Summary
Ved hjelp av humant primære prostata epitelceller, rapporterer vi en roman biomarkør-fri metode for funksjonell karakterisering av stilk-lignende celler ved en spheroid-basert etikett-oppbevaring analysen. En trinnvis protokoll er beskrevet for BrdU, CFSE eller far Red 2D cellemerking; tredimensjonal spheroid formasjon; Label-beholder stilk-lignende celle identifisering av immuncytokjemi; og isolert av FACS.
Abstract
Til tross for fremskritt i voksen stamcelleforskningen, er identifisering og isolering av stamceller fra vevsprøver fortsatt en stor utfordring. Mens bosatt stamceller er relativt Quiescent med nisje begrensninger i voksen vev, de kommer inn i cellen syklus i anker-fri tredimensjonal (3D) kultur og gjennomgår både symmetrisk og asymmetrisk celledeling, noe som gir opphav til både stilk og stamfar Celler. Sistnevnte sprer raskt og er den store cellen befolkning på ulike stadier av avstamning forpliktelse, danner heterogene spheroids. Ved hjelp av primære normal humant prostata epitelceller (HPrEC), en spheroid-basert, etikett-oppbevaring analysen ble utviklet som tillater identifisering og funksjonell isolering av spheroid-initiering stamceller på en enkelt celle oppløsning.
HPrEC eller cellelinjer er to-tredimensjonalt (2D) kultivert med BrdU i 10 dager for å tillate sin innlemmelse i DNA av alle dele celler, inkludert selv fornyelse stamceller. Vask ut starter ved overføring til 3D-kulturen i 5 dager, der stamceller selv fornye gjennom asymmetrisk divisjon og initiere spheroid formasjon. Mens relativt Quiescent datter stamceller beholde BrdU-merket foreldrenes DNA, datteren forfedre raskt sprer, mister BrdU etiketten. BrdU kan erstattes med CFSE eller far Red Pro-fargestoffer, som tillater levende stilk cellen isolasjon av FACS. Stem celle egenskaper bekreftes av in vitro spheroid formasjon, in vivo vev regenerering analyser, og ved å dokumentere deres symmetrisk/asymmetrisk celle divisjoner. Den isolerte etikett-beholde stamceller kan bli grundig avhørt av nedstrøms molekylære og biologiske studier, inkludert RNA-SEQ, ChIP-SEQ, enkelt celle fangst, metabolsk aktivitet, proteom profilering, immuncytokjemi, organoid formasjon, og in vivo vev gjenfødelse. Viktigere, identifiserer denne markøren-fri funksjonell stilk cellen isolasjon tilnærming stilk-lignende celler fra fersk kreft prøver og kreftcelle linjer fra flere organer, noe som tyder på bred relevans. Den kan brukes til å identifisere kreft stilk-lignende celle biomarkører, skjermen legemidler rettet mot kreft stilk-lignende celler, og oppdage romanen terapeutiske mål i kreft.
Introduction
Den menneskelige prostatakjertel inneholder luminal epitel med sekretoriske funksjon og basal celler underliggende det sammen med en uvanlig Nevroendokrine celle komponent. Epitelceller, i dette tilfellet, er generert fra en sjelden populasjon av prostata stamceller som er relativt Quiescent in vivo og fungere som et reparasjonssystem for å opprettholde kjertel homeostase gjennom hele livet1. Til tross for mange fremskritt, er identifisering og funksjonell isolering av prostata stamceller fortsatt en stor utfordring i feltet. Stem Cell biomarkører, inkludert Cell Surface markør-baserte metoder kombinert med Flow flowcytometri brukes vanligvis for stilk cellen forskning2,3,4. Men resultatene for berikelse og isolasjon varierer mye som en funksjon av markør kombinasjoner og antistoff spesifisitet5,6, heve spørsmål om identiteten til de isolerte cellene. En annen mye brukt tilnærming for Stem-lignende celle berikelse er tredimensjonal (3D) spheroid kultur2,3,4. Mens Resident stamceller er relativt Quiescent in vivo med nisje begrensninger, de gjennomgår celledeling i 3D Matrix kultur (både symmetrisk og asymmetrisk), genererer både stilk og stamceller som raskt reprodusere mot avstamning engasjement7,8. Dannet spheroids er en heterogen blanding som inneholder både stamceller og stamceller på ulike stadier av avstamning forpliktelse, inkludert tidlig og sent stadium stamceller. Dermed analyser ved hjelp av hele spheroids er ikke Stamcelle eksklusive, noe som gjør identifisering av unike stilk cellen egenskaper mangelfulle. Derfor er det avgjørende å lage analyser for å identifisere og skille prostata stamceller fra deres datter forfedre. Mot dette formålet, er målet med den nåværende protokollen for å etablere en analysesystem som gjør det mulig for effektiv identifisering og isolering av stamceller fra humant prostata vev etterfulgt av robust nedstrøms analyse av deres biologiske funksjoner.
