Summary
Mycobacterium tuberculosis mostra un aumento della produzione e del rilascio di vescibole extracellulari in risposta a basse condizioni di ferro. Questo lavoro descrive in dettaglio un protocollo per la generazione di basse condizioni e metodi di ferro per la purificazione e la caratterizzazione delle vesciche extracellulari micobatteriche rilasciate in risposta alla carenza di ferro.
Abstract
I micobatteri, tra cui Mycobacterium tuberculosis (Mtb), l'agente causale della tubercolosi umana, rilasciano naturalmente vescicoli extracellulari (EV) contenenti molecole immunologicamente attive. La conoscenza dei meccanismi molecolari della biogenesi vescicante, del contenuto delle vescibole e delle loro funzioni nell'interfaccia patogeno-ospite è molto limitata. Per affrontare queste questioni sono necessarie procedure rigorose per l'isolamento, la purificazione e la convalida dei veicoli elettrici. In precedenza, la produzione di vescicola era migliorata quando M. tuberculosis era esposto a restrizione del ferro, una condizione riscontrata da Mtb nell'ambiente host. Presentato qui è un protocollo completo e dettagliato per isolare e purificare i veicoli elettrici dai micobatteri carenti di ferro. I metodi quantitativi e qualitativi vengono applicati per convalidare i VE purificati.
Introduction
Le vescicole extracellulari micobatteriche (MEV) sono nanoparticelle legate alla membrana, di dimensioni di 60-300 nm, naturalmente rilasciate da micobatteri a crescita rapida e lenta1. I MEV rilasciati dai micobatteri patogeni costituiscono un meccanismo per interagire con l'ospite tramite proteine immunologicamente attive, lipidi e glicolipidi secreti in modo concentrato e protetto2,3,4. Per caratterizzare i MEV e comprenderne la biogenesi e le funzioni, sono cruciali metodi rigorosi ed efficienti di purificazione e convalida delle vesciche. Finora, i MEV sono stati isolati dalla coltura filtrati di micobatteri coltivati in un mezzo ricco di ferro1,5,6,7,8.
Tuttavia, il lavoro precedente ha dimostrato che la limitazione del ferro stimola notevolmente il rilascio di vesciche in Mtb,possibilmente per catturare il ferro tramite mycobactin, un siderophore secreto in MEV9. Sebbene siano state descritte le procedure per l'isolamento dei MEV dai Mtb coltivati nell'alto mezzo di ferro, non è stata riportata una metodologia efficiente per ottenere MEV da culture di ferro basso. Pertanto, l'obiettivo di questo metodo è quello di isolare, purificare e quantificare i MEV ottenuti da colture di ferro basse in modo che possano essere utilizzati per saggi biochimici e funzionali e per l'analisi dei determinanti genetici della produzione di vescicoli nei micobatteri.
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Protocol
1. Preparazione del mezzo definito impoverito di ferro
- Preparare 1 L di mezzo minimo (MM) sciogliendo 5 g di KH2PO4, 5 g di L-asparagine, 20 mL di glicerolo e 2 g di dextrose in 900 mL di acqua deionizzata in un contenitore di plastica. Evitare il vetro per evitare la contaminazione da ferro. Regolare il pH a 6,8 con 5 N NaOH e il volume a 1 L con acqua.
- Aggiungere 50 g di resina metallica chelante (MCR) e agitare delicatamente con una barra di stirazione magnetica per 24 h a 4 gradi centigradi. Sterilizzare e rimuovere l'MCR filtrando attraverso un'unità filtro 0,22 m con un ricevitore di plastica. Per accelerare la filtrazione e prevenire l'intasamento dei filtri, lasciare che il sedimento di resina per circa 30 min prima della filtrazione.
NOT: Questo mezzo contiene meno di 2 M di ferro residuo, come determinato dalla spettroscopia atomica ad assorbimento. - Supplemento MM con 0,5 mg/L di nCl2, 40 mg/L di MgSO4e 0,1 mg/L di MnSO4. Separatamente, preparare le scorte concentrate (1,000x) di ciascuno degli integratori metallici in acqua deionizzata e sterilizzare per filtrazione prima del completamento MM. La MM integrata in metallo eibita al ferro sarà qui chiamata MM a basso ferro (LIMM).
- Da uno stock di 50 mM di FeCl3 sciolto in 10 mM HCl, aggiungere 1 mL a 1 L di LIMM (50 m concentrazione finale) per preparare l'alta ferro MM (HIMM).
2. Micobatteri in crescita in condizioni limitate di ferro
- Scongelare 50 lun di uno stock di glicerolo del 15% congelato di Mtb e strisciare una piastra di agar integrata con 10% arricchimento ADN (5 g/L albumina, 2 g/L dextrose, e 0.85 g/L cloruro di sodio, 0.2% glicerol e 0.05% Tween-80)10. Incubare la piastra a 37 gradi centigradi fino a quando le colonie sono visibili.
