Summary
Usando células epitelia de próstata primárias humanas, relatamos um novo método livre de biomarcadores de caracterização funcional de células semelhantes a troncos por um ensaio de retenção de rótulos à base de esferóides. Um protocolo passo a passo é descrito para a rotulagem de células BrdU, CFSE ou Far Red 2D; formação tridimensional de esferóides; identificação de células-tronco de retenção de rótulos por imunocitoquímica; e isolamento pela FACS.
Abstract
Apesar dos avanços na pesquisa de células-tronco adultas, a identificação e o isolamento das células-tronco de espécimes de tecidos continua sendo um grande desafio. Enquanto as células-tronco residentes são relativamente quiescentes com restrições de nicho em tecidos adultos, elas entram no ciclo celular na cultura tridimensional (3D) livre de âncoras e passam por divisão de células simétricas e assimétricas, dando origem a tronco e progenitor Células. Este último proliferar rapidamente e são a população celular principal em vários estágios do compromisso de linhagem, formando esferóides heterogêneos. Usando células epiteliais de próstata humanas normais primárias (HPrEC), foi desenvolvido um ensaio de retenção de rótulos à base de esferóides que permite a identificação e o isolamento funcional das células-tronco que iniciam esferóides em uma única resolução celular.
HPrEC ou linhas celulares são bidimensionalmente (2D) cultivadas com BrdU por 10 dias para permitir sua incorporação no DNA de todas as células divisórias, incluindo células-tronco auto-renovadoras. Lavar começa após a transferência para a cultura 3D por 5 dias, durante os quais as células-tronco se auto-renovam através da divisão assimétrica e iniciam a formação esferóide. Enquanto as células-tronco filhas relativamente quiescentes retêm o DNA parental com rótulo BrdU, os progenitores da filha proliferam rapidamente, perdendo o rótulo BrdU. A BrdU pode ser substituída por CFSE ou Far Red pró-corantes, que permitem o isolamento de células-tronco vivas pela FACS. As características das células-tronco são confirmadas pela formação esferóide in vitro, ensaios de regeneração de tecidos invivo e documentando suas divisões de células simétricas/assimétricas. As células-tronco isoladas que retêm rótulos podem ser rigorosamente interrogadas por estudos moleculares e biológicos a jusante, incluindo RNA-seq, ChIP-seq, captura de células únicas, atividade metabólica, perfil proteoma, imunocitoquímica, formação organóide e regeneração in vivo do tecido. Importante, esta abordagem de isolamento de células-tronco funcionais sem marcadores identifica células-tronco de espécimes de câncer fresco e linhas de células cancerosas de vários órgãos, sugerindo ampla aplicabilidade. Ele pode ser usado para identificar o câncer de células-tronco biomarcadores, tela farmacêutica visando células-tronco de câncer, e descobrir novos alvos terapêuticos em cânceres.
Introduction
A próstata humana contém epitélio luminal com função de secretismo e células basais subjacentes, juntamente com um componente de célula neuroendócrina incomum. As células epiteliais, neste caso, são geradas a partir de uma população rara de células-tronco da próstata que são relativamente quiescentes in vivo e atuam como um sistema de reparo para manter a homeostase glandular ao longo da vida1. Apesar de muitos avanços, a identificação e isolamento funcional das células-tronco da próstata continua a ser um grande desafio no campo. Biomarcadores de células-tronco, incluindo metodologias baseadas em marcadores de superfície celular combinadas com citometria de fluxo são comumente usados para pesquisa de células-tronco2,3,4. No entanto, os resultados para enriquecimento e isolamento variam muito em função de combinações de marcadores e especificidade de anticorpos5,6,levantando questões sobre a identidade das células isoladas. Outra abordagem amplamente utilizada para o enriquecimento de células semelhantes a troncos é a cultura esferóide tridimensional (3D)2,3,4. Enquanto as células-tronco residentes são relativamente quiescentin vivo com restrições de nicho, elas passam por divisão celular na cultura da matriz 3D (simétrica e assimétrica), gerando células-tronco e progenitoras que se reproduzem rapidamente em direção ao compromisso de linhagem7,8. Os esferóides formados são uma mistura heterogênea contendo células-tronco e células progenitoras em vários estágios do compromisso de linhagem, incluindo células progenitoras em estágio inicial e tardio. Assim, os ensaios que utilizam todo o esferóides não são exclusivos de células-tronco, tornando a identificação de propriedades únicas de células-tronco inconclusivas. Portanto, é fundamental criar ensaios para identificar e separar as células-tronco da próstata de seus progenitores filhas. Para este fim, o objetivo do protocolo atual é estabelecer um sistema de ensaio que permita a identificação eficiente e isolamento das células-tronco dos tecidos da próstata humana seguido por uma análise robusta a jusante de suas funções biológicas.