Langsiktig 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) Label-oppbevaring er mye brukt for in vivo og in vitro avstamning tracing av stamceller basert på deres forlenget dobling tid9,10. Den nåværende tilnærmingen for prostata stilk cellen identifisering og isolasjon beskrevet her er basert på deres relative Quiescent karakteristiske og etikett-oppbevaring egenskaper innenfor en blandet epitel befolkning. Videre, basert på den udødelige Strand DNA-hypotesen, kan bare stamceller gjennomgå asymmetrisk celledeling. Stam cellen representerer datter cellen som inneholder det eldre foreldrenes DNA, mens Stam cellen, som er en engasjert datter celle, mottar det nylig syntetisert DNA. Den unike stilk cellen eiendom beskrevet ovenfor er utnyttet til å utføre BrdU merking i foreldrenes stamceller i primære kulturer og deretter spore sin etikett etter BrdU-bleke ved overføring til 3D-anker-fri spheroid kultur. Mens flertallet av primær prostata epitelceller beholde en basal og transitt forsterke fenotype i 2D kultur, er det også en sjelden befolkning på Multipotent stamceller fylle og vedlikeholde epitel homeostase som dokumentert ved dannelse av spheroids eller fullt differensiert organoids med tilsvarende kultur Media ved overføring til 3D-systemer3,12. I vår nåværende protokoll, ved hjelp av HPrEC prostata spheroids eller prostasphere-baserte BrdU, CFSE, eller far Red oppbevaring analyser etterfulgt av fluorescens aktivert celle sortering (FACS), identifiserer vi etikett-beholder stamceller i spheroids på en enkelt cellenivå13.
Viktigere, vi bekreftet ytterligere Stamcelle egenskapene til etikett-beholde celler innen tidlig stadium spheroids i forhold til stamceller med avstamning forpliktelse. Disse inkluderer stilk cellen asymmetrisk divisjon, in vitro spheroid dannelse evne og in vivo vev gjenfødelse kapasitet, forhøyet autofagi aktivitet, utvidet ribosom kognitiv og redusert metabolsk aktivitet. Deretter ble RNAseq-analysen utført. Differensielt uttrykte gener i etikett-beholder spheroid celler ble observert som kan tjene som romanen biomarkører for humant prostata stamceller. Dette spheroid-basert etikett-beholder tilnærming kan gjelde for kreft prøver å tilsvarende identifisere et lite antall kreft stilk-lignende celler, og dermed gi translational muligheter til å håndtere den terapeutiske resistente populasjoner13. Presentert nedenfor er prostasphere-baserte Label-oppbevaring analysen bruker menneskelige primære prostata epitelceller (HPrEC) som et eksempel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle celle håndtering og Media preparater bør utføres med aseptisk teknikk i et klasse II biologisk sikkerhetskabinett (BSC).
1. kultur og vedlikehold av HPrEC celler i 2D
- Coat 100 mm kultur retter med 2 mL 2,5 μg/cm2 fibronektin løsning over natten ved romtemperatur (RT). Aspirer løsningen og la kulturen retter luften tørr i BSC for 45 min. Fibronektin-belagte kultur retter kan oppbevares 2 – 4 uker ved 4 ° c.
- Tilsett 9 mL av prostata epitel cellevekst medium (f. eks, PrEGM) til en fibronektin-belagt 100 mm kultur rett og holde parabolen varm i en CO2 inkubator ved 37 ° c.
- Tin ett hetteglass med frosne HPrEC-celler (2 x 105/ml) i en 37 ° c vannbad og resuspend cellene i 10 ml varmt medium.
- Sentrifuger celle fjæringen ved 500 x g i 5 min ved RT. aspirer og kast supernatanten.
- Grundig resuspend cellene i 1 mL av den varme kulturen medium. Seed celler ved pipettering 1 mL av cellen suspensjon direkte inn i fibronektin-belagt 100 mm kultur parabolen inneholder 9 mL av prewarmed medium (totalt volum av medium og celler er 10 mL). Plasser kultur retter tilbake i en CO2 inkubator på 37 ° c.
- Etterfylle mediet hver 2 dager. For å gjøre dette, må du nøye aspirer alle medier og tilsett 10 mL friskt varmt medium.
- I ca 5 dager, sikre at kulturer er ~ 70-80% confluent. Gjør enzymatisk fordøyelse ved å incubating cellene med 3 mL 0,05% Trypsin/EDTA ved 37 ° c i 5 min.
- Stopp fordøyelsen ved å legge 3 mL varm PBS inneholder 10% FBS.
- Samle cellene i et 50 mL sentrifugerør og sentrifuger ved 500 x g i 5 min ved RT. aspirer og kast supernatanten.
- Resuspend celle pellet i 30 mL varmt medium og dispensere det like inn i tre nye fibronektin-belagt 100 mm kultur retter til neste passasje.