- Inoculare una singola colonia di Mtb10 in 2 mL di brodo micobatterico medio (Tabella dei materiali) integrato con arricchimento ADN. Incubare con agitazione a 37 gradi centigradi.
- Lasciare che la coltura Mtb cresca fino alla fase logaritmica tardiva (OD540 è 0,8 dollari). Per verificare questo, misurare l'OD540 utilizzando uno spettrometro.
- Stendere 200 l della coltura logaritmica tardiva sulle piastre di agar micobatteriche (Tabella dei Materiali) completate con 0,2% glicerolo, 0,05% Tween-80 e ADN. Inoculare almeno 5 piatti. Incubare le piastre a 37 gradi centigradi fino a quando la crescita batterica è visibile come strato confluente. Questa operazione richiede 1 settimana per Mtb.
- In LIMM è stato umido un tampone sterile di cotone. Utilizzare questo tampone per raccogliere i batteri dalle piastre di agar e inoculare 100 mL di LIMM per preparare una sospensione batterica concentrata con un OD540 di 1,0 dollari.
- Diluire questa sospensione 10 a 1 L con LIMM e dividerla in due bottiglie di plastica sterile da 2 L, ognuna contenente 500 mL di coltura.
- Estrarre 2 mL di cultura e trasferirlo in un tubo di coltura 5 mL. Aggiungete 10 -L del 10% di tintura vol/vol.
- Incubare le culture a 37 gradi centigradi in piedi per 14 giorni.
3. Collezione di MEV
- Misurare l'OD540 della coltura da 2 mL al momento della raccolta. Effettuare diluizioni seriali 1:10 della coltura e la piastra 100 l di ogni diluizione su piastre di agar con ADN e 0,05% Tween-80.
- Trasferire la coltura a cinque tubi di centrifuga conica da 225 mL e centrifugare a 2.850 x g per 7 min a 20 gradi centigradi.
- Raccogliere la coltura supernatant con una pipetta da 50 mL e filtrare sterilizzare attraverso un'unità filtro 0.22 m.
4. Isolamento dei MEV
- Trasferire la coltura filtrata in un sistema di ultrafiltrazione cellulare agitato posto a 4 gradi centigradi e filtrare il concentrato a <50 psi attraverso una membrana cutoff da 100 kDa a 50 mL.
- Centrifugare la coltura concentrata filtrare a 15.000 x g per 15 min a 4 gradi centigradi e raccogliere il sovrinnovatore.
- Centrifugare la coltura filtrare in tubi di ultracentrifugazione policarbonato a 100.000 x g per 2 h a 4 gradi centigradi.
- Risospendere i pellet membranosi in un totale di 1 mL di fosfato sterile tampinato salina (PBS) con una leggera pipettatura.
- Mescolare 0,5 mL della sospensione a pellet ottenuta al passo 4.4 con 1,5 mL di soluzione iodixanol 60%, producendo una concentrazione finale di ioxanol del 45% wt/vol.
- Sovrapporre le sospensioni MEV-iodixanol 45% con 1 mL del 40%, 35%, 30%, 25% e 20% (vol/vol in PBS) soluzioni iodixanolo e 1 mL di PBS in cima.
- Centrifuga a 100.000 x g per 18 h a 4 gradi centigradi.
- Raccogliere le frazioni di pendenza di densità di 1 mL a partire dall'alto utilizzando una siringa Hamilton da 1 mL.
- Diluire ogni frazione raccolta a 20 mL con PBS e centrifuga a 100.000 x g per 2 h a 4 gradi centigradi.
- Rimuovere il supernatante e sospendere il pellet in 0,5 mL di PBS. Conservare questo pellet a 4 gradi centigradi.
5. Quantificazione dei MEV
- Misurare la concentrazione proteica in ogni frazione da un saggio di Bradford (Tabella dei materiali), seguendo le linee guida del produttore.
-
Eseguire l'analisi lipidida della membrana.
- Incubare 10 l di ogni frazione di pendenza con la sonda a membrana fluorescente 1-(4-Trimethylammoniumphenyyil)-6-Phenyl-1,3,5-Hexatriene p-Toluenesulfofonate (TMA-DPH) ad una concentrazione finale di 1 g/mL in un volume finale di 50 gradi di PBS in 96 Piastre.
- Incubare le piastre a 33 gradi centigradi per 20 min.
- Misurare la fluorescenza a 360 nm eccitazione e 430 nm emissione.
6. Analisi qualitativa dei MEV
-
Eseguire l'elettroforesi proteica.
