Summary
Mycobacterium tuberculose vertoont een verhoogde productie en afgifte van extracellulaire blaasjes als reactie op lage ijzer omstandigheden. Dit werk Details een protocol voor het genereren van lage ijzer omstandigheden en methoden voor de zuivering en karakterisering van mycobacteriële extracellulaire blaasjes vrijgegeven in reactie op ijzertekort.
Abstract
Mycobacteriën, waaronder Mycobacterium tuberculose (MTB), de veroorzaker van humane tuberculose, brengen natuurlijke extracellulaire blaasjes (ev's) met immunologisch actieve moleculen vrij. Kennis over de moleculaire mechanismen van blaasje biogenese, de inhoud van de blaasjes, en hun functies op de pathogeen-hostinterface is zeer beperkt. Het aanpakken van deze vragen vergt strenge procedures voor isolatie, zuivering en validering van Ev's. Eerder bleek de productie van blaasje te worden verbeterd toen M. tuberculose werd blootgesteld aan ijzer beperking, een aandoening die door MTB in de hostomgeving wordt ondervonden. Hier gepresenteerd is een compleet en gedetailleerd protocol om Ev's te isoleren en te zuiveren van ijzer deficiënte mycobacteriën. Er worden kwantitatieve en kwalitatieve methoden toegepast om gezuiverde Ev's te valideren.
Introduction
Mycobacteriële extracellulaire blaasjes (mev's) zijn membraan gebonden nanodeeltjes, 60 − 300 nm in grootte, natuurlijk vrijgegeven door snel-en langzaam groeiende mycobacteriën1. Mev's vrijgegeven door pathogene mycobacteriën vormen een mechanisme om te communiceren met de gastheer via immunologisch actieve eiwitten, lipiden, en glycolipiden uitgescheiden in een geconcentreerde en beschermde manier2,3,4. Om mevs te karakteriseren en hun biogenese en functies te begrijpen, zijn strikte en efficiënte methoden voor het zuiveren en valideren van blaasje cruciaal. Tot nu toe zijn mev's geïsoleerd van de cultuur filtraten van mycobacteriën geteeld in een ijzerrijke medium1,5,6,7,8.
Echter, vorig werk toonde aan dat ijzer beperking sterk stimuleert blaasje vrijlating in MTB, mogelijk om ijzer vast te leggen via mycobactin, een siderophore uitgescheiden in mevs9. Hoewel er een beschrijving is gegeven van de procedures voor Mev's die geïsoleerd zijn van MTB-culturen in een hoog ijzer medium, is er geen efficiënte methodologie gerapporteerd voor het verkrijgen van Mev's uit een laag ijzergehalte. Daarom is het doel van deze methode het isoleren, zuiveren en kwantificeren van mev's die zijn verkregen uit lage ijzer culturen, zodat ze kunnen worden gebruikt voor biochemische en functionele testen en voor de analyse van genetische determinanten van blaasje productie in mycobacteriën.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bereiding van met ijzer uitgeput gedefinieerd medium
- Bereid 1 L minimaal medium (MM) door het oplossen van 5 g KH2po4, 5 g L-Asparagine, 20 ml glycerol en 2 g dextrose in 900 ml gedeïoniseerd water in een plastic container. Vermijd glas om ijzer verontreiniging te voorkomen. Pas de pH op 6,8 met 5 N NaOH en het volume op 1 L met water.
- Voeg 50 g metaal chelaat hars (MCR) toe en roer voorzichtig met een magnetische roer stang gedurende 24 uur bij 4 °C. Steriliseren en verwijderen van de MCR door filtratie door een 0,22 μm filter unit met een plastic ontvanger. Om filtratie te versnellen en filter verstopping te voorkomen, laat de hars gedurende ongeveer 30 minuten voor filtratie.
Opmerking: Dit medium bevat minder dan 2 μM rest ijzer, zoals bepaald door Atoom Absorptie spectroscopie. - Supplement MM met 0,5 mg/L ZnCl2, 40 mg/l MgSO4, en 0,1 mg/l mnso4. Afzonderlijk, bereid geconcentreerde aandelen (1, 000x) van elk van de metalen supplementen in gedeïoniseerd water en steriliseren door filtratie vóór MM suppletie. Ijzer-uitgeput, metaal aangevuld MM zal hier worden verwezen als laag ijzer MM (LIMM).
- Van een 50 mM voorraad FeCl3 opgelost in 10 mm HCl, voeg 1 ml aan 1 L van limm (50 μM eindconcentratie) om te bereiden van hoge ijzer mm (himm).
2. mycobacteriën kweken in ijzer beperkte omstandigheden
- Ontdooien 50 μL van een bevroren 15% glycerol voorraad MTB en streak een agar plaat aangevuld met 10% ADN verrijking (5 g/L albumine, 2 g/L dextrose, en 0,85 g/L natriumchloride, 0,2% glycerol en 0,05% Tween-80)10. Inincuberen van de plaat bij 37 °C tot kolonies zichtbaar zijn.
- Inoculeren van een enkele kolonie MTB10 in 2 ml mycobacteriële Bouillon medium (tabel van de materialen) aangevuld met ADN verrijking. Incuberen met roeren bij 37 °C.
- Laat de MTB-cultuur uitgroeien tot de late logaritmische fase (OD540 is ~ 0,8). Om dit te controleren meet u de OD540 met behulp van een spectrofotometer.
- Verdeel 200 μL van de late logaritmische cultuur op de mycobacteriële agar-platen (tabel met materialen) aangevuld met 0,2% glycerol, 0,05% Tween-80 en ADN. Inoculeren ten minste 5 platen. Inincuberen de platen bij 37 °C tot de bacteriegroei zichtbaar is als een confluente laag. Dit duurt ~ 1 week voor MTB.
- Bevochtig een steriel wattenstaafje in LIMM. Gebruik dit wattenstaafje om bacteriën van de agar-platen te verzamelen en 100 mL LIMM te gebruiken om een geconcentreerde bacteriële suspensie te bereiden met een OD540 van ~ 1,0.
- Verdun deze suspensie 10 keer tot 1 L met LIMM en verdeel deze in twee, 2 L steriele plastic flessen, elk met 500 mL cultuur.
- Neem 2 mL cultuur en breng het over naar een 5 mL kweek buis. Voeg 10 μL 10% vol/vol tyloxapol toe.
- Incuberen de culturen bij 37 °C die 14 dagen staan.
3. verzameling van Mev's
- Meet de OD540 van de 2 ml cultuur op het moment van de inzameling. Maak 1:10 seriële verdunningen van de kweek en plaat 100 μL van elke verdunning op agarplaten met ADN en 0,05% Tween-80.
- Breng de cultuur over naar 5 225 mL conische centrifugebuizen en centrifugeer bij 2.850 x g gedurende 7 minuten bij 20 °c.
- Verzamel de kweek supernatant met een 50 mL pipet en filter steriliseren door een 0,22 μm filter unit.
4. isolatie van Mev's
- Breng het filtraat van de cultuur over in een met 4 °C geplaatst roercel-ultrafiltratie systeem en filtreer het concentraat bij < 50 psi door middel van een 100 kDa-cutoff-membraan tot ~ 50 mL.
- Centrifugeer het filtraat van geconcentreerde kweek bij 15.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °c en vang het supernatant op.
- Centrifuge de cultuur filtraat in polycarbonaat ultracentrifugatie buisjes bij 100.000 x g voor 2 uur bij 4 °c.
- Breng de membraneuze pellets in totaal 1 mL steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) aan door voorzichtig te pipetteren.
- Meng 0,5 mL van de pelletsuspensie die is verkregen in stap 4,4 met 1,5 mL 60% iodixanol-oplossing, wat een uiteindelijke iodixanolconcentratie oplevert van 45% WT/vol. Verdeel deze mix aan de onderkant van een 13 mm x 51 mm polypropyleen dunwandige ultracentrifuge buis.
- Overlay de MEV-iodixanol 45% suspensie met 1 mL 40%, 35%, 30%, 25% en 20% (vol/vol in PBS) iodixanol-oplossingen en 1 mL PBS aan de bovenkant.
- Centrifugeer bij 100.000 x g gedurende 18 uur bij 4 °c.
- Verzamel de 1 mL dichtheidsgradiënt fracties vanaf de bovenkant met behulp van een 1 mL Hamilton spuit.
- Verdun elke verzamelde fractie tot 20 mL met PBS en centrifugeer op 100.000 x g gedurende 2 uur bij 4 °c.
