen.
- Fortsæt med at være identisk for kraniet.
Bemærk: Sørg for at pege Scissor tips udad for at undgå at beskadige cerebellum under dissektion. - Tag hjernen ud og overfør den til en 60 mm skål fyldt med kold HBSS + 5 mg/mL glucose.
- Forsigtigt dissekere cerebellum ved hjælp af sterile lige fine pincet (figur 1B). Overfør det til plastik skiven placeret på skærebordet af vævs chopper ved hjælp af sterile buede fine tang.
- Orienter vævet ved at rotere skærebordet for at udføre parasagittal sektioner.
- Flyt skærebordet ved at trække bord udløserknappen til højre, så klingen er placeret ved kanten af vævet.
- Juster udsnitstykkelsen til 350 μm og kniv hastigheden til medium.
- Start chopper. Når hele cerebellum er skåret i skiver (figur 1C), skal du slukke for chopper.
- Fjern plastik skiven med sterile pincet.
- Medbring forsigtigt plastik skiven tæt på en 60-mm skål, der indeholder HBSS + 5 mg/mL glucose. Afpipettér kold HBSS + 5 mg/mL glucose på vævet ved hjælp af en steril overførings pipette for at tillade høst af cerebellare skiver i den buffer fyldte skål.
- Adskil cerebellare skiver fra hinanden ved hjælp af en mikrosonde. Tag gode kvalitets sektioner med overførings pipetten (det anbefales at bruge vævs sektioner, der er tæt på vermis), og slip dem af i et præ-ækvibreret cellekultur skær (figur 1D).
- Placer cerebellare skiver på cellekultur indsatsen ved hjælp af mikrosonden, og fjern forsigtigt den overskydende HBSS + 5 mg/mL glucoseopløsning med overførings pipetten.
Bemærk: på dette stadium er vævet ekstremt ømt og tilbøjelig til fysisk skade. Det maksimale antal cerebellar skiver pr. celle dyrknings indsats afhænger af donordyrets alder. 6 – 8 skiver kan dyrkes for et p0 – P4-gammelt dyr, og 4 – 6 skiver til dyr ældre end P5. - Placer kulturen skålen i inkubator, ændre mediet helt hver 2 – 3 dage.
- For at vurdere Purkinje-cellernes overlevelse kan skiver indsamles så tidligt som 5 dage in vitro. Til andre formål kan de bevares i kulturen i flere uger (figur 1F).
Bemærk: i forbindelse med forsøg med Purkinje-celle overlevelse er der ingen grund til at forny den farmakologiske behandling, når celle dyrkningsmediet ændres (figur 1F).
3. immunofluorescens
- Tag 6-brønd pladen ud af inkubatoren. Fjern cellekultur mediet, vask cellekultur indsatsen med 1x PBS, og fastgør udsnittene med kold 4% PARAFORMALDEHYD opløsning i 1 time, med 1 mL under cellekultur indsatsen og 500 μL oven på cellekultur indsatsen.
- Skær 4X 10 min med 1x PBS, med 1 mL under og 500 μL oven på skæret, på en orbital shaker.
- Med en børste, overføre cerebellar skiver fra 1 cellekultur Indsæt til 1 brønd af en 24-godt fyldt med 1x PBS, 0,25% Triton X-100, og 3% BSA (PBS-TB), 500 μL/brønd.
- Permeabilize og Bloker udsnittene ved inkubation i PBS-TB i 1 time ved stuetemperatur.
- Inkubér med primære antistoffer fortyndet i PBS-TB-opløsningen, natten over ved + 4 °C, på en orbital Shaker, 200 μL/brønd.
- På den følgende dag, udføre fire skyller på 10 min med 1x PBS, på en orbital Shaker, 500 μL/brønd.
- Inkubér med sekundære antistoffer fortyndet i PBS-TB opløsningen, to timer ved stuetemperatur, på en orbital Shaker, og beskyttet mod lys, 200 μL/brønd.
- Udfør fire skyller på 10 min med 1x PBS, på en orbital Shaker, 500 μL/brønd.
- Skiver med Hoechst 33342, fortyndet i 1x PBS (2 μg/mL), i 10 min ved stuetemperatur, beskyttet mod lys, 500 μL/brønd.
- Monter cerebellare skiver på en mikroskopi slide med en overførings pipette. Lad dem lufttørre helt, beskyttet mod lys. Re-fugtning dem med 1x PBS og anvende en dækseddel dækket med få dråber af monterings medium (~ 80 μL). Undgå at lave bobler.
- Når monterings mediet er helbredt, er cerebellare sektioner klar til at blive imaged.
