Summary
Med hjälp av mänskliga primära prostataepitelceller, rapporterar vi en ny biomarker-fri metod för funktionell karakterisering av stamceller med en sfäroid-baserade etikett-retention assay. Ett steg-för-steg-protokoll beskrivs för BrdU, CFSE eller långt röd 2D-cellmärkning; tredimensionell sfäroid formation; etikett-behålla Stem-liknande cell identifiering av immunocytochemistry; och isolering av FACS.
Abstract
Trots framsteg inom forskning om adulta stamceller är identifiering och isolering av stamceller från vävnadsprov fortfarande en stor utmaning. Medan inhemska stamceller är relativt quiescent med nisch begränsningar i vuxna vävnader, de går in i cellcykeln i ankare-fri tredimensionell (3D) kultur och genomgår både symmetriska och asymmetriska celldelning, vilket ger upphov till både Stem och stamcells Celler. Den senare sprider sig snabbt och är den stora cellpopulationen i olika stadier av härstamnings åtagande, som bildar heterogena spheroids. Med hjälp av primära normala mänskliga prostataepitelceller (HPrEC), en spheroid-baserade, etikett-retention assay utvecklades som möjliggör identifiering och funktionell isolering av sfäroid-initiera stamceller vid en enda cell upplösning.
HPrEC eller cellinjer är två-dimensionellt (2D) odlade med BrdU i 10 dagar för att tillåta dess införlivande i DNA av alla delnings celler, inklusive självförnyande stamceller. Tvätta ur inleds vid överföring till 3D-kulturen i 5 dagar, under vilken stamceller själv förnya genom asymmetrisk Division och initiera sfäroid formation. Medan relativt quiescent dotter stamceller behåller BrdU-märkt föräldra-DNA, dotter föräldraparets snabbt förökat, förlorar BrdU etiketten. BrdU kan ersättas med CFSE eller långt rött Pro-färgämnen, som tillåter levande stamcells isolering av FACS. Stamcells egenskaper bekräftas av in vitro-sfäroid formation, in vivo vävnad förnyelse analyser, och genom att dokumentera deras symmetriska/asymmetriska cell divisioner. Den isolerade etikett-behålla stamceller kan noggrant förhöras av nedströms molekylära och biologiska studier, inklusive RNA-SEQ, ChIP-SEQ, Single cell Capture, metabolisk aktivitet, proteomet profilering, immunocytokemi, Organoid formation, och in vivo vävnad förnyelse. Viktigt, denna markör-fri funktionell stamcells isolering metod identifierar Stem-liknande celler från färska cancer preparat och cancer cellinjer från flera organ, vilket tyder på bred tillämplighet. Det kan användas för att identifiera cancer Stem-liknande cell biomarkörer, Screen Pharmaceuticals inriktning cancer Stem-liknande celler, och upptäcka nya terapeutiska mål i cancer.
Introduction
Den mänskliga prostatakörteln innehåller luminala epitel med sekretoriska funktion och basal celler underliggande det tillsammans med en ovanlig neuroendokrina cell komponent. De epitelceller, i detta fall, genereras från en sällsynt population av prostata stamceller som är relativt quiescent in vivo och fungera som ett reparationssystem för att upprätthålla körtel homeostas hela livet1. Trots många framsteg är identifieringen och funktionell isolering av prostata stamceller fortfarande en stor utmaning på området. Stamcells biomarkörer, inklusive cellytmarkeringsbaserade metoder kombinerat med flödescytometri används ofta för stamcellsforskning2,3,4. Resultaten för berikning och isolering varierar dock mycket som en funktion av markör kombinationer och antikropps specificitet5,6, vilket väcker frågor om de isolerade cellernas identitet. En annan allmänt använd metod för stamliknande cell berikning är tredimensionell (3D) sfäroid kultur2,3,4. Medan inhemska stamceller är relativt quiescent in vivo med nisch begränsningar, de genomgår celldelning i 3D Matrix kultur (både symmetriska och asymmetriska), genererar både stamceller och progenitorceller som snabbt föröka sig mot härstamnings åtagandet7,8. De bildade sfäoiderna är en heterogen blandning som innehåller både stamceller och progenitorceller i olika stadier av härstamnings åtagande, inklusive tidiga och sena Stadium stamceller. Således, analyser med hjälp av hela spheroids är inte stamcells exklusiva, vilket gör identifieringen av unika stamceller egenskaper ofullständiga. Därför är det viktigt att skapa analyser för att identifiera och separera stamceller från deras dotter progenitorer. I detta syfte är målet med det nuvarande protokollet att upprätta ett analyssystem som möjliggör effektiv identifiering och isolering av stamceller från mänskliga prostata vävnader följt av en robust analys av deras biologiska funktioner i senare led.
Långsiktig 5-Bromo-2 '-deoxyuridine (BrdU) etikett-retention används ofta för in vivo och in vitro-linjen spårning av stamceller baserat på deras förlängda fördubblings tid9,10. Den nuvarande metoden för identifiering och isolering av prostata stamceller är baserad på deras relativa quiescent karakteristiska och etikett-retention egenskaper inom en blandad epitelial population. Dessutom, baserat på den odödliga strand DNA-hypotesen, kan endast stamceller genomgå asymmetrisk celldelning. Stamcellen representerar den dotter cell som innehåller den äldre föräldra-DNA medan stamcells cellen, som är en engagerad dotter cell, tar emot den nyligen syntetiserade DNA. Den unika stamcells egendom som beskrivs ovan utnyttjas för att utföra BrdU märkning i föräldra stamceller i primära kulturer och sedan spåra deras etikett efter BrdU-washout vid överföring till 3D ankare-fri sfäroid kultur. Medan majoriteten av primära prostata epitelceller behålla en basal och transit förstärkning fenotyp i 2D-kultur, det finns också en sällsynt population av multipotenta stamceller påfyllning och bibehålla epitelial homeostas som framgår av bildandet av sfätrooider eller helt differentierade organoider med motsvarande kultur media vid överföring till 3D-system3,12. I vårt nuvarande protokoll, genom att använda hprec prostata spheroids eller prostasphere-baserade BrdU, cfse, eller far Red retention analyser följt av fluorescens aktiverad cell sortering (FACS), identifierar vi etikett-behålla stamceller i spheroids på en enda cellnivå13.
Viktigt, vi bekräftade ytterligare stamcells egenskaperna hos etikett-behålla celler inom tidigt skede spheroids jämfört med stamceller med härstamning engagemang. Dessa inkluderar stamceller asymmetrisk Division, in vitro-sfäroid formation förmåga och in vivo vävnad regenereringskapacitet, förhöjd autofagi aktivitet, förstärkt ribosombiogenes och minskad metabolisk aktivitet. Därefter utfördes RNAseq-analys. Differentiellt uttryckt gener i etikett-behålla sfäroid celler observerades som kan fungera som nya biomarkörer för mänskliga prostata stamceller. Detta spheroid-baserade etikett-behålla tillvägagångssätt kan gälla för cancer preparat att på liknande sätt identifiera ett litet antal cancer Stem-liknande celler, vilket ger translationella möjligheter att hantera de terapeutiska resistenta populationer13. Presenteras nedan är prostasphere-baserade etikett-retention analys med hjälp av mänskliga primära prostataepitelceller (HPrEC) som ett exempel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla cell hanterings-och medie preparat ska utföras med aseptisk teknik i ett biologiskt säkerhetsskåp av klass II (BSC).
1. kultur och underhåll av HPrEC-celler i 2D
- Coat 100 mm kultur rätter med 2 ml 2,5 μg/cm2 Fibronektin lösning över natten vid rumstemperatur (RT). Aspirera på lösningen och låt kultur rätterna lufttorka i BSC för 45 min. fibronectin-belagda kultur rätter kan förvaras 2 – 4 veckor vid 4 ° c.
- Tillsätt 9 mL av prostatan epitelial cell growth medium (t. ex. PrEGM) till en fibronectin-belagd 100 mm kultur rätt och håll skålen varm i en CO2 inkubator vid 37 ° c.
- Tina en injektionsflaska med frysta HPrEC-celler (2 x 105/ml) i en 37 ° c vattenbad och Omsuspendera cellerna i 10 ml varmt medium.
- Centrifugera cellsuspensionen vid 500 x g i 5 minuter vid RT. Aspirera och Kassera supernatanten.
- Grundligt Omsuspendera cellerna i 1 mL av det varma odlingsmediet. Frö celler genom att Pipettera 1 mL av cellsuspensionen direkt i den fibronectin-belagda 100 mm-kulturskålen som innehåller 9 mL av det förvärmda mediet (den totala volymen av medel och celler är 10 mL). Placera kultur rätter tillbaka i en CO2 inkubator vid 37 ° c.
- Fyll på mediet var 2 dagar. För att göra det, aspirera försiktigt alla medier och tillsätt 10 mL färskt varmt medium.
- I ca 5 dagar, se till att kulturerna är ~ 70-80% confluent. Utför enzymatisk nedbrytning genom inkuberande cellerna med 3 mL 0,05% trypsin/EDTA vid 37 ° c i 5 min.
- Stoppa matsmältningen genom att tillsätta 3 mL varm PBS som innehåller 10% FBS.
- Samla in cellerna i ett 50 mL centrifugrör och centrifugera vid 500 x g i 5 minuter vid RT. Aspirera och Kassera supernatanten.
- Omsuspendera cellpelleten i 30 mL varmt medium och fördela den jämnt i tre nya fibronectin-belagda 100 mm kultur rätter för nästa passage.
Anmärkning: primära hprec-celler kan vara blint ~ 3 – 5x utan att ändra deras basala epitelcell egenskaper. Epitelial fenotyp testas genom uttryck av basal epitelceller markörer cytokeratin 5 och p63 med immunocytokemi/immunofluorescent (ICC/IF) analyser.
