Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Изоляция и характеристика внеклеточных пузырьков, производимых железо-ограниченным имикобактериями

Published: October 31, 2019 doi: 10.3791/60359

Summary

Микобактерия туберкулеза показывает увеличение производства и высвобождение внеклеточных пузырьков в ответ на низкие железные условия. Эта работа детали протокола для генерации низких железных условий и методов для очистки и характеристики микобактериальных внеклеточных пузырьков, выпущенных в ответ на дефицит железа.

Abstract

Микобактерии, в том числе Микобактерии туберкулеза (МТБ), возбудителя туберкулеза человека, естественным образом высвобождают внеклеточные пузырьки (ЭВ), содержащие иммунологически активные молекулы. Знания о молекулярных механизмах везиклового биогенеза, содержании пузырьков и их функциях при патогенно-хост-интерфейсе очень ограничены. Решение этих вопросов требует строгих процедур для изоляции, очистки и проверки EVs. Ранее было установлено, что производство везикл было увеличено, когда М. туберкулез подвергался воздействию ограничения железа, состояние, с которым сталкивается Mtb в принимающей среде. Представлен полный и подробный протокол для изоляции и очистки EVs от железодефицитных микобактерий. Количественные и качественные методы применяются для проверки очищенных ЭВ.

Introduction

Микобактериальные внеклеточные пузырьки (MEV) являются мембранными наночастицами, размером 60-300 нм, естественно выделяемых быстро- и медленно растущими микобактериями1. МЕВ, высвобождаемые патогенными микобактериями, представляют собой механизм взаимодействия с хозяином с помощью иммунологически активных белков, липидов и гликолипидов, выделяемых концентрированным и защищенным образом2,3,4. Для характеристики МЭВ и понимания их биогенеза и функций, строгие и эффективные методы очистки везикулы и проверки имеют решающее значение. До сих пор, MEVs были изолированы от культуры фильтратов микобактерий, выращенных в богатых железом среде1,5,6,7,8.

Тем не менее, предыдущая работа показала, что ограничение железа значительно стимулирует высвобождение везикля в Mtb, возможно, для захвата железа с помощью микобактина, siderophore выделяется в MEVs9. Хотя процедуры изоляции МЭВ от Mtb, культивированные в высокой железной среде, были описаны, эффективной методологии получения МЭВ из низкой культуры железа не сообщалось. Таким образом, цель этого метода состоит в том, чтобы изолировать, очистить и количественно MEVs, полученные из низких культур железа, так что они могут быть использованы для биохимических и функциональных анализов и для анализа генетических детерминантов везиклов производства в микобактериях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка истощенного железом определяемого среднего

  1. Приготовьте 1 л минимальной средней (ММ) путем растворения 5 г KH2PO4,5 г L-аспарагина, 20 мл глицерола и 2 г декстроза в 900 мл деионизированной воды в пластиковом контейнере. Избегайте стекла, чтобы предотвратить загрязнение железа. Отрегулируйте рН до 6,8 с 5 N NaOH и объем до 1 л с водой.
  2. Добавьте 50 г металлической хелатирующей мизины (MCR) и осторожно агитировать с помощью магнитной перемешивания бар для 24 ч при 4 c. Стерилизовать и удалить MCR путем фильтрации через 0,22 мкм фильтр аудиенции с пластиковым приемником. Для ускорения фильтрации и предотвращения засорения фильтра, пусть осадка отложения около 30 минут до фильтрации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта среда содержит менее 2 мкм остаточного железа, как это определено атомной спектроскопии поглощения.
  3. Дополнение ММ с 0,5 мг/л nCl2, 40 мг/л MgSO4, и 0,1 мг/л MnSO4. Отдельно подготовьте концентрированные запасы (1000x) каждого из металлических добавок в деионизированной воде и стерилизуют путем фильтрации перед мМ добавками. Утюг-обед, металл дополненный MM будет refer here как низкий утюг MM (LIMM).
  4. Из 50 мМ запас FeCl3 растворяется в 10 мМ HCl, добавить 1 мл до 1 л ЛИММ (50 мм конечной концентрации) для подготовки высокой железной ММ (HIMM).

