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Immunology and Infection

철분 제한 마이코박테리아에 의해 생성된 세포외 소포의 격리 및 특성화

Published: October 31, 2019 doi: 10.3791/60359

Summary

결핵 균은 낮은 철 조건에 응하여 세포외 소포의 증가된 생산 그리고 방출을 보여줍니다. 이 작품은 철 결핍에 응하여 풀어 놓인 진균 세포외 소포의 정제 그리고 특성화를 위한 낮은 철 조건 및 방법을 생성하기 위한 프로토콜을 상세히 기술합니다.

Abstract

인간 결핵의 원인원인 인균인 결핵 균(Mtb)을 포함한 마이코박테리아는 면역학적 활성 분자를 함유하는 세포외 소포(EV)를 자연적으로 방출합니다. 소포 생물 발생의 분자 메커니즘, 소포의 함량 및 병원체 숙주 인터페이스에서의 기능에 관한 지식은 매우 제한적입니다. 이러한 문제를 해결하려면 EV의 격리, 정화 및 검증을 위한 엄격한 절차가 필요합니다. 이전에는 M. 결핵이 숙주 환경에서 Mtb에 의해 발생하는 조건인 철제한에 노출되었을 때 소포 생산이 강화되는 것으로 나타났습니다. 여기에 제시된 완전하고 상세한 프로토콜은 철결핍 균으로부터 전기자동차를 분리하고 정화하는 것입니다. 정제 된 전기 를 검증하기 위해 정량적 및 질적 방법이 적용됩니다.

Introduction

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진균성 세포밖 소포 (MEV)는 막 결합 된 나노 입자, 60-300 nm 크기로, 빠르고 느리게 성장하는 진균에 의해 자연적으로 방출됩니다1. 병원성 진균에 의해 방출된 MEV는 면역학적 활성 단백질, 지질 및 글리콜리피드를 통해 숙주와 상호 작용하는 메커니즘을 구성하여 농축 및 보호 방식으로분비되는 2,3,4. MEV를 특성화하고 생물 발생 및 기능을 이해하려면 소포 정화 및 검증의 엄격하고 효율적인 방법이 중요합니다. 지금까지 MEV는 철분이 풍부한 배지1,5,6,7,8에서자란 진균의 배양 여과체로부터 분리되어 왔다.

그러나, 전작에서는 철 제한이 Mtb에서 소포 방출을 크게 자극한다는 것을 보여주었으며, 아마도 MEV9에서분비되는 사이드로포어인 마이코박틴을 통해 철을 포착할 수 있습니다. 높은 철 배지에서 배양된 Mtb로부터의 MEV 격리 에 대한 절차가 설명되었지만, 낮은 철 배양물에서 MEV를 얻는 효율적인 방법은 보고되지 않았다. 따라서, 이 방법의 목적은 낮은 철 배양물에서 얻은 MEV를 분리, 정화 및 정량화하여 생화학 및 기능성 분석및 진균에서 소포 생산의 유전 적 결정요인의 분석에 사용될 수 있도록 하는 것입니다.

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Protocol

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1. 철분 고갈 정의 매체의 준비

  1. KH2 PO4,L-아스파라긴 5g,글리세롤 20 mL, 덱스트로오스 2g을 플라스틱 용기에 탈이온수 900 mL에 녹여 최소 배지(MM) 1L를 준비합니다. 철분 오염을 방지하기 위해 유리를 피하십시오. pH를 5 N NaOH로 6.8로 조정하고 부피를 물로 1L로 조정합니다.
  2. 금속 킬레이트 수지(MCR) 50g을 넣고 4°C에서 24시간 동안 마그네틱 교반 막대를 사용하여 부드럽게 교반합니다. 플라스틱 수신기가 있는 0.22 μm 필터 유닛을 통해 여과하여 MCR을 살균하고 제거합니다. 여과를 가속화하고 필터 막힘을 방지하기 위해, 여과 하기 전에 약 30 분 동안 수지 퇴적물을 보자.
    참고: 이 배지는 원자 흡수 분광법에 의해 결정된 2 μM 잔류 철보다 적습니다.
  3. ZnCl의 0.5 mg/L,MgSO4의40 mg/L, 그리고 0.1 mg/L의 MnSO4. 별도로, 탈이온수에서 각 금속 보충제의 농축 된 주식 (1,000x)을 준비하고 MM 보충 전에 여과하여 살균하십시오. 철고갈, 금속 보충 MM은 여기서 저철 MM(LIMM)이라고 한다.
  4. 10 mM HCl에 용해된 FeCl3의 50 mM 스톡에서 1 mL을 LIMM(50 μM 최종 농도)에 1mL추가하여 높은 철MM(HIMM)을 준비합니다.

