Summary
Utilizando células epiteliales de próstata primarias humanas, informamos de un nuevo método libre de biomarcadores de caracterización funcional de células similares a tallos mediante un ensayo de retención de etiquetas basado en esferoides. Se describe un protocolo paso a paso para el etiquetado de celdas 2D BrdU, CFSE o Far Red; formación de esferoides tridimensionales; identificación celular similar a un tallo que retiene la etiqueta por inmunocitoquímica; y aislamiento por FACS.
Abstract
A pesar de los avances en la investigación con células madre adultas, la identificación y el aislamiento de células madre de muestras de tejido sigue siendo un desafío importante. Mientras que las células madre residentes están relativamente inactivas con restricciones de nicho en los tejidos adultos, entran en el ciclo celular en cultivo tridimensional (3D) libre de anclaje y se someten a división celular simétrica y asimétrica, dando lugar tanto al tallo como al progenitor Células. Estos últimos proliferan rápidamente y son la principal población celular en varias etapas del compromiso de linaje, formando esferoides heterogéneos. Usando células epiteliales humanas normales primarias (HPrEC), se desarrolló un ensayo de retención de etiquetas basado en esferoides que permite la identificación y el aislamiento funcional de las células madre que inician los esferoides a una sola resolución celular.
HPrEC o líneas celulares se cultivan bidimensionalmente (2D) con BrdU durante 10 días para permitir su incorporación al ADN de todas las células divisorias, incluidas las células madre auto-renuevas. El lavado comienza tras la transferencia al cultivo 3D durante 5 días, durante los cuales las células madre se autonuevan a través de la división asimétrica e inician la formación de esferoides. Mientras que las células madre hijas relativamente inactivas conservan el ADN parental etiquetado por BrdU, los progenitores hijas proliferan rápidamente, perdiendo la etiqueta BrdU. BrdU se puede sustituir por CFSE o Far Red pro-dyes, que permiten el aislamiento de células madre vivas por FACS. Las características de las células madre se confirman mediante la formación de esferoides in vitro, ensayos de regeneración de tejido in vivo y la documentación de sus divisiones celulares simétricas/asimétricas. Las células madre aisladas que retienen etiquetas pueden ser interrogadas rigurosamente por estudios moleculares y biológicos aguas abajo, incluyendo ARN-seq, ChIP-seq, captura de células únicas, actividad metabólica, perfilado de proteome, inmunocitoquímica, formación de organoides y regeneración de tejido in vivo. Es importante destacar que este enfoque de aislamiento funcional de células madre sin marcadores identifica células similares a los tallos de muestras de cáncer fresco y líneas celulares cancerosas de múltiples órganos, lo que sugiere una amplia aplicabilidad. Se puede utilizar para identificar biomarcadores celulares similares a los tallos del cáncer, productos farmacéuticos de la pantalla dirigidos a células similares a los tallos del cáncer, y descubrir nuevas dianas terapéuticas en los cánceres.
Introduction
La glándula prostática humana contiene epitelio luminal con función secretora y células basales subyacentes junto con un componente inusual de la célula neuroendocrina. Las células epiteliales, en este caso, se generan a partir de una población rara de células madre prostáticas que están relativamente inactivas in vivo y actúan como un sistema de reparación para mantener la homeostasis glandular durante toda la vida1. A pesar de muchos avances, la identificación y el aislamiento funcional de las células madre prostáticas sigue siendo un desafío importante en el campo. Los biomarcadores de células madre, incluidas las metodologías basadas en marcadores de superficie celular combinadas con la citometría de flujo, se utilizan comúnmente para la investigación de células madre2,3,4. Sin embargo, los resultados de enriquecimiento y aislamiento varían ampliamente en función de las combinaciones de marcadores y la especificidad de los anticuerpos5,6, lo que plantea preguntas sobre la identidad de las células aisladas. Otro enfoque ampliamente utilizado para el enriquecimiento celular similar a un tallo es el cultivo esferoide tridimensional (3D)2,3,4. Mientras que las células madre residentes son relativamente indistinguen in vivo con restricciones de nicho, se someten a división celular en el cultivo de matriz 3D (tanto simétrica como asimétrica), generando células madre y progenitoras que se reproducen rápidamente hacia el compromiso de linaje7,8. Los esferoides formados son una mezcla heterogénea que contiene células madre y células progenitoras en varias etapas del compromiso de linaje, incluyendo células progenitoras en etapas tempranas y tardías. Por lo tanto, los ensayos que utilizan toda la esferoides no son exclusivos de las células madre, por lo que la identificación de propiedades únicas de células madre no es concluyente. Por lo tanto, es fundamental crear ensayos para identificar y separar las células madre de la próstata de sus progenitores hijas. Con este fin, el objetivo del protocolo actual es establecer un sistema de ensayo que permita la identificación y aislamiento eficiente de las células madre de los tejidos prostáticos humanos seguido de un sólido análisis aguas abajo de sus funciones biológicas.