4. billeddannelse og kvantificering af cellens overlevelse
- Tænd mikroskopet og laserne i henhold til producentens og/eller Imaging Core facilitets anvisninger.
- Start anskaffelses softwaren.
- Ved hjælp af en 10X mål, lokalisere ikke-ændrede cerebellare skiver, der præsenterer 9 – 10 lobuler (normalt cerebellar sektioner tæt på vermis).
- Aktiver z-stack erhvervelse. Definer intervallet af z-stakken til at omfatte alle Purkinje celler til stede i cerebellar skive. Indstil en 2 μm trin størrelse og start købet. Gem det erhvervede billede i det format, som producenten af anskaffelsesoftware har, for at bevare de tilknyttede metadata.
- Åbn den erhvervede fil i ImageJ ved hjælp af bio-formater plugin18.
- Gå til billede > stakke > Z-projekt... (figur 2A).
- Vælg maksimal intensitet i rullemenuen projektions type, og klik på OK (figur 2B).
- Der genereres et fladt 2-D-billede. Dobbeltklik på multi punkts værktøjet for at lade værktøjet punkt værktøj blive vist. Fjern markeringen af etiket punkter mulighed for at lette tælles celler visualisering. Klik derefter direkte på en Soma af en Purkinje-celle for at begynde at tælle (figur 1E). Det samlede antal optalte celler vil blive angivet nederst i værktøjet til punkt værktøjet (figur 3).
Bemærk: normalt kan mindst 3 ikke-beskadigede sektioner med 9 – 10 lobuler pr. cellekultur skær kvantificeres. For at vurdere den neuroprotektive virkning af en farmakologisk agens skal der udføres mindst 3 uafhængige eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som vist i figur 4producerer denne protokol organotypiske cerebellare skive kulturer, hvor Purkinjes celle overlevelse kan vurderes efter immunofluorescens-og billed erhvervelses trinene. Purkinje celler blev mærket med en kombination af anti-Calbindin D-28K (fortynding 1/200) og Alexa594 anti-mus (fortynding 1/300) antistoffer. Billede syning blev gjort automatisk af mikroskop erhvervelse software (NIS-elementer) for at få et billede af hele cerebellar skive. Purkinje-celle numrene pr. skive blev indtastet i Prism 8-softwaren for at generere diagrammet og udføre statistisk analyse. Ved P6 var Purkinjes celle overlevelse lav i kontrol, i overensstemmelse med deres kendte sårbarhed vindue4 (figur 4A, E). Overlevelse steg som donordyret voksede ældre og forlod denne kritiske periode (figur 4C, E). Cerebellare skiver blev behandlet med høj KCl-koncentration for med held at inducere deres depolarisering og overlevelse14 (figur 4B, D, E).
Figur 1: illustration af, hvilken protokol fra dissektion til Purkinje celle overlevelse kvantificering.
Musen pup er hurtigt halshugget (A). Efter hjerne dissektion isoleres cerebellum (B) og hakkes derefter i 350 μm-bredde skiver (C). De cerebellar sektioner anbringes på en kontrol eller behandlet cellekultur Indsæt (D) og vedligeholdes i kultur i mindst 5 dage in vitro. Vævet fastgøres derefter i 4% PARAFORMALDEHYD, immun farvning udføres, og billeder erhverves med et Konfokal mikroskop. Endelig kvantificeres Purkinjes celle nummer i hver skive ved hjælp af multipunkt værktøjet i ImageJ (E). F) skematisk af tidsforløbet for KCl-behandling under kulturen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: ImageJ-indstillinger, der bruges til at samkopiere 3D-stakken før kvantificering. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: indstillinger, der bruges til at tælle Purkinjes celle nummer ved hjælp af multipunkts værktøjet i ImageJ med et eksempel på en cerebellare skive, der kvantificeres. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Purkinje-cellernes overlevelse i den organotypiske cerebellare skive kultur efter høj KCl-behandling.
Repræsentativt billede af cerebellare skiver taget på postnatale dag 6 (a, B) eller 8(c, c ', d, d '), enten ubehandlet (A, c, c') eller behandlet med 30 mm KCl (B, d, d '). (C ' og D ') Højere forstørrelse visning af de hvide boxed regioner i C og D. Skiver blev holdt 5 dage in vitro før fiksering. Purkinje celler mærkes med Calbindin D-28K i rødt. Scale bar = 500 μm (A–D) og 100 μm (C ' og d '). (E) kvantificering af Purkinje-cellens overlevelse fra P6-og P8-kulturer, i kontrol eller behandlet med 30 mm KCl, viser en højere overlevelse med behandlingen (Mann-Whitney-testen, n = 3 til 5 skiver). Data udtrykkes som middelværdien ± SEM. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cerebellar skive kultur er et kraftfuldt værktøj til at studere programmeret Purkinje celledød under postnatal udvikling. Denne teknik kan bruges til hurtigt at screene kandidat molekyler for deres neuroprotektive potentiale. Den største fordel er, at opsætningen er enkel og meget omkostningseffektiv, og kræver kun en beskeden investering i udstyr (en vibratome kan koste op til 3 gange mere end en vævs chopper). Desuden kan 10 til 15 sunde skiver genereres fra en mus pup, giver mulighed for forskellige analyser, der skal udføres parallelt ved hjælp af kun ét dyr.