Merk: primær HPrEC celler kan være passert ~ 3-5x uten å endre deres basal epitel celle egenskaper. Epitel fenotype er testet av uttrykk for basal epitelcellemarkører cytokeratin 5 og p63 med immuncytokjemi/immunofluorescent (ICC/IF) analyser.
2. merking HPrEC med BrdU, CFSE, eller far Red Pro-fargestoffer
Merk: cellene kan fortsette enten til trinn 2,1 eller trinn 2,2 etterfulgt av overføring til 3D-prostasphere kultur som beskrevet i trinn 3,1.
-
Enkel merking av celler med BrdU
- Kultur 2 x 105 HPrEC celler i fibronektin-belagt 100 mm kultur retter med 10 ml varmt medium som inneholder 1 ΜM av BrdU. Kultur cellene i 10 dager (over to passasjer) for å sikre merking av alle celler, inkludert prostata stammen og stamceller.
- Etter 10 dager, nøye aspirer PrEGM medium som inneholder BrdU og vask cellene med 5 mL varm PBS. Gjenta 1x.
- Utføre enzymatisk fordøyelsen ved hjelp 0,05% Trypsin/EDTA som beskrevet i trinn 1.7-1.8. Sentrifuger cellene ved 500 x g i 5 min ved RT. aspirer og kast supernatanten.
- Resuspend den BrdU-merket pelleted celler (5 x 104) i 500 μL av iskald (1:1) kjeller membran matrise/medium og overføre til en 3D prostasphere kultur (beskrevet i trinn 3,1) i 5 dager for å tillate BrdU bleke under spheroid formasjon (~ 6 celle sykluser).
-
Dobbel merking av celler med BrdU og CFSE eller far Red Pro-fargestoffer
- Hvis co-merking for levende celler er ønskelig, ta pre-merket celler inkubert med BrdU for 10 dager fra trinn 2,1 og co-Label med 5 μM CFSE eller far Red Live celle fluorescerende Pro-fargestoffer i 30 min. Utfør co-merking på dag 10.
- Nøye aspirer mediet som inneholder BrdU og CFSE eller far Red Pro-fargestoffer. Vask cellene med 5 mL varm PBS. Gjenta vasken 1x.
- Utfør enzymatisk fordøyelse med 0,05% Trypsin/EDTA som beskrevet i trinn 1.7 – 1.8. Sentrifuger cellene ved 500 x g i 5 min ved RT. Remove og kast supernatanten.
- Resuspend de co-merket celler (5 x 104) i 500 μL av iskald (1:1) kjeller membran matrise/medium og overføre til en 3D prostasphere kultur (beskrevet i § 3,1) i 5 dager for å tillate BRDU og CFSE eller far Red bleke under spheroid formasjon (~ 6 celle sykluser).
- Utfør påvisning av etikett støtte celler i sfærer (dag 5 prostaspheres) som beskrevet i trinn 4,1, 4,2, 4,3 eller 5.
Merk: Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl Ester (CFSE) og far Red er langvarige fluorescerende Pro-fargestoffer og er godt bevart innenfor de merkede cellene. Intracellulære esterase i levende celler Cleave den acetate grupper som aktiverer den grønne eller røde fluorescerende molekyler som nå membran impermeant.
3. Prostasphere formasjon i 3D kjeller membran kultur system
-
Prostasphere kultur i 3D kjeller membran Matrix system
- Tine den kjeller membran matrise ved 4 ° c over natten og holde på isen før bruk.
- Forsiktig Tilsett 1 mL iskald kjeller membran matrise i et likt volum av iskald kultur medium. Bland langsomt ved å pipettering opp og ned, unngå bobler.
Merk: pre-coat bunnen av 12 brønn kultur plate brønner med 100 μL av denne løsningen. Dette vil redusere antall celler som faller gjennom matrisen og vokse som en monolag. - Resuspend 5 x 104 HPrEC celler i iskaldt (1:1) kjeller membran matrise/kultur medium mix i et total volum på 500 μL.
- Pipetter 500 μL av denne celle løsningen rundt nedre kant av hver brønn.
- Virvel platen til jevnt fordele blandingen rundt kanten av brønnen. Plasser platen i en CO2 inkubator ved 37 ° c i 30 min slik at matrisen å stivne.
- Når matrisen har befestet, dekk med 1 mL varm kultur medium per brønn. Ikke forstyrr kjelleren membranen matrise ringen. Sikt forsiktig på pipette spissen og dispensere kulturen medium til midten av brønnen.
Merk: kultur mediet må varmes til 37 ° c når det legges til matrisen for befestet kjeller membran. Kjelleren membran matrise vil miste sin integritet og oppløse når de utsettes for kulde/kule medier. - Etterfylle medium hver 2 dager. Forsiktig aspirer ~ 500 μL av brukte medium og tilsett 500 μL av friskt, varmt kultur medium.
