Summary
Mycobacterium tuberculosis zeigt eine erhöhte Produktion und Freisetzung von extrazellulären Vesikeln als Reaktion auf niedrige Eisenbedingungen. Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll zur Erzeugung niedriger Eisenbedingungen und Methoden zur Reinigung und Charakterisierung mykobakterieller extrazellulärer Vesikel, die als Reaktion auf Eisenmangel freigesetzt werden.
Abstract
Mykobakterien, einschließlich Mycobacterium tuberculosis (Mtb), dem Erreger der menschlichen Tuberkulose, setzen natürlich extrazelluläre Vesikel (EVs) frei, die immunologisch aktive Moleküle enthalten. Das Wissen über die molekularen Mechanismen der Vesikelbiogenese, den Gehalt der Vesikel und ihre Funktionen an der Pathogen-Host-Schnittstelle ist sehr begrenzt. Um diese Fragen zu lösen, sind strenge Verfahren für die Isolierung, Reinigung und Validierung von Elektrofahrzeugen erforderlich. Zuvor wurde festgestellt, dass die Vesikelproduktion verbessert wurde, wenn M. tuberculosis einer Eisenbeschränkung ausgesetzt war, ein Zustand, dem Mtb in der Wirtsumgebung begegnete. Hier wird ein vollständiges und detailliertes Protokoll zur Isolierung und Reinigung von Elektrofahrzeugen von eisenmangeligen Mykobakterien vorgestellt. Quantitative und qualitative Methoden werden angewendet, um gereinigte Elektrofahrzeuge zu validieren.
Introduction
Mykobakterielle extrazelluläre Vesikel (MEVs) sind membrangebundene Nanopartikel mit einer Größe von 60 bis 300 nm, die natürlicherweise von schnell- und langsam wachsenden Mykobakterien freigesetzt werden1. MEVs, die von pathogenen Mykobakterien freigesetzt werden, bilden einen Mechanismus, um mit dem Wirt über immunologisch aktive Proteine, Lipide und Glykolipide zu interagieren, die konzentriert und geschützt abgesondert werden2,3,4. Um MEVs zu charakterisieren und ihre Biogenese und Funktionen zu verstehen, sind strenge und effiziente Methoden der Vesikelreinigung und -validierung von entscheidender Bedeutung. Bisher wurden MEVs aus den Kulturfiltraten von Mykobakterien isoliert, die in einem eisenreichenMedium1,5,6,7,8angebaut wurden.
Frühere Arbeiten zeigten jedoch, dass die Eisenbegrenzung die Freisetzung von Vesikel in Mtb stark stimuliert, möglicherweise um Eisen über Mycobactin zu fangen, ein Siderophor, das in MEVs9abgesondert wird. Obwohl Verfahren für die Isolierung von MEVs von Mtb, die in eisenhohem Medium kultiviert wurden, beschrieben wurden, wurde keine effiziente Methode zur Gewinnung von MEVs aus eisenarmen Kulturen beschrieben. Daher ist das Ziel dieser Methode, MEVs aus niedrigen Eisenkulturen zu isolieren, zu reinigen und zu quantifizieren, so dass sie für biochemische und funktionelle Tests und für die Analyse genetischer Determinanten der Vesikelproduktion in Mykobakterien verwendet werden können.
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Protocol
1. Vorbereitung des eisenabschöpfungsorientierten definierten Mediums
- Bereiten Sie 1 l minimalen Medium (MM) durch Auflösen von 5 g KH2PO4, 5 g L-Asparagin, 20 ml Glycerin und 2 g Dextrose in 900 ml entionisiertem Wasser in einem Kunststoffbehälter vor. Vermeiden Sie Glas, um Eisenkontamination zu verhindern. Stellen Sie den pH-Wert auf 6,8 mit 5 N NaOH und das Volumen auf 1 L mit Wasser ein.
- 50 g Metallchelatharz (MCR) hinzufügen und vorsichtig mit einem magnetischen Rührstab für 24 h bei 4 °C rühren. Sterilisieren und entfernen Sie den MCR durch Filtration durch eine 0,22 m Filtereinheit mit einem Kunststoffempfänger. Um die Filtration zu beschleunigen und Filterverstopfungen zu verhindern, lassen Sie das Harz sedimentieren für ca. 30 min vor der Filtration.
