Summary
Mycobacterium tuberculosis montre une augmentation de la production et la libération de vésicules extracellulaires en réponse à de faibles conditions de fer. Ce travail détaille un protocole pour générer de faibles conditions de fer et des méthodes pour la purification et la caractérisation des vésicules extracellulaires mycobactériennes libérées en réponse à une carence en fer.
Abstract
Les mycobactéries, y compris Mycobacterium tuberculosis (Mtb), l'agent causal de la tuberculose humaine, libèrent naturellement des vésicules extracellulaires (VE) contenant des molécules immunologiquement actives. Les connaissances concernant les mécanismes moléculaires de la biogenèse vésicule, le contenu des vésicules et leurs fonctions à l'interface pathogène-hôte sont très limitées. Pour répondre à ces questions, il faut des procédures rigoureuses d'isolement, de purification et de validation des véhicules électriques. Auparavant, la production de vésicules s'est avérée améliorée lorsque M. tuberculosis a été exposé à la restriction de fer, une condition rencontrée par Mtb dans l'environnement hôte. Présenté ici est un protocole complet et détaillé pour isoler et purifier les véhicules électriques à partir de mycobactéries déficientes en fer. Des méthodes quantitatives et qualitatives sont appliquées pour valider les véhicules électriques purifiés.
Introduction
Les vésicules extracellulaires mycobactériennes (MEV) sont des nanoparticules membranaires, de 60 à 300 nm de taille, naturellement libérées par les mycobactéries à croissance rapide et lente1. Les MEV libérés par les mycobactéries pathogènes constituent un mécanisme d'interaction avec l'hôte par l'intermédiaire de protéines immunologiquement actives, lipides et glycolipides sécrétés d'une manière concentrée et protégée2,3,4. Pour caractériser les Monos et comprendre leur biogenèse et leurs fonctions, des méthodes strictes et efficaces de purification et de validation des vésicules sont cruciales. Jusqu'à présent, les MEV ont été isolés des filtrates de culture des mycobactéries cultivées dans un milieu riche en fer1,5,6,7,8.
Cependant, des travaux antérieurs ont démontré que la limitation du fer stimule grandement la libération de vésicule dans Mtb, peut-être pour capturer le fer par l'intermédiaire de la mycobactine, un siderophore sécrété dans meVs9. Bien que des procédures d'isolement des MVE par rapport à la culture Mtb dans un milieu de fer élevé aient été décrites, une méthodologie efficace pour obtenir des MPV à partir de cultures de fer faible n'a pas été signalée. Par conséquent, l'objectif de cette méthode est d'isoler, purifier et quantifier les Monovirus obtenus à partir de cultures de fer faible afin qu'ils puissent être utilisés pour des essais biochimiques et fonctionnels et pour l'analyse des déterminants génétiques de la production de vésicules chez les mycobactéries.
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Protocol
1. Préparation du milieu défini appauvri en fer
- Préparer 1 L de milieu minimal (MM) en dissolvant 5 g de KH2PO4, 5 g de L-asparagine, 20 ml de glycérol et 2 g de dextrose dans 900 ml d'eau deionisée dans un récipient en plastique. Évitez le verre pour prévenir la contamination du fer. Ajuster le pH à 6,8 avec 5 N NaOH et le volume à 1 L avec de l'eau.
- Ajouter 50 g de résine de chélage métallique (MCR) et agiter doucement à l'aide d'une barre magnétique pendant 24 h à 4 oC. Stériliser et retirer le MCR par filtration à travers une unité de filtre de 0,22 m avec un récepteur en plastique. Pour accélérer la filtration et prévenir l'engorgement du filtre, laissez les sédiments de résine pendant environ 30 minutes avant la filtration.
REMARQUE: Ce milieu contient moins de 2 m de fer résiduel, tel que déterminé par spectroscopie d'absorption atomique. - Supplément MM avec 0,5 mg/L de ZnCl2, 40 mg/L de MgSO4, et 0,1 mg/L de MnSO4. Séparément, préparer les stocks concentrés (1 000x) de chacun des suppléments métalliques dans l'eau déionisée et stériliser par filtration avant la supplémentation MM. Le MM, épuisé de fer et en métal, sera ici appelé MM à faible teneur en fer (LIMM).
- À partir d'un stock de 50 mM de FeCl3 dissous en 10 mm HCl, ajouter 1 ml à 1 L de LIMM (concentration finale de 50 M) pour préparer le MM de fer élevé (HIMM).
2. Cultiver des mycobactéries dans des conditions limitées en fer
- Décongeler 50 l d'un bouillon de glycérol congelé de 15 % de Mtb et silloner une plaque d'agar complétée par un enrichissement ADN de 10 % (5 g/L d'albumine, 2 g/L dextrose, et 0,85 g/L de chlorure de sodium, 0,2 % de glycérol et 0,05 % de Tween-80)10. Incuber la plaque à 37 oC jusqu'à ce que les colonies soient visibles.