- Overvåk prostasphere dannelse og vekst i 5 – 7 dager ved hjelp av et omvendt mikroskop.
-
Passaging av prostaspheres
- Harvest prostaspheres fra matrisen ved å nøye aspirating av så mye Media som mulig. Unngå forstyrrende eller plukke opp flytende biter av befestet matrise.
- Tilsett 1 mL dispase oppløsning (kjeller membran matrise: dispase på et 1:2 ratio). Bland godt ved å pipettering opp og ned flere ganger.
- Ruge kultur platene i en CO2 inkubator ved 37 ° c i 30 min.
- Ta bilder av prostaspheres som er på bunnen av kulturen parabolen for sfære tall telling og størrelse målinger.
- Samle sfæren blandingen i en 15 mL tube. Sentrifuger suspensjonen på 500 x g i 5 min ved RT til pellet kulene. Aspirer og kast supernatanten.
- Spre kulene til enkeltceller ved å fordøye med 500 μL av varm 0,05% Trypsin/EDTA og overføre fjæringen til et 1,5 mL mikrosentrifugen rør.
- Ruge mikrosentrifugen røret i en CO2 inkubator ved 37 ° c i 5 min.
- Stopp den Trypsin handlingen med 500 μL av varm PBS som inneholder 10% FBS. Pass fordøyd sfære suspensjon gjennom en 1 mL sprøyte med en 26 G nål 5x å distansere kulene i enkeltceller.
- Sentrifuger suspensjonen på 500 x g for 5 min til pellet CELLENE ved RT. aspirer supernatanten og kast.
- Resuspend cellen pellet i 1 mL av varm kultur medium og filter gjennom en 40 μm pore størrelse nylon celle sil.
- Sentrifuger celle fjæringen ved 500 x g i 5 min til pellets CELLENE ved RT. aspirer og kast supernatanten.
- Resuspend cellen pellet i 1 mL av iskald (1:1) kjeller membran matrise/kultur medium og under kultur i en 3D kjeller membran matrise for andre passering av prostasphere.
4. identifisering av BrdU-beholder prostata stamceller ved immunofluorescent farging
- Vokse den vedlagte prostaspheres etterfulgt av immunofluorescent (IF) farging for prostata stilk cellen 2D Imaging.
- Harvest prostaspheres av dispase fordøyelsen som beskrevet i trinn 3.2.1-3.2.3. Sentrifuger kulene i et 1,5 mL mikrosentrifugen rør ved 500 x g i 5 min. kast supernatanten.
- Resuspend kuler i 1 mL varmt kultur medium.
- Ruge ~ 50 prostaspheres per brønn i 8 brønn kammer glir i 200 μL av kultur medium i en 37 ° c inkubator over natten for å muliggjøre feste og utvekst av kuler.
- På dag 2 aspirer og forkaster du kultur mediet. Vask vokst sfærer med 200 μL av PBS i 5 min.
- Fest kulene i 200 μL/brønn av iskald metanol ved-20 ° c i 20 min.
- Vask kulene med 200 μL/brønn av PBS i 5 min. Gjenta 2x.
- Syre vask kuler med 200 μL/brønn av 2N HCl i 30 minutter ved RT.
- Vask kulene med 200 μL/brønn av PBS i 5 min. Gjenta 3x.
- Tilsett 100 μL av blokkerings løsning som inneholder 5% normal geit serum i PBST (PBS med 0,25% Triton X-100) og ruge i 30 min ved RT.
- Aspirer av blokkerings løsningen og tilsett 100 μL av PBST inneholdende 2% normal geit serum og primær mus anti-humant BrdU antistoff (1:200) til hver brønn og ruge i en fuktet eske ved 4 ° c over natten.
Merk: mus IgG-antistoff brukes som en negativ kontroll. - Aspirer og fjern den primære antistoff løsningen. Vask kulene med 200 μL av PBS i 5 min. Gjenta 2x.
- Tilsett 100 μL av PBST inneholdende 2% normal geit serum og sekundære geit anti-mus Alexa fluor 488 antistoff (1:500) til hver brønn og ruge på RT i mørket for 2 h.
- Aspirer og fjern den sekundære antistoff løsningen. Vask kulene med 200 μL av PBS i 5 min. Gjenta 3x.
- Monter lysbildene med ~ 25-40 μL av vandig festemiddel som inneholder DAPI.
- Skaff bilder av fargede kuler/celler med et fluorescerende mikroskop og et farge digitalt kamera.
- Hele montere IF farging av prostaspheres for prostata stilk cellen 3D Imaging
Merk: for hel montering hvis farging, prostaspheres håndteres med 1,5 mL mikrosentrifugen rør.- Harvest The prostaspheres ved dispase fordøyelsen som beskrevet i trinn 3.2.1-3.2.3. Sentrifuger kulene i et 1,5 mL mikrosentrifugen rør ved 500 x g i 5 min. aspirer supernatanten og kast.