HINWEIS: Dieses Medium enthält weniger als 2 M Resteisen, wie durch atomare Absorptionsspektroskopie bestimmt. - Ergänzung MM mit 0,5 mg/L ZnCl2, 40 mg/L mgSO4und 0,1 mg/L MnSO4. Separat, bereiten konzentrierte Bestände (1.000x) der Metallergänzungen in entionisiertem Wasser und sterilisieren durch Filtration vor MM-Supplementierung. Eisenabbau, metallergänztmm wird hier als low iron MM (LIMM) bezeichnet.
- Aus einem 50 mM Lager von FeCl3 in 10 mM HCl gelöst, fügen Sie 1 ml bis 1 L LIMM (50 M Endkonzentration) zu hohen Eisen MM (HIMM) vorzubereiten.
2. Heranwachsende Mykobakterien unter eisenbegrenzten Bedingungen
- 50 l eines gefrorenen 15% Glycerinbestandes von Mtb auftauen und eine Agarplatte mit 10% ADN-Anreicherung (5 g/L Albumin, 2 g/L Dextrose und 0,85 g/L Natriumchlorid, 0,2% Glycerin und 0,05% Tween-80)10streichen. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C, bis Kolonien sichtbar sind.
- Impfen Sie eine einzelne Kolonie von Mtb10 in 2 ml mykobakteriellebrües Brühemedium (Tisch aus Materialien) ergänzt mit ADN-Anreicherung. Mit Rührung bei 37 °C inkubieren.
- Lassen Sie die Mtb-Kultur bis zur späten logarithmischen Phase wachsen (OD540 ist 0,8 ). Um dies zu überprüfen, messen Sie den OD540 mit einem Spektralphotometer.
- Verteilen Sie 200 l der späten logarithmischen Kultur auf die mykobakteriellen Agarplatten (Materialtabelle), ergänzt mit 0,2% Glycerin, 0,05% Tween-80 und ADN. Impfen Sie mindestens 5 Platten. Inkubieren Sie die Platten bei 37 °C, bis das Bakterienwachstum als Konfluentschicht sichtbar ist. Dies dauert 1 Woche für Mtb.
- Nass einen sterilen Wattestäbchen in LIMM. Verwenden Sie diesen Tupfer, um Bakterien aus den Agarplatten zu sammeln und 100 ml LIMM zu impfen, um eine konzentrierte bakterielle Suspension mit einem OD540 von 1,0 zu zu zubereiten.
- Verdünnen Sie diese Suspension 10 mal auf 1 L mit LIMM und teilen Sie sie in zwei, 2 L sterile Kunststoffflaschen, die jeweils 500 ml Kultur enthalten.
- Nehmen Sie 2 ml Kultur heraus und übertragen Sie sie in eine 5 ml Kulturröhre. Fügen Sie 10 l von 10% vol/vol tyloxapol hinzu.
- Inkubieren Sie die Kulturen bei 37 °C stehend für 14 Tage.
3. Sammlung von MEVs
- Messen Sie die OD540 der 2-ml-Kultur zum Zeitpunkt der Sammlung. Machen Sie 1:10 serielle Verdünnungen der Kultur und Platte 100 l jeder Verdünnung auf Agarplatten mit ADN und 0,05% Tween-80.
- Übertragen Sie die Kultur auf fünf 225 ml konische Zentrifugenrohre und Zentrifuge bei 2.850 x g für 7 min bei 20 °C.
- Sammeln Sie den Kulturüberstand mit einer 50 ml Pipette und filtern Sie ihn durch eine 0,22 m Filtereinheit.
4. Isolierung von MEVs
- Übertragen Sie das Kulturfiltrat in ein bei 4 °C platziertes Gerührzell-Ultrafiltrationssystem und filtern Sie das Konzentrat bei <50 psi durch eine 100 kDa-Grenzmembran auf 50 ml.
- Zentrifugieren Sie das konzentrierte Kulturfiltrat bei 15.000 x g für 15 min bei 4 °C und sammeln Sie den Überstand.
- Zentrifugieren Sie das Kulturfiltrat in Polycarbonat-Ultrazentrifugationsröhrchen bei 100.000 x g für 2 h bei 4 °C.
- Die membranösen Pellets in insgesamt 1 ml steriler Phosphatgepufferte Saline (PBS) durch sanfteS Pipettieren wieder aufhängen.