2. märkning HPrEC med BrdU, CFSE, eller far Red Pro-färgämnen
ANMÄRKNINGAR: cellerna kan fortsätta antingen till steg 2,1 eller steg 2,2 följt av överföringen till 3D prostasphere kultur som beskrivs i steg 3,1.
-
Enkel märkning av celler med BrdU
- Culture 2 x 105 hprec-celler i fibronectin-belagda 100 mm kultur rätter med 10 ml varmt medium innehållande 1 ΜM BrdU. Odla cellerna i 10 dagar (över två passager) för att säkerställa märkning av alla celler inklusive prostata stam och stamceller.
- Efter 10 dagar, försiktigt aspirera PrEGM medium som innehåller BrdU och tvätta cellerna med 5 mL varm PBS. Upprepa 1x.
- Utför enzymatisk nedbrytning med 0,05% trypsin/EDTA enligt beskrivningen i steg 1.7 – 1.8. Centrifugera cellerna vid 500 x g i 5 minuter vid RT. Aspirera och Kassera supernatanten.
- Omsuspendera de BrdU-märkta pelleterade cellerna (5 x 104) i 500 μl av iskalla (1:1) basalmembran Matrix/medium och överför till en 3D prostasphere kultur (beskrivs i steg 3,1) i 5 dagar för att tillåta BrdU blekt under sfäroid formation (~ 6 cell cykler).
-
Dubbel märkning av celler med BrdU och CFSE eller far Red Pro-färgämnen
- Om Co-märkning för levande celler önskas, ta förmärkta celler inkuberas med BrdU i 10 dagar från steg 2,1 och co-Label med 5 μM CFSE eller far Red Live cell fluorescerande Pro-färgämnen för 30 min. utföra Co-märkning på dag 10.
- Försiktigt aspirera mediet som innehåller BrdU och CFSE eller långt röda Pro-färgämnen. Tvätta cellerna med 5 mL varm PBS. Upprepa tvätten 1x.
- Utför enzymatisk nedbrytning med 0,05% trypsin/EDTA enligt beskrivningen i steg 1.7 – 1.8. Centrifugera cellerna vid 500 x g i 5 minuter vid RT. ta bort och Kassera supernatanten.
- Omsuspendera de Co-märkta cellerna (5 x 104) i 500 μl av iskalla (1:1) basalmembran matris/medium och överföra till en 3D prostasphere kultur (beskrivs i avsnitt 3,1) för 5 dagar för att tillåta BrdU och cfse eller långt rött blekt under sfäroid bildas (~ 6 cell cykler).
- Utför detektering av celler som behåller märkningen i sfärer (dag 5 prostaspheres) enligt beskrivningen i steg 4,1, 4,2, 4,3 eller 5.
Anmärkning: Karboxyfluorescein diacetat succinimidyl Ester (CFSE) och far Red är långvariga fluorescerande Pro-färgämnen och är väl bevarade inom de märkta cellerna. Intracellulära esteras i levande celler klyva de acetat grupper som aktiverar den gröna eller röda fluorescerande molekyler som nu membran impermenade.
3. prostasphere formation i 3D basalmembran kultur system
-
Prostasphere kultur i 3D basalmembran Matrix system
- Tina basalmembranet matrisen vid 4 ° c över natten och hålla på isen före användning.
- Tillsätt försiktigt 1 mL iskall basalmembran matris till en lika stor volym av det iskalla odlingsmediet. Blanda långsamt genom att Pipettera upp och ner, undvika bubblor.
Anmärkning: pre-Coat botten av 12 well kultur plattan brunnar med 100 μL av denna lösning. Detta kommer att minimera antalet celler som faller genom matrisen och växa som en monolayer. - Omsuspendera 5 x 104 hprec celler i iskallt (1:1) basalmembran Matrix/Culture medium mix i en total volym av 500 μl.
- Pipettera 500 μL av denna cell lösning runt nedre kanten av varje brunn.
- Snurra plattan för att jämnt fördela blandningen runt kanten av brunnen. Placera plattan i en CO2 inkubator vid 37 ° c i 30 minuter så att matrisen kan stelna.
- När matrisen har stelnat, täck med 1 mL varm odlingssubstrat per brunn. Stör inte basalmembranet Matrix ring. Sikta försiktigt pipettspetsen och fördela odlingsmediet till mitten av brunnen.
Observera: odlingsmediet måste värmas till 37 ° c när det läggs till den stelnade basalmembranet matrisen. Basalmembranet matrisen kommer att förlora sin integritet och upplösas när den utsätts för kyla/kyla media. - Fyll på medium var 2: a dag. Aspirera försiktigt ~ 500 μL av använt medium och tillsätt 500 μL färskt varmt odlingssubstrat.
- Övervaka prostasphere bildning och tillväxt för 5 – 7 dagar med hjälp av ett inverterat Mikroskop.