- Resuspend og fest kulene med 1 mL 4% paraformaldehyde ved RT i 20 min. sentrifuger kulene på 500 x g i 5 min. aspirer supernatanten og kast.
- Vask kulene ved å blanding pellet i 1 mL PBS. Sentrifuger kulene på 500 x g i 5 min. aspirer supernatanten og kast. Gjenta 1x.
- Acid vaske kulene ved blanding pellet i 1 mL 2N HCl i 30 min.
- Vask kulene med 1 mL PBS i 5 min og sentrifuger ved 500 x g i 5 min. aspirer supernatanten og kast. Gjenta 3x.
- Resuspend på ca. 15 – 30 kuler i 100, μL av blokkerings løsning som inneholder 5% normalt geit serum i PBST (PBS med 0,25% Triton X-100) og ruge i 30 min ved RT.
- For å fjerne blokkerings løsningen, sentrifuger kulene ved 500 x g i 5 min. aspirer og kast supernatanten.
- Resuspend av kulene i 100 μL av PBST inneholdende 2% normal geit serum og primær mus anti-humant BrdU antistoff (1:200) og ruge ved 4 ° c over natten.
- Vask kulene ved å blanding pellet i 1 mL PBS. Sentrifuger kulene på 500 x g i 5 min. aspirer supernatanten og kast. Gjenta 1x.
- Resuspend kulene i 100 μL av PBST inneholdende 2% normal geit serum og sekundære geit anti-mus Alexa fluor 488 antistoff (1:1000) og ruge ved RT for 2 t.
- Vask kulene ved å blanding pellet i 1 mL PBS. Sentrifuger kulene på 500 x g i 5 min. aspirer supernatanten og kast. Gjenta 1x.
- Resuspend kulene i 30 – 50 μL av vandig festemiddel som inneholder DAPI. For å hindre flatere kulene, dispensere dem inn i en godt opprettet fra en 35 mm blanke kultur parabolen med et deksel glassbunn. Deretter legger en dekkglass til kulturen parabolen, dekker brønnen.
- Tilegne seg hele sfære Z-stack bilder ved hjelp av en overført lys invertert fluorescerende konfokalmikroskopi mikroskop. Konvertere disse Z-stack bilder til 3D-bilder ved hjelp av en tenkelig programvare med frihåndstegning evner.
Merk: mus IgG-antistoff brukes som en negativ kontroll.
- Sammen-celle analyse (4 dagers protokoll)
- Kultur BrdU-merket sfærer til dag 5.
- Dag 1: høste kuler fra en kjeller membran matrise med 1 mL dispase fordøyelsen. Sprer seg til enkeltceller med 500 μL av varm 0,05% Trypsin/EDTA i et 1,5 mL mikrosentrifugen rør som beskrevet i trinn 3.2.1 – 3.2.11.
- Resuspend cellene i 1 mL varmt kultur medium.
- Plate de spredte enkeltceller (~ 300-500 per brønn) i 8 brønn kammer lysbilder og kultur i 200 μL/brønn kultur medium over natten for å muliggjøre vedlegg.
- Dag 2: endre kultur medium med 200 μL av 2 μM cytochalasin D i kultur mediet og ruge over natten ved 37 ° c for å tillate en celledeling som pauser ved sen metafase til anaphase.
- Dag 3 – 4: aspirer og kast mediet. Fix celler i 200 μL/brønn av iskald metanol ved-20 ° c i 20 min. Følg immunostaining protokoll for BrdU som beskrevet i trinn 4.1.5 – 4.1.14.
- Ta bilder av sammenkoblede celler med et fluorescens mikroskop. Sørg for at avstanden mellom de to kjernene er mindre enn 30 μm. basert på BrdU-bevaring, identifisere de sammenkoblede stamceller som gjennomgår symmetrisk eller asymmetrisk celle divisjon.
Merk: BrdU for å beholde prostata stamceller gjennomgår en symmetrisk divisjon for å gi opphav til to datter stamceller som beholder en lik mengde BrdU, mens stamceller under asymmetrisk divisjon gir opphav til en datter Stamcelle som bevarer alle BrdU og annen datter Stamcelle som har mistet BrdU etiketten.
5. isolering av CFSE etikett-beholde prostata stamceller ved FACS sortering
- Dag 5: høste CFSE-merket dag 5 prostaspheres vokser i 6 brønn kultur plater i 3D-kultur ved å erstatte mediet med 2 mL dispase (kjeller membran matrise: dispase på et 1:2 ratio). Pipetter opp og ned flere ganger for å blande godt.
- Ruge platene i en CO2 inkubator ved 37 ° c i 30 min å fordøye matrisen.
- Samle kule blandingen i et 15 mL sentrifugerør. Sentrifuger kulene på 500 x g i 5 min ved RT. aspirer supernatanten og kast.