2. 철분 제한 조건에서 마이코박테리아 재배

  1. Mtb의 냉동 15% 글리세롤 스톡 50 μL을 해동하고 10% ADN 농축(5 g/L 알부민, 2 g/L 덱스트로스, 0.85 g/L 염화나트륨, 0.2% 글리세롤 및 0.05% 트위든-80)으로 보충된 한천 플레이트를 줄무늬. 식민지가 보일 때까지 37 °C에서 접시를 배양하십시오.
  2. ADN 농축물로 보충된 진균 육수배지(재료 표)의2 mL에 Mtb10의 단일 콜로니를 접종합니다. 37 °C에서 교반으로 배양하십시오.
  3. Mtb 배양이 후기 로그 단계(OD540 ~0.8)로 성장하게 한다. 이를 확인하려면 분광광도계를 사용하여 OD540을 측정합니다.
  4. 0.2% 글리세롤, 0.05% 트웬-80, 및 ADN을 보충된 진균 한천플레이트(재료표)에후기 로그학 배양물의 200 μL을 퍼뜨리고. 적어도 5 개의 접시를 접종하십시오. 박테리아 성장이 동급층으로 보일 때까지 플레이트를 37°C에서 배양합니다. 이것은 Mtb에 대 한 ~ 1 주 걸립니다.
  5. LIMM에 멸균 면봉을 적시소. 이 면봉을 사용하여 한천 접시에서 박테리아를 수집하고 LIMM의 100 mL을 접종하여 ~ 1.0의 OD540으로 농축 된 세균 현탁액을 준비하십시오.
  6. 이 현탁액을 LIMM으로 10~1L로 희석하고 2L 멸균 플라스틱 병으로 나누고 각각 500 mL의 배양을 함유합니다.
  7. 배양 2 mL을 꺼내 5 mL 배양 튜브로 옮김을 옮김. 10% vol/vol tyloxapol의 10 μL을 추가합니다.
  8. 14일 동안 37°C에서 배양한다.

3. MEV의 컬렉션

  1. 수집 시 2 mL 배양의OD(540)를 측정한다. ADN과 0.05 % 트웬-80한천 플레이트에 배양 및 플레이트 100 μL의 직렬 희석을 합니다.
  2. 20°C에서 7분 동안 2,850 x g에서 5개의 225 mL 원원심분리기 및 원심분리기로 배양을 옮긴다.
  3. 50 mL 파이펫으로 배양 상류를 수집하고 0.22 μm 필터 유닛을 통해 필터를 살균합니다.

4. MEV의 격리

  1. 배양 여과액을 4°C에 배치한 교반 세포 초여과 시스템으로 옮기고 100 kDa 컷오프 막을 통해 <50 psi에서 농축물을 ~50 mL로 여과한다.
  2. 농축배양여체를 15,000 x g에서 4°C에서 15분 동안 15분 간 및 상급체를 수집한다.
  3. 4 °C에서 2 시간 동안 100,000 x g에서 폴리 카보네이트 초원심분리 튜브에서 배양 여과.
  4. 부드러운 파이펫팅으로 총 1 mL의 멸균 인산완충식염수(PBS)로 밀폐펠릿을 다시 일시 중단합니다.
  5. 4.4 단계에서 얻은 펠릿 현탁액의 0.5 mL을 60 % 이오디산놀 용액의 1.5 mL로 혼합하여 최종 이오디크산놀 농도를 45 % wt / vol. 13mm x 51mm 폴리 프로필렌 박막 박막 초원각지 튜브의 바닥에서이 혼합물을 분배합니다.
  6. MEV-이오디산올 45% 서스펜션을 40%, 35%, 30%, 25%, 20%(PBS의 vol/vol) iodixanol 용액과 1 mL의 PBS 상단에 오버레이합니다.
  7. 4 °C에서 18 시간 동안 100,000 x g의 원심 분리기.
  8. 1 mL 해밀턴 주사기를 사용하여 상단으로부터 시작하여 1 mL 밀도 그라데이션 분획을 수집합니다.
  9. 수집된 분획을 PBS 및 원심분리기로 각각 100,000 x g에서 4°C에서 2시간 동안 희석합니다.
  10. 상급체를 제거하고 PBS의 0.5 mL에서 펠릿을 일시 중단합니다. 이 펠릿을 4°C에 보관하십시오.

5. MEV정량화

  1. 제조업체의 지침에 따라 브래드포드분석(재료 표)을통해 각 분획의 단백질 농도를 측정합니다.
  2. 막 지질 분석을 수행합니다.
    1. 형광막 프로브 1-(4-트리메틸람모니우페닐)-6-페닐-1,3,5-헥사트리엔 p-톨루엔술포네이트(TMA-DPH)를 최종 농도에서 1 μg/mL의 최종 농도에서 90μg/mL의 최종 농도로 90μg/mL의 최종 농도로 각 그라데이션 분획의 배양 격판덮개.
    2. 플레이트를 33°C에서 20분 동안 배양합니다.
    3. 360 nm 여기 및 430 nm 방출에서 형광을 측정합니다.

6. MEV의 정성적 분석

  1. 단백질 전기 동동을 수행합니다.
    1. MEV 시료 약 1 μg를 16 μL에서 5x 시료 로딩 버퍼 4 μL(10% w/v SDS, 10 mM dithiothreitol, 20% v/v 글리세롤 0.2 M Tris-HCl, pH 6.8 0.05% w/v/v 브로모펜 올 블루)에 혼합하고 샘플 샘플을 C5°C에서 가열합니다.
    2. 10% 트리스/글리신 SDS-폴리아크릴아미드 젤11을 적재하고 완충완충(25mMTris 베이스, 190 mM 글리신, 0.1% SDS)에서 10V/cm에서 실행하여 청색 염료 전면이 겔의 바닥에 도달할 때까지 실행합니다.
    3. 젤을 초민감성 단백질 염색 용액(재료 표)으로염색하십시오.
  2. 도트 블롯을 수행합니다.
    1. 약 0.5 μg/μL의 농도로 MEV 서스펜션의 2 μL을 적재하고, 니트로셀룰로오스 멤브레인에 2중 직렬 희석을 하고 제조업체의 지침에 따라 도트 블롯을 처리합니다.
    2. 1:5,000의 희석에서 MEV의 제조에 대하여 마우스에서 기르는 항세럼을 1:5,000의 1차 항체및 고추냉이 과산화증(HRP)에 결합된 염소 항마우스를 1:10,000 희석된 이차 항체로서 사용한다. 적절한 HRP 기판 블로팅 검출 시약 및 이미징 시스템으로 항원 항체 복합체를 검출합니다.
  3. 네거티브 염색 및 전자 현미경 검사를 수행합니다.
    1. 250 μL의 MEV를 실온에서 0.1M 의 글루타랄데히드와 함께 2%의 글루타랄데히드를 2시간 동안 체온에서 수정하고 포름알데히드 4%, 글루타랄데히드 1%, PBS 0.1%로 밤새 배양합니다.
    2. 90 분 동안 2 % 오스뮴 테트 옥사이드로 고정 된 샘플을 염색하십시오.
    3. 샘플을 에탄올로 연속적으로 탈수시키고 Spurr의 에폭시 수지에 포함시다.
    4. 투과 전자 현미경으로 MEV를 관찰합니다.

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Representative Results

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MEV는 밀도 구배에서 차등 침전물을 정제하였다(도1, 도 2). 설명된 조건하에서, MEV는 대부분 25% 이오디산올에 해당하는 그라데이션 분획 3(F3)으로 분리되었다. 이러한 결론은 단백질, 막 지질, 손상되지 않은 MEV의 현미경 시각화, 나노입자 크기 분포, 및 항베제 항혈전을 통한 양성 반응성의 검출에 기초한다(도2, 도 3). 콜로니 형성 단위(CFUs)로 정규화된 단백질 및 지질 농도는 높은 철 조건에 비해 낮은 철분에서 MEV 수율의 약 8배 증가를 보였다(50 μM FeCl3)(그림 3). 한 가지 대표적인 실험의 결과가 제시되었지만, 이는 MEV의 다중(>10) 격리를 기반으로 매우 재현가능한 결과입니다. 이 방법에 의해 1 L 낮은 철 배양으로부터 얻은 순수한 MEV 수율은 약 500 μg의 단백질이었다.

Figure 1
그림 1: MEV 정제 및 정량화에 사용되는 방법론의 도식적 표현. 한천 플레이트에서 자란 마이코박테리아는 철분고갈을 막고 최소 배지를 접종하고 EV 격리를 위해 Mtb를 성장시키는 데 사용되었습니다. MEV는 무세포 배양 여과액으로부터 불연속 밀도 구배를 정제하였다. 정제된 MEV를 특성화하기 위해 막 지질 및 소포 단백질 측정, 현미경 검사법 및 나노입자 분석의 조합이 구현되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 정제된 MEV의 특성화. (A)도시된 사진은 그라데이션 분획 3(F3)의 초원심분리에 의해 수집된 정제된 MEV의 실제 밀도 구배 분리 및 정제된 MEV의 펠릿의 사진이다. (B)다양한 밀도 구배 분획의 단백질 프로파일을 나타내는 SDS-겔 염색. (C)F3에 농축된 소포 관련 단백질을 나타내는 도트 블롯 분석. (D)F3에 존재하는 MEV는 부정적인 염색에 의해 관찰된다. (E)나노 입자 분석 (NTA)에 따라 MEV 크기 분포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 저철 배양물에서 MEV 수율의 비교 분석. 대표적인 결과(A)단백질 및 지질 정량화 및(B)정제된 MEV의 도트 블롯 분석은 철분 제한 및 철분 충분한 Mtb 배양으로부터 분리되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

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진핵 세포 유래 엑소좀을 정화하는 여러 방법이12가지개발되었다. 이에 반해, 박테리아 유래 EV7을정화하는 효과적인 방법에 대한 정보는 제한적이다. Mtb 유래 전기 EV의 효율적인 격리는 이 병원성 진균을 성장에 있는 본질적인 어려움을 고려할 필요가 있습니다. Mtb는 긴 분할 시간 (~24 h)을 가지고 있으며 생물 안전 성 수준 3 (BSL-3) 조건에서 처리해야합니다. 따라서 MEV 절연 방법의 효율을 최적화하는 것이 중요합니다. 진균은 조잡한 MEV 제제를 배지로 쉽게 응집하고 쉽게 오염시키는 글리콜리파이드 및 기타 소수성 분자를 방출하기 때문에 생화학 및 기능적 연구를 수행하기 전에 MEV를 정화하고 검증하는 것이 중요합니다. Mtb가 철 제한 조건하에서 MEV의 방출을 향상시킨다는 것을 입증한 이전 관찰에 기초하여, 철 제한 진균에서 EV 정제를 위한 프로토콜이 설치되었습니다. 또한 비악성 M. 스메그마티스는 또한 낮은 철 조건 (데이터가 표시되지 않음)에 대한 응답으로 전기 EV의 방출을 증가시키는 것으로 확인되었다. 따라서, 동일한 프로토콜BSL-2 조건에서이 박테리아에서 전기 를 정화 하는 데 사용할 수 있습니다.