- Mischen Sie 0,5 ml der in Schritt 4,4 erhaltenen Pelletsuspension mit 1,5 ml 60% Iodixanollösung, was zu einer endgültigen Iodixanolkonzentration von 45% wt/vol führt. Geben Sie diese Mischung an der Unterseite eines 13 mm x 51 mm Polypropylen dünnwandigen Ultrazentrifugenrohres aus.
- Überlagern Sie die MEV-Iodixanol 45% Suspension mit 1 ml von 40%, 35%, 30%, 25% und 20% (vol/vol in PBS) Iodixanol-Lösungen und 1 ml PBS an der Spitze.
- Zentrifuge bei 100.000 x g für 18 h bei 4 °C.
- Sammeln Sie die 1 ml Dichtegradientenfraktionen von oben mit einer 1 ml Hamilton Spritze.
- Jede gesammelte Fraktion mit PBS und Zentrifuge bei 100.000 x g für 2 h bei 4 °C auf 20 ml verdünnen.
- Entfernen Sie den Überstand und hängen Sie das Pellet in 0,5 ml PBS aus. Bewahren Sie dieses Pellet bei 4 °C auf.
5. Quantifizierung von MEVs
- Messen Sie die Proteinkonzentration in jeder Fraktion durch einen Bradford-Assay (Materialtabelle ),der den Richtlinien des Herstellers folgt.
-
Führen Sie eine Membranlipidanalyse durch.
- Inkubieren Sie 10 l jeder Gradientenfraktion mit der fluoreszierenden Membransonde 1-(4-Trimethylammoniumphenyl)-6-Phenyl-1,3,5-Hexatrien p-Toluenesulfonat (TMA-DPH) in einer Endkonzentration von 1 g/ml in einem abschließenden 50-L-Volumen von PBS in 96 gut schwarz Platten.
- Inkubieren Sie die Platten bei 33 °C für 20 min.
- Messen Sie die Fluoreszenz bei 360 nm Anregung und 430 nm Emission.
6. Qualitative Analyse von MEVs
-
Führen Sie Proteinelektrophorese durch.
- Mischen Sie ca. 1 g MEV-Proben in 16 l mit 4 l 5x Probenladepuffer (10% w/v SDS, 10 mM Dithiothreitol, 20% v/v Glycerin 0,2 M Tris-HCl, pH 6,8 0,05% w/v Bromphenolblau) und erhitzen die Proben im Probenpuffer bei 85 °C für 5 min.
- In einem 10% Tris/Glycine SDS-Polyacrylamid-Gel11 eintragen und bei 10 V/cm im Laufpuffer (25 mM Tris-Basis, 190 mM Glycin, 0,1% SDS) laufen, bis die blaue Farbstofffront den Boden des Gels erreicht.
- Färben Sie das Gel mit einer ultraempfindlichen Protein-Färbelösung (Tabelle der Materialien).
-
Führen Sie den Punktfleck aus.
- Laden Sie 2 l einer MEVs-Aufhängung mit einer Konzentration von ca. 0,5 g/l und zweifach serielle Verdünnungen auf eine Nitrocellulosemembran und Verfahren für einen Punktblot gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Verwenden Sie ein Antiserum, das bei Mäusen gegen eine Präparation von MEVs bei einer Verdünnung von 1:5.000 als primärer Antikörper und einer Mitmagerantimaus gekoppelt an Meerrettichperoxidase (HRP) bei einer Verdünnung von 1:10.000 als sekundärer Antikörper aufgezogen wird. Detektieren Sie Antigen-Antikörper-Komplexe mit einem geeigneten HRP-Substrat-Blotting Detection Reagenz und einem Bildgebungssystem.
-
Führen Sie negative Färbung und Elektronenmikroskopie durch.
- Fix 250 l MEVs mit 2% Glutaraldehyd in 0,1 m Cacodylat bei Raumtemperatur für 2 h und über Nacht in 4% Formaldehyd, 1% Glutaraldehyd und 0,1% PBS inkubieren.
- Die festen Proben mit 2% Osmiumtetroxid für 90 min färben.
- Die Probe seriell in Ethanol dehydrieren und in Spurrs Epoxidharz einbetten.
- Beobachten Sie die MEVs unter einem Transmissionselektronenmikroskop.
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Representative Results
MEVs wurden durch Differentialsedimentation in einem Dichtegradienten gereinigt (Abbildung 1, Abbildung 2). Unter den beschriebenen Bedingungen trennten sich DIE MEVs meist in Gradientenfraktion 3 (F3), was 25% Iodixanol entspricht. Diese Schlussfolgerung basiert auf dem Nachweis von Protein, Membranlipid, mikroskopischer Visualisierung intakter MEVs, Nanopartikelgrößenverteilung und positiver Reaktivität mit einem Antivesicle Antiserum (Abbildung 2, Abbildung 3). Die auf kolonienbildende Einheiten (KBE) normalisierte Protein- und Lipidkonzentration zeigte eine etwa achtfache Erhöhung der MEV-Ausbeute bei niedrigen Eisenbedingungen im Verhältnis zu hohen Eisenbedingungen (50 'M FeCl3) (Abbildung 3). Obwohl die Ergebnisse eines repräsentativen Experiments präsentiert werden, ist dies ein hochreproduzierbares Ergebnis, das auf mehreren (>10) Isolierungen von MEVs basiert. Der reine MEV-Ertrag, der bei dieser Methode aus einer 1 L niedrigen Eisenkultur gewonnen wurde, betrug etwa 500 g Protein.
Abbildung 1: Diagrammische Darstellung der methodik für die MEV-Reinigung und -Quantifizierung. Mykobakterien, die in Agarplatten angebaut wurden, wurden verwendet, um eisenentwässerte minimale Mittel zu impfen und Mtb für die EV-Isolierung zu wachsen. MEVs wurden durch einen diskontinuierlichen Dichtegradienten aus dem zellfreien Kulturfiltrat gereinigt. Eine Kombination aus Membranlipid- und Vesikelproteinbestimmung, Mikroskopie und Nanopartikelanalyse wurde implementiert, um gereinigte MEVs zu charakterisieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Charakterisierung gereinigter MEVs. (A) Gezeigt werden Fotografien einer tatsächlichen Dichtegradiententrennung von rohen MEVs und dem Pellet von gereinigten MEVs, die durch Ultrazentrifugierung der Gradientenfraktion 3 (F3) gesammelt werden. (B) SDS-Gel gebeizt, das das Proteinprofil der verschiedenen Dichtegradientenfraktionen zeigt. (C) Punktfleckanalyse, die vesikelassoziierte Proteine zeigt, die in F3 konzentriert sind. (D) MEVs in F3, beobachtet durch negative Färbung. (E) MEV-Größenverteilung nach Nanopartikelanalyse (NTA). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Vergleichende Analyse des MEV-Ertrags in niedrigen und hohen Eisenkulturen. Ein repräsentatives Ergebnis der (A) Protein- und Lipidquantifizierung und (B) Punktfleckanalyse von gereinigten MEVs, die aus eisenbegrenzten und eisenreichen Mtb-Kulturen isoliert sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Mehrere Methoden zur Reinigung von eukaryotischen Zell-abgeleiteten Exosomen wurden entwickelt12. Im Gegensatz dazu gibt es nur begrenzte Informationen über wirksame Methoden zur Reinigung von bakteriellen EVs7. Effiziente Isolierung von Mtb-abgeleiteten Elektrofahrzeugen muss die intrinsischen Schwierigkeiten beim Anbau dieses pathogenen Mycobacteriums berücksichtigen. Mtb hat eine lange Teilungszeit (24 h) und sollte unter Biosicherheitsstufe drei (BSL-3) Bedingungen behandelt werden. Daher ist es wichtig, die Effizienz von MEV-Isolationsmethoden zu optimieren. Da Mykobakterien Glykolipide und andere hydrophobe Moleküle freisetzen, die rohe MEV-Präparate in das Medium aggregieren und leicht kontaminieren, ist es wichtig, MEVs zu reinigen und zu validieren, bevor biochemische und funktionelle Studien durchgeführt werden. Basierend auf früheren Beobachtungen, die gezeigt haben, dass Mtb die Freisetzung von MEVs unter Bedingungen der Eisenbegrenzung verbessert, wurde ein Protokoll zur EV-Reinigung von eisenbegrenzten Mykobakterien erstellt. Es wurde auch bestätigt, dass nicht-virulent M. smegmatis auch die Freisetzung von Elektrofahrzeugen als Reaktion auf niedrige Eisenbedingungen erhöht (Daten nicht gezeigt). Daher könnte das gleiche Protokoll verwendet werden, um Elektrofahrzeuge von diesem Bakterium unter BSL-2-Bedingungen zu reinigen.
Ein kritischer Schritt dieses Verfahrens ist die Vorbereitung des eisenarmen Mediums. Dieses Medium sollte wie hier beschrieben hergestellt und in einem Kunststoffbehälter, nicht in Glas gelagert werden, um eine Eisenkontamination zu verhindern. Ergänzungen häufig in Mtb Wachstumsmedium verwendet, um bakterielles Wachstum zu stimulieren und verhindern, charakteristische mykobakterielle Verklumpung, wie Rinderserum Albumin, Tween-80, oder tyloxapol, muss vermieden werden. Diese Additive führen zu Lipoprotein-komplexen Artefakten, die mit Vesikeln kopurifizieren und die Vesikelausbeute reduzieren. Zur KBE-Bestimmung kann parallel zur waschmittelfreien Großkultur eine kleine, mittelergänzte Mediumkultur (Tween-80 oder tyloxapol) eingestellt werden. MEVs im Kulturfiltrat sind bei 4 °C für mehrere Tage stabil. Daher kann das Kulturfiltrat gekühlt gelagert werden, wenn es nicht sofort verarbeitet wird.
Der Gesamtertrag des gereinigten MEV aus 1 L Kultur betrug etwa 500 g/l Protein, was ausreicht, um mehrere Analysen wie Proteomik, Lipidomik und funktionelle Assays durchzuführen. Je nach Art des Assays können genügend MEVs von kleineren Volumina (d. h. 250 ml) isoliert werden. Dies erleichtert die vergleichende Analyse von Bedingungen und Faktoren, die die FREISETZUNG von MEV beeinflussen.
Dies ist eine effektive Methode, um MEVs zu reinigen, aber es hat Einschränkungen. Es ist ein langer Vorgang mit mehreren Ultrazentrifugationsschritten. In Zukunft wird diese Methode mit der Gelfiltrationschromatographie verglichen, und wenn molekulare Marker von MEVs entdeckt werden, könnten Affinitätserfassungsmethoden implementiert werden. Die Wirtsumgebung ist eisenbegrenzt, daher sind DIE von Mtb in einem eisenarmen Medium produzierten MEVs wahrscheinlich enger mit DEN während der Infektion produzierten MEVs verwandt und könnten relevante Erkenntnisse über die Rolle von MEVs bei der Tuberkulosepathogenese liefern.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Wir danken Rafael Prados-Rosales für die gemeinsame Nutzung der Anti-MEV-Antisera und Navneet Dogra für die Durchführung von Nanopartikel-Tracking-Analysen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amicon stirred cell Model 108 | EMD Milipore | UFSC40001 | Cell Ultrafiltration system |
| BD Polypropilene 225 mL conical tubes | Fisher | 05-538-61 | Conical centrifuge tubes |
| Biomax 100 kDa cut-off ultrafiltration membrane | EMD Milipore | PBHK07610 | Ultrafiltration membrane |
| Chelex-100 resin | Bio-Rad | 142-2842 | Metal chelating resin |
| Middlebrook 7H10 Agar | BD Difco | 262710 | Mycobacterial Agar plates |
| Middlebrook 7H9 Broth | BD Difco | 271310 | Mycobacterial broth medium |
| Nitro cellulose blotting membrane | GE Healthcare | 10600001 | Blotting Membrane |
| Optiprep | Sigma | D1556 | Iodixanol |
| Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 mm x 89 mm | Beckman Coulter | 355618 | Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 mm x 89 mm |
| Polypropylene thin walled centrifuge tube 13 mm x 15 mm | Beckman Coulter | 344059 | Polypropylene thin walled centrifuge tube 13 mm x 15 mm |
| Protein Assay dye | BioRad | 5000006 | Bradford Protein Staining |
| SYPRO Ruby | Molecular Probes | S12000 | Ultrasensitive protein stain |
| TMA-DPH | Molecular Probes | T204 | 1-(4-Trimethylammoniumphenyl)-6-Phenyl-1,3,5-Hexatriene p-Toluenesulfonate |
| Vacuum filtration flasks | CellPro | V50022 | Filter Unit |
References
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