- Resuspend sfæren pellet i 500 μL av varm 0,05% Trypsin/EDTA, og overføre til en 1,5 mL mikrosentrifugen tube.
- Ruge kulene i en CO2 inkubator ved 37 ° c i 5 min. Tilsett 500 μL av varm PBS som inneholder 10% FBS.
- Pass kulene gjennom en 1 mL sprøyte med en 26 G nål 5x for å fullstendig distansere kulene i enkeltceller.
- Sentrifuger cellene ved 500 x g i 5 min ved RT. aspirer og kast supernatanten.
- Resuspend cellene i 1 mL varmt kultur medium som inneholder 1 μg/mL propidium iodide (PI) for å flekk døde celler. Ruge for 1 min ved RT.
- Sentrifuger cellene ved 500 x g i 5 min ved RT. aspirer og kast supernatanten.
- Resuspend cellene i 1 mL varmt kultur medium. Sentrifuger cellene ved 500 x g i 5 min ved RT. aspirer og kast supernatanten.
- Resuspend cellene i 500 μL av varm kultur medium og samle cellene i 5 mL polystyren runde bunn rørene ved å filtrere dem gjennom 35 μm pore størrelse celle sil snap caps.
- Utføre analysen av Trypsin-spredte CFSE-merket prostasphere celler med en enkelt-kanals FACS analysator.
- Gate subpopulasjoner av fraksjonert CFSEHi, CFSEmed, og CFSElo celler. Bruk de negative og positive kontrollene for gating.
Merk: tilstedeværelsen av FACS sortert CFSE etikett-beholde prostata stamceller (se Hu et al.13) kan bekreftes av grønne fluorescens mikroskopi og deres større Cellestørrelse sammenlignet med ikke-beholde celler. Denne større Cellestørrelse er en egenskap av prostata stamceller i forhold til Stamcelle populasjoner. Dette kan være forskjellig med andre vevstyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Primær normal humant prostata epitelceller er plassert i fibronektin-belagt kultur retter og cellevekst opprettholdes i 2D kultur (figur 1a). Ved overføring til 3D-kultur med en kjeller membran matrise, differensiert epitelceller langsomt dø ut. Bare prostata stamceller kan overleve i et anker-fri kultur og form spheroids i 5 dager (figur 1b).
Dobbel merking av prostata epitelceller i 2D kultur etterfulgt av spheroid formasjon i 3D kultur indikerer colocalization av BrdU, CFSE, og far Red i samme etikett-beholder celler (figur 2a-i).
Etikett støtte celler viser Stamcelle egenskaper i dag 5 spheroids. Dobbel immunostaining viser at etikett holde celler utviser lavere nivåer av cytokeratin protein KRT14; redusert celle kryss protein E-cadherin14; økt stilk cellen tidlig markør proteiner Wnt10B13,15,16 og ALDH1A1; økt autofagi protein LC3, en indikator på autofagi Flux aktivitet17; og økt myosin IIB (Figur 3a-f).
En spheroid-basert etikett-bevaring analysen også vellykket oppdager kreft stilk-lignende celler i prostata kreft prøver (Figur 4). Dette vil muliggjøre oppdagelsen av ekte biomarkører for kreft stilk-lignende celler og har potensial til å identifisere romanen terapeutiske mål for prostatakreft.
Figur 1: vedlikehold av HPrEC i 2D-kultur og spheroid-formasjon i 3D-kultur. (a) en 2D primær kultur av HPrEC ble BrdU-merket og overført til 3D-kultur med prostasphere formasjon på dag 5 (b). Skala bars = 400 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: identifisering av langsiktige etiketter-beholde celler i primære prostaspheres. Dobbel merking av BrdU (rød) og CFSE (grønn); CFSE (grønn) og far Red (rød); BrdU (grønn) og far Red (rød) identifiserte de samme stilk-lignende celler med oppbevaring av foreldrenes DNA. Eventuelle BrdU, CFSE, eller far Red etiketter i raskt å dele stamceller (DAPI, blå) ble utvannet og tapt (a-i). Representative bilder viser BrdU/CFSE (a-c) (øvre panel), CFSE/far Red (d-f) (midtre panel), og BrdU/far Red (g-i) (nedre panel) co-merking i enkelt prostasphere (PS) celler. Skala bars = 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: etikett-beholder PS-celler som viser Stamcelle egenskaper. I forhold til ikke-Label-beholder stamceller, BrdU eller CFSE Label-beholde stamceller utstillingen (a) lavere nivåer av cytokeratin 14 (KRT 14), (b) reduserte nivåer av E-cadherin, (c) forhøyede nivåer av Wnt10B, (d) høyere nivåer av ALDH1A1, (E) økt LC3, og (f) økt myosin IIB proteiner. Skala bars = 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: bruke sfære-baserte Label-beholder analysen for identifisering av kreft stilk-lignende celler. CFSE etikett-beholde kreft stilk-lignende celler i spheroids avledet fra menneskelig prostata kreft prøver utstilt redusert E-cadherin protein i forhold til de ikke-merket stamceller. Skala bars = 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flow flowcytometri bruker flere Stem Cell Surface markører er en vanlig metode for stamcelleforskningen tross mangler både spesifisitet og selektivitet1,5,6. Mens spheroid formasjon i et 3D kultur system er en annen nyttig metode i berikende den sjeldne stilk cellen befolkning fra primære epitelceller, inkludert HPrEC, den resulterende spheroids er fortsatt en heterogen blanding av stammen og stamceller2,3,4. I prostaspheres, sammenlignet med den raskt voksende stamceller, gjør den relativt Quiescent karakteren av stamceller dem til å bli identifisert av langsiktige Label-oppbevaring analysen.
