Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

בידוד ואפיון מסחטות ושלפוחיות מתוצרת ברזל-בקטריה מוגבלת

Published: October 31, 2019 doi: 10.3791/60359

Summary

שחפת של פטרת מראה הפקה מוגברת ושחרור של ושלפוחיות של מסחטות בתגובה לתנאי ברזל נמוך. עבודה זו מפרטת פרוטוקול ליצירת תנאי ברזל נמוך ושיטות לטיהור ואפיון של שלפוחיות ומסחטות בקטריאליים שפורסמו בתגובה למחסור בברזל.

Abstract

בקטריה, כולל שחפת של פטרת (Mtb), הסוכן סיבתי של שחפת האדם, שחרור באופן טבעי ושלפוחיות (EVs) המכיל מולקולות פעילות חיסונית. ידע בנוגע למנגנון המולקולרי של שלפוחית הביוגנזה, התוכן של שלפוחיות, והתפקודים שלהם בממשק מארח הפתוגן הוא מאוד מוגבל. טיפול בשאלות אלה דורש הליכים קפדניים לבידוד, טיהור ואימות של EVs. בעבר, הפקת שלפוחית הייצור היתה משופרת כאשר M. שחפת נחשף הגבלה ברזל, מצב שנתקל Mtb בסביבה המארחת. מוצג כאן הוא פרוטוקול מלא ומפורט כדי לבודד ולטהר EVs מן הברזל מלקוי של ברזל. שיטות כמותיים ואיכותניות מוחלות על אימות EVs מטוהרים.

Introduction

מסחטות של פטרת שלפוחיות (MEVs) הם חלקיקים מאוגדים קרום, 60-300 ננומטר בגודל, באופן טבעי שוחרר על ידי מהיר-ו-לאט גדל בקטריה מפטרת1. Mevs שוחרר על ידי חיידקים פתוגניים מהווים מנגנון לאינטראקציה עם המארח באמצעות חלבונים פעילים חיסוני, שומנים, ו גליקולפידים מופרש באופן מרוכז ומוגן2,3,4. כדי לאפיין MEVs ולהבין הביוגנזה שלהם פונקציות, שיטות קפדניות ויעילות של שלפוחית השמש והאימות הם קריטיים. עד כה, mevs מבודדים מן filtrates תרבות של פטרת גדל בינוני עשיר ברזל1,5,6,7,8.

עם זאת, העבודה הקודמת הוכיחה כי מגבלת ברזל מעוררת במידה רבה שחרור שלפוחית ב Mtb, אולי כדי ללכוד ברזל דרך פטרת, siderophore מופרש MEVs9. למרות ההליכים עבור MEVs בידוד מ Mtb תרבותי בינוני ברזל גבוה תוארו, מתודולוגיה יעילה להשיג MEVs מתרבויות ברזל נמוך לא דווחו. לכן, המטרה של שיטה זו היא לבודד, לטהר, ולכמת mevs שהתקבלו מתרבויות ברזל נמוך, כך שהם יכולים לשמש עבור בחני הביוכימי ופונקציונלי לניתוח של דטרמיניזם גנטי של ייצור שלפוחית לפוחית ב בקטריה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת ברזל מוגדר מידי המדיום