La retención de etiquetas a largo plazo de 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) es ampliamente utilizada para el seguimiento in vivo e in vitro del linaje de las células madre en función de su tiempo de duplicación prolongado9,10. El enfoque actual para la identificación y el aislamiento de células madre prostáticas descritos en este documento se basa en sus propiedades relativas de característica en reposo y retención de etiquetas dentro de una población epitelial mixta. Además, sobre la base de la hipótesis inmortal del ADN de la hebra, sólo las células madre pueden someterse a la división celular asimétrica. La célula madre representa la célula hija que contiene el ADN parental más antiguo, mientras que la célula progenitora, que es una célula hija comprometida, recibe el ADN recién sintetizado. La propiedad única de células madre descrita anteriormente se explota para realizar el etiquetado BrdU en células madre parentales en cultivos primarios y luego rastrear su etiqueta después de BrdU-washout tras la transferencia al cultivo esferoide sin anclaje 3D. Mientras que la mayoría de las células epiteliales primarias de próstata conservan un fenotipo ampollador basal y de tránsito en el cultivo 2D, también hay una población rara de células madre multipotentes que reponen y mantienen la homeostasis epitelial como lo demuestra la formación de esferoides o organoides totalmente diferenciados con los medios de cultivo correspondientes al transferirlo a los sistemas 3D3,12. En nuestro protocolo actual, mediante el uso de esferoides prostíferos HPrEC o ensayos de retención BrdU, CFSE o Far Red basados en prostafera seguidos de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), identificamos células madre retenedoras de etiquetas en esferoides en un solo nivel de célula13.
Es importante destacar que confirmamos además las características de las células madre de las células que retienen etiquetas dentro de los esferoides en etapa temprana en comparación con las células progenitoras con compromiso de linaje. Estos incluyen división asimétrica de células madre, capacidad de formación de esferoides in vitro y capacidad de regeneración de tejido in vivo, actividad elevada de la autofagia, biogénesis ribosoma aumentada y disminución de la actividad metabólica. Posteriormente, se realizó el análisis de ARNseq. Se observaron genes expresados diferencialmente en células esferoides que conservan etiquetas que pueden servir como nuevos biomarcadores para células madre de próstata humanas. Este enfoque de retención de etiquetas basado en esferoides puede aplicarse a las muestras de cáncer para identificar de manera similar a un pequeño número de células similares a los tallos de cáncer, proporcionando así oportunidades traslacionales para manejar las poblaciones resistentes terapéuticas13. A continuación se presenta el ensayo de retención de etiquetas basado en prostasfera utilizando células epiteliales de próstata primarias humanas (HPrEC) como ejemplo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todas las preparaciones de manipulación celular y medios deben realizarse con técnica aséptica en un gabinete de seguridad biológica de clase II (BSC).
1. Cultivo y mantenimiento de células HPrEC en 2D
- Recubrir platos de cultivo de 100 mm con 2 ml de solución de fibronectina de 2,5 g/cm2 durante la noche a temperatura ambiente (RT). Aspirar la solución y dejar que los platos de cultivo se sequen al aire en el BSC durante 45 minutos.
- Añadir 9 ml del medio de crecimiento de células epiteliales de próstata (p. ej., PrEGM) a un plato de cultivo de 100 mm recubierto de fibronectina y mantener el plato caliente en una incubadora de CO2 a 37 oC.
- Descongelar un vial de células HPrEC congeladas (2 x 105/ml) en un baño de agua de 37oC y resuspender las células en 10 ml de medio caliente.
- Centrifugar la suspensión celular a 500 x g durante 5 min en RT. Aspirar y desechar el sobrenadante.
- Resuspender completamente las células en 1 ml del medio de cultivo cálido. Células de semilla sin titulación de 1 ml de la suspensión celular directamente en el plato de cultivo de 100 mm recubierto de fibronectina que contiene 9 ml del medio precalentado (volumen total de medio y células es de 10 ml). Coloque los platos de cultivo de nuevo en una incubadora de CO2 a 37 oC.
- Reponer el medio cada 2 días. Para ello, aspirar cuidadosamente todos los medios y añadir 10 ml de medio caliente fresco.
- En unos 5 días, asegúrese de que las culturas sean de entre el 70 y el 80 % de fluidez. Realizar la digestión enzimática incubando las células con 3 ml de 0,05% de tripina/EDTA a 37 oC durante 5 min.
- Detener la digestión añadiendo 3 ml de PBS caliente que contiene 10% FBS.
- Recoger las células en un tubo centrífugo de 50 ml y centrífuga a 500 x g durante 5 minutos en RT. Aspirar y desechar el sobrenadante.
- Resuspende el pellet celular en 30 ml de medio cálido y dispéndalo por igual en tres nuevos platos de cultivo de 100 mm recubiertos de fibronectina para el siguiente pasaje.
NOTA: Las células primarias de HPrEC se pueden pasar de 3 a 5 veces sin alterar sus características de células epiteliales basales. El fenotipo epitelial se prueba mediante expresiones de marcadores de células epiteliales basales de citoqueratina 5 y p63 con ensayos inmunocitoquímicos/inmunofluorescentes (ICC/IF).