- Mescolare circa 1 g di campioni di MEV in 16 gradi con 4 1l di 5 x di buffer di carico del campione (10% w/v SDS, 10 mM dithiothreitol, 20% v/v glicerol 0,2 M Tris-HCl, pH 6.8 0.05% w/v brofenmol blue) e i campioni di calore in buffer campione a 85 m.
- Caricare in un gel 10% Tris/Glycine SDS-polyacrylamide11 e correre a 10 V/cm nel buffer di corsa (25 mM Tris base, 190 mM glicina, 0,1% SDS) fino a quando la parte anteriore colorante blu raggiunge il fondo del gel.
- Macchiare il gel con una soluzione di colorazione delle proteine ultrasensibile (Tabella dei materiali).
-
Eseguire la macchia del punto.
- Caricare 2 - L di una sospensione MEV con una concentrazione di circa 0,5 g/l, e due diluizioni seriali su una membrana di nitrocellulosa e il processo per una macchia di punti secondo le istruzioni del produttore.
- Utilizzare un antisiero sollevato nei topi contro una preparazione di MEV a una diluizione di 1:5.000 come anticorpo primario e una capra anti-torace accoppiato al rafano perossidasi (HRP) ad una diluizione 1:10,000 come anticorpo secondario. Rilevare i complessi antigeni-anticorpi con un reagente di rilevamento del rilevamento del rilevamento del rilevamento del supporto HRP appropriato e un sistema di imaging.
-
Eseguire la colorazione negativa e la microscopia elettronica.
- Fissare 250 L di MEV con 2% glutaraldeide in cacodylate 0,1 M a temperatura ambiente per 2 h e incubare durante la notte in 4% formaldeide, 1% glutaraldeide, e 0.1% PBS.
- Macchiare i campioni fissi con 2% di tetrossido di osmio per 90 min.
- Disidratare serialmente il campione in etanolo e incorporarlo nella resina epossidica di Spurr.
- Osservare i MEV al microscopio elettronico a trasmissione.
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Representative Results
I MEV sono stati purificati dalla sedimentazione differenziale in un gradiente di densità (Figura 1, Figura 2). Nelle condizioni descritte, MEV separati per lo più nella frazione sfumata 3 (F3), che corrisponde al 25% di iodixanol. Questa conclusione si basa sul rilevamento di proteine, lipidi della membrana, visualizzazione microscopica di MEV intatti, distribuzione delle dimensioni delle nanoparticelle e reattività positiva con un antisiero antivesciante (Figura 2, Figura 3). La concentrazione di proteine e lipidi normalizzata a unità formanti una colonia (CTU) ha mostrato un aumento di circa otto volte della resa di MEV in ferro basso rispetto alle condizioni di ferro elevato (50 M FeCl3) (Figura 3). Anche se vengono presentati i risultati di un esperimento rappresentativo, si tratta di un risultato altamente riproducibile basato su molteplici (>10) isolazioni di MEV. La resa MEV pura ottenuta da una coltura di ferro bassa 1 L con questo metodo era di circa 500 g di proteine.
Figura 1: Rappresentazione diagrammatica della metodologia utilizzata per la purificazione e la quantificazione del MEV. I micobatteri coltivati in piastre di agar sono stati utilizzati per inoculare il mezzo minimo impoverito di ferro e crescere Mtb per l'isolamento EV. I MEV sono stati purificati da un gradiente di densità discontinuo dalla coltura senza cellule filtrata. È stata implementata una combinazione di determinazione delle proteine a membrana e di proteine vescicane, microscopia e analisi delle nanoparticelle per caratterizzare i MEV purificati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Caratterizzazione dei MEV purificati. (A) Sono mostrate fotografie di una effettiva separazione del gradiente di densità dei MEV grezzi e il pellet dei MEV purificati raccolti dall'ultracentrifugazione della frazione di grado 3 (F3). (B) SDS-gel macchiato che mostra il profilo proteico delle varie frazioni di gradiente di densità. (C) Analisi delle macchie a punti che mostrano proteine vesciche concentrate in F3. (D) MEV presenti in F3 osservati da colorazione negativa. (E) Distribuzione delle dimensioni MEV in base all'analisi delle nanoparticelle (NTA). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Analisi comparativa della resa MEV nelle colture di ferro basse e alte. Un risultato rappresentativo della quantificazione di proteine e lipidi (A) e dell'analisi delle macchie a punti(B)di MEV purificati isolati dalle colture Mtb, con limitato di ferro e ferro. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Sono stati sviluppati diversi metodi per purificare gli esosomi eucarioti derivati dalle cellule12. Al contrario, vi sono informazioni limitate sui metodi efficaci per purificare gli EV7derivati dai batteri. L'isolamento efficiente dei veicoli elettrici derivati da Mtb deve considerare le difficoltà intrinseche nella coltivazione di questo micatacterio patogeno. Mtb ha un lungo tempo di divisione (24 h) e deve essere gestito in condizioni di biosicurezza di livello tre (BSL-3). Pertanto, è importante ottimizzare l'efficienza dei metodi di isolamento MEV. Poiché i micobatteri rilasciano glicolipidi e altre molecole idrofobiche che aggregano e contaminano facilmente i preparati grezzi MEV nel mezzo, è importante purificare e convalidare i MEV prima di condurre studi biochimici e funzionali. Sulla base di osservazioni precedenti che hanno dimostrato che Mtb migliora il rilascio di MEV in condizioni di limitazione del ferro, è stato istituito un protocollo per la purificazione eV da micobatteri ferrosi. È stato inoltre confermato che M. smegmatis non virulente aumenta anche il rilascio di veicoli elettrici in risposta a condizioni di ferro basse (dati non mostrati). Pertanto, lo stesso protocollo potrebbe essere utilizzato per purificare gli EV da questo batterio in condizioni BSL-2.