  1. להכין 1 L של בינונית מינימלית (MM) על ידי המסת 5 גרם של KH2PO4, 5 g של L-אספרגין, 20 מ ל של גליצרול, ו 2 גרם של דקסטרוז ב 900 ml של מים מוהים במיכל פלסטיק. להימנע זכוכית כדי למנוע זיהום ברזל. כוונן את ה-pH ל 6.8 עם 5 N NaOH ונפח ל 1 L עם מים.
  2. הוסף 50 g של שרף מתכת הכלף (MCR) ומתפרעים בעדינות באמצעות משחק מגנטי בר עבור 24 שעות ב 4 ° c. חטא והסר את mcr באמצעות סינון באמצעות יחידת סינון של 0.22 יקרומטר עם מקלט פלסטי. כדי להאיץ את הסינון ולמנוע סתימת מסננים, הנח לשרף לעבור כ -30 דקות לפני הסינון.
    הערה: מדיום זה מכיל פחות מ 2 μM שיורית ברזל, כפי שנקבע על ידי ספקטרוסקופיית ספיגה אטומית.
  3. תוספת MM עם 0.5 mg/L של לאוסול2, 40 Mg/l של mgso4, ו 0.1 Mg/l של mgso4. בנפרד, להכין מניות מרוכז (1, 000x) של כל אחד מתוספי מתכת במים המזים ולעקר על ידי סינון לפני תוספי MM. ברזל התרוקן, מתכת בתוספת MM יהיה התייחס כאן ברזל נמוך MM (LIMM).
  4. מתוך 50 מ"מ מלאי של פוריות3 מומס 10 מ"מ, להוסיף 1 מ ל 1 L של limm (50 משנת הריכוז הסופי) כדי להכין ברזל גבוה mM (הימלM).

2. גידול בקטריה ברזל-תנאים מוגבלים

  1. להפשיר את 50 μL של מלאי קפוא 15% גליצרול של Mtb ו פס לצלחת אגר שיושלם עם 10% ADN העשרה (5 g/L אלבומין, 2 g/L דקסטרוז, ו 0.85 g/L נתרן כלוריד, 0.2% גליצרול ו 0.05% יצירת רצף-80)10. מודקת את הצלחת ב 37 ° c עד מושבות גלויים.
  2. איחסן מושבה אחת של Mtb10 ב 2 מ ל של בינונית של ציר של פטרת (שולחן חומרים) שיושלם עם העשרה adn. מודטה עם עצבנות ב 37 ° c.
  3. ניתן לתרבות Mtb לצמוח לשלב המאוחר לוגריתמי (OD540 הוא ~ 0.8). כדי לבדוק את זה, למדוד את OD540 באמצעות ספקטרוסקופיה.
  4. התפשטות 200 μL של התרבות לוגריתמית מאוחר על לוחותהלוח של החיידק של החומר (טבלה של חומרים) שיושלם עם 0.2% גליצרול, 0.05% רצף-80, ו-adn. מחסן לפחות 5 צלחות. מודמת את הצלחות ב-37 ° צ' עד שהגידול החיידקי נראה כשכבה שוטפת. זה לוקח ~ 1 שבוע עבור Mtb.
  5. להרטיב מנקי כותנה סטרילית ב LIMM. השתמש בספוגית זה כדי לאסוף חיידקים מלוחות אגר ו חסן mL של limm להכין הבולם חיידקי מרוכז עם OD540 של ~ 1.0.
  6. לדלל את ההשעיה 10 פעמים 1 L עם LIMM ולחלק אותו לשתיים, 2 L בקבוקי פלסטיק סטרילי, כל אחד המכיל 500 mL של התרבות.
  7. קחו 2 מ ל של תרבות והעבירו אותו לצינור התרבות של 5 מ ל. הוסף 10 μL של 10% vol/vol tyloxapol.
  8. מודפה את התרבויות ב-37 ° c בעמידה 14 יום.

3. אוסף של MEVs

  1. למדוד את OD540 של התרבות 2 מ ל בזמן איסוף. הפוך 1:10 לדילול סדרתי של התרבות והלוח 100 μL של כל דילול על צלחות אגר עם ADN ו 0.05% רצף-80.
  2. העבר את התרבות כדי 5 225 mL מצינורות צנטריפוגה חרוטי ו צנטריפוגה ב 2,850 x g עבור 7 דקות ב 20 ° c.
  3. לאסוף את התרבות supernatant עם פיפטה 50 mL ומסננים לעקר אותו באמצעות יחידת מסנן יקרומטר 0.22.