A retenção de rótulos de 5 bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) a longo prazo é amplamente utilizada para o rastreamento de linhagem in vivo e in vitro de células-tronco com base em seu tempo de duplicação prolongada9,10. A abordagem atual para a identificação e isolamento de células-tronco da próstata descritas aqui é baseada em sua característica quiescente relativa e propriedades de retenção de rótulos dentro de uma população epiteliana mista. Além disso, com base na hipótese imortal do DNA da cadeia, apenas as células-tronco podem ser submetidas a divisão de células assimétricas. A célula-tronco representa a célula filha que contém o DNA parental mais velho, enquanto a célula progenitora, que é uma célula filha comprometida, recebe o DNA recém-sintetizado. A propriedade única de células-tronco descrita acima é explorada para realizar rotulagem BrdU em células-tronco parentais em culturas primárias e, em seguida, acompanhar seu rótulo após BrdU-washout após a transferência para a cultura esferóide sem âncora 3D. Enquanto a maioria das células epiteliais da próstata primária retém um fenótipo basal e de trânsito amplificando na cultura 2D, há também uma população rara de células-tronco multipotentes reabastecendo e mantendo a homeostase epitelial como evidenciado pela formação de esferóides ou organóides totalmente diferenciados com a mídia cultura correspondente após a transferência para sistemas 3D3,12. Em nosso protocolo atual, usando esféóides de próstata HPrEC ou BrdU à base de prostasphere, CFSE ou ensaios de retenção de far red seguidos de triagem de células ativadas por fluorescência (FACS), identificamos células-tronco de retenção de rótulos em esferóides em um nível de célula única13.
Importante, confirmamos ainda mais as características das células-tronco das células de retenção de rótulos dentro de esferóides em estágio inicial em comparação com as células progenitoras com compromisso de linhagem. Estes incluem divisão assimétrica de células-tronco, capacidade de formação esferóide in vitro e capacidade de regeneração do tecido invivo, atividade de autofagia elevada, biogênese ribossoma aumentada e diminuição da atividade metabólica. Posteriormente, foi realizada a análise do RNAseq. Genes diferencialmente expressos em células esferóides de retenção de rótulos foram observados que podem servir como novos biomarcadores para células-tronco da próstata humana. Esta abordagem de retenção de rótulos à base de esferóide pode aplicar-se a espécimes de câncer para identificar de forma semelhante um pequeno número de células semelhantes a troncos de câncer, proporcionando assim oportunidades translacionais para gerenciar as populações resistentes terapêuticas13. Apresentado abaixo está o ensaio de retenção de rótulos baseado em prostasphere usando células epiteliais primárias da próstata humana (HPrEC) como exemplo.
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Protocol
Todo o manuseio celular e os preparativos da mídia devem ser realizados com técnica asséptica em um armário de segurança biológica classe II (BSC).
1. Cultura e manutenção das células HPrEC em 2D
- Casaco 100 mm pratos cultura com 2 mL de 2,5 μg/cm2 solução de fibronectina durante a noite à temperatura ambiente (RT). Ascute a solução e deixe os pratos culturais secarem o ar no BSC por 45 min. Pratos de cultura revestidos de fibronectina podem ser armazenados 2-4 semanas a 4 °C.
- Adicione 9 mL do meio de crescimento de células epiteliais da próstata (por exemplo, PrEGM) a um prato de cultura de 100 mm revestido de fibronectina e mantenha o prato aquecido em uma incubadora de CO2 a 37 °C.
- Descongele um frasco de células HPrEC congeladas (2 x 105/mL) em um banho de água de 37 °C e resuspenda as células em 10 mL de meio quente.
- Centrífuga a suspensão celular em 500 x g por 5 min em RT. Aspirate e descartar o supernatant.
- Resuspende completamente as pilhas em 1 mL do meio morno da cultura. Células de sementes por pipetting 1 mL da suspensão celular diretamente no prato de cultura de 100 mm revestido de fibronectina contendo 9 mL do meio pré-aquecido (volume total de médio e células é de 10 mL). Coloque os pratos culturais de volta em uma incubadora de CO2 a 37 °C.
- Reabastecer o meio a cada 2 dias. Para fazer isso, aspirate cuidadosamente todos os meios de comunicação e adicionar 10 mL de meio quente fresco.