-
Passaging av prostaspheres
- Skörda prostaspheres från matrisen genom att noggrant aspirera så mycket media som möjligt. Undvik att störa eller plocka upp flytande bitar av den stelnade matrisen.
- Tillsätt 1 ml dispas lösning (basalmembran matris: dispas vid en 1:2 ratio). Blanda noga genom att Pipettera upp och ner flera gånger.
- Inkubera kultur plattorna i en CO2 inkubator vid 37 ° c i 30 min.
- Ta bilder av prostaspheres som är på botten av kulturen skålen för sfär nummer räkning och mått storlek.
- Samla upp sfär blandningen i en 15 mL tub. Centrifugera fjädringen på 500 x g i 5 min vid RT för att pelleten av kulorna. Aspirera och Kassera supernatanten.
- Skingra sfärerna i enstaka celler genom att smälta med 500 μL varm 0,05% trypsin/EDTA och överföra suspensionen till ett 1,5 mL microcentrifugerör.
- Inkubera microcentrifugeröret i en CO2 inkubator vid 37 ° c i 5 min.
- Stoppa trypsin-åtgärden med 500 μL varm PBS som innehåller 10% FBS. Passera den smälta sfär suspensionen genom en 1 mL spruta med en 26 G nål 5x för att separera sfärerna i enskilda celler.
- Centrifugera suspensionen vid 500 x g i 5 min för att pelleten CELLERNA vid RT. aspirera på supernatanten och kassera.
- Omsuspendera cellpelleten i 1 mL varm odlingssubstrat och filtrera genom en 40 μm porstorlek nylon cell SIL.
- Centrifugera cellsuspensionen vid 500 x g i 5 min för att pelleten CELLERNA vid RT. Aspirera och Kassera supernatanten.
- Omsuspendera cellpelleten i 1 mL iskallt (1:1) basalmembran Matrix/kultur medium och subkultur i en 3D-basalmembran matris för den andra passagen av prostasphere.
4. identifiering av BrdU-behåller prostata stamceller genom Immunofluorescerande färgning
- Växa ur den bifogade prostaspheres följt av Immunofluorescerande (om) färgning för prostata stamcells 2D-avbildning.
- Skörd prostaspheres av dispas matsmältning som beskrivs i steg 3.2.1 – 3.2.3. Centrifugera sfärerna i ett 1,5 mL microcentrifugerör på 500 x g i 5 min. Kassera supernatanten.
- Omsuspendera sfärer i 1 mL varmt odlingssubstrat.
- Inkubera ~ 50 prostaspheres per brunn i 8 brunn kammare glider i 200 μL av kultur medium i en 37 ° c inkubator över natten för att möjliggöra kvarstad och utväxt av sfärer.
- På dag 2, aspirera och kassera odlingsmediet. Tvätta de utodlade sfärerna med 200 μL PBS i 5 minuter.
- Fixera sfärerna i 200 μL/brunn av iskall metanol vid-20 ° c i 20 min.
- Tvätta sfärerna med 200 μL/brunn av PBS i 5 min. Upprepa 2x.
- Syra tvätta sfärer med 200 μL/brunn av 2N HCl för 30 min vid RT.
- Tvätta sfärerna med 200 μL/brunn av PBS i 5 min. Upprepa 3x.
- Tillsätt 100 μL blockerande lösning som innehåller 5% normalt get serum i PBST (PBS med 0,25% Triton X-100) och inkubera i 30 minuter vid RT.
- Aspirera på den blockerande lösningen och tillsätt 100 μL av PBST innehållande 2% normalt get serum och primär mus anti-human BrdU-antikropp (1:200) till varje brunn och inkubera i en fuktad låda vid 4 ° c över natten.
Obs: mus-IgG-antikroppar används som en negativ kontroll. - Sug upp och ta bort den primära antikroppslösningen. Tvätta sfärerna med 200 μL PBS i 5 min. Upprepa 2x.
- Tillsätt 100 μL av PBST innehållande 2% normal get serum och sekundär get anti-Mouse Alexa fluor 488 antikropp (1:500) till varje brunn och inkubera vid RT i mörkret för 2 h.
- Sug upp och avlägsna den sekundära antikroppslösningen. Tvätta sfärerna med 200 μL PBS i 5 min. Upprepa 3x.
- Montera bilderna med ~ 25-40 μL vattenhaltiga monteringsmedel som innehåller DAPI.
- Få bilder av färgade sfärer/celler med ett fluorescerande Mikroskop och en färg digitalkamera.
- Hela fästet om färgning av prostaspheres för prostata stamcells 3D-avbildning
Anmärkning: för hela monteringen om färgning, prostaspheres hanteras med 1,5 mL microcentrifug rör.- Skörda prostaspheres genom dispas nedbrytning som beskrivs i steg 3.2.1 – 3.2.3. Centrifugera sfärerna i ett 1,5 mL microcentrifugerör på 500 x g i 5 min. aspirera på supernatanten och kassera.
- Omsuspendera och fixera sfärerna med 1 mL 4% PARAFORMALDEHYD vid RT under 20 min. Centrifugera sfärerna vid 500 x g i 5 min. aspirera på supernatanten och kassera.
- Tvätta sfärerna genom att omlägga pelleten i 1 mL PBS. Centrifugera sfärerna vid 500 x g i 5 min. aspirera på supernatanten och kassera. Upprepa 1x.
- Syra tvätta sfärerna genom att omlägga pelleten i 1 mL 2N HCl i 30 min.
- Tvätta sfärerna med 1 mL PBS i 5 min och centrifugera vid 500 x g i 5 min. Aspirera supernatanten och kassera. Upprepa 3x.
- Omsuspendera ~ 15 – 30 sfärer i 100 μL blockerande lösning innehållande 5% normalt get serum i PBST (PBS med 0,25% Triton X-100) och inkubera i 30 minuter vid RT.
- För att avlägsna blockeringslösningen, Centrifugera sfärerna vid 500 x g i 5 min. Aspirera och Kassera supernatanten.
- Omsuspendera sfärerna i 100 μL av PBST innehållande 2% normal get serum och primär mus anti-human BrdU-antikropp (1:200) och inkubera vid 4 ° c över natten.
- Tvätta sfärerna genom att omlägga pelleten i 1 mL PBS. Centrifugera sfärerna vid 500 x g i 5 min. aspirera på supernatanten och kassera. Upprepa 1x.
- Omsuspendera sfärerna i 100 μL av PBST innehållande 2% normal get serum och sekundär get anti-Mouse Alexa fluor 488 antikropp (1:1000) och inkubera vid RT för 2 h.
- Tvätta sfärerna genom att omlägga pelleten i 1 mL PBS. Centrifugera sfärerna vid 500 x g i 5 min. aspirera på supernatanten och kassera. Upprepa 1x.
- Omsuspendera sfärerna i 30 – 50 μL vattenhaltigt monteringsmedium som innehåller DAPI. För att förhindra att slätar ut sfärerna, fördela dem i en väl skapad från en 35 mm obestruket kultur skålen med en täckglas botten. Lägg sedan till en täckslip till kultur skålen, som täcker brunnen.
- Förvärva hela sfären Z-stack bilder med hjälp av en överförd ljus inverterad fluorescerande konfokal Mikroskop. Konvertera dessa Z-stack bilder till 3D-bilder med hjälp av en bildprogram med frihandsritning kapacitet.
Obs: mus-IgG-antikroppar används som en negativ kontroll.
- Parkopplad cell analys (4-dagarsprotokoll)
- Odla de BrdU-märkta sfärerna till dag 5.
- Dag 1: skörda sfärerna från en basalmembran matris med 1 ml dispas matsmältning. Skingra i enstaka celler med 500 μL varm 0,05% trypsin/EDTA i ett 1,5 mL microcentrifugerör enligt beskrivningen i steg 3.2.1 – 3.2.11.
- Omsuspendera cellerna i 1 mL varmt odlingssubstrat.
- Platta de spridda enskilda cellerna (~ 300 – 500 per brunn) i 8 väl kammare diabilder och kultur i 200 μL/well kultur medium över natten för att möjliggöra kvarstad.
- Dag 2: Byt odlingssubstrat med 200 μL av 2 μM cytochalasin D i odlingsmediet och inkubera över natten vid 37 ° c för att möjliggöra en celldelning som pausar vid sen metafas till Anaphase.
- Dag 3 – 4: aspirera och kassera mediet. Fix celler i 200 μL/brunn av iskall metanol vid-20 ° c i 20 min. Följ immunfärgnings protokollet för BrdU enligt beskrivningen i steg 4.1.5 – 4.1.14.
- Ta bilder av Parade celler med ett fluorescensmikroskop. Se till att avståndet mellan de två kärren är mindre än 30 μm. baserat på BrdU-retention, identifiera de parade stamcellerna som genomgår symmetrisk eller asymmetrisk celldelning.
Obs: BrdU Label-behålla prostata stamceller genomgår symmetrisk division för att ge upphov till två dotter stamceller behålla en lika stor mängd BrdU, medan stamceller som genomgår asymmetrisk Division ger upphov till en dotter stamcells behåller alla BrdU och andra dotter progenitorceller cell som har förlorat BrdU etiketten.
5. isolering av CFSE etikett-behålla prostata stamceller genom FACS sortering
- Dag 5: skörda cfse-märkta dag 5 prostaspheres växer i 6 väl kultur tallrikar i 3D-kultur genom att ersätta mediet med 2 ml dispas (basalmembran matris: dispas vid en 1:2 ratio). Pipettera upp och ner flera gånger för att blanda noggrant.
- Inkubera plattorna i en CO2 inkubator vid 37 ° c i 30 min för att smälta matrisen.
- Samla upp sfär blandningen i ett 15 mL centrifugerör. Centrifugera sfärerna vid 500 x g i 5 minuter vid RT. aspirera på supernatanten och kassera.
- Omsuspendera sfär pelleten i 500 μL varm 0,05% trypsin/EDTA, och överför till ett 1,5 mL microcentrifugerör.
- Inkubera sfärerna i en CO2 inkubator vid 37 ° c i 5 min. Tillsätt 500 μl varm PBS som innehåller 10% FBS.
- Passera sfärerna genom en 1 mL spruta med en 26 G nål 5x för att helt separera sfärerna i enskilda celler.
- Centrifugera cellerna vid 500 x g i 5 minuter vid RT. Aspirera och Kassera supernatanten.
- Omsuspendera cellerna i 1 ml varmt odlingssubstrat innehållande 1 μg/ml propidiumjodid jodid (PI) för att färga döda celler. Inkubera i 1 min vid RT.
- Centrifugera cellerna vid 500 x g i 5 minuter vid RT. Aspirera och Kassera supernatanten.
- Omsuspendera cellerna i 1 mL varmt odlingssubstrat. Centrifugera cellerna vid 500 x g i 5 minuter vid RT. Aspirera och Kassera supernatanten.
- Omsuspendera cellerna i 500 μL av varma odlingssubstrat och samla in cellerna i 5 mL polystyren runda botten rör genom att filtrera dem genom 35 μm porstorlek cell SIL Snap CAPS.
- Utför analysen av trypsin-spridda CFSE-märkta prostasphere celler med en enda kanal FACS Analyzer.
- Grind subpopulationer av fraktionerad CFSEHi, Cfsemed, och cfseLo celler. Använd de negativa och positiva kontrollerna för gating.
Obs: närvaron av FACS sorteras CFSE etikett-behålla prostata stamceller (se hu et al.13) kan bekräftas av grön fluorescens mikroskopi och deras större Cellstorlek jämfört med icke-behållande celler. Denna större Cellstorlek är en egenskap hos prostata stamceller i förhållande till stamceller populationer. Detta kan vara annorlunda med andra vävnadstyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Primära normala humana prostataepitelceller placeras i fibronectin-belagda kultur rätter och celltillväxt upprätthålls i 2D-kultur (figur 1a). Vid överföring till 3D-kultur med en basalmembran matris, differentierade epitelceller sakta dö ut. Endast prostata stamceller kan överleva i en ankare-fri kultur och bilda spheroids i 5 dagar (figur 1b).
Dubbel märkning av prostata epitelceller i 2D-kulturen följt av sfäroid formation i 3D-kulturen indikerar colocalization av BrdU, CFSE, och långt rött i samma etikett-behållande celler (figur 2a-i).
Etikett-behållande celler visar stamcells egenskaper i dag 5 spheroids. Dual immunofärgning visar att celler som behåller märkningen uppvisar lägre halter av cytokeratin protein KRT14; minskad cell knutpunkt protein E-cadherin14; ökad stamcells tidiga markör proteiner Wnt10B13,15,16 och ALDH1A1; ökad autofagi protein LC3, en indikator på autofagi Flux aktivitet17; och ökad myosin IIB (figur 3a-f).
En spheroid-baserade etikett-retention assay också framgångsrikt upptäcker cancer Stem-liknande celler i prostatacancer prover (figur 4). Detta kommer att möjliggöra upptäckten av sanna biomarkörer för cancer stamceller och har potential att identifiera nya terapeutiska mål för prostatacancer.
Figur 1: underhåll av HPrEC i 2D-kultur och sfäroid formation i 3D-kultur. (a) en primär kultur i 2D av HPrEC var BrdU-märkt och överförd till 3D-kultur med prostasphere formation på dag 5 (b). Skalstreck = 400 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: identifiering av långtids celler som behåller märkningen i primär prostaspheres. Dubbel märkning av BrdU (röd) och CFSE (grön); CFSE (grön) och långt röd (röd); BrdU (grön) och far Red (röd) identifierade samma stamliknande celler med bibehållen föräldra-DNA. Alla BrdU, CFSE, eller långt röda etiketter i snabbt dividera progenitorceller (DAPI, blå) var utspädd och förlorad (a-i). Representativa bilder visar BrdU/CFSE (a-c) (övre panelen), Cfse/far Red (d-f) (mitten panelen), och BrdU/far Red (g-i) (nedre panelen) Co-märkning i enskilda prostasphere (PS) celler. Skalstreck = 50 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Etikettbehållande av PS-celler som uppvisar stamcells egenskaper. Jämfört med icke-etikett-behållande progenitorceller, BrdU eller CFSE etikett-behålla stamceller uppvisar (a) lägre nivåer av cytokeratin 14 (Krt 14), (b) minskade nivåer av E-cadherin, (c) förhöjda nivåer av Wnt10B, (d) högre nivåer av ALDH1A1, (E) ökade LC3, och (f) ökade myosin IIb proteiner. Skalstreck = 50 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: använda den Sphere-baserade etiketten-behålla analysen för identifiering av cancer Stem-liknande celler. CFSE Label-behålla cancer Stem-liknande celler i spheroids härrör från Human prostatacancer prover uppvisade reducerad E-cadherin protein i förhållande till de icke-märkta progenitorceller. Skalstreck = 50 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flödescytometri med flera stamcells markörer är en vanlig metod för stamcellsforskning, trots att den saknar både specificitet och selektivitet1,5,6. Medan sfäroid formation i ett 3D-kultur system är en annan användbar metod för att berika den sällsynta stamceller befolkningen från primära epitelceller, inklusive hprec, de resulterande sfäroid är fortfarande en heterogen blandning av stamceller och stamfader celler2,3,4. I prostaspheres, jämfört med den snabbt prolifererande stamceller, den relativt quiescent karaktär stamceller gör att de kan identifieras genom långsiktig etikett-retention assay.
De metoder som sammanfattas i denna uppsats beskriver märkningen av HPrEC med BrdU, CFSE, och/eller långt röda Pro-färgämnen13. Medan BrdU, CFSE, och/eller långt röda Pro-färger i snabbt växande celler är alla snabbt späds ut av varje celldelning, det finns en ytterligare mekanism som står för förlusten av BrdU kallas Immortal strand DNA segregering11. Detta är när stamcellen genomgår asymmetrisk Division, vilket ger upphov till en dotter stamcell och en stamcells cell. Dottern Stem cell behåller alla gamla föräldra-DNA med BrdU etikett, medan dottern progenitorcellen tar emot den nyligen syntetiserade DNA utan BrdU etiketten. En etikett hållnings analys med BrdU möjliggör därför en tydligare och enklare identifiering av de etikett hållande stamcellerna genom immunofluorescensfärgning. Detta är särskilt användbart för att bekräfta stamcells biomarkörer vid dubbel färgning med två olika antikroppar. En stor begränsning av BrdU märkning är att celler måste fastställas för om färgning, vilket förhindrar ytterligare funktionella studier efter BrdU märkning och cellfixering.
För att lösa detta problem, två fluorescerande Pro-färgämnen för levande HPrEC märkning testades i etikett-behålla analyser. Resultaten visade att det fanns en fullständig överlappning av BrdU, CFSE och far Red märkta sfär celler. BrdU Label kan ersättas med CFSE eller långt rött i Sphere-baserade kvarhållande analyser för att möjliggöra visualisering av levande celler för avbildning och separation av FACS, främja funktionell karakterisering av isolerade levande stamceller med både in vitro cellkultur analyser och in vivo xenograft-analyser13. CFSE eller far Red Label-baserade FACS sorterade levande stamceller och stamceller kan också användas för RNA-SEQ inklusive Single cell RNA-SEQ, vilket är mycket kraftfullt för att identifiera nya stamceller gen markörer och signalering vägar samt epitelceller Lineage hierarki.
Romanen biomarker-fri metod för funktionell karakterisering av stamceller av en sfäroid-baserade etikett-retention assay presenteras här kan identifiera cancer Stem-liknande celler från primär patient prover och cancer cellinjer. Sålunda, det ger en väg för att upptäcka nya biomarkörer av cancer stamceller och utveckla effektiva Therapeutics inriktning cancer13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inte ekonomiska förhållanden att avslöja.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av bidrag från National Cancer Institute R01-CA172220 (GSP, WYH), R01-ES02207 (GSP, WYH). Vi tackar Flow Cytometry Core vid University of Illinois i Chicago för hjälp med cell sortering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| 1 mL tuberculin syringes | Bectin Dickinson | BD 309625 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes, sterile | |||
| 100 mm culture dishes | Corning/Falcon | 353003 | |
| 12-well culture plate | Corning/Falcon | 353043 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Corning/Falcon | 352097 | |
| 22 x 22 mm coverslips, sq | Corning | 284522 | For MatTek 35 mm culture dish |
| 24 x 50 mm coverslips | Corning | 2975245 | |
| 26G x 1.5 inch hypodermic needle | Monoject | 1188826112 | |
| 2N HCl | |||
| 35 mm culture dish with cover glass bottom | MatTek Corp | P35G-0-10-C | Glass bottom No. 0, uncoated,  irradiated |
| 40 µm pore nylon cell strainer | Corning | 352340 | |
| 5% CO2 culture incubator, 37 °C | Forma | ||
| 50 mL centrifuge tubes | Corning/Falcon | 352098 | |
| 5mL Polystyrene Round-Bottom Tube with strainer snap cap | Corning | 352235 | 35 µm nylon mesh |
| 6-well culture plates | Corning | 353046 | |
| 8-well chamber slides | Millipore Sigma | PEZGS0816 | |
| Aqueous mounting medium containing DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | A nuclear fluorescent dye |
| Biological safety cabinet, Level 2 certified | |||
| BrdU (5-bromo-2’-deoxyuridine) | Sigma-Aldrich | B5002 | 1 mM stock solution in DMSO |
| Centrifuge for 1.5 mL microcentrifuge tubes | Eppendorf | ||
| Centrifuge for 15 mL tubes | Beckman Coulter | Allegra 6 | |
| CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl ester) | Thermo Fisher Scientific | C34554 | 5 mM stock solution in DMSO |
| cytochalasin D | Thermo Fisher Scientific | PHZ1063 | |
| Dispase 1U/mL | StemCell Technologies | 07923 | |
| FACS CellSorter MoFlo XDP | Beckman Coulter | s | |
| Far-Red pro-dye | Thermo Fisher | C34564 | 5 mM stock solution in DMSO |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | |||
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895 | For coating 100 mm culture dishes |
| Fluorescent microscope with color digital camera | Carl Zeiss | Axioskop 20 fluorescent microscope; color digital Axiocamera | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A-11029 | |
| HPrEC (Primary normal human prostate epithelial cells) | Lifeline Cell Technology | FC-0038 | Pooled from 3 young (19-21yr od) disease-free organ donors; 1 x 105 cells/mL; stored in liquid nitrogen |
| ice bucket and ice | |||
| Inverted microsope with digital camera | |||
| Matrigel, low growth factor, phenol-red free | Corning | 356239 | |
| Methanol | Corning | A452-4 | |
| Mouse anti-BrdU antibody | Cell Signaling | 5292S | |
| Mouse IgG antibody (negative control) | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | |
| Normal goat serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
| Pipettors and tips, various sizes | |||
| PrEGM (ProstaLife Epithelial Cell Growth Medium) | Lifeline Cell Technology | LL-0041 | |
| Propidium Iodide (PI) | R & D Systems | 5135/10 | 10 μg/mL PI in PBS stored at 4 °C in the dark |
| Serological pipets, various sizes | |||
| Software for sphere counting and size measurements | |||
| Software: 3D images using Imaris an imageing software with freeform drawing capabilities | |||
| Triton X-100 | Millipore Sigma | T8787 | |
| Water bath, 37 °C | |||
| z-stack images using a transmitted light inverted fluorescent confocal microscope |
References
- Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. Generation of a prostate from a single cell. Nature. 456, 804-808 (2008).
- Xin, L., Lukacs, R. U., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. Self-renewal and multilineage differentiation in vitro from murine prostate stem cells. Stem Cells. 25, 2760-2769 (2007).
- Hu, W. Y., et al. Estrogen-initiated transformation of prostate epithelium derived from normal human prostate stem-progenitor cells. Endocrinology. 152, 2150-2163 (2011).
- Hu, W. Y., Shi, G. B., Hu, D. P., Nelles, J. L., Prins, G. S. Actions of endocrine disrupting chemicals on human prostate stem/progenitor cells and prostate cancer risk. Molecular and Cellular Endocrinology. 354, 63-73 (2012).
- Collins, A. T., Berry, P. A., Hyde, C., Stower, M. J., Maitland, N. J. Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells. Cancer Research. 65, 10946-10951 (2005).
- Vander Griend, D. J., et al. The role of CD133 in normal human prostate stem cells and malignant cancer-initiating cells. Cancer Research. 68, 9703-9711 (2008).
- Wang, J., et al. Symmetrical and asymmetrical division analysis provides evidence for a hierarchy of prostate epithelial cell lineages. Nature Communications. 5, 4758 (2014).
- Neumuller, R. A., Knoblich, J. A. Dividing cellular asymmetry: asymmetric cell division and its implications for stem cells and cancer. Genes and Development. 23, 2675-2699 (2009).
- Cicalese, A., et al. The tumor suppressor p53 regulates polarity of self-renewing divisions in mammary stem cells. Cell. 138, 1083-1095 (2009).
- Klein, A. M., Simons, B. D. Universal patterns of stem cell fate in cycling adult tissues. Development. 138, 3103-3111 (2011).
- Cairns, J. Mutation selection and the natural history of cancer. Nature. 255, 197-200 (1975).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159, 163-175 (2014).
- Hu, W. Y., et al. Isolation and functional interrogation of adult human prostate epithelial cells at single cell resolution. Stem Cell Research. 23, 1-12 (2017).
- Bryant, D. M., Stow, J. L. The ins and outs of E-cadherin trafficking. Trends in Cell Biology. 14, 427-434 (2004).
- Clevers, H., Loh, K. M., Nusse, R. Stem cell signaling. An integral program for tissue renewal and regeneration: Wnt signaling and stem cell control. Science. 346, 1248012 (2014).
- Madueke, I., et al. The role of WNT10B in normal prostate gland development and prostate cancer. The Prostate. 79 (14), 1692-1704 (2019).
- Guan, J. L., et al. Autophagy in stem cells. Autophagy. 9, 830-849 (2013).