Metodene oppsummert i dette dokumentet beskriver merking av HPrEC bruker BrdU, CFSE, og/eller far Red Pro-fargestoffer13. Mens BrdU, CFSE, og/eller far Red Pro-fargestoffer i raskt voksende celler er alle raskt fortynnet av hver celle divisjon, er det en ekstra mekanisme som står for tapet av BrdU kjent som udødelig Strand DNA segregering11. Dette er når Stam cellen gjennomgår asymmetrisk divisjon, noe som gir opphav til en datter stilk celle og en Stamcelle. Datteren stilk cellen beholder alle de gamle foreldrenes DNA med BrdU etiketten, mens datteren stamfar cellen mottar det nye syntetisert DNA uten BrdU etiketten. Derfor, en etikett-oppbevaring analysen bruker BrdU gir klarere og enklere identifisering av etikett-beholder stamceller ved immunofluorescent farging. Dette er spesielt nyttig for å bekrefte Stamcelle biomarkører ved IF dobbel farging ved hjelp av to forskjellige antistoffer. En stor begrensning av BrdU merking er at cellene må fikses for IF farging, og dermed hindre videre funksjonelle studier etter BrdU merking og celle fiksering.
For å løse dette problemet, to fluorescerende Pro-fargestoffer for Live HPrEC merking ble testet i Label-beholde analyser. Resultatene indikerte at det var en fullstendig overlapping av BrdU, CFSE, og far Red merket sfære celler. BrdU etiketten kunne erstattes med CFSE eller far Red i sfære-basert etikett-beholder analyser for å tillate visualisering av levende celler for bildebehandling og separasjon av FACS, fremme funksjonell karakterisering av isolerte levende stamceller ved hjelp av både in vitro cellekultur analyser og in vivo xenograft analyser13. CFSE eller far Red Label-baserte FACS sortert Live Stem og stamceller kan også brukes for RNA-SEQ inkludert enkelt celle RNA-SEQ, som er svært kraftig i å identifisere romanen stilk cellen genet markører og signalering trasé samt epitel celle avstamning hierarki.
Romanen biomarkør-fri metode for funksjonell karakterisering av stamceller ved en spheroid-basert etikett-oppbevaring analysen som presenteres her kan identifisere kreft stilk-lignende celler fra primær pasientprøver og kreftcelle linjer. Dermed gir det en vei for å oppdage romanen biomarkører av kreft stilk-lignende celler og utvikle effektive legemidler rettet mot kreft13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke økonomiske relasjoner til å avsløre.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av tilskudd fra National Cancer Institute R01-CA172220 (GSP, WYH), R01-ES02207 (GSP, WYH). Vi takker Flow flowcytometri Core ved University of Illinois i Chicago for assistanse på celle sortering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| 1 mL tuberculin syringes | Bectin Dickinson | BD 309625 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes, sterile | |||
| 100 mm culture dishes | Corning/Falcon | 353003 | |
| 12-well culture plate | Corning/Falcon | 353043 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Corning/Falcon | 352097 | |
| 22 x 22 mm coverslips, sq | Corning | 284522 | For MatTek 35 mm culture dish |
| 24 x 50 mm coverslips | Corning | 2975245 | |
| 26G x 1.5 inch hypodermic needle | Monoject | 1188826112 | |
| 2N HCl | |||
| 35 mm culture dish with cover glass bottom | MatTek Corp | P35G-0-10-C | Glass bottom No. 0, uncoated,  irradiated |
| 40 µm pore nylon cell strainer | Corning | 352340 | |
| 5% CO2 culture incubator, 37 °C | Forma | ||
| 50 mL centrifuge tubes | Corning/Falcon | 352098 | |
| 5mL Polystyrene Round-Bottom Tube with strainer snap cap | Corning | 352235 | 35 µm nylon mesh |
| 6-well culture plates | Corning | 353046 | |
| 8-well chamber slides | Millipore Sigma | PEZGS0816 | |
| Aqueous mounting medium containing DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | A nuclear fluorescent dye |
| Biological safety cabinet, Level 2 certified | |||
| BrdU (5-bromo-2’-deoxyuridine) | Sigma-Aldrich | B5002 | 1 mM stock solution in DMSO |
| Centrifuge for 1.5 mL microcentrifuge tubes | Eppendorf | ||
| Centrifuge for 15 mL tubes | Beckman Coulter | Allegra 6 | |
| CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl ester) | Thermo Fisher Scientific | C34554 | 5 mM stock solution in DMSO |
| cytochalasin D | Thermo Fisher Scientific | PHZ1063 | |