- Em cerca de 5 dias, garantir que as culturas são ~ 70-80% confluent. Realize a digestão enzimática incubando as células com 3 mL de 0,05% Trypsin/EDTA a 37 °C por 5 min.
- Pare a digestão adicionando 3 mL de PBS quente contendo 10% FBS.
- Colete as células em um tubo de centrífuga de 50 mL e centrífuga a 500 x g por 5 min no RT. Aspirate e descarte o supernatant.
- Resuspenda a pelota de células em 30 mL de meio quente e dispense-a igualmente em três novos pratos de cultura de 100 mm revestidos de fibronecina para a próxima passagem.
NOTA: As células hprec primárias podem ser passagens ~ 3-5x sem alterar suas características de células epiteliais basais. O fenótipo epitelia é testado por expressões de marcadores epiteliais basais citoqueratina 5 e p63 com imunocitoquímica / imunofluorescente (ICC / IF) ensaios.
2. Rotulagem HPrEC com BrdU, CFSE, ou Far Red pró-corantes
NOTA: As células podem proceder para o passo 2.1 ou passo 2.2 seguido pela transferência para a cultura de prostafera 3D, conforme descrito na etapa 3.1.
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Rotulagem única de células com BrdU
- Cultura 2 x 105 células HPrEC em pratos de cultura de 100 mm revestidos de fibronectina com 10 mL de meio quente contendo 1 μM de BrdU. Cultura das células por 10 dias (mais de duas passagens) para garantir a rotulagem de todas as células, incluindo células-tronco da próstata e progenitor.
- Após 10 dias, pirata cuidadosamente o meio pregm contendo a BrdU e lavar as células com 5 mL de PBS quente. Repita 1x.
- Realizar a digestão enzimática usando 0,05% de trippsina/EDTA, conforme descrito nos passos 1,7-1,8. Centrífuga as células a 500 x g por 5 min em RT. Aspirate e descartar o supernatant.
- Resuspenda as células pelleted rotuladas por BrdU (5 x 104)em 500 μL de matriz/média de membrana de porão/11-cold-gelo (1:1) e transfira para uma cultura de prostafera 3D (descrita no passo 3.1) por 5 dias para permitir a lavagem da BrdU durante a formação esferóide (~ 6 ciclos celulares).
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Rotulagem dupla de células com BrdU e CFSE ou Far Red pro-corantes
- Se a co-rotulagem de células vivas for desejada, tome células pré-rotuladas incubadas com BrdU por 10 dias a partir do passo 2.1 e co-label com 5 μM CFSE ou Far Red célula sarláira fluorescente pro-corantes por 30 min. Executar a co-rotulagem no dia 10.
- Aspeto cuidadosamente o meio contendo BrdU e CFSE ou Far Red pro-corantes. Lave as células com 5 mL de PBS quente. Repita a lavagem 1x.
- Realize a digestão enzimática usando 0,05% de trippsina/EDTA, conforme descrito nos passos 1,7-1,8. Centrífuga as células a 500 x g por 5 min em RT. Remover e descartar o supernatant.
- Resuspenda as células co-rotuladas (5 x 104)em 500 μL de matriz/meio de membrana de porão de gelo (1:1) e transfira para uma cultura de prostafera 3D (descrita na seção 3.1) por 5 dias para permitir o lava-jato BrdU e CFSE ou Far Red durante a formação esferóide (~6 ciclos celulares).
- Realize a detecção de células que retêm rótulos em esferas (prostasferas do Dia 5) conforme descrito nos passos 4.1, 4.2, 4.3 ou 5.
NOTA: Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) e Far Red são pro-corantes fluorescentes de longa duração e são bem retidos dentro das células rotuladas. Esterase intracelular em células vivas clificam os grupos de acetato que ativam as moléculas fluorescentes verdes ou vermelhas que agora são membranas imperdestinadas.
3. Formação da prostafera no sistema 3D da cultura da membrana do porão
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Cultura da prostafera no sistema 3D da matriz da membrana do porão
- Descongele a matriz da membrana do porão em 4 °C durante a noite e mantenha-se no gelo antes do uso.
- Adicione delicadamente 1 mL da matriz da membrana do porão gelo-frio em um volume igual do meio da cultura gelo-frio. Misture lentamente por pipetting cima e para baixo, evitando bolhas.
NOTA: Pré-casaco na parte inferior de 12 poços de placa de cultura bem com 100 μL desta solução. Isso minimizará o número de células que caem através da matriz e crescem como uma monocamada. - Resuspenda 5 x 104 células HPrEC em matriz de membrana de porão/mistura média de membrana de porão/1em um volume total de 500 μL.
