Summary
المتفطره السليه تظهر زيادة إنتاج وإطلاق الحويصلات خارج الخلية استجابه لظروف الحديد المنخفضة. هذا العمل تفاصيل بروتوكول لتوليد الشروط والأساليب منخفضه الحديد لتنقيه وتوصيف الحويصلات المتفطرات خارج الخلية التي صدرت استجابه لنقص الحديد.
Abstract
البكتيريا الفطرية ، بما في ذلك المتفطره السل (Mtb) ، العامل المسبب للسل البشري ، وبطبيعة الشكل الإفراج عن الحويصلات خارج الخلية (المركبات الحيوية) التي تحتوي علي جزيئات نشطه من الناحية المناعية. المعرفة بشان أليات الجزيئية لتكوين الخلايا الحيوية ، ومحتوي الحويصلات ، ووظائفها في واجهه الممرض والمضيف محدوده جدا. ويتطلب التصدي لهذه المسائل إجراءات صارمة للعزل والتنقية والتحقق من صحة المركبات. في السابق ، تم العثور علي إنتاج حويصلة لتعزيز عندما تعرض m. السل لتقييد الحديد ، وهي حاله واجهتها Mtb في البيئة المضيفة. يقدم هنا بروتوكول كامل ومفصل لعزل وتنقيه المركبات الخاصة من المتفطره التي تعاني من نقص الحديد. يتم تطبيق الطرق الكمية والنوعية للتحقق من صحة المركبات الكترونيه المنقية.
Introduction
المتفطرات الحويصلات الخارجة عن الخلية (الميمياس) هي جسيمات نانويه مرتبطة بالغشاء ، 60 − 300 نانومتر في الحجم ، والتي يطلقها بشكل طبيعي المتفطره السريعة والبطيءه النمو1. ميقاف التي أطلقتها المتفطره المسببة للامراض تشكل اليه للتفاعل مع المضيف عن طريق البروتينات النشطة مناعيا ، والدهون ، و جليكوليبيد يفرز في طريقه مركزه ومحمية2،3،4. لتوصيف المولود وفهم تكوينه الحيوي ووظائفه ، فان الطرق الصارمة والفعالة لتنقيه الحويصلة والتحقق منها حاسمه. حتى الآن ، تم عزل المولودين من الترشيحات الثقافية من المتفطره المزروعة في وسط غني بالحديد1،5،6،7،8.
ومع ذلك ، أظهرت الاعمال السابقة ان الحد من الحديد يحفز إلى حد كبير الإفراج عن حويصلة في Mtb ، ربما للتقاط الحديد عن طريق المتفابط ، وهو فلكي يفرز في ميسيس9. وعلي الرغم من ان إجراءات عزل المولود من Mtb المستزرعة في وسط الحديد العالي قد وصفت ، فانه لم يتم الإبلاغ عن منهجيه فعاله للحصول علي المولودين من ثقافات الحديد المنخفضة. ولذلك ، فان الهدف من هذه الطريقة هو عزل وتنقيه وقياس الميس التي تم الحصول عليها من ثقافات الحديد المنخفضة بحيث يمكن استخدامها لاختبارات الكيمياء الحيوية والوظيفية ولتحليل المحددات الوراثية لإنتاج حويصلة في المتفطره.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. اعداد الحديد المنضب المتوسطة المحددة
- اعداد 1 لتر من الحد الأدنى المتوسطة (مم) عن طريق تذويب 5 غرام من KH2بو4، 5 غرام من L-اسباراجين ، 20 مل من الجلسرين ، و 2 غرام من سكر العنب في 900 مل من الماء منزوع الأيونات في وعاء من البلاستيك. تجنب الزجاج لمنع تلوث الحديد. ضبط درجه الحموضة إلى 6.8 مع 5 N NaOH وحجم إلى 1 لتر مع الماء.
- أضف 50 جرام من الراتنج المعدني (MCR) وحرك برفق باستخدام شريط التحريك المغناطيسي لمده 24 ساعة عند درجه حرارة 4 درجات مئوية. تعقيم وأزاله MCR عن طريق الترشيح من خلال وحده تصفيه 0.22 μm مع جهاز استقبال من البلاستيك. لتسريع الترشيح ومنع انسداد فلتر ، والسماح للراتنج الرواسب لمده 30 دقيقه قبل الترشيح.
ملاحظه: تحتوي هذه الوسيطة علي اقل من 2 μM من الحديد المتبقي ، كما هو محدد بواسطة الطيف الطيفي للامتصاص الذري. - ملحق مم مع 0.5 ملغ/لتر من ZnCl2, 40 Mg/l من mgso4, و 0.1 ملغم/لتر من mnso4. بشكل منفصل, اعداد المخزونات المركزة (1, 000x) من كل من المكملات المعدنية في الماء منزوع الأيونات وتعقيم عن طريق الترشيح قبل مكملات MM. الحديد المنضب ، والمعادن المكملة مم سيشار هنا كما منخفضه مم الحديد (LIMM).
- من 50 mM المخزون من الخصوبة3 الذائبة في 10 مم حمض الهيدروكلوريك ، أضافه 1 مل إلى 1 لتر من limm (50 μM التركيز النهائي) لاعداد عاليه مم الحديد (himm).
2. تزايد المتفطره في الحديد-الشروط المحدودة
- ذوبان 50 μL من المجمدة 15 ٪ الجلسرين الأسهم من Mtb وخط لوحه أجار تستكمل مع 10 ٪ الإثراء ADN (5 غرام/لتر الزلال ، 2 غرام/لتر سكر العنب ، و 0.85 g/L كلوريد الصوديوم ، 0.2 ٪ الجلسرين و 0.05 ٪ توين-80)10. احتضان اللوحة عند 37 درجه مئوية حتى تصبح المستعمرات مرئية.
- تطعيم مستعمره واحده من Mtb10 في 2 مل من مرق المتفطرات المتوسطة (جدول المواد) تستكمل مع التخصيب ADN. احتضان مع الانفعالات في 37 درجه مئوية.
- السماح للثقافة Mtb تنمو إلى المرحلة اللوغاريتمية المتاخره (OD540 هو ~ 0.8). للتحقق من ذلك ، قياس OD540 باستخدام مقياس طيفي.
- انتشار 200 μL من الثقافة اللوغاريتمية المتاخره علي لوحات أجار المتفطرات (جدول المواد) تستكمل مع 0.2 ٪ الجلسرين ، 0.05 ٪ توين-80 ، و ADN. تطعيم 5 لوحات علي الأقل. احتضان لوحات في 37 درجه مئوية حتى النمو البكتيري مرئية كطبقه متموج. هذا ياخذ ~ 1 أسبوع ل Mtb.
- بلل مسحه قطنية معقمه في LIMM. استخدام هذه المسحة لجمع البكتيريا من لوحات أجار وتطعيم 100 مل من LIMM لاعداد تعليق البكتيرية المركزة مع OD540 من ~ 1.0.
- تمييع هذا التعليق 10 مرات إلى 1 لتر مع LIMM وتقسيمه إلى اثنين ، 2 لتر من الزجاجات البلاستيكية المعقمة ، كل واحده تحتوي علي 500 مل من الثقافة.
- إخراج 2 مل من الثقافة ونقله إلى أنبوب ثقافة 5 مل. أضافه 10 μL من 10 ٪ المجلد/المجلد tyloxapol.
- احتضان الثقافات في 37 درجه مئوية واقفا لمده 14 يوما.
3-مجموعه المولودين
- قياس OD540 للثقافة 2 مل في وقت جمع. جعل المخففات التسلسلية 1:10 من الثقافة ولوحه 100 μL من كل تخفيف علي لوحات أجار مع ADN و 0.05% توين-80.
- نقل الثقافة إلى 5 225 mL أنابيب الطرد المركزي المخروطية وأجهزه الطرد المركزي في 2,850 x g ل 7 دقيقه في 20 ° c.
- جمع الثقافة ماده طافي مع ماصه 50 mL وتصفيه تعقيمها من خلال وحده تصفيه 0.22 μm.
4. عزل المولود
- نقل الترشيح الثقافة في نظام الترشيح الفائق للخلايا التي وضعت في 4 درجه مئوية وتصفيه التركيز في < 50 رطل من خلال 100 كده غشاء قطع ل ~ 50 mL.
- الطرد المركزي الترشيح الثقافة المركزة في 15,000 x g ل 15 دقيقه في 4 °c وجمع supernatant.
- أجهزه الطرد المركزي الترشيح الثقافة في أنابيب البولي نبذ حلول في 100,000 x g ل 2 ح في 4 ° c.
- أعاده تعليق الكريات غشائي في ما مجموعه 1 مل من الفوسفات معقمه مخزنه المالحة (تلفزيوني) بواسطة الأنابيب لطيف.
- مزيج 0.5 mL من التعليق بيليه الحصول عليها في الخطوة 4.4 مع 1.5 mL من الحل إيوديكسانول 60 ٪ ، مما أسفر عن تركيز إيوديكسانول النهائي من 45 ٪ wt/vol. الاستغناء عن هذا المزيج في الجزء السفلي من 13 مم x 51 مم البولي بروبيلين الأنابيب رقيقه الجدران الانبوبه.
- تراكب إيوديكسانول التعليق 45 ٪ مع 1 مل من 40 ٪ ، 35 ٪ ، 30 ٪ ، 25 ٪ ، و 20 ٪ (المجلد/المجلد في تلفزيوني) إيوديكسانول الحلول و 1 مل من تلفزيوني في الجزء العلوي.
- جهاز الطرد المركزي في 100,000 x g ل 18 ح في 4 ° c.
- جمع 1 مل كسور التدرج الكثافة بدءا من اعلي باستخدام حقنه هاميلتون 1 مل.
- تمييع كل كسر جمعها إلى 20 مل مع تلفزيوني وأجهزه الطرد المركزي في 100,000 x g ل 2 ح في 4 ° c.
- أزاله ماده طافي وتعليق بيليه في 0.5 mL من تلفزيوني. تخزين هذا بيليه في 4 درجه مئوية.
5. القياس الكمي للميق
- قياس تركيز البروتين في كل كسر من قبل الفحص برادفورد (جدول المواد) ، وفقا للمبادئ التوجيهية للشركة المصنعة.
-
اجراء تحليل الدهون الغشاء.
- احتضان 10 μL من كل كسر التدرج مع مسبار الغشاء الفلوري 1-(4-تريميثيلامونيومفينيل) -6-فينيل-1 ، 3 ، 5-هيكاتريين ف-تولوينيسولفوناتي (تي ان تي-DPH) في التركيز النهائي من 1 ميكروغرام/مل في النهائي 50 μL حجم من برنامجتلفزيوني في 96 الأسود بشكل جيد لوحات.
- احتضان لوحات في 33 درجه مئوية لمده 20 دقيقه.
- قياس الفلوري في 360 nm الاثاره و 430 nm الانبعاثات.
6. التحليل النوعي للمياس
-
أداء البروتين الكهربائي.
- خلط ما يقرب من 1 ميكروغرام من عينات MEV في 16 μL مع 4 μL من المخزن المؤقت عينه 5x (10 ٪ ث/الخامس SDS ، 10 ملم dithiothreitol ، 20 ٪ v/v الجلسرين 0.2 M تريس-HCl ، pH 6.8 0.05 ٪ ث/الخامس بروموفينول الأزرق) والحرارة العينات في ال85 مخزن
- تحميل في 10 ٪ تريس/الجليسين SDS-بولياكرياميد هلام11 وتشغيل في 10 V/سم في تشغيل العازلة (25 ملم تريس قاعده ، 190 mm الجليسين ، 0.1 ٪ SDS) حتى الجبهة صبغه زرقاء تصل إلى الجزء السفلي من هلام.
- وصمه عار الهلام مع محلول تلطيخ البروتين بالموجات فوق الصوتية (جدول المواد).