Una fase critica di questa procedura è la preparazione del mezzo di ferro basso. Questo mezzo deve essere preparato come descritto qui e conservato in un contenitore di plastica, non in vetro, per prevenire la contaminazione da ferro. Devono essere evitati integratori comunemente utilizzati nel mezzo di crescita di Mtb per stimolare la crescita batterica e prevenire l'agglomerazione micobatterica caratteristica, come l'albumina del siero bovino, Tween-80 o il tyloxapol. Questi additivi portano a manufatti complessi di lipoproteina che copurificano con vesciche e riducono la resa delle vesciche. Per la determinazione della CFU, una piccola coltura a medio eintegrato da detergenti (Tween-80 o tyloxapol) può essere impostata in parallelo alla grande coltura senza detersivo. I MEV della coltura filtrano sono stabili a 4 gradi centigradi per diversi giorni. Pertanto, se non elaborato immediatamente, la coltura filtrata può essere immagazzinata refrigerata.
La resa totale di MEV purificato da 1 L di coltura è stata di circa 500 g/L di proteine, che è sufficiente per condurre analisi multiple come proteomica, lipimmica e saggi funzionali. A seconda del tipo di analisi, un numero sufficiente di MEV può essere isolato da volumi più piccoli (ad esempio, 250 mL). Ciò facilita l'analisi comparativa delle condizioni e dei fattori che influenzano il rilascio di MEV.
Questo è un metodo efficace per purificare i MEV, ma ha dei limiti. Si tratta di una procedura lunga con più passaggi di ultracentrifugazione. In futuro, questo metodo sarà paragonato alla cromatografia della filtrazione dei gel e, man mano che vengono scoperti i marcatori molecolari dei MEV, potrebbero essere implementati metodi di cattura dell'affinità. L'ambiente ospitante è limitato al ferro, quindi i MEV prodotti da Mtb in un mezzo di ferro basso sono probabilmente più strettamente correlati ai MEV prodotti durante l'infezione e potrebbero fornire informazioni pertinenti sul ruolo dei MEV nella patogenesi della tubercolosi.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse.
Acknowledgments
Siamo grati a Rafael Prados-Rosales per aver condiviso l'antisera anti-MEV e Navneet Dogra per aver eseguito l'analisi del monitoraggio delle nanoparticelle.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amicon stirred cell Model 108 | EMD Milipore | UFSC40001 | Cell Ultrafiltration system |
| BD Polypropilene 225 mL conical tubes | Fisher | 05-538-61 | Conical centrifuge tubes |
| Biomax 100 kDa cut-off ultrafiltration membrane | EMD Milipore | PBHK07610 | Ultrafiltration membrane |
| Chelex-100 resin | Bio-Rad | 142-2842 | Metal chelating resin |
| Middlebrook 7H10 Agar | BD Difco | 262710 | Mycobacterial Agar plates |
| Middlebrook 7H9 Broth | BD Difco | 271310 | Mycobacterial broth medium |
| Nitro cellulose blotting membrane | GE Healthcare | 10600001 | Blotting Membrane |
| Optiprep | Sigma | D1556 | Iodixanol |
| Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 mm x 89 mm | Beckman Coulter | 355618 | Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 mm x 89 mm |
| Polypropylene thin walled centrifuge tube 13 mm x 15 mm | Beckman Coulter | 344059 | Polypropylene thin walled centrifuge tube 13 mm x 15 mm |
| Protein Assay dye | BioRad | 5000006 | Bradford Protein Staining |
| SYPRO Ruby | Molecular Probes | S12000 | Ultrasensitive protein stain |
| TMA-DPH | Molecular Probes | T204 | 1-(4-Trimethylammoniumphenyl)-6-Phenyl-1,3,5-Hexatriene p-Toluenesulfonate |
| Vacuum filtration flasks | CellPro | V50022 | Filter Unit |
References
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