- Verwijder de supernatant en onderbreek de pellet in 0,5 mL PBS. Bewaar deze pellet bij 4 °C.
5. kwantificering van Mev's
- Meet de eiwitconcentratie in elke fractie door een Bradford-test (tabel met materialen), volgens de richtlijnen van de fabrikant.
-
Voer membraan lipiden analyse uit.
- Incuberen 10 μL van elke gradiënt fractie met de fluorescerende membraan sonde 1-(4-Trimethylammoniumfenyl) -6-fenyl-1, 3, 5-Hexatrieen p-toluenesulfonaat (TMA-dph) bij een eindconcentratie van 1 μg/ml in een laatste 50 ΜL volume PBS in 96 goed zwart Platen.
- Incuberen de platen gedurende 20 minuten bij 33 °C.
- Meet de fluorescentie bij een excitatie van 360 nm en een emissie van 430 nm.
6. kwalitatieve analyse van Mev's
-
Voer eiwit elektroforese.
- Meng ongeveer 1 μg MeV-monsters in 16 μl met 4 μl 5x monster laad buffer (10% w/v SDS, 10 mm dithiothreitol, 20% v/v glycerol 0,2 M Tris-HCl, pH 6,8 0,05% w/v broomfenolblauw) en verwarm de monsters in de monster buffer bij 85 °c gedurende 5 minuten.
- Laden in een 10% tris/Glycine SDS-Polyacrylamide gel11 en lopen op 10 V/cm in lopende buffer (25 mm tris-basis, 190 mm Glycine, 0,1% SDS) totdat het blauwe kleurstof front de bodem van de gel bereikt.
- Vlek de gel met een ultragevoelige eiwit kleurings oplossing (tabel met materialen).
-
Voer de dot-Blot uit.
- Laad 2 μL van een MEVs-suspensie met een concentratie van ongeveer 0,5 μg/μL, en tweevoudige seriële verdunningen op een nitrocellulose membraan en proces voor een dot-vlek volgens de instructies van de fabrikant.
- Gebruik een antiserum dat in muizen is verhoogd tegen een preparaat van Mev's bij een verdunning van 1:5000 als primair antilichaam en een geit-anti muis, gekoppeld aan mierikswortelperoxidase (HRP) bij een verdunning van 1:10000 als secundair antilichaam. Detecteer antilichaam complexen met een geschikte HRP substraat blotting Detection reagens en een imaging systeem.
-
Voer negatieve kleuring en elektronenmicroscopie uit.
- Fixeer 250 μL MEVs met 2% Glutaaraldehyde in 0,1 M cacodylaat bij kamertemperatuur gedurende 2 uur en inbroed in een nacht in 4% formaldehyde, 1% Glutaaraldehyde en 0,1% PBS.
- Vlek de vaste monsters met 2% osmium tetroxide voor 90 min.
- Dehydraat het monster in ethanol en sluit het aan op epoxy hars van Spurr.
- Observeer de MEVs onder een transmissie elektronen microscoop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mev's werden gezuiverd door differentiële sedimentatie in een dichtheidsgradiënt (Figuur 1, Figuur 2). Onder de beschreven omstandigheden scheidden Mev's meestal in gradiënt breuk 3 (F3), wat overeenkomt met 25% iodixanol. Deze conclusie is gebaseerd op de detectie van eiwitten, membraan lipide, microscopische visualisatie van intact MEVs, nanodeeltjes grootteverdeling, en positieve reactiviteit met een antivesicle antiserum (Figuur 2, Figuur 3). Eiwit-en lipide-concentratie genormaliseerd tot kolonie vormende eenheden (CFUs) toonde een ongeveer achtvoudige stijging van de MEV-opbrengst in laag ijzer ten opzichte van hoge ijzer omstandigheden (50 μM FeCl3) (Figuur 3). Hoewel de resultaten van één representatief experiment worden gepresenteerd, is dit een zeer reproduceerbaar resultaat op basis van meerdere (> 10) isolaties van Mev's. De zuivere MEV opbrengst verkregen uit een 1 L laag ijzer cultuur met deze methode was ongeveer 500 μg eiwit.