For at opnå konsistente og reproducerbare resultater er det afgørende at udføre kulturen så effektivt som muligt og at vælge sunde cerebellar sektioner, der skal dyrkes. Denne metode er også velegnet til langsigtet kultur (op til flere måneder). Så det er vigtigt at bruge god aseptisk teknik under dissektion og snitning proces for at undgå forureninger og behovet for at supplere kulturer med antibiotika.
Den cerebellar skive kulturmodel bevarer eksisterende celle-celle interaktioner i planet af vævs sektionen, og i regionen kultiveret. Dette kommer med en advarsel: forbindelser med mål uden for den dyrkede region kan være afskåret. Leveringen i neurotrofiske faktorer, der leveres af afferent fibre kan afbrydes så godt og forringe neuronal overlevelse. Dette kan delvist omgås ved at udføre organotypiske skive Co-kulturer. Det har vist sig, at klatre fibre kan trænge ind postnatal cerebellar skive kulturer, når de er co-dyrket med ringere oliven skive kulturer14,19. Mere interessant, Purkinje celler kontaktet af klatring fibre overlevede14.
Her fokuserede vi på brugen af organotypiske skive kultur for at søge efter neuroprotektive molekyler i den udviklende cerebellum. Men, denne metode er lige så velegnet til andre betingelser såsom neurodegeneration20, axonal regenerering21, og overvågning af neuronal kredsløb aktivitet22,23. Post-kultur applikationer går ud over immunofluorescens. Skiver kan anvendes til biokemiske eller genekspression undersøgelser, for at undersøge de biologiske mekanismer, der er involveret i neuroprotektive effekt af en given forbindelse. Helt, denne model kan lægge fundamentet for at finde nye Neuro aktive molekyler før in vivo test og være et effektivt og pålideligt supplement til in vivo Mekanistiske undersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Imaging arbejde blev udført på Northwestern University Center for Advanced Microscopy generøst støttet af NCI CCSG P30 CA060553 tildelt Robert H Lurie Comprehensive Cancer Center. Vi takker Sean McDermott for hans tekniske assistance og støtte, og Maya Epstein for de håndtegnede illustrationer, der er vist i figur 1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti-Mouse IgG secondary antibody | ThermoFisher scientific | A21203 | |
| Basal Medium Eagle (BME) | ThermoFisher scientific | 21010046 | |
| Biosafety cabinet Class II, Type A2 | NuAire | NU-540-400 | |
| Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A2153 | |
| Brush | |||
| anti-Calbindin D-28K antibody (CB-955) | Abcam | ab82812 | |
| CO2 Incubator | NuAire | NU-5700 | |
| Corning Costar Flat Bottom 6-well Cell Culture Plates | Fisher Scientific | 07-200-83 | |
| Coverslips, 22 x 50 mm | Fisher Scientific | 12-545-E | |
| Dressing forceps, straight | Harvard Apparatus | 72-8949 | |
| Double edge blades | Fisher Scientific | 50949411 | |
| Ethanol 200 proof | Decon Labs, Inc | 2701 | |
| Eye Scissors, straight | Harvard Apparatus | 72-8428 | |
| Fine forceps | Fisher Scientific | 16-100-127 | |
| L-Glutamine 100X | ThermoFisher scientific | 25030149 | |
| Glucose solution | ThermoFisher scientific | A2494001 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution | ThermoFisher scientific | 14025092 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Fisher Scientific | H21492 | |
| Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin | ThermoFisher scientific | 26050088 | |
| ImageJ | |||
| McIlwain Tissue Chopper | Fisher Scientific | NC9914528 | |
| Microprobes | Fisher Scientific | 08-850 | |
| Millicell Cell Culture Inserts | Millipore Sigma | PICM0RG50 | |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane, 250 mL | ThermoFisher scientific | 168-0045 | |
| Nikon A1R confocal laser microscope system | Nikon | ||
| NIS-Elements Imaging Software | Nikon | ||
| Paraformaldehyde | Acros Organics | 41678-0010 | |
| Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher scientific | P10144 | |
| Operating Scissors, straight | Harvard Apparatus | 72-8403 | |
| Orbital shaker Belly Dancer | IBI Scientific | BDRLS0003 | |
| Prism 8 | GraphPad | ||
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Tissue Culture Dish, 60 mm w/ grip ring | Fisher Scientific | FB012921 | |
| Tissue culture plate, 24 well | Falcon/Corning | 353047 | |
| Transfer pipettes, sterile | ThermoFisher scientific | 13-711-21 | |
| Triton X-100 | ThermoFisher scientific | BP151-500 |
References
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Gahwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
- Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro. Science. 245 (4914), 192-194 (1989).