2. Выращивание микобактерий в условиях, ограниченных железом

  1. Оттепели из 50 л замороженных 15% глицерола запасов Mtb и полоса агар пластины дополняется 10% ADN обогащения (5 г / л альбумина, 2 г / л декстроза, и 0,85 г / л хлорид натрия, 0,2% глицерола и 0,05% Tween-80)10. Инкубировать пластину при 37 градусах Цельсия, пока не будут видны колонии.
  2. Прививать одну колонию Mtb10 в 2 мл микобактериального бульона среды (Таблица материалов) дополнены обогащения ADN. Инкубировать с возбуждением при 37 градусах Цельсия.
  3. Пусть культура Mtb вырастет до поздней стадии логарифмического (OD540 - 0,8 евро). Чтобы проверить это, измерьте OD540 с помощью спектрофотометра.
  4. Распространение 200 зл и культуры позднего логарифмического на микобактериальные агар пластины(Таблица материалов) дополнены 0,2% глицерола, 0,05% Tween-80, и ADN. Привить не менее 5 пластин. Инкубировать пластины при 37 градусах Цельсия до тех пор, пока бактериальный рост не будет виден как сливовый слой. Это занимает 1 неделю для Mtb.
  5. Влажный стерильный ватный тампон в LIMM. Используйте этот тампон для сбора бактерий из агар пластин и привить 100 мл LIMM для подготовки концентрированной бактериальной подвески с OD540 из 1,0.
  6. Разбавить эту подвеску 10 раз до 1 л с LIMM и разделить его на две, 2 л стерильных пластиковых бутылок, каждая из которых содержит 500 мл культуры.
  7. Выняйте 2 мл культуры и перенесите его в культурную трубку 5 мл. Добавьте 10 зл 10% vol/vol tyloxapol.
  8. Инкубировать культуры при 37 градусов по Цельсию стоя в течение 14 дней.

3. Коллекция МЕВ

  1. Измерьте OD540 культуры 2 мл на момент сбора. Сделать 1:10 серийных разбавления культуры и пластины 100 л каждого разбавления на агар пластины с ADN и 0,05% Tween-80.
  2. Перенесите культуру на пять конических центрифуговых трубок 225 мл и центрифугу при 2850 х г в течение 7 мин при 20 градусах Цельсия.
  3. Соберите культурный супернатант с помощью пипетки 50 мл и фильтр стерилизуйте его через блок фильтра 0,22 мкм.

4. Изоляция МЕВ

  1. Перенесите культурный фильтрат в перемешанную систему ультрафильтрации клеток, расположенную при 4 градусах по Цельсию, и процедите концентрат на уровне 100 кВт с мембраной до 50 мл.
  2. Centrifuge концентрированной культуры фильтрата на 15000 х г в течение 15 минут при 4 кв и собирать супернатант.
  3. Центрифуги культуры фильтрации в поликарбонатных ультрацентрифугных труб при 100000 х г на 2 ч при 4 градусах Цельсия.
  4. Отдохните membranous гранулы в общей сложности 1 мл стерильных фосфатов буферного солей (PBS) путем нежного пипеттинг.
  5. Смешайте 0,5 мл гранулированной подвески, полученной в шаге 4.4 с 1,5 мл 60% раствора йодиксанола, что дает окончательную концентрацию йодиксанола в 45% wt/vol. Распределите эту смесь в нижней части 13 мм х 51 мм полипропилена тонкой стеной ультрацентрифуге трубки.
  6. Наложение MEV-iodixanol 45% подвески с 1 мл 40%, 35%, 30%, 25%, и 20% (vol/vol в PBS) йодиксанол решений и 1 мл PBS в верхней части.
  7. Центрифуга при 100 000 х г на 18 ч при 4 градусах Цельсия.
  8. Соберите 1 мЛ градиентных фракций плотности, начиная с верхней с помощью 1 мл Шприц Гамильтон.
  9. Разбавить каждую собранную фракцию до 20 мл с PBS и центрифугой при 100 000 х г на 2 ч при 4 градусах Цельсия.
  10. Удалить супернатант и приостановить гранулы в 0,5 мл PBS. Храните эту гранулу при 4 градусах Цельсия.

5. Количественная оценка МЕВ

  1. Измерьте концентрацию белка в каждой фракции по анализу Брэдфорда(Таблица материалов),следуя рекомендациям производителя.
  2. Выполняйте мембранный липидный анализ.
    1. Инкубировать 10 злитровую фракцию с флуоресцентным мембранным зондом 1-(4-Триметилламмонимфенил)-6-фенил-1,3,5-Hexatriene р-Toluenesulfonate (TMA-DPH) при конечной концентрации 1 мкг/мл в окончательном 50 мл объема PBS в 96 хорошо черный Пластины.
    2. Инкубировать пластины при 33 градусах по Цельсию в течение 20 мин.
    3. Измерьте флуоресценцию при 360 нм возбуждении и 430 нм эмиссии.

6. Квалификационный анализ МЕВ

  1. Выполните белковый электрофорез.
    1. Смешайте примерно 1 мкг образцов MEV в 16 л с 4 qL 5x образец погрузки буфера (10% W/V SDS, 10 мм дитиотрейтол, 20% v/v глицерол 0,2 M Tris-HCl, pH 6,8 05% w/v SDS, 10 мМ дитиотрейтол, 20% v/v глицерол 0,2 M Tris-HCl, pH 6.8 0.05% w/v
    2. Загрузите в 10% Tris/Glycine SDS-полиакриламид гель11 и запустить на 10 V/cm в бегущий буфер (25 мм Tris базы, 190 мм глицин, 0,1% SDS) до синего красителя фронт достигает нижней части геля.
    3. Пятно гель с ультрачувствительным раствором окрашивания белка (Таблица материалов).
  2. Выполните точечную помотку.
    1. Загрузите 2 злицы подвески МЭВ с концентрацией около 0,5 мкг/Зл, а также двукратные серийные разбавления на мембрану нитроцеллюлозы и процесс для точки пятно в соответствии с инструкциями производителя.
    2. Используйте антисыворотку, выращенную у мышей, против подготовки МЭВ при разбавлении 1:5,000 в качестве основного антитела и козьего антимышки в сочетании с пероксидазах хрена (HRP) при 1:10,000 разбавления в качестве вторичного антитела. Обнаружение антиген-антител комплексов с соответствующим субстратом HRP Blotting Detection Reagent и системой визуализации.
  3. Выполните отрицательную окрашивание и электронную микроскопию.
    1. Исправить 250 Л МЕВ с 2% глютаральдегида в 0,1 м какодилат при комнатной температуре в течение 2 ч и инкубировать ночь в 4% формальдегида, 1% глутаральдегида, и 0,1% PBS.
    2. Пятно фиксированных образцов с 2% тетроксид осмия в течение 90 мин.
    3. Серийно обезвоживают образец в этаноле и встраивают в эпоксидную смолу Сперра.
    4. Наблюдайте за МЕВ под электронным микроскопом передачи.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

MEV были очищены дифференциальной осадок в градиент плотности(Рисунок 1, Рисунок 2). В описанных условиях, MEVs разделены главным образом в градиентной фракции 3 (F3), который соответствует 25% йодиксанол. Этот вывод основан на обнаружении белка, мембранного липида, микроскопической визуализации нетронутых МЭВ, распределении размеров наночастиц и положительной реактивности с антивисикулным антисывороткой(рисунок 2, Рисунок 3). Концентрация белка и липидов нормализовалась до колоний-образующих единиц (CfUs) показала примерно восьмикратное увеличение урожайности MEV в низком железе по сравнению с высокими железом (50 км. FeCl3)(рисунок 3). Хотя представлены результаты одного репрезентативного эксперимента, это очень воспроизводимый результат, основанный на нескольких изоляциях МЭВ. Чистый выход MEV полученный от культуры 1 L низкой железной железы этим методом был приблизительно 500 мкг протеина.

Figure 1
Рисунок 1: Диаграмматическое представление методологии, используемой для очистки и количественной оценки MEV. Микобактерии, выращенные в агарных пластинах, использовались для привить железо-обеденный минимум среды и выращивать Mtb для изоляции EV. MEVs были очищены прерывистой градиентом плотности от фильтрата культуры клетки свободной. Сочетание мембранного липида и везикулового белка, микроскопии и анализа наночастиц было реализовано для характеристики очищенных МЭВ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Характеристика очищенных МЕВ. (A) Показаны фотографии фактического разделения градиента плотности сырой MEV и гранулы очищенных MEVs собранные ультрацентрифугированием градиентной фракции 3 (F3). (B) SDS-гель окрашенные показаны белковый профиль различных фракций градиента плотности. (C) Dot подевой анализ, показывающий, что связанные с везикулами белки, сосредоточенные в F3. (D) MEVs присутствует в F3 наблюдается отрицательным окрашиванием. (E) Распределение размера MEV согласно анализу наночастиц (NTA). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Сравнительный анализ урожайности MEV в низких и высоких культурах железа. Репрезентативный результат (A) белка и липидной количественной оценки и (B) точечный анализ пятен очищенных MEVs, изолированных от железа ограничено и железо достаточно Mtb культур. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Несколько методов для очистки эукариотических клеток, полученных экзосомы были разработаны12. В отличие от этого, существует ограниченная информация об эффективных методах очистки бактерий полученных EVs7. Эффективная изоляция Mtb-полученных EVs необходимо учитывать внутренние трудности в выращивании этого патогенного микобактерий. Mtb имеет долгое время деления (24 ч) и должны быть обработаны в условиях биобезопасности уровня 3 (BSL-3). Поэтому важно оптимизировать эффективность методов изоляции MEV. Поскольку микобактерии выделяют гликолипиды и другие гидрофобные молекулы, которые агрегируют и легко загрязняют сырые препараты MEV в среду, важно очистить и проверить MEV перед проведением биохимических и функциональных исследований. На основе предыдущих наблюдений, которые показали, что Mtb усиливает выпуск МЭВ в условиях ограничения железа, был создан протокол для очистки EV от железа ограниченных микобактерий. Было также подтверждено, что невирулентный M. smegmatis также увеличивает выпуск EVs в ответ на низкие условия железа (данные не показаны). Таким образом, тот же протокол может быть использован для очистки EVs от этой бактерии в условиях BSL-2.

Важным шагом этой процедуры является подготовка низкой железной среды. Эта среда должна быть подготовлена, как описано здесь и хранится в пластиковом контейнере, а не в стекле, чтобы предотвратить загрязнение железа. Добавки, обычно используемые в среде роста Mtb для стимулирования роста бактерий и предотвращения характерных микобактериальных слипаний, таких как бычья сыворотка альбумина, Tween-80, или tyloxapol, следует избегать. Эти добавки приводят к липопротеиновой комплекс артефактов, которые copurify с пузырьками и уменьшить выход везикулы. Для определения CFU, малая культура в среде дополненной с моющим средством (Tween-80 или tyloxapol) может быть установлена в параллельном моющего средства-свободной большой культуре. MeVs в фильтрации культуры стабильны на 4 c в течение нескольких дней. Поэтому, если не обрабатываться немедленно, культурный фильтррат можно хранить в холодильнике.

Общий выход очищенного MEV от 1 L культуры составил около 500 мкг/л белка, что достаточно для проведения нескольких анализов, таких как протеомика, липидомика и функциональные анализы. В зависимости от типа асссировки, достаточное количество МЭВ может быть изолировано от меньших объемов (т.е. 250 мл). Это облегчает сравнительный анализ условий и факторов, влияющих на выпуск MEV.

Это эффективный метод очистки МЭБ, но он имеет ограничения. Это длительная процедура с несколькими ультрацентрифугация шаги. В будущем этот метод будет сравниваться с хроматографией фильтрации геля, и по мере обнаружения молекулярных маркеров МЭВ могут быть внедрены методы улавливания сродства. Среда хозяина железа ограничена, поэтому MEV произведенные Mtb в низкой среде утюга вероятно близко отнесемы к MEVs произведенным во время инфекции и смогли обеспечить уместные проницательности о роли MEVs в патогенеза туберкулеза.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликта интересов.