- Pipeta 500 μL desta solução celular em torno da borda inferior de cada poço.
- Agite a placa para distribuir uniformemente a mistura em torno da borda do poço. Coloque a placa em uma incubadora de CO2 a 37 °C por 30 min para permitir que a matriz se solidifique.
- Uma vez que a matriz se solidificou, cubra com 1 mL de meio de cultura quente por poço. Não perturbe o anel da matriz da membrana do porão. Cuidadosamente apontar a ponta da pipeta e dispensar o meio de cultura para o centro do poço.
NOTA: O meio da cultura deve ser aquecido a 37 °C quando adicionado à matriz solidificada da membrana do porão. A matriz da membrana do porão perderá sua integridade e dissolver-se-á quando expor aos meios frios/frescos. - Reabastecer médio a cada 2 dias. Cuidadosamente aspirado ~ 500 μL de meio gasto e adicionar 500 μL de meio de cultura quente fresco.
- Monitore a formação e o crescimento da prostafera por 5 a 7 dias usando um microscópio invertido.
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Passaging de prostasferas
- Colher prostasferas da matriz, aspirando cuidadosamente fora de mídia tanto quanto possível. Evite perturbar ou pegar pedaços flutuantes da matriz solidificada.
- Adicione 1 mL de solução de dispase (matriz de membrana do porão:dispase em uma proporção de 1:2). Misture bem por pipetting cima e para baixo várias vezes.
- Incubar as placas de cultura em uma incubadora de CO2 a 37 °C por 30 min.
- Tire imagens de prostasferas que estão na parte inferior do prato de cultura para contagem de números de esferas e medições de tamanho.
- Colete a mistura da esfera em um tubo de 15 mL. Centrífuga a suspensão em 500 x g para 5 min em RT para pelotas as esferas. Aspirar e descartar o supernatant.
- Disperse as esferas em células individuais, digerindo com 500 μL de trippsina/EDTA quente de 0,05% e transferindo a suspensão para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
- Incubar o tubo de microcentrífuga em uma incubadora de CO2 a 37 °C por 5 min.
- Pare a ação de trippsina com 500 μL de PBS quente contendo 10% FBS. Passe a suspensão da esfera digerida através de uma seringa de 1 mL com uma agulha 5x 26 G para dissociar as esferas em células individuais.
- Centrífuga a suspensão em 500 x g por 5 min para pelotas as células em RT. Aspirar o supernatant e descartar.
- Resuspenda a pelota de célula em 1 mL de meio de cultura quente e filtrar através de um 40 μm tamanho filtro de células de nylon tamanho.
- Centrífuga a suspensão celular em 500 x g por 5 min para pelotas as células em RT. Aspirate e descartar o supernatant.
- Resuspenda a pelota celular em 1 mL de matriz/meio de membrana de porão/cultura de porão de gelo (1:1) em uma matriz de membrana 3D para a segunda passagem da prostasphere.
4. Identificação de células-tronco da próstata que retêm BrdU por coloração imunofluorescente
- Supere as prostasferas anexadas seguidas de imunofluorescente (IF) de coloração para imagens de células-tronco 2D da próstata.
- Colheita prostasferas por digestão dispase como descrito nos passos 3.2.1-3.2.3. Centrífuga as esferas em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL a 500 x g por 5 min. Descarte o supernatant.
- Resuspenda esferas em 1 mL de meio de cultura quente.
- Incubate ~ 50 prostasferas por poço em 8 poços de câmara slides em 200 μL de meio de cultura em uma incubadora de 37 °C durante a noite para permitir o apego e conseqüência das esferas.
- No dia 2, aspira e descarta o meio de cultura. Lave as esferas superadas com 200 μL de PBS por 5 min.
- Corrija as esferas em 200 μL/bem de metanol gelado a -20 °C por 20 min.
- Lave as esferas com 200 μL/bem de PBS por 5 min. Repetição 2x.
- Esferas de lavagem ácida com 200 μL/bem de 2N HCl por 30 min na RT.
- Lave as esferas com 200 μL/bem de PBS por 5 min. Repetição 3x.
- Adicione 100 μL de solução de bloqueio contendo 5% de soro de cabra normal em PBST (PBS com 0,25% Triton X-100) e incubar por 30 min na RT.
- Aspirar a solução de bloqueio e adicionar 100 μL de PBST contendo 2% de soro de cabra normal e anticorpo brdu anti-humano de camundongo primário (1:200) a cada poço e incubação em uma caixa umidificada a 4 °C durante a noite.