- Dusart, I., Airaksinen, M. S., Sotelo, C. Purkinje cell survival and axonal regeneration are age dependent: an in vitro study. Journal of Neuroscience. 17 (10), 3710-3726 (1997).
- Wiegreffe, C., Feldmann, S., Gaessler, S., Britsch, S. Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation. Journal of Visualized Experiments. (125), e55886 (2017).
- Daviaud, N., et al. Modeling nigrostriatal degeneration in organotypic cultures, a new ex vivo model of Parkinson's disease. Neuroscience. 256, 10-22 (2014).
- Ghoumari, A. M., et al. Mifepristone (RU486) protects Purkinje cells from cell death in organotypic slice cultures of postnatal rat and mouse cerebellum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7953-7958 (2003).
- Labombarda, F., et al. Neuroprotection by steroids after neurotrauma in organotypic spinal cord cultures: a key role for progesterone receptors and steroidal modulators of GABA(A) receptors. Neuropharmacology. 71, 46-55 (2013).
- Gao, P., et al. P2X7 receptor-sensitivity of astrocytes and neurons in the substantia gelatinosa of organotypic spinal cord slices of the mouse depends on the length of the culture period. Neuroscience. , 195-207 (2017).
- Sundstrom, L., Morrison, B., Bradley, M., Pringle, A. Organotypic cultures as tools for functional screening in the CNS. Drug Discovery Today. 10 (14), 993-1000 (2005).
- Jankowski, J., Miething, A., Schilling, K., Baader, S. L. Physiological purkinje cell death is spatiotemporally organized in the developing mouse cerebellum. Cerebellum. 8 (3), 277-290 (2009).
- Ghoumari, A. M., Wehrle, R., Bernard, O., Sotelo, C., Dusart, I. Implication of Bcl-2 and Caspase-3 in age-related Purkinje cell death in murine organotypic culture: an in vitro model to study apoptosis. European Journal of Neuroscience. 12 (8), 2935-2949 (2000).
- Ghoumari, A. M., Wehrle, R., De Zeeuw, C. I., Sotelo, C., Dusart, I. Inhibition of protein kinase C prevents Purkinje cell death but does not affect axonal regeneration. Journal of Neuroscience. 22 (9), 3531-3542 (2002).
- Ghoumari, A. M., et al. Neuroprotective effect of mifepristone involves neuron depolarization. FASEB Journal. 20 (9), 1377-1386 (2006).
- Repici, M., Wehrle, R., Antoniou, X., Borsello, T., Dusart, I. c-Jun N-terminal kinase (JNK) and p38 play different roles in age-related Purkinje cell death in murine organotypic culture. Cerebellum. 10 (2), 281-290 (2011).
- Rakotomamonjy, J., Ghoumari, A. M. Brain-Derived Neurotrophic Factor Is Required for the Neuroprotective Effect of Mifepristone on Immature Purkinje Cells in Cerebellar Slice Culture. International Journal of Molecular Sciences. 20 (2), (2019).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
- Uesaka, N., et al. Organotypic coculture preparation for the study of developmental synapse elimination in mammalian brain. Journal of Neuroscience. 32 (34), 11657-11670 (2012).
- Falsig, J., et al. Prion pathogenesis is faithfully reproduced in cerebellar organotypic slice cultures. PLoS Pathogens. 8 (11), 1002985 (2012).
- Bouslama-Oueghlani, L., Wehrle, R., Sotelo, C., Dusart, I. The developmental loss of the ability of Purkinje cells to regenerate their axons occurs in the absence of myelin: an in vitro model to prevent myelination. Journal of Neuroscience. 23 (23), 8318-8329 (2003).
- Apuschkin, M., Ougaard, M., Rekling, J. C. Spontaneous calcium waves in granule cells in cerebellar slice cultures. Neuroscience Letters. 553, 78-83 (2013).
- Audinat, E., Knopfel, T., Gahwiler, B. H. Responses to excitatory amino acids of Purkinje cells' and neurones of the deep nuclei in cerebellar slice cultures. Journal of Physiology. 430, 297-313 (1990).