| Dispase 1U/mL | StemCell Technologies | 07923 | |
| FACS CellSorter MoFlo XDP | Beckman Coulter | s | |
| Far-Red pro-dye | Thermo Fisher | C34564 | 5 mM stock solution in DMSO |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | |||
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895 | For coating 100 mm culture dishes |
| Fluorescent microscope with color digital camera | Carl Zeiss | Axioskop 20 fluorescent microscope; color digital Axiocamera | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A-11029 | |
| HPrEC (Primary normal human prostate epithelial cells) | Lifeline Cell Technology | FC-0038 | Pooled from 3 young (19-21yr od) disease-free organ donors; 1 x 105 cells/mL; stored in liquid nitrogen |
| ice bucket and ice | |||
| Inverted microsope with digital camera | |||
| Matrigel, low growth factor, phenol-red free | Corning | 356239 | |
| Methanol | Corning | A452-4 | |
| Mouse anti-BrdU antibody | Cell Signaling | 5292S | |
| Mouse IgG antibody (negative control) | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | |
| Normal goat serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
| Pipettors and tips, various sizes | |||
| PrEGM (ProstaLife Epithelial Cell Growth Medium) | Lifeline Cell Technology | LL-0041 | |
| Propidium Iodide (PI) | R & D Systems | 5135/10 | 10 μg/mL PI in PBS stored at 4 °C in the dark |
| Serological pipets, various sizes | |||
| Software for sphere counting and size measurements | |||
| Software: 3D images using Imaris an imageing software with freeform drawing capabilities | |||
| Triton X-100 | Millipore Sigma | T8787 | |
| Water bath, 37 °C | |||
| z-stack images using a transmitted light inverted fluorescent confocal microscope |
References
- Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. Generation of a prostate from a single cell. Nature. 456, 804-808 (2008).
- Xin, L., Lukacs, R. U., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. Self-renewal and multilineage differentiation in vitro from murine prostate stem cells. Stem Cells. 25, 2760-2769 (2007).
- Hu, W. Y., et al. Estrogen-initiated transformation of prostate epithelium derived from normal human prostate stem-progenitor cells. Endocrinology. 152, 2150-2163 (2011).
- Hu, W. Y., Shi, G. B., Hu, D. P., Nelles, J. L., Prins, G. S. Actions of endocrine disrupting chemicals on human prostate stem/progenitor cells and prostate cancer risk. Molecular and Cellular Endocrinology. 354, 63-73 (2012).
- Collins, A. T., Berry, P. A., Hyde, C., Stower, M. J., Maitland, N. J. Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells. Cancer Research. 65, 10946-10951 (2005).
- Vander Griend, D. J., et al. The role of CD133 in normal human prostate stem cells and malignant cancer-initiating cells. Cancer Research. 68, 9703-9711 (2008).
- Wang, J., et al. Symmetrical and asymmetrical division analysis provides evidence for a hierarchy of prostate epithelial cell lineages. Nature Communications. 5, 4758 (2014).
- Neumuller, R. A., Knoblich, J. A. Dividing cellular asymmetry: asymmetric cell division and its implications for stem cells and cancer. Genes and Development. 23, 2675-2699 (2009).
- Cicalese, A., et al. The tumor suppressor p53 regulates polarity of self-renewing divisions in mammary stem cells. Cell. 138, 1083-1095 (2009).
- Klein, A. M., Simons, B. D. Universal patterns of stem cell fate in cycling adult tissues. Development. 138, 3103-3111 (2011).
- Cairns, J. Mutation selection and the natural history of cancer. Nature. 255, 197-200 (1975).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159, 163-175 (2014).
- Hu, W. Y., et al. Isolation and functional interrogation of adult human prostate epithelial cells at single cell resolution. Stem Cell Research. 23, 1-12 (2017).
- Bryant, D. M., Stow, J. L. The ins and outs of E-cadherin trafficking. Trends in Cell Biology. 14, 427-434 (2004).
- Clevers, H., Loh, K. M., Nusse, R. Stem cell signaling. An integral program for tissue renewal and regeneration: Wnt signaling and stem cell control. Science. 346, 1248012 (2014).
- Madueke, I., et al. The role of WNT10B in normal prostate gland development and prostate cancer. The Prostate. 79 (14), 1692-1704 (2019).
- Guan, J. L., et al. Autophagy in stem cells. Autophagy. 9, 830-849 (2013).