4. בידוד של MEVs

  1. להעביר את פילטרט התרבות לתוך מערכת מעורבב האולטרסאונד תא ממוקם על 4 ° צ' ולסנן את הריכוז ב < 50 psi דרך קרום החיתוך kda 100 ~ 50 mL.
  2. צנטריפוגה את פילטרט תרבות מרוכזת ב 15,000 x g עבור 15 דקות ב 4 ° צ' ולאסוף את supernatant.
  3. צנטריפוגה את פילטרט התרבות בצינורות פוליקרבונט ב100,000 x g עבור 2 h ב 4 ° c.
  4. השהה מחדש את כדורי הקרומי בסכום כולל של 1 מ ל של תמיסת מלח סטרילית באגירה (PBS) על-ידי ליטוף עדין.
  5. מערבבים 0.5 mL של ההשעיה גלולה שהושג בשלב 4.4 עם 1.5 mL של 60% הפתרון יודיאקיול, מניב ריכוז יודיאקיול הסופי של 45% wt/vol. מערבבים את התערובת בתחתית של 13 מ"מ x 51 מילימטר ultracentrifuge שפופרת פוליפרופילן דק קירות.
  6. שכבת-על של MEV-יודיקסנול 45% השעיה עם 1 מ ל של 40%, 35%, 30%, 25%, ו 20% (vol/vol ב PBS) פתרונות יודיקסנול ו-1 mL של PBS בראש.
  7. צנטריפוגה ב 100,000 x g עבור 18 h ב 4 ° c.
  8. לאסוף את השברים בצפיפות 1 mL החל מלמעלה באמצעות 1 מ"ל מזרק המילטון.
  9. לדלל כל שבר שנאסף ל 20 מ ל עם PBS ו צנטריפוגה ב 100,000 x g עבור 2 h ב 4 ° c.
  10. הסר את הסופרנטנט והשהה את הגלולה ב 0.5 mL של PBS. . אחסן את הגלולה ב -4 ° c

5. קוונפיקציה של MEVs

  1. למדוד את ריכוז החלבון בכל שבר על ידי שיטת ברדפורד (לוח חומרים), בעקבות הנחיות היצרן.
  2. בצע ניתוח השומנים הממברנה.
    1. מודדת 10 μL של כל שבר מעבר צבע עם ממברנה פלורסנט בדיקה 1-(4-מתיונין לאמונופנקסיל) -6-פניאיל -1, 3, 5-הקספרין p-טולוט (tma-dph) בריכוז סופי של 1 μg/mL בנפח הסופי 50 μl של PBS ב 96 שחור טוב צלחות.
    2. מודקון את הצלחות ב 33 ° c עבור 20 דקות.
    3. למדוד את הזריחה ב 360 הריגוש ננומטר ו 430 הפליטה nm.

6. אנליזה איכותית של MEVs

  1. לבצע אלקטרופורזה בחלבון.
    1. מערבבים כ 1 μg של דגימות MEV ב 16 μL עם 4 μL של מאגר טעינה של 5x לדוגמה (10% w/v SDS, 10 מ"מ מילימטר, 20% v/v גליצרול 0.2 M טריס-HCl, pH 6.8 0.05% w/v ברומרופנול כחול) ולחמם את דגימות במאגר לדוגמה ב 85 ° צ' עבור 5 דקות.
    2. טען ב 10% טריס/גליצין SDS-polyacrylamide ג'ל11 ולהפעיל ב 10 V/cm במאגר פועל (25 מ"מ בסיס טריס, 190 מ"מ גליצין, 0.1% sds) עד החזית לצבוע כחול מגיע לתחתית של ג'ל.
    3. הכתם את הג בתמיסה בעלת רגישות גבוהה לחלבון מכתים (טבלת חומרים).
  2. ביצוע הנקודה החשופה.
    1. טען 2 μL של השעיה MEVs עם ריכוז של כ 0.5 μg/μL, וכפולה מדלל סדרתי על קרום התאית ניטרוגליצרין תהליך לכתם נקודה על פי הוראות היצרן.
    2. השתמש בנסיוב חיסון הגדל עכברים נגד הכנת MEVs ב דילול של 1:5000 כמו הנוגדן העיקרי עז נגד העכבר מצמידים לחזרת peroxidase (HRP) ב 1:10000 דילול כמו הנוגדן המשני. לזהות אנטיגן-נוגדן מתחמי עם מתאים מתאימים לזיהוי המצע HRP מגיב ומערכת הדמיה.
  3. בצע כתמים שליליים ומיקרוסקופ אלקטרוני.
    1. תקן 250 μL של MEVs עם 2% גלוראלדהיד ב 0.1 M cacodylate אוחר בטמפרטורת החדר עבור 2 h ו-דגירה לילה ב 4% פורמלדהיד, 1% גלוטרלדהיד, ו 0.1% PBS.
    2. הכתם את הדגימות קבוע עם 2% אוסמיום tetroxide עבור 90 דקות.
    3. מייבשים את המדגם באתנול ומטביעים את שרף האפוקסי של ספאר.
    4. התבונן ב-MEVs תחת מיקרוסקופ אלקטרוני של שידור.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

MEVs היו מטוהרים על ידי משקעי שיפוע דיפרנציאלי במילוי צפיפות (איור 1, איור 2). תחת התנאים שתוארו, MEVs מופרדים בעיקר השבר הדרגתי 3 (F3), אשר מתאים 25% יודיקסנול. מסקנה זו מבוססת על זיהוי חלבון, השומנים הממברנה, ויזואליזציה מיקרוסקופיים של MEVs שלמים, התפלגות ננו-חלקיק size, ופעילות מחודשת חיובית עם נסיוב נגד שלפוחית (איור 2, איור 3). החלבון וריכוז השומנים המנורמל ליחידות שיוצרות המושבה (CFUs) הראו עלייה של כ-8 שמונת היבול בברזל נמוך יחסית לתנאי ברזל גבוהים (50 μMליטר)(איור 3). למרות שמדובר בתוצאות של ניסוי מייצג אחד, זוהי תוצאה מאוד מבוססת המבוססת על מספר (> 10) מבודדים של MEVs. התשואה MEV טהור שהתקבל מתרבות ברזל 1 L נמוכה על ידי שיטה זו היתה כ 500 μg של חלבון.