2. Etiquetado HPrEC con BrdU, CFSE o Far Red pro-dyes
NOTA: Las celdas pueden continuar con el paso 2.1 o el paso 2.2 seguido de la transferencia al cultivo de la prostasfera 3D como se describe en el paso 3.1.
-
Etiquetado único de celdas con BrdU
- Cultivo 2 x 105 Células HPrEC en platos de cultivo de 100 mm recubiertos de fibronectina con 10 ml de medio caliente que contienen 1 m de BrdU. Cultivo de las células durante 10 días (durante dos pasajes) para asegurar el etiquetado de todas las células, incluyendo el tallo de la próstata y las células progenitoras.
- Después de 10 días, aspirar cuidadosamente el medio PrEGM que contiene el Brdu y lavar las células con 5 ml de PBS caliente. Repita 1x.
- Realizar la digestión enzimática usando 0.05% trypsin/EDTA como se describe en los pasos 1.7–1.8. Centrifugar las células a 500 x g durante 5 min en RT. Aspirar y desechar el sobrenadante.
- Resuspenda las células peletizadas con etiqueta BrdU (5 x 104) en 500 ml de matriz de membrana de sótano/medio de hielo (1:1) y transfiera a un cultivo de prostasfera 3D (descrito en el paso 3.1) durante 5 días para permitir el lavado de BrdU durante la formación de esferoides (ciclos de células 6).
-
Etiquetado doble de células con BrdU y CFSE o Pro-distees Far Red
- Si se desea el co-etiquetado de células vivas, tome las celdas preetiquetadas incubadas con BrdU durante 10 días desde el paso 2.1 y co-etiquete con 5 oM CFSE o Far Red fluorescente fluorescente pro-disyes durante 30 min. Realice el co-etiquetado en el día 10.
- Aspirar cuidadosamente el medio que contiene BrdU y CFSE o Far Red pro-dyes. Lavar las células con 5 ml de PBS caliente. Repita el lavado 1x.
- Realizar la digestión enzimática usando 0.05% trypsin/EDTA como se describe en los pasos 1.7–1.8. Centrifugar las células a 500 x g durante 5 min en RT. Retire y deseche el sobrenadante.
- Resuspender las células co-etiquetadas (5 x 104) en 500 l de matriz de membrana de sótano/medio de hielo (1:1) y transferirlas a un cultivo de prostasfera 3D (descrito en la sección 3.1) durante 5 días para permitir que BrdU y CFSE o Far Red se laven durante la formación de esferoides (ciclos de células de 6).
- Realizar la detección de células retenedoras de etiquetas en esferas (prostaesferas del día 5) como se describe en los pasos 4.1, 4.2, 4.3 o 5.
NOTA: El éster de succinimidil de diacetato de carboxifluoresceína (CFSE) y el far rojo son pro-disteos fluorescentes de larga duración y están bien retenidos dentro de las células etiquetadas. La esterasa intracelular en células vivas separa los grupos de acetato que activan las moléculas fluorescentes verdes o rojas que ahora son impermeant de membrana.
3. Formación de prostasfera en el sistema de cultivo de membrana de sótano 3D
-
Cultivo prostasphere en el sistema de matriz de membrana de sótano 3D
- Descongelar la matriz de membrana del sótano a 4oC durante la noche y mantener la temperatura de hielo antes de su uso.
- Agregue suavemente 1 ml de matriz de membrana de sótano helada en un volumen igual del medio de cultivo helado-frío. Mezcle lentamente pipeteando hacia arriba y hacia abajo, evitando burbujas.
NOTA: Recubra previamente la parte inferior de 12 pozos de matrícula de pozos con 100 ml de esta solución. Esto minimizará el número de celdas que caen a través de la matriz y crecen como una monocapa. - Resuspenda 5 x 104 células HPrEC en mezcla de matriz/media de membrana de sótano en frío (1:1) en un volumen total de 500 l.
- Pipetear 500 l de esta solución celular alrededor del borde inferior de cada poca.
- Gire la placa para distribuir uniformemente la mezcla alrededor del borde del pozo. Coloque la placa en una incubadora de CO2 a 37 oC durante 30 minutos para permitir que la matriz se solidifique.
- Una vez que la matriz se haya solidificado, cubrir con 1 ml de medio de cultivo cálido por pocido. No moleste el anillo de matriz de membrana del sótano. Apunte con cuidado la punta de la pipeta y dispensar el medio de cultivo hasta el centro del pozo.
NOTA: El medio de cultivo debe calentarse a 37 oC cuando se añade a la matriz de membrana del sótano solidificada. La matriz de membrana del sótano perderá su integridad y se disolverá cuando se expone a medios fríos/fríos. - Reponer medio cada 2 días. Aspirar con cuidado 500 s de medio gastado y añadir 500 ml de medio de cultivo fresco y cálido.
- Supervise la formación y el crecimiento de la prostasfera durante 5-7 días utilizando un microscopio invertido.
-
Paso de prostaesferas
- Cosecha prostaesferas de la matriz aspirando cuidadosamente tantos medios como sea posible. Evite molestar o recoger piezas flotantes de la matriz solidificada.
- Añadir 1 ml de solución de dosificación (matriz de membrana de sótano:dispase en una proporción de 1:2). Mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces.
- Incubar las placas de cultivo en una incubadora de CO2 a 37oC durante 30 min.
- Tome imágenes de prostaesferas que se encuentran en la parte inferior del plato de cultivo para el recuento de números de esfera y mediciones de tamaño.
- Recoger la mezcla de esfera en un tubo de 15 ml. Centrifugar la suspensión a 500 x g durante 5 min a RT para peletizar las esferas. Aspira y descarta el sobrenadante.
- Disperse las esferas en células individuales digiriendo con 500 ml de trippsina/EDTA caliente 0,05% y transfiriendo la suspensión a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Incubar el tubo de microcentrífuga en una incubadora de CO2 a 37oC durante 5 min.
- Detenga la acción de la trippsina con 500 ml de PBS caliente que contiene 10% FBS. Pase la suspensión de la esfera digerida a través de una jeringa de 1 ml con una aguja de 26 G 5x para disociar las esferas en células individuales.
- Centrifugar la suspensión a 500 x g durante 5 min para peletizar las células en RT. Aspirar el sobrenadante y desechar.
- Resuspenda el pellet celular en 1 ml de medio de cultivo cálido y filtre a través de un colador de células de nylon de tamaño de poro de 40 m.
- Centrifugar la suspensión celular a 500 x g durante 5 min para peletizar las células en RT. Aspirar y desechar el sobrenadante.
- Resuspender el pellet celular en 1 ml de matriz de membrana de sótano (1:1) y medio de cultivo y subcultivo en una matriz de membrana de sótano 3D para el segundo paso de la prostaesfera.
4. Identificación de células madre prostáticas retenedoras de BrdU por tinción inmunofluorescente
- Superar las prostaesferas unidas seguidas de la tinción inmunofluorescente (IF) para la toma de imágenes 2D de células madre prostáticas.
- Cosecha las prostaesferas por disección de digestión como se describe en los pasos 3.2.1–3.2.3. Centrifugar las esferas en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml a 500 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante.
- Resuspender esferas en 1 ml de medio de cultivo cálido.
- Incubar 50 prostaesferas por pozo en 8 toboganes de cámara de pozos en 200 oL de medio de cultivo en una incubadora de 37 oC durante la noche para permitir la fijación y el crecimiento de las esferas.
- En el día 2, aspirar y descartar el medio de cultivo. Lave las esferas de superficie cubierta con 200 ml de PBS durante 5 min.
- Fijar las esferas en 200 l/pozo de metanol helado a -20 oC durante 20 min.
- Lave las esferas con 200 l/bien de PBS durante 5 min.
- Esferas de lavado ácido con 200 l/pozo de 2N HCl durante 30 min a RT.
- Lavar las esferas con 200 l/pozo de PBS durante 5 min. Repetir 3x.
- Añadir 100 l de solución de bloqueo que contenga un 5% de suero de cabra normal en PBST (PBS con 0,25% De Tritón X-100) e incubar durante 30 min a RT.
- Aspirar la solución de bloqueo y añadir 100 ml de PBST que contenga un 2% de suero de cabra normal y anticuerpo santi-humano de ratón primario BrdU (1:200) a cada pocal e incubar en una caja humidificada a 4oC durante la noche.
NOTA: El anticuerpo Mouse IgG se utiliza como control negativo. - Aspirar y eliminar la solución de anticuerpos primarios. Lave las esferas con 200 s de PBS durante 5 min.
- Añadir 100 l de PBST que contenga un 2% de suero de cabra normal y un anticuerpo secundario de cabra Alexa Fluor 488 (1: 500) a cada pocal e incubar a RT en la oscuridad durante 2 horas.
- Aspirar y eliminar la solución secundaria de anticuerpos. Lave las esferas con 200 s de PBS durante 5 min.
- Montar los portaobjetos con un medio de montaje acuoso de 25-40 ml que contenga DAPI.
- Obtenga imágenes de las esferas/células manchadas con un microscopio fluorescente y una cámara digital a color.
- Tinción IF de montaje completo de prostaesferas para imágenes 3D de células madre prostáticas
NOTA: Para la tinción IF de montaje completo, las prostaesferas se manipulan con tubos de microcentrífuga de 1,5 ml.- Cosecha las prostaesferas desprendela la digestión como se describe en los pasos 3.2.1–3.2.3. Centrifugar las esferas en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml a 500 x g durante 5 min. Aspirar el sobrenadante y desechar.
- Resuspenda y fije las esferas con 1 mL de 4% de paraformaldehído en RT durante 20 minutos. Centrifugar las esferas a 500 x g durante 5 min. Aspirar el sobrenadante y descartar.