Figuur 1: schematisch weergave van de methodologie die wordt gebruikt voor de zuivering en kwantificering van MEV. Mycobacteriën geteeld in agar-platen werden gebruikt om met ijzer verarmd minimale medium en Grow MTB voor EV-isolatie te beënten. Mev's werden gezuiverd door een discontinu dichtheidsgradiënt uit het celvrije kweek filtraat. Een combinatie van membraan lipide en blaasje eiwit bepaling, microscopie, en nanodeeltjes analyse werd uitgevoerd om gezuiverde mevs karakteriseren. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: karakterisering van gezuiverde Mev's. A) getoonde Foto's zijn van een werkelijke dichtheidsgradiënt scheiding van ruwe mev's en de pellet van gezuiverde mev's, verzameld door ultracentrifugatie van gradiënt Fractie 3 (F3). B) SDS-gel bevlekt met het eiwit Profiel van de verschillende dichtheids fracties. C) analyse van de dot-Blot met Vesicle-geassocieerde eiwitten geconcentreerd in F3. D) mev's die in F3 worden waargenomen door negatieve kleuring. E) MeV-grootteverdeling volgens nanodeeltjes-analyse (NTA). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: vergelijkende analyse van de MEV-opbrengst in lage en hoge ijzer culturen. Een representatief resultaat van (a) eiwit-en lipide-kwantificering en (B) dot-vlek analyse van gezuiverde mev's geïsoleerd uit ijzer-en ijzer voldoende MTB-culturen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Er zijn meerdere methoden ontwikkeld voor het zuiveren van eukaryote celafgeleide exosomen12. Er is daarentegen beperkte informatie beschikbaar over effectieve methoden voor het zuiveren van door bacteriën afgeleide Ev's7. Efficiënte isolatie van Ev's met MTB-derivaten moet rekening houden met de intrinsieke moeilijkheden bij het kweken van deze pathogene Mycobacterium. MTB heeft een lange delings tijd (~ 24 uur) en moet worden behandeld in de bioveiligheid niveau drie (BSL-3) voorwaarden. Daarom is het belangrijk om de efficiëntie van MEV-isolatie methoden te optimaliseren. Omdat mycobacteriën Glycolipiden en andere hydrofobe moleculen vrijgeven die ruwe MEV-preparaten aggregeren en gemakkelijk besmetten in het medium, is het belangrijk om Mev's te zuiveren en te valideren alvorens biochemische en functionele studies uit te voeren. Op basis van eerdere waarnemingen die aantonen dat MTB het vrijkomen van Mev's verbetert onder omstandigheden van ijzer beperking, werd een protocol opgesteld voor EV-zuivering van ijzer-beperkte mycobacteriën. Het is ook bevestigd dat niet-virulent M. smegmatis ook de afgifte van EVS verhoogt als reactie op lage ijzer condities (gegevens niet weergegeven). Daarom kan hetzelfde protocol worden gebruikt voor het zuiveren van EVs van deze bacterie in BSL-2 voorwaarden.
Een kritieke stap van deze procedure is de voorbereiding van het laag-ijzer medium. Dit medium moet worden bereid zoals hier beschreven en opgeslagen in een plastic container, niet in glas, om ijzer verontreiniging te voorkomen. Supplementen die gewoonlijk in MTB-groeimedium worden gebruikt om bacteriële groei te stimuleren en karakteristiek mycobacteriële klontering te voorkomen, zoals boviene serumalbumine, Tween-80 of tyloxapol, moeten worden vermeden. Deze additieven leiden tot lipoproteïne complexe artefacten die copurify met blaasjes en verminderen blaasje rendement. Voor CFU-bepaling kan een kleine cultuur in medium aangevuld met detergens (Tween-80 of tyloxapol) parallel met de detergentia vrije grote cultuur worden ingesteld. Mev's in het kweek filtraat zijn gedurende meerdere dagen stabiel bij 4 °C. Daarom kan het filtraat van de kweek, als het niet onmiddellijk wordt verwerkt, gekoeld worden opgeslagen.
De totale opbrengst van gezuiverde MEV uit 1 L cultuur bedroeg ongeveer 500 μg/L eiwit, wat voldoende is om meerdere analyses uit te voeren, zoals Proteomics, lipidomics en functionele assays. Afhankelijk van het type test kunnen voldoende Mev's worden geïsoleerd van kleinere volumes (d.w.z. 250 mL). Dit vergemakkelijkt de vergelijkende analyse van de omstandigheden en factoren die de MEV-afgifte beïnvloeden.
Dit is een effectieve methode om Mev's te zuiveren, maar het heeft beperkingen. Het is een lange procedure met meerdere ultracentrifugatie stappen. In de toekomst, deze methode wordt vergeleken met gel filtratie chromatografie, en als moleculaire markers van Mev's worden ontdekt, affiniteits opname methoden kunnen worden geïmplementeerd. De gast omgeving is ijzer-beperkt, daarom MEVs geproduceerd door MTB in een laag ijzer medium zijn waarschijnlijk nauwer verwant aan MEVs geproduceerd tijdens infectie en kunnen relevante inzichten geven over de rol van Mev's in tuberculose pathogenese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten.
Acknowledgments
We zijn Rafael Prados-Rosales dankbaar voor het delen van de anti-MeV antisera en Navneet Dogra voor het uitvoeren van nanodeeltjes Tracking Analysis.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amicon stirred cell Model 108 | EMD Milipore | UFSC40001 | Cell Ultrafiltration system |
| BD Polypropilene 225 mL conical tubes | Fisher | 05-538-61 | Conical centrifuge tubes |
| Biomax 100 kDa cut-off ultrafiltration membrane | EMD Milipore | PBHK07610 | Ultrafiltration membrane |
| Chelex-100 resin | Bio-Rad | 142-2842 | Metal chelating resin |
| Middlebrook 7H10 Agar | BD Difco | 262710 | Mycobacterial Agar plates |
| Middlebrook 7H9 Broth | BD Difco | 271310 | Mycobacterial broth medium |
| Nitro cellulose blotting membrane | GE Healthcare | 10600001 | Blotting Membrane |
| Optiprep | Sigma | D1556 | Iodixanol |
| Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 mm x 89 mm | Beckman Coulter | 355618 | Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 mm x 89 mm |
| Polypropylene thin walled centrifuge tube 13 mm x 15 mm | Beckman Coulter | 344059 | Polypropylene thin walled centrifuge tube 13 mm x 15 mm |
| Protein Assay dye | BioRad | 5000006 | Bradford Protein Staining |
| SYPRO Ruby | Molecular Probes | S12000 | Ultrasensitive protein stain |
| TMA-DPH | Molecular Probes | T204 | 1-(4-Trimethylammoniumphenyl)-6-Phenyl-1,3,5-Hexatriene p-Toluenesulfonate |
| Vacuum filtration flasks | CellPro | V50022 | Filter Unit |
References
- Prados-Rosales, R., et al. Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice. Journal of Clinical Investigation. 121, 1471-1483 (2011).
- Gupta, S., Rodriguez, G. M. Mycobacterial extracellular vesicles and host pathogen interactions. Pathogens and Disease. 76 (4), (2018).
- Athman, J. J., et al. Bacterial Membrane Vesicles Mediate the Release of Mycobacterium tuberculosis Lipoglycans and Lipoproteins from Infected Macrophages. Journal of Immunology. 195, 1044-1053 (2015).
- Athman, J. J., et al. Mycobacterium tuberculosis Membrane Vesicles Inhibit T Cell Activation. Journal of Immunology. 198, 2028-2037 (2017).
- Rath, P., et al. Genetic regulation of vesiculogenesis and immunomodulation in Mycobacterium tuberculosis. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 110, E4790-E4797 (2013).
- White, D. W., Elliott, S. R., Odean, E., Bemis, L. T., Tischler, A. D. Mycobacterium tuberculosis Pst/SenX3-RegX3 Regulates Membrane Vesicle Production Independently of ESX-5 Activity. mBio. 9, pii 00778 (2018).
- Dauros Singorenko, P., et al. Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity. Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1324731 (2017).
- Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quiros, S., Luque-Garcia, J. L. Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria. MethodsX. 1, 124-129 (2014).
- Prados-Rosales, R., et al. Role for Mycobacterium tuberculosis membrane vesicles in iron acquistion. Journal of Bacteriology. 196, 1250-1256 (2014).
- Sanders, E. Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods. Journal of Visualized Experiments. 63, e3064 (2012).
- Harlow, E., Lane, L. Antibodies. A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory. (1988).
- Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).