Figure 1
איור 1: ייצוג תרשים של המתודולוגיה המשמשת לטיהור וכימות MEV. פטרת גדל לוחות אגר שימשו כדי לחסן ברזל מינימלי מינימלית ולצמוח Mtb עבור EV בידוד. MEVs היו מטוהרים על ידי הדרגתי צפיפות מתמשכת מתוך filtrate התרבות ללא תא. שילוב של השומנים הממברנה ובדיקת חלבון שלפוחית החלבונים, מיקרוסקופ, וניתוח ננו-חלקיק יושם כדי לאפיין מטוהר MEVs. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: אפיון מטומול מטוהרים. (א) הראו תצלומים של הפרדה בפועל מעבר הדרגתי של mevs גסה ואת הגלולה של מטוהר mevs שנאסף על ידי מעבר של שבר של הדרגתי שבריר 3 (F3). (ב) sds-ג'ל מוכתם מראה פרופיל חלבון של שברים בצפיפות שונים הדרגתי. (ג) ניתוח כתמי נקודה מראה vesicle לפוחית החלבונים מרוכזים ב F3. (ד) mevs הנוכחי ב F3 נצפתה על ידי כתמים שליליים. (ה) התפלגות גודל mev בהתאם לניתוח ננו-חלקיק (נ. ת. ע). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: ניתוח השוואתי של תשואה MEV בתרבויות ברזל נמוך וגבוה. תוצאה של מייצג (א) חלבון וכימות השומנים ו (ב) כתם כתמי ניתוח של מטוהרים mevs מבודדים מברזל-מוגבל וברזל מספיק תרבויות Mtb. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שיטות מרובות כדי לטהר תא איקריוטית הנגזרות המפותחות התפתחו12. לעומת זאת, יש מידע מוגבל על שיטות יעילות כדי לטהר חיידקים נגזר EVs7. בידוד יעיל של Mtb נגזר EVs צריך לשקול את הקשיים הפנימיים בגידול זה פטרת הפתוגני. Mtb יש זמן חלוקה ארוכה (~ 24 שעות) ויש לטפל ברמת בטיחות שלושה (BSL-3) תנאים. לכן, חשוב למטב את היעילות של שיטות בידוד MEV. מכיוון שהחיידקים משחררים גליקולפידים ומולקולות הידרופובי אחרות, שבהן מצטברים ומזהם בקלות את ההכנות של MEV גסה למדיום, חשוב לטהר ולאמת את Mev לפני ביצוע מחקרים ביוכימיים ופונקציונליים. בהתבסס על תצפיות קודמות שהפגינו כי Mtb משפר את שחרורו של MEVs תחת תנאים של הגבלת ברזל, פרוטוקול הוקמה עבור טיהור EV מ-ברזל מוגבלת פטרת. יש גם אישר כי M. סמגטיס לא-מדבק מגביר גם שחרור של EVs בתגובה לתנאי ברזל נמוך (נתונים לא מוצגים). לכן, אותו פרוטוקול יכול לשמש כדי לטהר EVs מן החיידק הזה בתנאים BSL-2.

צעד קריטי של הליך זה הוא הכנת מדיום הברזל הנמוך. מדיום זה צריך להיות מוכן כמתואר כאן ומאוחסן במיכל פלסטיק, לא בזכוכית, כדי למנוע זיהום ברזל. תוספי מזון נפוץ בMtb צמיחה בינונית כדי לעורר את הצמיחה חיידקים ולמנוע מאוד מהקטקטריות מאפייני, כגון סרום בשור הפרה, רצף-80, או tyloxapol, יש להימנע. תוספים אלה מובילים ללייפופרוטאין חפצים מורכבים המקוריפי בעזרת שלפוחיות ומצמצמים את תפוקת הוולפוחית. עבור הגדרת CFU, תרבות קטנה בינונית בתוספת עם אבקת (רצף-80 או tyloxapol) ניתן להגדיר במקביל לתרבות גדולה ללא כביסה. Mevs ב פילטרט התרבות הם יציבים ב 4 ° c במשך כמה ימים. לכן, אם לא מעובד מיידית, פילטרט התרבות ניתן לאחסן בקירור.

התשואה הכוללת של MEV מטוהרים מ 1 L של התרבות היתה סביב 500 μg/L חלבון, אשר מספיק כדי לבצע ניתוחים מרובים כגון פרוטאומיקס, lipidomics, ופונקציונלי. בהתאם לסוג השיטת, מספיק MEVs יכול להיות מבודד מאמצעי אחסון קטנים יותר (כלומר, 250 mL). פעולה זו מקלה על ניתוח השוואתי של תנאים וגורמים המשפיעים על שחרור MEV.

זוהי שיטה יעילה לטיהור MEVs, אבל יש לו מגבלות. זהו תהליך ארוך עם שלבים מרובים. בעתיד, שיטה זו תהיה מושווים ל כרומטוגרפיה של סינון ג'ל, וכאשר מתגלים סמנים מולקולריים של MEVs, ניתן ליישם שיטות לכידת אהדה. הסביבה המארחת הוא ברזל מוגבל, ולכן MEVs המיוצר על ידי Mtb במדיום ברזל נמוך הם כנראה קשורים יותר קרוב מתוצרת MEVs המיוצר במהלך זיהום יכול לספק תובנות רלוונטיות על התפקיד של MEVs ב פתוגנזה שחפת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי אינטרסים.

Acknowledgments

אנחנו אסירי תודה לרפאל prados-rosales עבור שיתוף anti-mev קטריולוגיה ו navneet dogra לביצוע ניתוח מעקב ננו-חלקיק.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amicon stirred cell Model 108 EMD Milipore UFSC40001 Cell Ultrafiltration system
BD Polypropilene 225 mL conical tubes Fisher 05-538-61 Conical centrifuge tubes
Biomax 100 kDa cut-off ultrafiltration membrane EMD Milipore PBHK07610 Ultrafiltration membrane
Chelex-100 resin Bio-Rad 142-2842 Metal chelating resin
Middlebrook 7H10 Agar BD Difco 262710 Mycobacterial Agar plates
Middlebrook 7H9 Broth BD Difco 271310 Mycobacterial broth medium
Nitro cellulose blotting membrane GE Healthcare 10600001 Blotting Membrane
Optiprep Sigma D1556 Iodixanol
Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 mm x 89 mm Beckman Coulter 355618 Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 mm x 89 mm
Polypropylene thin walled centrifuge tube 13 mm x 15 mm Beckman Coulter 344059 Polypropylene thin walled centrifuge tube 13 mm x 15 mm
Protein Assay dye BioRad 5000006 Bradford Protein Staining
SYPRO Ruby Molecular Probes S12000 Ultrasensitive protein stain
TMA-DPH Molecular Probes T204 1-(4-Trimethylammoniumphenyl)-6-Phenyl-1,3,5-Hexatriene p-Toluenesulfonate
Vacuum filtration flasks CellPro V50022 Filter Unit

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Prados-Rosales, R., et al. Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice. Journal of Clinical Investigation. 121, 1471-1483 (2011).
  2. Gupta, S., Rodriguez, G. M. Mycobacterial extracellular vesicles and host pathogen interactions. Pathogens and Disease. 76 (4), (2018).
  3. Athman, J. J., et al. Bacterial Membrane Vesicles Mediate the Release of Mycobacterium tuberculosis Lipoglycans and Lipoproteins from Infected Macrophages. Journal of Immunology. 195, 1044-1053 (2015).
  4. Athman, J. J., et al. Mycobacterium tuberculosis Membrane Vesicles Inhibit T Cell Activation. Journal of Immunology. 198, 2028-2037 (2017).
  5. Rath, P., et al. Genetic regulation of vesiculogenesis and immunomodulation in Mycobacterium tuberculosis. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 110, E4790-E4797 (2013).
  6. White, D. W., Elliott, S. R., Odean, E., Bemis, L. T., Tischler, A. D. Mycobacterium tuberculosis Pst/SenX3-RegX3 Regulates Membrane Vesicle Production Independently of ESX-5 Activity. mBio. 9, pii 00778 (2018).
  7. Dauros Singorenko, P., et al. Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity. Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1324731 (2017).
  8. Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quiros, S., Luque-Garcia, J. L. Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria. MethodsX. 1, 124-129 (2014).
  9. Prados-Rosales, R., et al. Role for Mycobacterium tuberculosis membrane vesicles in iron acquistion. Journal of Bacteriology. 196, 1250-1256 (2014).
  10. Sanders, E. Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods. Journal of Visualized Experiments. 63, e3064 (2012).
  11. Harlow, E., Lane, L. Antibodies. A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory. (1988).
  12. Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).

Tags

אימונולוגיה וזיהום סוגיה 152 פטרת שלפוחיות חוסר ברזל הפרשה קרום התקפה אלימה בידוד
בידוד ואפיון מסחטות ושלפוחיות מתוצרת ברזל-בקטריה מוגבלת
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gupta, S., Marcela Rodriguez, G.More

Gupta, S., Marcela Rodriguez, G. Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles Produced by Iron-limited Mycobacteria. J. Vis. Exp. (152), e60359, doi:10.3791/60359 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter