Summary
Mycobacterium tuberculosis muestra un aumento de la producción y liberación de vesículas extracelulares en respuesta a condiciones bajas de hierro. Este trabajo detalla un protocolo para generar condiciones de hierro bajas y métodos para la purificación y caracterización de vesículas extracelulares micobacterianas liberadas en respuesta a la deficiencia de hierro.
Abstract
Las micobacterias, incluyendo Mycobacterium tuberculosis (Mtb), el agente causante de la tuberculosis humana, liberan naturalmente vesículas extracelulares (EV) que contienen moléculas inmunológicamente activas. El conocimiento sobre los mecanismos moleculares de la biogénesis vesícula, el contenido de las vesículas y sus funciones en la interfaz patógeno-huésped es muy limitado. Abordar estas preguntas requiere procedimientos rigurosos para el aislamiento, purificación y validación de vehículos eléctricos. Anteriormente, se encontró que la producción de vesículas se mejoró cuando M. tuberculosis estaba expuesta a una restricción de hierro, una condición encontrada por Mtb en el entorno huésped. Aquí se presenta un protocolo completo y detallado para aislar y purificar los vehículos eléctricos de las micobacterias con deficiencia de hierro. Se aplican métodos cuantitativos y cualitativos para validar los vehículos eléctricos purificados.
Introduction
Las vesículas extracelulares micobacterianas (MEV) son nanopartículas unidas a la membrana, de 60 a 300 nm de tamaño, liberadas naturalmente por micobacterias de crecimiento rápido y lento1. Los MEV liberados por micobacterias patógenas constituyen un mecanismo para interactuar con el huésped a través de proteínas inmunológicamente activas, lípidos y glucólidos secretados de manera concentrada y protegida2,3,4. Para caracterizar MEVs y comprender su biogénesis y funciones, son cruciales métodos estrictos y eficientes de purificación y validación de vesículas. Hasta ahora, los MEV se han aislado de los filtrados de cultivo de micobacterias cultivadas en un medio rico en hierro1,5,6,7,8.
Sin embargo, trabajos anteriores demostraron que la limitación del hierro estimula en gran medida la liberación de vesículas en Mtb, posiblemente para capturar hierro a través de mycobactin, un siderophore secretado en MEVs9. Aunque se han descrito procedimientos para el aislamiento de MEV de Mtb cultivadoen en medios de hierro alto, no se ha informado de una metodología eficiente para obtener MEV de cultivos de hierro bajos. Por lo tanto, el objetivo de este método es aislar, purificar y cuantificar los MEV obtenidos de cultivos de hierro bajos para que puedan ser utilizados para ensayos bioquímicos y funcionales y para el análisis de determinantes genéticos de la producción de vesículas en micobacterias.
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Protocol
1. Preparación del medio definido agotado de hierro
- Preparar 1 L de medio mínimo (MM) disolviendo 5 g de KH2PO4, 5 g de L-asparagina, 20 ml de glicerol, y 2 g de dextrosa en 900 ml de agua desionizada en un recipiente de plástico. Evite el vidrio para evitar la contaminación del hierro. Ajuste el pH a 6,8 con 5 NaOH y el volumen a 1 L con agua.
- Añadir 50 g de resina quelante metálica (MCR) y agitar suavemente con una barra de agitación magnética durante 24 h a 4oC. Esterilice y retire el MCR por filtración a través de una unidad de filtro de 0,22 m con un receptor de plástico. Para acelerar la filtración y evitar la obstrucción del filtro, deje que el sedimento de resina durante unos 30 minutos antes de la filtración.
NOTA: Este medio contiene menos de 2 m de hierro residual, según lo determinado por la espectroscopia de absorción atómica. - Suplemento MM con 0,5 mg/L de ZnCl2,40 mg/L de MgSO4y 0,1 mg/L de MnSO4. Por separado, preparar las existencias concentradas (1,000x) de cada uno de los suplementos de metal en agua desionizada y esterilizar por filtración antes de la suplementación MM. MM de metal suplementado con material de hierro agotado se denominará aquí MM de hierro bajo (LIMM).
- A partir de un stock de 50 mM de FeCl3 disuelto en 10 mM HCl, añadir 1 mL a 1 L de LIMM (concentración final de 50 M) para preparar MM de hierro alto (HIMM).
2. Crecimiento de las micobacterias en condiciones limitadas de hierro
- Descongelar 50 l de una población congelada de 15% de glicerol de Mtb y rayar una placa de agar complementada con 10% de enriquecimiento de ADN (5 g/L de albúmina, 2 g/L dextrosa y cloruro de sodio de 0,85 g/L, 0,2% glicerol y 0,05% de tween-80)10. Incubar la placa a 37oC hasta que las colonias sean visibles.
- Inocular una sola colonia de Mtb10 en 2 ml de caldo micobacteriano medio(Tabla de Materiales)complementado con enriquecimiento ADN. Incubar con agitación a 37oC.
- Deje que el cultivo de Mtb crezca hasta la fase logarítmica tardía (OD540 es 0,8). Para comprobar esto, mida el OD540 usando un espectrofotómetro.
- Esparcir 200 l del cultivo logarítmico tardío en las placas de agar micobacterianos(Tabla de Materiales)complementado con 0.2% de glicerol, 0.05% Tween-80, y ADN. Inocular al menos 5 placas. Incubar las placas a 37oC hasta que el crecimiento bacteriano sea visible como una capa de confluente. Esto toma 1 semana para Mtb.
- Humedezca un hisopo de algodón estéril en LIMM. Utilice este hisopo para recoger bacterias de las placas de agar e inocular 100 ml de LIMM para preparar una suspensión bacteriana concentrada con una DoP540 de 1,0 euros.
- Diluir esta suspensión 10 veces a 1 L con LIMM y dividirla en dos botellas de plástico estériles de 2 L, cada una de las cuales contenga 500 ml de cultivo.
- Saque 2 ml de cultivo y transfiéralo a un tubo de cultivo de 5 ml. Añadir 10 s de 10% vol/vol tyloxapol.
- Incubar las culturas a 37oC de pie durante 14 días.
3. Colección de MEVs
- Mida la OD540 del cultivo de 2 ml en el momento de la recolección. Hacer diluciones en serie 1:10 del cultivo y la placa 100 l de cada dilución en placas de agar con ADN y 0,05% de Tween-80.
- Transfiera el cultivo a cinco tubos centrífugos cónicos de 225 ml y centrífuga a 2.850 x g durante 7 min a 20 oC.
- Recoger el sobrenadante de cultivo con una pipeta de 50 ml y filtrar lo esterilizar a través de una unidad de filtro de 0,22 m.
4. Aislamiento de MEV
- Transfiera el filtrado de cultivo a un sistema de ultrafiltración de células agitadas colocado a 4 oC y filtre el concentrado a <50 psi a través de una membrana de corte de 100 kDa a 50 ml.
- Centrifugar el filtrado de cultivo concentrado a 15.000 x g durante 15 min a 4oC y recoger el sobrenadante.
- Centrifugar el filtrado de cultivo en tubos de ultracentrifugación de policarbonato a 100.000 x g durante 2 h a 4oC.
- Resuspenda los gránulos membranosos en un total de 1 ml de solución salina tamponada de fosfato estéril (PBS) mediante pipeteo suave.
- Mezclar 0,5 ml de la suspensión de pellets obtenida en el paso 4.4 con 1,5 ml de solución de iodixanol al 60%, produciendo una concentración final de iodixanol del 45% wt/vol. Dispensar esta mezcla en la parte inferior de un tubo ultracentrífugo de pared delgada de polipropileno de 13 mm x 51 mm.
- Superponer la suspensión MEV-iodixanol 45% con 1 ml de 40%, 35%, 30%, 25% y 20% (vol/vol en PBS) soluciones de iodixanol y 1 ml de PBS en la parte superior.
- Centrífuga a 100.000 x g durante 18 h a 4oC.
- Recoja las fracciones de gradiente de densidad de 1 ml a partir de la parte superior utilizando una jeringa Hamilton de 1 ml.
- Diluir cada fracción recogida a 20 ml con PBS y centrifugar a 100.000 x g durante 2 h a 4 oC.
- Retire el sobrenadante y suspenda el pellet en 0,5 ml de PBS. Conservar este pellet a 4oC.
5. Cuantificación de MEV
- Mida la concentración de proteínas en cada fracción mediante un ensayo de Bradford(Tabla de materiales),siguiendo las directrices del fabricante.
-
Realizar análisis de lípidos de membrana.
- Incubar 10 l de cada fracción de gradiente con la sonda de membrana fluorescente 1-(4-Trimethylammoniumphenyl)-6-Phenyl-1,3,5-Hexatriene p-Toluenesulfonato (TMA-DPH) a una concentración final de 1 g/ml en un volumen final de 50 ol de PBS en 96 pocillos negros (TMA-DPH) a una concentración final de 1 g/ml en un volumen final de 50 ol de PBS en 96 pocillos negros (TMA-DPH) a una concentración final de 1 g/ml en un volumen final de 50 ol de PBS en 96 pocillos in 96 pocillos negros (TMA-DPH) a una concentración final de 1 g/ml en un volumen final de 50 ol de PBS en 96 pocillos negros (TMA-DPH) a una concentración final de 1 g/ml en un volumen final de 50 ol de PBS en 96 pocillos negros (TMA-DPH) a una concentración final de 1 g/ml en un volumen final de 50 ol de PB Placas.
- Incubar las placas a 33oC durante 20 min.
- Mida la fluorescencia a 360 nm de excitación y 430 nm de emisión.
6. Análisis cualitativo de los MEV
-
Realizar electroforesis proteica.
- Mezclar aproximadamente 1 g de muestras de MEV en 16 l con 4 l de tampón de carga de muestras de 5x (10% p/v SDS, 10 mM dithiothreitol, 20% v/v glicerol 0,2 M Tris-HCl, pH 6,8 0,05% p/v bromophenolazul azul) y calentar las muestras en tampón de muestra a 85 oC durante 5 minutos.
- Cargar en un gel11 Tris/Glycine SDS-poliacrilamida al 10% y correr a 10 V/cm en tampón de carrera (base Tris de 25 mM, glicina de 190 mM, 0,1% SDS) hasta que el frente del tinte azul llegue al fondo del gel.
- Manchar el gel con una solución de tinción de proteínas ultrasensible(Tabla de materiales).
-
Realice la mancha de puntos.
- Cargar 2 ml de una suspensión MEV con una concentración de aproximadamente 0,5 g/l, y diluciones en serie dobles en una membrana de nitrocelulosa y procesar una mancha de puntos de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Utilizar un antisuero criado en ratones contra una preparación de MEVs con una dilución de 1:5.000 como anticuerpo primario y un antiratón de cabra acoplado a la peroxidasa de rábano picante (HRP) a una dilución de 1:10.000 como anticuerpo secundario. Detecte complejos de anticuerpos antigen con un reactivo de detección de blotting de sustrato HRP adecuado y un sistema de imágenes.
-
Realice tinción negativa y microscopía electrónica.
- Fijar 250 éL de MEVs con 2% de glutaraldehído en 0,1 M de cacodilato a temperatura ambiente durante 2 h e incubar durante la noche en 4% de formaldehído, 1% de glutaraldehído y 0,1% PBS.
- Mancha las muestras fijas con tetróxido de osmio al 2% durante 90 min.
- Deshidratar en serie la muestra en etanol e incrustar la resina epoxi de Spurr.
- Observe los MEV bajo un microscopio electrónico de transmisión.
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Representative Results
Los MEV fueron purificados por sedimentación diferencial en un gradiente de densidad(Figura 1, Figura 2). En las condiciones descritas, los MEV se separaron principalmente en la fracción de gradiente 3 (F3), que corresponde al 25% de iodixanol. Esta conclusión se basa en la detección de proteínas, lípidos de membrana, visualización microscópica de MEV intactos, distribución del tamaño de nanopartículas y reactividad positiva con un antisuero antivo(Figura 2, Figura 3). La concentración de proteínas y lípidos normalizada a unidades formadoras de colonias (Unidades formadoras de colonias) mostró un aumento de aproximadamente ocho veces el rendimiento MEV en hierro bajo en relación con las condiciones elevadas de hierro (50 M FeCl3)(Figura 3). Aunque se presentan los resultados de un experimento representativo, este es un resultado altamente reproducible basado en múltiples (>10) aislamientos de MEV. El rendimiento MEV puro obtenido a partir de un cultivo de hierro bajo de 1 L por este método fue de aproximadamente 500 g de proteína.
Figura 1: Representación esquemática de la metodología utilizada para la purificación y cuantificación del MEV. Las micobacterias cultivadas en placas de agar se utilizaron para inocular un medio mínimo agotado de hierro y cultivar Mtb para el aislamiento EV. Los MEV fueron purificados por un gradiente de densidad discontinua del filtrado de cultivo libre de células. Se implementó una combinación de determinación de lípidos de membrana y proteína de vesícula, microscopía y análisis de nanopartículas para caracterizar LOS MEV purificados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Caracterización de MEV purificados. (A) Se muestran fotografías de una separación de gradiente de densidad real de MEV crudos y el pellet de MEV purificados recogidos por ultracentrifugación de la fracción de gradiente 3 (F3). (B) Teñida sDS-gel que muestra el perfil proteico de las distintas fracciones de gradiente de densidad. (C) Análisis de manchas de puntos que muestra proteínas asociadas a la vesícula concentradas en F3. (D) MEV presentes en F3 observados por tinción negativa. (E) Distribución del tamaño MEV según el análisis de nanopartículas (NTA). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Análisis comparativo del rendimiento MEV en cultivos de hierro bajos y altos. Un resultado representativo de(A)cuantificación de proteínas y lípidos y (B) análisis de manchas de puntos de MEV purificados aislados de cultivos Mtb limitados en hierro y hierro suficiente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Múltiples métodos para purificar exosomas derivados de células eucariotas se han desarrollado12. Por el contrario, hay información limitada sobre métodos eficaces para purificar los vehículos eléctricos derivados de bacterias7. El aislamiento eficiente de los vehículos eléctricos derivados de Mtb debe tener en cuenta las dificultades intrínsecas en el crecimiento de esta micobacterium patógena. Mtb tiene un largo tiempo de división (24 h) y debe manejarse en condiciones de nivel de bioseguridad tres (BSL-3). Por lo tanto, es importante optimizar la eficiencia de los métodos de aislamiento MEV. Debido a que las micobacterias liberan glucólidos y otras moléculas hidrofóbicas que agregan y contaminan fácilmente las preparaciones MEV brutas en el medio, es importante purificar y validar los MEV antes de realizar estudios bioquímicos y funcionales. Sobre la base de observaciones anteriores que demostraron que Mtb mejora la liberación de MEV en condiciones de limitación de hierro, se estableció un protocolo para la purificación de EV a partir de micobacterias limitadas por hierro. También se ha confirmado que M. smegmatis no virulenta también aumenta la liberación de vehículos eléctricos en respuesta a condiciones de hierro bajas (datos no mostrados). Por lo tanto, el mismo protocolo podría utilizarse para purificar los vehículos eléctricos de esta bacteria en condiciones BSL-2.
Un paso crítico de este procedimiento es la preparación del medio de hierro bajo. Este medio debe prepararse como se describe aquí y almacenarse en un recipiente de plástico, no en vidrio, para evitar la contaminación del hierro. Deben evitarse los suplementos comúnmente utilizados en el medio de crecimiento de Mtb para estimular el crecimiento bacteriano y prevenir el aglutinamiento micobacteriano característico, como la albúmina sérica bovina, Tween-80 o tyloxapol. Estos aditivos conducen a artefactos complejos de lipoproteínas que copurify con vesículas y reducen el rendimiento de la vesícula. Para la determinación de la CFU, un pequeño cultivo en medio complementado con detergente (Tween-80 o tyloxapol) se puede establecer en paralelo al gran cultivo libre de detergente. Los MEV en el filtrado de cultivo son estables a 4 oC durante varios días. Por lo tanto, si no se procesa inmediatamente, el filtrado de cultivo se puede almacenar refrigerado.
El rendimiento total del MEV purificado a partir de 1 L de cultivo fue de alrededor de 500 g/L de proteína, que es suficiente para realizar múltiples análisis como proteómica, lipidómica y ensayos funcionales. Dependiendo del tipo de ensayo, se pueden aislar suficientes MEV de volúmenes más pequeños (es decir, 250 ml). Esto facilita el análisis comparativo de las condiciones y factores que influyen en la liberación del MEV.
Este es un método eficaz para purificar LOS MEV, pero tiene limitaciones. Es un procedimiento largo con múltiples pasos de ultracentrifugación. En el futuro, este método se comparará con la cromatografía de filtración de gel, y a medida que se descubren marcadores moleculares de MEV, se podrían implementar métodos de captura de afinidad. El entorno de acogida es limitado por el hierro, por lo que los MEV producidos por Mtb en un medio de hierro bajo están probablemente más estrechamente relacionados con los MEV producidos durante la infección y podrían proporcionar información relevante sobre el papel de los MEV en la patogénesis de la tuberculosis.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses.
Acknowledgments
Agradecemos a Rafael Prados-Rosales por compartir el antisera anti-MEV y Navneet Dogra por realizar análisis de seguimiento de nanopartículas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amicon stirred cell Model 108 | EMD Milipore | UFSC40001 | Cell Ultrafiltration system |
| BD Polypropilene 225 mL conical tubes | Fisher | 05-538-61 | Conical centrifuge tubes |
| Biomax 100 kDa cut-off ultrafiltration membrane | EMD Milipore | PBHK07610 | Ultrafiltration membrane |
| Chelex-100 resin | Bio-Rad | 142-2842 | Metal chelating resin |
| Middlebrook 7H10 Agar | BD Difco | 262710 | Mycobacterial Agar plates |
| Middlebrook 7H9 Broth | BD Difco | 271310 | Mycobacterial broth medium |
| Nitro cellulose blotting membrane | GE Healthcare | 10600001 | Blotting Membrane |
| Optiprep | Sigma | D1556 | Iodixanol |
| Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 mm x 89 mm | Beckman Coulter | 355618 | Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 mm x 89 mm |
| Polypropylene thin walled centrifuge tube 13 mm x 15 mm | Beckman Coulter | 344059 | Polypropylene thin walled centrifuge tube 13 mm x 15 mm |
| Protein Assay dye | BioRad | 5000006 | Bradford Protein Staining |
| SYPRO Ruby | Molecular Probes | S12000 | Ultrasensitive protein stain |
| TMA-DPH | Molecular Probes | T204 | 1-(4-Trimethylammoniumphenyl)-6-Phenyl-1,3,5-Hexatriene p-Toluenesulfonate |
| Vacuum filtration flasks | CellPro | V50022 | Filter Unit |
References
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