NOTA: O anticorpo Mouse IgG é usado como controle negativo. - Aspirar e remover a solução principal de anticorpos. Lave as esferas com 200 μL de PBS por 5 min. Repita 2x.
- Adicione 100 μL de PBST contendo 2% de soro de cabra normal e cabra secundária anti-mouse Alexa Fluor 488 anticorpo (1: 500) para cada poço e incubação em RT no escuro por 2 h.
- Aspirar e remover a solução de anticorpos secundários. Lave as esferas com 200 μL de PBS por 5 min. Repita 3x.
- Monte os slides com ~ 25-40 μL de montagem aquosa médio contendo DAPI.
- Obter imagens das esferas manchadas / células com um microscópio fluorescente e uma câmera digital colorida.
- Montagem inteira SE a mancha de prostaspheres para a imagem latente 3D da pilha de haste da próstata
NOTA: Para toda a montagem, se colorir, as prostasferas são manuseadas usando tubos de microcentrífuga de 1,5 mL.- Colha as prostasferas por digestão dispase, como descrito nos passos 3.2.1-3.2.3. Centrífuga as esferas em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL a 500 x g por 5 min. Aspirar o supernatant e descartar.
- Resuspenda e corrige as esferas com 1 mL de paraformaldeído de 4% na RT por 20 min. Centrífuga as esferas a 500 x g por 5 min. Aspirao supernatant e descarte.
- Lave as esferas resuspendendo a pelota em 1 mL de PBS. Centrífuga s esferas a 500 x g por 5 min. Aspirar o supernatant e descartar. Repita 1x.
- Ácido lavar as esferas, resuspendendo a pelota em 1 mL de 2N HCl por 30 min.
- Lave as esferas com 1 mL de PBS por 5 min e centrífuga a 500 x g por 5 min. Aspirar o supernatant e descartar. Repita 3x.
- Resuspenda ~15-30 esferas em 100 μL de solução de bloqueio contendo 5% de soro de cabra normal em PBST (PBS com 0,25% Triton X-100) e incubação por 30 min na RT.
- Para remover a solução de bloqueio, centrífuga s esferas em 500 x g para 5 min. Aspirate e descartar o supernatant.
- Resuspenda as esferas em 100 μL de PBST contendo 2% de soro de cabra normal e anticorpobrista brdu anti-humano de camundongo primário (1:200) e incubada a 4 °C durante a noite.
- Lave as esferas resuspendendo a pelota em 1 mL de PBS. Centrífuga s esferas a 500 x g por 5 min. Aspirar o supernatant e descartar. Repita 1x.
- Resuspenda as esferas em 100 μL de PBST contendo 2% de soro de cabra normal e cabra secundária anti-mouse Alexa Fluor 488 anticorpo (1:1,000) e incubar em RT por 2 h.
- Lave as esferas resuspendendo a pelota em 1 mL de PBS. Centrífuga s esferas a 500 x g por 5 min. Aspirar o supernatant e descartar. Repita 1x.
- Resuspenda as esferas em 30-50 μL de médio de montagem aquoso contendo DAPI. Para evitar aplainar as esferas, dispense-as em um poço criado a partir de um prato de cultura não revestido de 35 mm com um fundo de vidro de cobertura. Em seguida, adicione um coverslip para o prato de cultura, cobrindo o bem.
- Adquirir imagens de pilha Z de esfera inteira usando um microscópio confocal fluorescente invertido de luz transmitida. Converta essas imagens z-stack em imagens 3D usando um software de imagem com recursos de desenho em forma livre.
NOTA: O anticorpo Mouse IgG é usado como controle negativo.
- Análise de células emparelhadas (protocolo de 4 dias)
- Cultura as esferas rotuladas pela BrdU para o Dia 5.
- Dia 1: Colha as esferas de uma matriz de membrana do porão com 1 mL de digestão dispase. Disperse-se em células individuais por 500 μL de trippsina/EDTA quente de 0,05% em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, conforme descrito nos passos 3,2,1-3,2,11.
- Resuspenda as células em 1 mL de meio de cultura quente.
- Placa as células dispersas únicas (~ 300-500 por poço) em 8 poços de câmara e cultura em 200 μL / bem meio cultura durante a noite para permitir o apego.
- Dia 2: Alterar o meio de cultura com 200 μL de 2 μM citocalasina D no meio da cultura e incubar durante a noite em 37 °C para permitir uma divisão celular que faz uma pausa no final da metafase para anafase.
- Dia 3-4: Aspira e descarte o meio. Fixar células em 200 μL/bem de metanol gelado a -20 °C por 20 min. Siga o protocolo de imunocoloração da BrdU, conforme descrito nos passos 4,1,5-4,1,14.
- Tire imagens de células emparelhadas com um microscópio de fluorescência. Certifique-se de que a distância entre os dois núcleos seja inferior a 30 μm. Com base na retenção de BrdU, identifique as células-tronco emparelhadas como submetidas à divisão de células simétricas ou assimétricas.
NOTA: As células-tronco da próstata que retêm rótulos brdu passam por divisão simétrica para dar origem a duas células-tronco filhas que mantêm uma quantidade igual de BrdU, enquanto as células-tronco submetidas a divisão assimétrica dão origem a uma célula-tronco filha que retém toda a BrdU e a outra célula progenitora filha que perdeu o rótulo BrdU.
5. Isolamento das células-tronco da próstata que retêm rótulos CFSE por classificação facs
- Dia 5: Colher as prostasferas do dia 5, rotuladas pela CFSE, crescendo em 6 placas de cultura de poços na cultura 3D, substituindo o meio por 2 mL de dispase (matriz de membrana do porão: dispase em uma proporção de 1:2). Pipeta para cima e para baixo várias vezes para misturar completamente.
- Incubar as placas em uma incubadora de CO2 a 37 °C por 30 min para digerir a matriz.
- Colete a mistura da esfera em um tubo de centrífuga de 15 mL. Centrífuga s esferas a 500 x g para 5 min em RT. Aspirar o supernatant e descartar.
- Resuspenda a pelota da esfera em 500 μL de trippsina/EDTA morna de 0.05% e transferência em um tubo do microcentrífuga de 1.5 mL.
- Incubar as esferas em uma incubadora de CO2 a 37 °C por 5 min. Adicionar 500 μL de PBS quente contendo 10% FBS.
- Passe as esferas através de uma seringa de 1 mL com uma agulha 5x 26 G para dissociar completamente as esferas em células individuais.
- Centrífuga as células a 500 x g por 5 min em RT. Aspirate e descartar o supernatant.
- Resuspenda as células em 1 mL de meio de cultura quente contendo 1 μg/mL propidium iodeto (PI) para manchar as células mortas. Incubar por 1 min em RT.
- Centrífuga as células a 500 x g por 5 min em RT. Aspirate e descartar o supernatant.
- Resuspenda as células em 1 mL de meio de cultura quente. Centrífuga as células a 500 x g por 5 min em RT. Aspirate e descartar o supernatant.
- Resuspenda as células em 500 μL de meio de cultura quente e colete as células em tubos de fundo redondos de poliestireno de 5 mL, filtrando-os através de 35 μm de células do tamanho do poros.
- Realize a análise das células de prosfera rotuladas por CFSE dispersas com um analisador FACS de um canal único.
- Gate as subpopulações de fracionado CFSEOi,CFSEMed,e cfselo células. Use os controles negativos e positivos para gating.
NOTA: A presença de células-tronco da próstata de retenção de rótulos CFSE da FACS (ver Hu et al.13)pode ser confirmada pela microscopia de fluorescência verde e seu tamanho celular maior em comparação com células não retendo. Este tamanho celular maior é uma propriedade de células-tronco da próstata em relação às populações de células progenitoras. Isso pode ser diferente com outros tipos de tecido.
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Representative Results
As células epiteliais da próstata humana normal primária são colocadas em pratos culturais revestidos de fibronectina e o crescimento celular é mantido na cultura 2D (Figura 1a). Após a transferência para a cultura 3D com uma matriz de membrana do porão, células epiteliais diferenciadas morrem lentamente. Apenas as células-tronco da próstata podem sobreviver em uma cultura livre de âncora e formar esferóides em 5 dias (Figura 1b).
A rotulagem dupla de células epiteliais da próstata na cultura 2D seguida pela formação esferóide na cultura 3D indica a colocalização de BrdU, CFSE e Far Red nas mesmas células de retenção de rótulos (Figura 2a-i).
Células que retêm rótulos mostram características de células-tronco nos esferóides do dia 5. A dupla imunomancha mostra que as células de retenção de rótulos apresentam níveis mais baixos de proteína citoqueratina KRT14; diminuição da proteína de junção celular E-cadherin14; proteínas de marcadores precoces de células-tronco aumentadas Wnt10B13,15,16 e ALDH1A1; aumento da proteína autofagia LC3, um indicador da atividade de fluxo de autofagia17; e aumentou a miosina IIB (Figura 3a-f).
Um ensaio de retenção de rótulos à base de esferóide também detecta com sucesso células de haste de câncer em espécimes de câncer de próstata (Figura 4). Isso permitirá a descoberta de verdadeiros biomarcadores para células-tronco cancerosas e tem o potencial de identificar novos alvos terapêuticos para o câncer de próstata.
Figura 1: Manutenção do HPrEC na cultura 2D e formação esferóide na cultura 3D. (a)Uma cultura primária 2D do HPrEC foi rotulada como BrdU e transferida para a cultura 3D com formação prostasfera no Dia 5(b). Barras de escala = 400 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 2: Identificação de células de retenção de rótulos de longo prazo nas prostasferas primárias. Rotulagem dupla de BrdU (vermelho) e CFSE (verde); CFSE (verde) e Far Red (vermelho); BrdU (verde) e Far Red (vermelho) identificaram as mesmas células-tronco com retenção de DNA parental. Quaisquer rótulos BrdU, CFSE ou Far Red em células progenitoras que se dividem rapidamente (DAPI, azul) foram diluídos e perdidos(a-i). Imagens representativas mostram BrdU/CFSE(a-c)(painel superior), CFSE/Far Red(d-f)(painel médio) e BrdU/Far Red(g-i)(painel inferior) co-rotulando em células únicas de prostasphere (PS). Barras de escala = 50 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Células PS que retêm rótulos exibindo propriedades de células-tronco. Em comparação com as células progenitoras não resistentes ao rótulo, BrdU ou CFSE exibem células-tronco de retenção de rótulos(a)níveis mais baixos de citoqueratina 14 (KRT 14),(b)diminuição dos níveis de E-cadherin,(c)níveis elevados de Wnt10B,(d)níveis mais elevados de ALDH1A1,(e)aumentaram lc3, e (f)aumentaram as proteínas myosin IIB. Barras de escala = 50 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Usando o ensaio baseado em esferas de retenção de rótulos para identificação de células-tronco semelhantes a câncer. Células-tronco cancerígenas que retêm rótulos cfse em esferóides derivados de espécimes de câncer de próstata humano exibiram proteína E-cadherin reduzida em relação às células progenitoras não rotuladas. Barras de escala = 50 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O fluxo de citometria usando vários marcadores de superfície de células-tronco é uma abordagem comumente usada para pesquisa com células-tronco, apesar de não ter especificidade e seletividade1,5,6. Enquanto a formação esferóide em um sistema de cultura 3D é outro método útil para enriquecer a população de células-tronco raras de células epiteliais primárias, incluindo HPrEC, os esferóides resultantes ainda são uma mistura heterogênea de células-tronco e progenitoras2,3,4. Nas prostasferas, em comparação com as células progenitoras em rápida proliferação, o caráter relativamente quiescente das células-tronco permite que elas sejam identificadas por um ensaio de retenção de rótulos de longo prazo.
Os métodos resumidos neste artigo descrevem a rotulagem do HPrEC utilizando BrdU, CFSE e/ou Far Red pro-corantes13. Enquanto BrdU, CFSE, e / ou Far Red pró-corantes em células em rápida proliferação são todos rapidamente diluídos por cada divisão celular, há um mecanismo adicional que responde pela perda de BrdU conhecido como imortal strand DNA segregação11. Isto é, quando a célula-tronco sofre divisão assimétrica, dando origem a uma célula-tronco filha e uma célula progenitora. A célula-tronco da filha retém todo o DNA parental antigo com rótulo BrdU, enquanto a célula progenitora filha recebe o DNA recém-sintetizado sem o rótulo BrdU. Portanto, um ensaio de retenção de rótulos usando BrdU permite uma identificação mais clara e fácil das células-tronco que retêm rótulos por manchaimunofluorescente. Isto é especialmente útil para confirmar biomarcadores de células-tronco por mancha dupla IF usando dois anticorpos diferentes. Uma das principais limitações da rotulagem da BrdU é que as células devem ser fixadas para a coloração de IF, evitando assim mais estudos funcionais após a rotulagem e fixação celular da BrdU.
Para resolver este problema, dois pró-corantes fluorescentes para rotulagem hprec ao vivo foram testados em ensaios de retenção de rótulos. Os resultados indicaram que houve uma sobreposição completa de células de esfera sapateadas de BrdU, CFSE e Far Red. O rótulo BrdU poderia ser substituído por CFSE ou Far Red em ensaios de retenção de rótulos baseados em esferas para permitir a visualização de células vivas para imagem e separação pela FACS, promovendo a caracterização funcional de células-tronco vivas isoladas usando tanto ensaios de cultura de células in vitro quanto em xenoenxerto vivo ensaios13. As células de tronco e progenitor baseadoem em etiquetas DE Far Red ou FACS também podem ser usadas para RNA-seq, incluindo RNA-seq de célula única, que é muito poderosa na identificação de novos marcadores de genes de células-tronco e vias de sinalização, bem como hierarquia de linhagem de células epiteliais.