- Inoculer une seule colonie de Mtb10 dans 2 ml de milieu de bouillon mycobactérien (Table de Matériaux) complété par l'enrichissement ADN. Incuber avec agitation à 37 oC.
- Laissez la culture Mtb se développer jusqu'à la phase logarithmique tardive (OD540 est de 0,8). Pour vérifier cela, mesurez l'OD540 à l'aide d'un spectrophotomètre.
- Étendre 200 L de la culture logarithmique tardive sur les plaques d'agar mycobactériennes (Table of Materials) complétées par 0,2 % de glycérol, 0,05 % de Tween-80 et ADN. Inoculer au moins 5 plaques. Incuber les plaques à 37 oC jusqu'à ce que la croissance bactérienne soit visible sous forme de couche de confluents. Cela prend 1 semaine pour Mtb.
- Mouillez un coton-tige stérile dans LIMM. Utilisez cet écouvillon pour recueillir les bactéries des plaques d'agar et inoculer 100 ml de LIMM pour préparer une suspension bactérienne concentrée avec un OD540 de 1,0.
- Diluer cette suspension 10 fois à 1 L avec LIMM et la diviser en deux bouteilles en plastique stériles de 2 L, chacune contenant 500 ml de culture.
- Sortez 2 ml de culture et transférez-le dans un tube de culture de 5 ml. Ajouter 10 lloxapol vol/vol.
- Incuber les cultures à 37 oC debout pendant 14 jours.
3. Collection de MONOspaces
- Mesurer l'OD540 de la culture de 2 mL au moment de la collecte. Faire 1:10 dilutions sérielles de la culture et de la plaque 100 'L de chaque dilution sur des plaques d'agar avec ADN et 0,05% Tween-80.
- Transférer la culture dans cinq tubes coniques de centrifugeuse de 225 ml et une centrifugeuse à 2 850 x g pendant 7 min à 20 oC.
- Recueillir le supernatant de culture avec une pipette de 50 ml et filtrer le stériliser à travers une unité de filtre de 0,22 m.
4. Isolement des Monospaces
- Transférer le filtrate de culture dans un système d'ultrafiltration de cellules agitées placé à 4 oC et filtrer le concentré à 50 psi à travers une membrane de coupure de 100 kDa à 50 ml.
- Centrifuger la culture concentrée filtrate à 15 000 x g pendant 15 min à 4 oC et recueillir le supernatant.
- Centrifuger la culture filtrate dans des tubes d'ultracentrifugation en polycarbonate à 100 000 x g pour 2 h à 4 oC.
- Resuspendre les granulés membranaires dans un total de 1 ml de phosphate stérile tamponné saline (PBS) par pipetting douce.
- Mélanger 0,5 ml de la suspension à granulés obtenue à l'étape 4.4 avec 1,5 mL de solution iodixanol à 60%, donnant une concentration finale d'iodixanol de 45% wt/vol. Dispensez ce mélange au fond d'un tube ultracentrifuge en polypropylène de 13 mm x 51 mm à parois minces.
- Reproduit la suspension MEV-iodixanol 45% avec 1 mL de 40%, 35%, 30%, 25%, et 20% (vol/vol en PBS) solutions iodixanol et 1 mL de PBS au sommet.
- Centrifugeuse à 100 000 x g pour 18 h à 4 oC.
- Recueillir les fractions de gradient de densité de 1 ml à partir du haut à l'aide d'une seringue Hamilton de 1 ml.
- Diluer chaque fraction recueillie à 20 ml avec le PBS et la centrifugeuse à 100 000 x g pendant 2 h à 4 oC.
- Retirez le supernatant et suspendez la pastille dans 0,5 ml de PBS. Entreposer cette pastille à 4 oC.
5. Quantification des Monospaces
- Mesurer la concentration en protéines dans chaque fraction par un test Bradford (Tableau des matériaux), suivant les directives du fabricant.
-
Effectuer l'analyse des lipides membranaires.
- Incuber 10 L de chaque fraction de gradient avec la sonde à membrane fluorescente 1-(4-Trimethylammoniumphenyl)-6-Phenyl-1,3,5-Hexatriene p-Toluenesulfonate (TMA-DPH) à une concentration finale de 1 g/mL dans un volume final de 50 L de PBS en 96 bien noir Plaques.
- Incuber les assiettes à 33 oC pendant 20 min.
- Mesurer la fluorescence à 360 nm d'excitation et 430 nm d'émission.
6. Analyse qualitative des Monospaces
-
Effectuer l'électrophoresis de protéine.
- Mélanger environ 1 g d'échantillons de MEV dans 16 L avec 4 l de tampon de chargement de l'échantillon 5x (10 % w/v SDS, 10 mM dithiothreitol, 20 % v/v glycerol 0,2 M Tris-HCl, pH 6,8 0,05 % w/v bromophenol bleu) et chauffer les échantillons dans un échantillon tampon à 85 min.
- Chargez dans un gel 10% Tris/Glycine SDS-polyacrylamide11 et courez à 10 V/cm dans le tampon de fonctionnement (base Tris 25 mM, 190 mM de glycine, 0,1% SDS) jusqu'à ce que le front de teinture bleue atteigne le fond du gel.
- Tainer le gel avec une solution de coloration de protéines ultrasensibles (Table des Matériaux).
-
Effectuer la tache de point.
- Chargez 2 L d'une suspension MEV avec une concentration d'environ 0,5 g/L, et des dilutions en série doubles sur une membrane de nitrocellulose et le processus pour une tache de point selon les instructions du fabricant.
- Utilisez un antisérum élevé chez la souris contre une préparation de MEV à une dilution de 1:5,000 comme anticorps primaire et un anti-souris de chèvre couplé au raifort peroxidase (HRP) à une dilution 1:10,000 comme anticorps secondaire. Détectez les complexes antigènes-anticorps avec un réagent approprié de détection de détection de blotting de substrat de HRP et un système de formation image.
-
Effectuer une coloration négative et une microscopie électronique.
- Fixer 250 L de MEV avec 2% de glutaraldéhyde en cacodylate de 0,1 M à température ambiante pendant 2 h et incuber toute la nuit dans 4% de formaldéhyde, 1% de glutaraldéhyde et 0,1% de PBS.
- Tainer les échantillons fixes avec 2% de tétroxide d'osmium pendant 90 min.
- Déshydrater l'échantillon en série dans de l'éthanol et l'intégrer dans la résine époxy de Spurr.
- Observez les MEV sous un microscope électronique de transmission.
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Representative Results
Les Monospaces ont été purifiés par sédimentation différentielle dans un gradient de densité (Figure 1, Figure 2). Dans les conditions décrites, les MEV se sont séparés principalement en fraction de gradient 3 (F3), ce qui correspond à 25% d'iodixanol. Cette conclusion est basée sur la détection de protéines, de lipides membranaires, de visualisation microscopique de Monomètres intacts, de distribution de la taille des nanoparticules et de réactivité positive avec un antisérum antivésicule(figure 2, figure 3). La concentration de protéines et de lipides normalisée en unités de formation de colonies (UFC) a montré une augmentation d'environ huit fois le rendement du VME dans le fer faible par rapport aux conditions de fer élevées (50 M FeCl3) (Figure 3). Bien que les résultats d'une expérience représentative soient présentés, il s'agit d'un résultat hautement reproductible basé sur de multiples isolements de Monotisme. Le rendement pur de MEV obtenu à partir d'une culture de fer basse de 1 L par cette méthode était d'environ 500 g de protéine.
Figure 1 : Représentation schématique de la méthodologie utilisée pour la purification et la quantification du MEV. Les mycobactéries cultivées dans les plaques d'agar ont été utilisées pour inoculer le milieu minimal appauvri en fer et cultiver Mtb pour l'isolement ev. Les MEV ont été purifiés par un gradient de densité discontinu du filtrate de culture sans cellules. Une combinaison de la détermination de protéine de membrane et de vésicule, de la microscopie, et de l'analyse de nanoparticule a été mise en application pour caractériser les MEV purifiés. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Caractérisation des Monospaces purifiés. (A) Sont montrées des photographies d'une séparation réelle du gradient de densité des Monospaces bruts et de la granule de MONOuvères purifiés recueillies par ultracentrifugation de gradient fraction 3 (F3). (B) SDS-gel taché montrant le profil protéique des différentes fractions de gradient de densité. (C) Analyse de la tache de points montrant des protéines associées à la vésicule concentrées en F3. (D) MEV présents en F3 observés par coloration négative. (E) distribution de taille DE MEV selon l'analyse de nanoparticule (NTA). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Analyse comparative du rendement du MEV dans les cultures de fer faible et élevée. Un résultat représentatif de (A) quantification des protéines et des lipides et (B) analyse de points de taille de MEV purifiés isolés de fer-limité et fer suffisant cultures Mtb. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Plusieurs méthodes pour purifier les exosomes eucaryotes dérivés de cellules ont été développées12. En revanche, il existe peu d'informations sur les méthodes efficaces pour purifier les véhicules électriques dérivés de bactéries7. L'isolement efficace des véhicules électriques dérivés de Mtb doit tenir compte des difficultés intrinsèques à cultiver ce mycobactérie pathogène. Mtb a un temps de division long (24 h) et doit être manipulé dans des conditions de niveau de biosécurité trois (BSL-3). Par conséquent, il est important d'optimiser l'efficacité des méthodes d'isolation MEV. Étant donné que les mycobactéries libèrent des glycolipides et d'autres molécules hydrophobes qui agrégent et contaminent facilement les préparations brutes de MEV dans le milieu, il est important de purifier et de valider les MONOavants avant de mener des études biochimiques et fonctionnelles. Sur la base d'observations antérieures qui ont démontré que Mtb améliore la libération de MEV dans des conditions de limitation de fer, un protocole a été établi pour la purification des EV à partir de mycobactéries limitées en fer. Il a également été confirmé que M. smegmatis, non virulent, augmente également la libération de véhicules électriques en réponse à de faibles conditions de fer (données non montrées). Par conséquent, le même protocole pourrait être utilisé pour purifier les véhicules électriques de cette bactérie dans des conditions BSL-2.
Une étape critique de cette procédure est la préparation du milieu de fer bas. Ce support doit être préparé tel que décrit ici et stocké dans un récipient en plastique, pas dans le verre, pour empêcher la contamination de fer. Les suppléments couramment utilisés dans le milieu de croissance de Mtb pour stimuler la croissance bactérienne et empêcher l'agglutinage mycobactérien caractéristique, tel que l'albumine bovine de sérum, Tween-80, ou tyloxapol, doivent être évités. Ces additifs conduisent à des artefacts complexes de lipoprotéines qui copurifient avec des vésicules et réduisent le rendement de la vésicule. Pour la détermination de CFU, une petite culture dans le milieu complétée avec le détergent (Tween-80 ou tyloxapol) peut être placé en parallèle à la grande culture détergent-libre. Les Monospaces dans le filtrate de culture sont stables à 4 oC pendant plusieurs jours. Par conséquent, s'il n'est pas traité immédiatement, le filtrate de culture peut être stocké au réfrigérateur.
Le rendement total du MEV purifié de 1 L de culture était d'environ 500 g/L de protéine, ce qui est suffisant pour effectuer de multiples analyses telles que la protéomique, la lipidomique et les essais fonctionnels. Selon le type d'analyse, un nombre suffisant de Monospaces peuvent être isolés à partir de volumes plus faibles (c.-à-d. 250 ml). Cela facilite l'analyse comparative des conditions et des facteurs influençant la libération de MEV.
Il s'agit d'une méthode efficace pour purifier les Monotains, mais elle a des limites. Il s'agit d'une procédure longue avec plusieurs étapes d'ultracentrifugation. À l'avenir, cette méthode sera comparée à la chromatographie de filtration de gel, et au fur et à mesure que des marqueurs moléculaires de MPV seront découverts, des méthodes de capture d'affinité pourraient être mises en œuvre. L'environnement hôte est limité en fer, c'est pourquoi les Monots produits par Mtb dans un milieu de fer faible sont probablement plus étroitement liés aux MeV produits pendant l'infection et pourraient fournir des informations pertinentes sur le rôle des MEV dans la pathogénie de la tuberculose.
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Disclosures
Les auteurs n'ont aucun conflit d'intérêts.
Acknowledgments
Nous sommes reconnaissants à Rafael Prados-Rosales d'avoir partagé l'antisera anti-MEV et Navneet Dogra pour avoir effectué des analyses de suivi des nanoparticules.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amicon stirred cell Model 108 | EMD Milipore | UFSC40001 | Cell Ultrafiltration system |
| BD Polypropilene 225 mL conical tubes | Fisher | 05-538-61 | Conical centrifuge tubes |
| Biomax 100 kDa cut-off ultrafiltration membrane | EMD Milipore | PBHK07610 | Ultrafiltration membrane |
| Chelex-100 resin | Bio-Rad | 142-2842 | Metal chelating resin |
| Middlebrook 7H10 Agar | BD Difco | 262710 | Mycobacterial Agar plates |
| Middlebrook 7H9 Broth | BD Difco | 271310 | Mycobacterial broth medium |
| Nitro cellulose blotting membrane | GE Healthcare | 10600001 | Blotting Membrane |
| Optiprep | Sigma | D1556 | Iodixanol |
| Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 mm x 89 mm | Beckman Coulter | 355618 | Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 mm x 89 mm |
| Polypropylene thin walled centrifuge tube 13 mm x 15 mm | Beckman Coulter | 344059 | Polypropylene thin walled centrifuge tube 13 mm x 15 mm |
| Protein Assay dye | BioRad | 5000006 | Bradford Protein Staining |
| SYPRO Ruby | Molecular Probes | S12000 | Ultrasensitive protein stain |
| TMA-DPH | Molecular Probes | T204 | 1-(4-Trimethylammoniumphenyl)-6-Phenyl-1,3,5-Hexatriene p-Toluenesulfonate |
| Vacuum filtration flasks | CellPro | V50022 | Filter Unit |
References
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