- Lavar las esferas mediante la resuspending el pellet en 1 mL de PBS. Centrifugar las esferas a 500 x g durante 5 min. Aspirar el sobrenadante y desechar. Repita 1x.
- Lavar las esferas mediante la resuspending el pellet en 1 mL de 2N HCl durante 30 min.
- Lave las esferas con 1 ml de PBS durante 5 min y centrífuga a 500 x g durante 5 min. Apiratee el sobrenadante y deseche. Repita 3x.
- Resuspenda las esferas de 15 a 30 oS en 100 ml de solución de bloqueo que contenga un 5% de suero de cabra normal en PBST (PBS con 0,25% de Tritón X-100) e incubar durante 30 minutos a RT.
- Para eliminar la solución de bloqueo, centrifugar las esferas a 500 x g durante 5 min. Aspirar y desechar el sobrenadante.
- Resuspenda las esferas en 100 oL de PBST que contenga un 2% de suero de cabra normal y anticuerpos brdU antihumanos de ratón primario (1:200) e incuban a 4 oC durante la noche.
- Lavar las esferas mediante la resuspending el pellet en 1 mL de PBS. Centrifugar las esferas a 500 x g durante 5 min. Aspirar el sobrenadante y desechar. Repita 1x.
- Resuspenda las esferas en 100 ml de PBST que contengan un 2% de suero normal de cabra y un anticuerpo antiratón secundario Alexa Fluor 488 (1:1.000) e incuban a RT durante 2 horas.
- Lavar las esferas mediante la resuspending el pellet en 1 mL de PBS. Centrifugar las esferas a 500 x g durante 5 min. Aspirar el sobrenadante y desechar. Repita 1x.
- Resuspenda las esferas en 30–50 ml de medio de montaje acuoso que contenga DAPI. Para evitar aplanar las esferas, dispensarlas en un pozo creado a partir de un plato de cultivo sin recubrimiento de 35 mm con un fondo de vidrio de cubierta. A continuación, agregue una cubierta al plato de cultivo, cubriendo el pozo.
- Adquiera imágenes de la pila Z de esfera completa utilizando un microscopio fluorescente confocal invertido de luz transmitida. Convierta estas imágenes de pila Z en imágenes 3D utilizando un software de imágenes con capacidades de dibujo de forma libre.
NOTA: El anticuerpo Mouse IgG se utiliza como control negativo.
- Análisis de células emparejadas (protocolo de 4 días)
- Cultura de las esferas etiquetadas por BrdU hasta el Día 5.
- Día 1: Cosecha las esferas de una matriz de membrana del sótano con 1 ml de digestión dispase. Disperse en células individuales en 500 ml de trippsina/EDTA caliente al 0,05% en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, como se describe en los pasos 3.2.1–3.2.11.
- Resuspender las células en 1 ml de medio de cultivo cálido.
- Placa las células individuales dispersas (300–500 por pozo) en 8 diapositivas de cámara de pozos y cultivo en medio de cultivo de 200 ol/pozo durante la noche para permitir la fijación.
- Día 2: Cambiar el medio de cultivo con 200 ml de citochalasina D de 2 m en el medio de cultivo e incubar durante la noche a 37 oC para permitir una división celular que se detiene a finales de la metafase a la anafase.
- Día 3–4: Aspira y descarta el medio. Fijar las células en 200 l/pozo de metanol helado a -20 oC durante 20 minutos. Siga el protocolo de inmunomanchación para BrdU como se describe en los pasos 4.1.5–4.1.14.
- Tome imágenes de células emparejadas con un microscopio de fluorescencia. Asegúrese de que la distancia entre los dos núcleos sea inferior a 30 m. Basándose en la retención de BrdU, identifique las células madre emparejadas como sometidas a división de células simétricas o asimétricas.
NOTA: Las células madre prostáticas que retienen etiquetas brdU se someten a una división simétrica para dar lugar a dos células madre hijas que conservan una cantidad igual de BrdU, mientras que las células madre sometidas a división asimétrica dan lugar a una célula madre hija que retiene todo el Brdu y el otra célula progenitora hija que ha perdido la etiqueta BrdU.
5. Aislamiento de las células madre prostáticas que retienen la etiqueta CFSE por clasificación FACS
- Día 5: Cosecha de las prostáferas 5 de día con la etiqueta CFSE que crecen en 6 placas de cultivo de pozos en cultivo 3D reemplazando el medio por 2 ml de dispensa (matriz de membrana de sótano: dispensar en una proporción de 1:2). Pipetear hacia arriba y hacia abajo varias veces para mezclar a fondo.
- Incubar las placas en una incubadora de CO2 a 37oC durante 30 min para digerir la matriz.
- Recoger la mezcla de esfera en un tubo centrífugo de 15 ml. Centrifugar las esferas a 500 x g durante 5 min en RT. Aspirar el sobrenadante y desechar.