-
تنفيذ لطخه نقطه.
- تحميل 2 μl من التعليق ميقاف مع تركيز حوالي 0.5 ميكروغرام/μl ، والمخففات التسلسلية مزدوجة علي غشاء النيتروسليلوز وعمليه للطخه نقطه وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- استخدام مصل المضادة التي أثيرت في الفئران ضد اعداد الميس في التخفيف من 1:5000 كالاجسام المضادة الاساسيه والماعز مكافحه الماوس إلى جانب الفجل البيروكسيديز (النظام الصحي العام) في 1:10000 التخفيف كالاجسام المضادة الثانوية. الكشف عن المجمعات مستضد الأجسام المضادة مع الركيزة المناسبة الشكل الصحيح للكشف عن الكشف الكاشف ونظام التصوير.
-
أداء تلطيخ السلبية والمجهر الكترون.
- إصلاح 250 μL من ميقاف مع 2 ٪ غلوتارالدهيد في 0.1 M cacodylate في درجه حرارة الغرفة لمده 2 ساعة واحتضان بين عشيه وضحيها في 4 ٪ الفورمالديهايد ، 1 ٪ غلوتارالديهيد ، و 0.1 ٪ تلفزيوني.
- وصمه عار عينات ثابته مع 2 ٪ الاوزميوم أكسيد لمده 90 دقيقه.
- ديهيدرات العينة في الايثانول وتضمينها في الراتنج الايبوكسي في سبوير.
- مراقبه المولود تحت مجهر الكترون الإرسال.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم تنقيه الميس بواسطة الترسب التفاضلي في تدرج الكثافة (الشكل 1، الشكل 2). وببموجب الشروط الموصوفة ، يفصل المولود في الغالب في الجزء المتدرج 3 (F3) ، الذي يقابل 25 في المائة إيوديكسانول. ويستند هذا الاستنتاج علي الكشف عن البروتين ، والدهون الغشاء ، والتصور المجهري للمواس سليمه ، وتوزيع حجم الجسيمات متناهي ، والتفاعل الإيجابي مع مضاد للمصل انتيفيسيليس (الشكل 2، الشكل 3). البروتين وتركيز الدهون تطبيع لوحدات تشكيل مستعمره (CFUs) وأظهرت زيادة ثمانيه اضعاف تقريبا من العائد MEV في انخفاض الحديد بالنسبة لظروف الحديد عاليه (50 μM فيلتر3) (الشكل 3). وعلي الرغم من ان نتائج تجربه تمثيليه واحده معروضه ، فان هذه النتيجة يمكن استنساخها بدرجه عاليه استنادا إلى العزلات المتعددة (> 10) للمياس. وكانت الغلة النقية MEV التي تم الحصول عليها من 1 L ثقافة الحديد منخفضه من قبل هذا الأسلوب حوالي 500 ميكروغرام من البروتين.