O novo método livre de biomarcadores de caracterização funcional de células-tronco por um ensaio de retenção de rótulos à base de esferóideapresentado aqui pode identificar células semelhantes a troncos de câncer de espécimes primários de pacientes e linhas de células cancerosas. Assim, ele fornece uma avenida para a descoberta de novos biomarcadores de células-tronco de câncer e desenvolvimento de terapêuticas eficazes visando câncer13.
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Disclosures
Os autores não têm relações financeiras para divulgar.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado por subvenções do Instituto Nacional do Câncer R01-CA172220 (GSP, WYH), R01-ES02207 (GSP, WYH). Agradecemos ao Núcleo de Citometria Flow da Universidade de Illinois, em Chicago, pela assistência na triagem celular.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| 1 mL tuberculin syringes | Bectin Dickinson | BD 309625 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes, sterile | |||
| 100 mm culture dishes | Corning/Falcon | 353003 | |
| 12-well culture plate | Corning/Falcon | 353043 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Corning/Falcon | 352097 | |
| 22 x 22 mm coverslips, sq | Corning | 284522 | For MatTek 35 mm culture dish |
| 24 x 50 mm coverslips | Corning | 2975245 | |
| 26G x 1.5 inch hypodermic needle | Monoject | 1188826112 | |
| 2N HCl | |||
| 35 mm culture dish with cover glass bottom | MatTek Corp | P35G-0-10-C | Glass bottom No. 0, uncoated,  irradiated |
| 40 µm pore nylon cell strainer | Corning | 352340 | |
| 5% CO2 culture incubator, 37 °C | Forma | ||
| 50 mL centrifuge tubes | Corning/Falcon | 352098 | |
| 5mL Polystyrene Round-Bottom Tube with strainer snap cap | Corning | 352235 | 35 µm nylon mesh |
| 6-well culture plates | Corning | 353046 | |
| 8-well chamber slides | Millipore Sigma | PEZGS0816 | |
| Aqueous mounting medium containing DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | A nuclear fluorescent dye |
| Biological safety cabinet, Level 2 certified | |||
| BrdU (5-bromo-2’-deoxyuridine) | Sigma-Aldrich | B5002 | 1 mM stock solution in DMSO |
| Centrifuge for 1.5 mL microcentrifuge tubes | Eppendorf | ||
| Centrifuge for 15 mL tubes | Beckman Coulter | Allegra 6 | |
| CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl ester) | Thermo Fisher Scientific | C34554 | 5 mM stock solution in DMSO |
| cytochalasin D | Thermo Fisher Scientific | PHZ1063 | |
| Dispase 1U/mL | StemCell Technologies | 07923 | |
| FACS CellSorter MoFlo XDP | Beckman Coulter | s | |
| Far-Red pro-dye | Thermo Fisher | C34564 | 5 mM stock solution in DMSO |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | |||
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895 | For coating 100 mm culture dishes |
| Fluorescent microscope with color digital camera | Carl Zeiss | Axioskop 20 fluorescent microscope; color digital Axiocamera | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A-11029 | |
| HPrEC (Primary normal human prostate epithelial cells) | Lifeline Cell Technology | FC-0038 | Pooled from 3 young (19-21yr od) disease-free organ donors; 1 x 105 cells/mL; stored in liquid nitrogen |
| ice bucket and ice | |||
| Inverted microsope with digital camera | |||
| Matrigel, low growth factor, phenol-red free | Corning | 356239 | |
| Methanol | Corning | A452-4 | |
| Mouse anti-BrdU antibody | Cell Signaling | 5292S | |
| Mouse IgG antibody (negative control) | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | |
| Normal goat serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
| Pipettors and tips, various sizes | |||
| PrEGM (ProstaLife Epithelial Cell Growth Medium) | Lifeline Cell Technology | LL-0041 | |
| Propidium Iodide (PI) | R & D Systems | 5135/10 | 10 μg/mL PI in PBS stored at 4 °C in the dark |
| Serological pipets, various sizes | |||
| Software for sphere counting and size measurements | |||
| Software: 3D images using Imaris an imageing software with freeform drawing capabilities | |||
| Triton X-100 | Millipore Sigma | T8787 | |
| Water bath, 37 °C | |||
| z-stack images using a transmitted light inverted fluorescent confocal microscope |
References
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