- Resuspenda el gránulo de la esfera en 500 ml de trippsina/EDTA caliente al 0,05%, y transfiera a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Incubar las esferas en una incubadora de CO2 a 37 oC durante 5 min. Añadir 500 s de PBS caliente que contenga 10% FBS.
- Pase las esferas a través de una jeringa de 1 ml con una aguja de 26 G 5x para disociar completamente las esferas en células individuales.
- Centrifugar las células a 500 x g durante 5 min en RT. Aspirar y desechar el sobrenadante.
- Resuspenda las células en 1 ml de medio de cultivo cálido que contenga 1 g/ml de yoduro de propidio (PI) para manchar las células muertas. Incubar durante 1 min a RT.
- Centrifugar las células a 500 x g durante 5 min en RT. Aspirar y desechar el sobrenadante.
- Resuspender las células en 1 ml de medio de cultivo cálido. Centrifugar las células a 500 x g durante 5 min en RT. Aspirar y desechar el sobrenadante.
- Resuspende las células en un medio de cultivo cálido de 500 ml y recoge las células en tubos inferiores redondos de poliestireno de 5 ml fildándolas a través de tapas de colador de células de tamaño de poro de 35 m.
- Realice el análisis de células de prostáfera con marca CFSE dispersa con tripasina con un analizador FACS de un solo canal.
- Atraviese las subpoblaciones de las células FRaccionadas CFSEHi, CFSEMedy CFSELo. Utilice los controles negativos y positivos para el gating.
NOTA: La presencia de células madre prostáticas de retención de etiquetas CFSE ordenadas por FACS (ver Hu et al.13) puede confirmarse mediante microscopía de fluorescencia verde y su mayor tamaño celular en comparación con las células que no retienen. Este tamaño celular más grande es una propiedad de las células madre prostáticas en relación con las poblaciones de células progenitoras. Esto puede ser diferente con otros tipos de tejido.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Las células epiteliales humanas normales primarias se colocan en platos de cultivo recubiertos de fibronectina y el crecimiento celular se mantiene en el cultivo 2D(Figura 1a). Tras la transferencia al cultivo 3D con una matriz de membrana de sótano, las células epiteliales diferenciadas mueren lentamente. Sólo las células madre de próstata pueden sobrevivir en un cultivo libre de anclas y formar esferoides en 5 días(Figura 1b).
El etiquetado dual de células epiteliales prostáticas en cultivo 2D seguido de formación de esferoides en el cultivo 3D indica la colocación de BrdU, CFSE y Far Red en las mismas células que retienen etiquetas(Figura 2a-i).
Las células que retienen etiquetas muestran las características de las células madre en los esferoides del Día 5. La inmunomanchadual muestra que las células retenedoras de etiquetas presentan niveles más bajos de proteína de citoqueratina KRT14; disminución de la proteína de unión celular E-cadherina14; aumento de las proteínas marcadoras tempranas de células madre Wnt10B13,15,16 y ALDH1A1; aumento de la proteína de autofagia LC3, un indicador de la actividad del flujo de autofagia17; y aumento del IIB de la miosina(Figura 3a-f).
Un ensayo de retención de etiquetas basado en esferoides también detecta con éxito células cancerosas similares a madres en muestras de cáncer de próstata(Figura 4). Esto permitirá el descubrimiento de verdaderos biomarcadores para células similares a los tallos de cáncer y tiene el potencial de identificar nuevas dianas terapéuticas para el cáncer de próstata.
Figura 1: Mantenimiento de HPrEC en cultivo 2D y formación de esferoides en cultivo 3D. (a) Un cultivo primario 2D de HPrEC fue etiquetado por BrdU y transferido al cultivo 3D con formación de prostasfera el día 5 (b). Barras de escala a 400 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Identificación de células retenedoras de etiquetas a largo plazo en prostaesferas primarias. Etiquetado doble de BrdU (rojo) y CFSE (verde); CFSE (verde) y rojo lejano (rojo); BrdU (verde) y rojo lejano (rojo) identificaron las mismas células similares a los tallos con retención del ADN parental. Las etiquetas BrdU, CFSE o Far Red en células progenitoras que se dividen rápidamente (DAPI, azul) se diluyeron y se perdieron (a-i). Las imágenes representativas muestran el coetiquetado BrdU/CFSE (a-c), CFSE/Far Red (d-f) (panel medio) y BrdU/Far Red (g-i) (panel inferior) en células de una sola prostasfera (PS). Barras de escala de 50 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Células PS que retienen etiquetas que exhiben propiedades de células madre. En comparación con las células progenitoras que no retienen etiquetas, las células madre retenedoras de etiquetas BrdU o CFSE presentan(a ) niveles más bajos de citoqueratina 14 (KRT 14), (b) disminución de los niveles de E-cadherin, (c) niveles elevados de Wnt10B, (d) niveles más altos de ALDH1A1, (e) aumento de lc3, y( f) aumento de las proteínas miosini. Barras de escala de 50 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Uso del ensayo de retención de etiquetas basado en esferas para la identificación de células similares a los tallos de cáncer. CFSE células similares a un cáncer de etiqueta de cfSE en esferoides derivados de muestras de cáncer de próstata humano exhibieron una proteína e-cadherina reducida en relación con las células progenitoras no etiquetadas. Barras de escala de 50 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La citometría de flujo utilizando múltiples marcadores de superficie de células madre es un enfoque comúnmente utilizado para la investigación de células madre a pesar de carecer de especificidad y selectividad1,5,6. Mientras que la formación de esferoides en un sistema de cultivo 3D es otro método útil para enriquecer la población rara de células madre de células epiteliales primarias, incluyendo HPrEC, los esferoides resultantes siguen siendo una mezcla heterogénea de células madre y progenitoras2,3,4. En las prostaesferas, en comparación con las células progenitoras que proliferan rápidamente, el carácter relativamente inactivo de las células madre permite identificarlas mediante el ensayo de retención de etiquetas a largo plazo.
Los métodos resumidos en este documento describen el etiquetado de HPrEC utilizando BrdU, CFSE y/o Far Red pro-dyes13. Mientras que brdU, CFSE y/o Pro-distes de Far Red en células que proliferan rápidamente se diluyen rápidamente por cada división celular, hay un mecanismo adicional que explica la pérdida de BrdU conocida como segregación de ADN de cadena inmortal11. Esto es cuando la célula madre se somete a una división asimétrica, dando lugar a una célula madre hija y una célula progenitora. La célula madre hija conserva todo el ADN parental antiguo con la etiqueta BrdU, mientras que la célula progenitora hija recibe el ADN recién sintetizado sin la etiqueta BrdU. Por lo tanto, un ensayo de retención de etiquetas con BrdU permite una identificación más clara y sencilla de las células madre que retienen etiquetas mediante tinción inmunofluorescente. Esto es especialmente útil para confirmar biomarcadores de células madre mediante la doble tinción IF utilizando dos anticuerpos diferentes. Una limitación importante del etiquetado BrdU es que las células deben fijarse para la tinción IF, evitando así más estudios funcionales después del etiquetado BrdU y la fijación celular.
Para resolver este problema, dos pro-tejefluorescentes para el etiquetado HPrEC en vivo se probaron en ensayos de retención de etiquetas. Los resultados indicaron que había una superposición completa de brdU, CFSE y Far Red etiquetadas como células esfera. La etiqueta BrdU podría sustituirse por CFSE o Far Red en ensayos de retención de etiquetas basados en esferas para permitir la visualización de células vivas para la toma de imágenes y la separación por FACS, promoviendo la caracterización funcional de células madre vivas aisladas utilizando ensayos de cultivo celular in vitro y ensayos de xenoinjerto in vivo13. CFSE o Far Red en etiquetas FS clasificadas células vivas madre y progenitoras también podrían utilizarse para ARN-seq incluyendo ARN-seq de célulaúnica, que es muy poderoso en la identificación de nuevos marcadores genéticos de células madre y vías de señalización, así como la jerarquía de linaje de células epiteliales.
El novedoso método libre de biomarcadores de caracterización funcional de células madre mediante un ensayo de retención de etiquetas basado en esferoides presentado aquí puede identificar células similares a los tallos de cáncer a partir de muestras de pacientes primarios y líneas celulares cancerosas. Por lo tanto, proporciona una vía para descubrir nuevos biomarcadores de células similares a los tallos del cáncer y el desarrollo de terapias eficaces dirigidas al cáncer13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen relaciones financieras que revelar.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por subvenciones del Instituto Nacional del Cáncer R01-CA172220 (GSP, WYH), R01-ES02207 (GSP, WYH). Agradecemos al Núcleo de Citometría de Flow de la Universidad de Illinois en Chicago por su ayuda en la clasificación de células.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| 1 mL tuberculin syringes | Bectin Dickinson | BD 309625 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes, sterile | |||
| 100 mm culture dishes | Corning/Falcon | 353003 | |
| 12-well culture plate | Corning/Falcon | 353043 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Corning/Falcon | 352097 | |
| 22 x 22 mm coverslips, sq | Corning | 284522 | For MatTek 35 mm culture dish |
| 24 x 50 mm coverslips | Corning | 2975245 | |
| 26G x 1.5 inch hypodermic needle | Monoject | 1188826112 | |
| 2N HCl | |||
| 35 mm culture dish with cover glass bottom | MatTek Corp | P35G-0-10-C | Glass bottom No. 0, uncoated,  irradiated |
| 40 µm pore nylon cell strainer | Corning | 352340 | |
| 5% CO2 culture incubator, 37 °C | Forma | ||
| 50 mL centrifuge tubes | Corning/Falcon | 352098 | |
| 5mL Polystyrene Round-Bottom Tube with strainer snap cap | Corning | 352235 | 35 µm nylon mesh |
| 6-well culture plates | Corning | 353046 | |
| 8-well chamber slides | Millipore Sigma | PEZGS0816 | |
| Aqueous mounting medium containing DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | A nuclear fluorescent dye |
| Biological safety cabinet, Level 2 certified | |||
| BrdU (5-bromo-2’-deoxyuridine) | Sigma-Aldrich | B5002 | 1 mM stock solution in DMSO |
| Centrifuge for 1.5 mL microcentrifuge tubes | Eppendorf | ||
| Centrifuge for 15 mL tubes | Beckman Coulter | Allegra 6 | |
| CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl ester) | Thermo Fisher Scientific | C34554 | 5 mM stock solution in DMSO |
| cytochalasin D | Thermo Fisher Scientific | PHZ1063 | |
| Dispase 1U/mL | StemCell Technologies | 07923 | |
| FACS CellSorter MoFlo XDP | Beckman Coulter | s | |
| Far-Red pro-dye | Thermo Fisher | C34564 | 5 mM stock solution in DMSO |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | |||
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895 | For coating 100 mm culture dishes |
| Fluorescent microscope with color digital camera | Carl Zeiss | Axioskop 20 fluorescent microscope; color digital Axiocamera | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A-11029 | |
| HPrEC (Primary normal human prostate epithelial cells) | Lifeline Cell Technology | FC-0038 | Pooled from 3 young (19-21yr od) disease-free organ donors; 1 x 105 cells/mL; stored in liquid nitrogen |
| ice bucket and ice | |||
| Inverted microsope with digital camera | |||
| Matrigel, low growth factor, phenol-red free | Corning | 356239 | |
| Methanol | Corning | A452-4 | |
| Mouse anti-BrdU antibody | Cell Signaling | 5292S | |
| Mouse IgG antibody (negative control) | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | |
| Normal goat serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
| Pipettors and tips, various sizes | |||
| PrEGM (ProstaLife Epithelial Cell Growth Medium) | Lifeline Cell Technology | LL-0041 | |
| Propidium Iodide (PI) | R & D Systems | 5135/10 | 10 μg/mL PI in PBS stored at 4 °C in the dark |
| Serological pipets, various sizes | |||
| Software for sphere counting and size measurements | |||
| Software: 3D images using Imaris an imageing software with freeform drawing capabilities | |||
| Triton X-100 | Millipore Sigma | T8787 | |
| Water bath, 37 °C | |||
| z-stack images using a transmitted light inverted fluorescent confocal microscope |
References
- Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. Generation of a prostate from a single cell. Nature. 456, 804-808 (2008).
- Xin, L., Lukacs, R. U., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. Self-renewal and multilineage differentiation in vitro from murine prostate stem cells. Stem Cells. 25, 2760-2769 (2007).
- Hu, W. Y., et al. Estrogen-initiated transformation of prostate epithelium derived from normal human prostate stem-progenitor cells. Endocrinology. 152, 2150-2163 (2011).
- Hu, W. Y., Shi, G. B., Hu, D. P., Nelles, J. L., Prins, G. S. Actions of endocrine disrupting chemicals on human prostate stem/progenitor cells and prostate cancer risk. Molecular and Cellular Endocrinology. 354, 63-73 (2012).
- Collins, A. T., Berry, P. A., Hyde, C., Stower, M. J., Maitland, N. J. Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells. Cancer Research. 65, 10946-10951 (2005).
- Vander Griend, D. J., et al. The role of CD133 in normal human prostate stem cells and malignant cancer-initiating cells. Cancer Research. 68, 9703-9711 (2008).
- Wang, J., et al. Symmetrical and asymmetrical division analysis provides evidence for a hierarchy of prostate epithelial cell lineages. Nature Communications. 5, 4758 (2014).
- Neumuller, R. A., Knoblich, J. A. Dividing cellular asymmetry: asymmetric cell division and its implications for stem cells and cancer. Genes and Development. 23, 2675-2699 (2009).
- Cicalese, A., et al. The tumor suppressor p53 regulates polarity of self-renewing divisions in mammary stem cells. Cell. 138, 1083-1095 (2009).
- Klein, A. M., Simons, B. D. Universal patterns of stem cell fate in cycling adult tissues. Development. 138, 3103-3111 (2011).
- Cairns, J. Mutation selection and the natural history of cancer. Nature. 255, 197-200 (1975).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159, 163-175 (2014).
- Hu, W. Y., et al. Isolation and functional interrogation of adult human prostate epithelial cells at single cell resolution. Stem Cell Research. 23, 1-12 (2017).
- Bryant, D. M., Stow, J. L. The ins and outs of E-cadherin trafficking. Trends in Cell Biology. 14, 427-434 (2004).
- Clevers, H., Loh, K. M., Nusse, R. Stem cell signaling. An integral program for tissue renewal and regeneration: Wnt signaling and stem cell control. Science. 346, 1248012 (2014).
- Madueke, I., et al. The role of WNT10B in normal prostate gland development and prostate cancer. The Prostate. 79 (14), 1692-1704 (2019).
- Guan, J. L., et al. Autophagy in stem cells. Autophagy. 9, 830-849 (2013).