الشكل 1: التمثيل المنهجي للمنهجية المستخدمة في تنقيه البيانات المتعلقة بالقياس والقياس الكمي. واستخدمت المتفطره المزروعة في لوحات أجار لتطعيم الحديد المنضب الحد الأدنى المتوسطة وتنمو Mtb للعزل EV. تم تنقيه الميس من خلال تدرج الكثافة المتقطعة من الترشيح الثقافة الخالية من الخلايا. تم تنفيذ مزيج من الدهون الغشائية وتحديد بروتين الحويصلة ، والمجهر ، وتحليل الجسيمات متناهي لتوصيف المولود المنقي. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: توصيف المياس المنقي. (ا) المبينة هي صور للفصل الفعلي لتدرج الكثافة للميق الخام وبيليه المولود المنقي الذي يجمعه الجزء الثالث من الانحدار 3 (F3). (B) SDS-هلام ملطخه تظهر البروتين من مختلف كسور الكثافة التدرج. (ج) تحليل نقطه لطخه تظهر البروتينات المرتبطة بالحويصلة تتركز في F3. (د) المولود الموجود في F3 الذي لوحظ بالتلطيخ السلبي. (ه) توزيع حجم mev وفقا لتحليل جسيمات متناهي (NTA). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تحليل مقارن لغله الحديد الصلب في الثقافات الحديدية المنخفضة والعالية. نتيجة تمثيليه من (ا) البروتين والدهن الكمي و (ب) نقطه لطخه تحليل من [ميس] منقيه يعزل من [ايرون-ليميتد] وحديد كاف [Mtb] ثقافات. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد تم تطوير أساليب متعددة لتنقيه الخلايا المشتقة النواة الخلوية12. وعلي النقيض من ذلك ، هناك معلومات محدوده عن الطرق الفعالة لتنقيه البكتيريا المشتقة من المركبات7. العزلة الفعالة للمركبات المركبة التي تستمد من Mtb تحتاج إلى النظر في الصعوبات المتاصله في زراعه هذه المتفطره المسببة للامراض. Mtb لديه وقت انقسام طويل (~ 24 ساعة) وينبغي التعامل معها في السلامة البيولوجية مستوي ثلاثه (BSL-3) الظروف. ولذلك ، فمن المهم لتحسين كفاءه أساليب العزل MEV. لان المتفطره الإفراج عن غليكوليدس والجزيئات المائية الأخرى التي تجمع وتلوث بسهوله الاستعدادات MEV الخام في المتوسطة ، فمن المهم لتنقيه والتحقق من صحة ميقاف قبل اجراء الدراسات البيوكيميائية والوظيفية. استنادا إلى الملاحظات السابقة التي أظهرت ان Mtb يعزز الإفراج عن الميس في ظل ظروف من الحديد الحد ، تم إنشاء بروتوكول لتنقيه EV من المتفطره المحدودة الحديد. وقد تاكد أيضا ان غير الخبيثة m. سميغاتيس أيضا يزيد من الإفراج عن المركبات الخفيفة استجابه لظروف الحديد منخفضه (البيانات لم تظهر). ولذلك ، يمكن استخدام نفس البروتوكول لتنقيه المركبات الدقيقة من هذه البكتيريا في شروط BSL-2.
ومن الخطوات الحاسمة في هذا الاجراء اعداد الوسيط الحديدي المنخفض. وينبغي اعداد هذه الوسيلة كما هو موضح هنا وتخزينها في حاويه بلاستيكية ، وليس في الزجاج ، لمنع التلوث بالحديد. المكملات الغذائية المستخدمة عاده في المتوسطة النمو Mtb لتحفيز نمو البكتيريا ومنع تكتل المتفطرات المميزة, مثل الزلال المصل البقري, توين-80, أو tyloxapol, يجب تجنبها. هذه المواد المضافة تؤدي إلى التحف المعقدة البروتين الدهني الذي copurify مع الحويصلات والحد من الغلة حويصلة. ل [كفو] تصميم, ثقافة صغيره في متوسطه يلحق مع منظفات ([توين-80 أو [تيلواكسبول]) يستطيع كنت ثبتت [أين بموازاة] ال [منظف-فر] ثقافة كبيره. ميقاف في الترشيح الثقافة مستقره في 4 درجه مئوية لعده أيام. لذلك ، إذا لم تتم معالجتها علي الفور ، يمكن تخزين الترشيح الثقافة المبردة.
وكان المحصول الكلي لل MEV المنقي من 1 لتر من الثقافة حوالي 500 ميكروغرام/لتر من البروتين ، وهو ما يكفي لاجراء تحليلات متعددة مثل البروموميات ، الشحوم ، والاختبارات الوظيفية. اعتمادا علي نوع الفحص ، يمكن عزل ميقاف كافيه من احجام أصغر (اي ، 250 mL). وهذا يسهل التحليل المقارن للظروف والعوامل التي تؤثر علي الإفراج عن MEV.
هذا هو وسيله فعاله لتنقيه الميس ، ولكن لديها قيود. وهو اجراء طويل مع العديد من الخطوات نبذ حلول. في المستقبل ، سيتم مقارنه هذه الطريقة إلى اللوني الترشيح هلام ، وكما يتم اكتشاف علامات الجزيئية من الميس ، يمكن تنفيذ أساليب التقاط التقارب. والبيئة المضيفة محدوده الحديد ، ولذلك فان المولود الذي تنتجه Mtb في وسط منخفض من الحديد ربما يكون أكثر ارتباطا بالمولود الذي ينتج اثناء العدوى ويمكن ان يوفر رؤى ذات صله بدور المولود في الاصابه بمرض السل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يوجد تضارب في المصالح بين أصحاب البلاغ.
Acknowledgments
ونحن ممتنون لرافائيل برادوس-روساليس لتقاسم antisera مضاده MEV و Navneet Dogra لأداء تحليل تتبع جسيمات متناهي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amicon stirred cell Model 108 | EMD Milipore | UFSC40001 | Cell Ultrafiltration system |
| BD Polypropilene 225 mL conical tubes | Fisher | 05-538-61 | Conical centrifuge tubes |
| Biomax 100 kDa cut-off ultrafiltration membrane | EMD Milipore | PBHK07610 | Ultrafiltration membrane |
| Chelex-100 resin | Bio-Rad | 142-2842 | Metal chelating resin |
| Middlebrook 7H10 Agar | BD Difco | 262710 | Mycobacterial Agar plates |
| Middlebrook 7H9 Broth | BD Difco | 271310 | Mycobacterial broth medium |
| Nitro cellulose blotting membrane | GE Healthcare | 10600001 | Blotting Membrane |
| Optiprep | Sigma | D1556 | Iodixanol |
| Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 mm x 89 mm | Beckman Coulter | 355618 | Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 mm x 89 mm |
| Polypropylene thin walled centrifuge tube 13 mm x 15 mm | Beckman Coulter | 344059 | Polypropylene thin walled centrifuge tube 13 mm x 15 mm |
| Protein Assay dye | BioRad | 5000006 | Bradford Protein Staining |
| SYPRO Ruby | Molecular Probes | S12000 | Ultrasensitive protein stain |
| TMA-DPH | Molecular Probes | T204 | 1-(4-Trimethylammoniumphenyl)-6-Phenyl-1,3,5-Hexatriene p-Toluenesulfonate |
| Vacuum filtration flasks | CellPro | V50022 | Filter Unit |
References
- Prados-Rosales, R., et al. Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice. Journal of Clinical Investigation. 121, 1471-1483 (2011).
- Gupta, S., Rodriguez, G. M. Mycobacterial extracellular vesicles and host pathogen interactions. Pathogens and Disease. 76 (4), (2018).
- Athman, J. J., et al. Bacterial Membrane Vesicles Mediate the Release of Mycobacterium tuberculosis Lipoglycans and Lipoproteins from Infected Macrophages. Journal of Immunology. 195, 1044-1053 (2015).
- Athman, J. J., et al. Mycobacterium tuberculosis Membrane Vesicles Inhibit T Cell Activation. Journal of Immunology. 198, 2028-2037 (2017).
- Rath, P., et al. Genetic regulation of vesiculogenesis and immunomodulation in Mycobacterium tuberculosis. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 110, E4790-E4797 (2013).
- White, D. W., Elliott, S. R., Odean, E., Bemis, L. T., Tischler, A. D. Mycobacterium tuberculosis Pst/SenX3-RegX3 Regulates Membrane Vesicle Production Independently of ESX-5 Activity. mBio. 9, pii 00778 (2018).
- Dauros Singorenko, P., et al. Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity. Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1324731 (2017).
- Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quiros, S., Luque-Garcia, J. L. Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria. MethodsX. 1, 124-129 (2014).
- Prados-Rosales, R., et al. Role for Mycobacterium tuberculosis membrane vesicles in iron acquistion. Journal of Bacteriology. 196, 1250-1256 (2014).
- Sanders, E. Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods. Journal of Visualized Experiments. 63, e3064 (2012).
- Harlow, E., Lane, L. Antibodies. A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory. (1988).
- Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).