이 절차의 중요한 단계는 낮은 철 배지의 제조입니다. 이 매체는 여기에 설명된 대로 제조되어야하며 철 오염을 방지하기 위해 유리가 아닌 플라스틱 용기에 보관해야합니다. 세균 성장을 자극 하 고 특성 진균 덩어리를 방지 하기 위해 Mtb 성장 매체에 일반적으로 사용 되는 보충 교재, 소 혈 청 알 부 민 등, Tween-80, 또는 tyloxapol, 피해 야 한다. 이 첨가제는 소포와 공고하고 소포 수율을 감소시키는 지단백질 복잡한 유물로 이끌어 내보어집니다. CFU 판정을 위해, 세제(Tween-80 또는 tyloxapol)로 보충된 배지의 작은 배양액은 세제없는 큰 배양과 병행하여 설정될 수 있다. 배양 여과액 중의 MEV는 며칠 동안 4°C에서 안정하다. 따라서, 즉시 처리되지 않으면, 배양 여과액은 냉장 보관될 수 있다.

배양 1L로부터 정제된 MEV의 총 수율은 약 500 μg/L 단백질이었으며, 이는 프로테오믹스, 지질학 및 기능성 분석과 같은 여러 분석을 수행하기에 충분합니다. 분석 의 유형에 따라, 충분한 ME는 더 작은 볼륨 (즉, 250 mL)에서 분리 될 수있다. 이는 MEV 방출에 영향을 미치는 조건 및 요인의 비교 분석을 용이하게 합니다.

이것은 MEV를 정화하는 효과적인 방법이지만 한계가 있습니다. 그것은 여러 초원심분리 단계가있는 긴 절차입니다. 미래에, 이 방법은 젤 여과 크로마토그래피와 비교될 것이고, MEV의 분자 마커가 발견될 때, 친화성 포착 방법이 구현될 수 있었다. 숙주 환경은 철 제한적이므로 낮은 철 배지에서 Mtb에 의해 생성된 MEV는 감염 중에 생성된 MEV와 더 밀접하게 관련되어 있으며 결핵 발병기전에서 MEV의 역할에 대한 관련 통찰력을 제공할 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 이해관계의 충돌이 없습니다.

Acknowledgments

우리는 나노 입자 추적 분석을 수행하기위한 안티 MEV 항 세라와 Navneet 도그라를 공유 라파엘 프라도스 - 로살레스에 감사드립니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amicon stirred cell Model 108 EMD Milipore UFSC40001 Cell Ultrafiltration system
BD Polypropilene 225 mL conical tubes Fisher 05-538-61 Conical centrifuge tubes
Biomax 100 kDa cut-off ultrafiltration membrane EMD Milipore PBHK07610 Ultrafiltration membrane
Chelex-100 resin Bio-Rad 142-2842 Metal chelating resin
Middlebrook 7H10 Agar BD Difco 262710 Mycobacterial Agar plates
Middlebrook 7H9 Broth BD Difco 271310 Mycobacterial broth medium
Nitro cellulose blotting membrane GE Healthcare 10600001 Blotting Membrane
Optiprep Sigma D1556 Iodixanol
Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 mm x 89 mm Beckman Coulter 355618 Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 mm x 89 mm
Polypropylene thin walled centrifuge tube 13 mm x 15 mm Beckman Coulter 344059 Polypropylene thin walled centrifuge tube 13 mm x 15 mm
Protein Assay dye BioRad 5000006 Bradford Protein Staining
SYPRO Ruby Molecular Probes S12000 Ultrasensitive protein stain
TMA-DPH Molecular Probes T204 1-(4-Trimethylammoniumphenyl)-6-Phenyl-1,3,5-Hexatriene p-Toluenesulfonate
Vacuum filtration flasks CellPro V50022 Filter Unit

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References

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Gupta, S., Marcela Rodriguez, G. Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles Produced by Iron-limited Mycobacteria. J. Vis. Exp. (152), e60359, doi:10.3791/60359 (2019).More

Gupta, S., Marcela Rodriguez, G. Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles Produced by Iron-limited Mycobacteria. J. Vis. Exp. (152), e60359, doi:10.3791/60359 (2019).

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