Acknowledgments

Мы благодарны Рафаэлю Прадос-Росалесу за то, что он поделился антисерой антисеры МИВ и Навнитом Догра за выполнение анализа отслеживания наночастиц.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amicon stirred cell Model 108 EMD Milipore UFSC40001 Cell Ultrafiltration system
BD Polypropilene 225 mL conical tubes Fisher 05-538-61 Conical centrifuge tubes
Biomax 100 kDa cut-off ultrafiltration membrane EMD Milipore PBHK07610 Ultrafiltration membrane
Chelex-100 resin Bio-Rad 142-2842 Metal chelating resin
Middlebrook 7H10 Agar BD Difco 262710 Mycobacterial Agar plates
Middlebrook 7H9 Broth BD Difco 271310 Mycobacterial broth medium
Nitro cellulose blotting membrane GE Healthcare 10600001 Blotting Membrane
Optiprep Sigma D1556 Iodixanol
Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 mm x 89 mm Beckman Coulter 355618 Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 mm x 89 mm
Polypropylene thin walled centrifuge tube 13 mm x 15 mm Beckman Coulter 344059 Polypropylene thin walled centrifuge tube 13 mm x 15 mm
Protein Assay dye BioRad 5000006 Bradford Protein Staining
SYPRO Ruby Molecular Probes S12000 Ultrasensitive protein stain
TMA-DPH Molecular Probes T204 1-(4-Trimethylammoniumphenyl)-6-Phenyl-1,3,5-Hexatriene p-Toluenesulfonate
Vacuum filtration flasks CellPro V50022 Filter Unit

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Prados-Rosales, R., et al. Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice. Journal of Clinical Investigation. 121, 1471-1483 (2011).
  2. Gupta, S., Rodriguez, G. M. Mycobacterial extracellular vesicles and host pathogen interactions. Pathogens and Disease. 76 (4), (2018).
  3. Athman, J. J., et al. Bacterial Membrane Vesicles Mediate the Release of Mycobacterium tuberculosis Lipoglycans and Lipoproteins from Infected Macrophages. Journal of Immunology. 195, 1044-1053 (2015).
  4. Athman, J. J., et al. Mycobacterium tuberculosis Membrane Vesicles Inhibit T Cell Activation. Journal of Immunology. 198, 2028-2037 (2017).
  5. Rath, P., et al. Genetic regulation of vesiculogenesis and immunomodulation in Mycobacterium tuberculosis. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 110, E4790-E4797 (2013).
  6. White, D. W., Elliott, S. R., Odean, E., Bemis, L. T., Tischler, A. D. Mycobacterium tuberculosis Pst/SenX3-RegX3 Regulates Membrane Vesicle Production Independently of ESX-5 Activity. mBio. 9, pii 00778 (2018).
  7. Dauros Singorenko, P., et al. Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity. Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1324731 (2017).
  8. Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quiros, S., Luque-Garcia, J. L. Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria. MethodsX. 1, 124-129 (2014).
  9. Prados-Rosales, R., et al. Role for Mycobacterium tuberculosis membrane vesicles in iron acquistion. Journal of Bacteriology. 196, 1250-1256 (2014).
  10. Sanders, E. Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods. Journal of Visualized Experiments. 63, e3064 (2012).
  11. Harlow, E., Lane, L. Antibodies. A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory. (1988).
  12. Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).

Tags

Иммунология и инфекция выпуск 152 микобактерии пузырьки дефицит железа секреция мембрана вирулентность изоляция
Изоляция и характеристика внеклеточных пузырьков, производимых железо-ограниченным имикобактериями
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gupta, S., Marcela Rodriguez, G.More

Gupta, S., Marcela Rodriguez, G. Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles Produced by Iron-limited Mycobacteria. J. Vis. Exp. (152), e60359, doi:10.3791/60359 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter