Summary
결핵 균은 낮은 철 조건에 응하여 세포외 소포의 증가된 생산 그리고 방출을 보여줍니다. 이 작품은 철 결핍에 응하여 풀어 놓인 진균 세포외 소포의 정제 그리고 특성화를 위한 낮은 철 조건 및 방법을 생성하기 위한 프로토콜을 상세히 기술합니다.
Abstract
인간 결핵의 원인원인 인균인 결핵 균(Mtb)을 포함한 마이코박테리아는 면역학적 활성 분자를 함유하는 세포외 소포(EV)를 자연적으로 방출합니다. 소포 생물 발생의 분자 메커니즘, 소포의 함량 및 병원체 숙주 인터페이스에서의 기능에 관한 지식은 매우 제한적입니다. 이러한 문제를 해결하려면 EV의 격리, 정화 및 검증을 위한 엄격한 절차가 필요합니다. 이전에는 M. 결핵이 숙주 환경에서 Mtb에 의해 발생하는 조건인 철제한에 노출되었을 때 소포 생산이 강화되는 것으로 나타났습니다. 여기에 제시된 완전하고 상세한 프로토콜은 철결핍 균으로부터 전기자동차를 분리하고 정화하는 것입니다. 정제 된 전기 를 검증하기 위해 정량적 및 질적 방법이 적용됩니다.
Introduction
진균성 세포밖 소포 (MEV)는 막 결합 된 나노 입자, 60-300 nm 크기로, 빠르고 느리게 성장하는 진균에 의해 자연적으로 방출됩니다1. 병원성 진균에 의해 방출된 MEV는 면역학적 활성 단백질, 지질 및 글리콜리피드를 통해 숙주와 상호 작용하는 메커니즘을 구성하여 농축 및 보호 방식으로분비되는 2,3,4. MEV를 특성화하고 생물 발생 및 기능을 이해하려면 소포 정화 및 검증의 엄격하고 효율적인 방법이 중요합니다. 지금까지 MEV는 철분이 풍부한 배지1,5,6,7,8에서자란 진균의 배양 여과체로부터 분리되어 왔다.
그러나, 전작에서는 철 제한이 Mtb에서 소포 방출을 크게 자극한다는 것을 보여주었으며, 아마도 MEV9에서분비되는 사이드로포어인 마이코박틴을 통해 철을 포착할 수 있습니다. 높은 철 배지에서 배양된 Mtb로부터의 MEV 격리 에 대한 절차가 설명되었지만, 낮은 철 배양물에서 MEV를 얻는 효율적인 방법은 보고되지 않았다. 따라서, 이 방법의 목적은 낮은 철 배양물에서 얻은 MEV를 분리, 정화 및 정량화하여 생화학 및 기능성 분석및 진균에서 소포 생산의 유전 적 결정요인의 분석에 사용될 수 있도록 하는 것입니다.
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Protocol
1. 철분 고갈 정의 매체의 준비
- KH2 PO4,L-아스파라긴 5g,글리세롤 20 mL, 덱스트로오스 2g을 플라스틱 용기에 탈이온수 900 mL에 녹여 최소 배지(MM) 1L를 준비합니다. 철분 오염을 방지하기 위해 유리를 피하십시오. pH를 5 N NaOH로 6.8로 조정하고 부피를 물로 1L로 조정합니다.
- 금속 킬레이트 수지(MCR) 50g을 넣고 4°C에서 24시간 동안 마그네틱 교반 막대를 사용하여 부드럽게 교반합니다. 플라스틱 수신기가 있는 0.22 μm 필터 유닛을 통해 여과하여 MCR을 살균하고 제거합니다. 여과를 가속화하고 필터 막힘을 방지하기 위해, 여과 하기 전에 약 30 분 동안 수지 퇴적물을 보자.
참고: 이 배지는 원자 흡수 분광법에 의해 결정된 2 μM 잔류 철보다 적습니다. - ZnCl의 0.5 mg/L,MgSO4의40 mg/L, 그리고 0.1 mg/L의 MnSO4. 별도로, 탈이온수에서 각 금속 보충제의 농축 된 주식 (1,000x)을 준비하고 MM 보충 전에 여과하여 살균하십시오. 철고갈, 금속 보충 MM은 여기서 저철 MM(LIMM)이라고 한다.
- 10 mM HCl에 용해된 FeCl3의 50 mM 스톡에서 1 mL을 LIMM(50 μM 최종 농도)에 1mL추가하여 높은 철MM(HIMM)을 준비합니다.
2. 철분 제한 조건에서 마이코박테리아 재배
- Mtb의 냉동 15% 글리세롤 스톡 50 μL을 해동하고 10% ADN 농축(5 g/L 알부민, 2 g/L 덱스트로스, 0.85 g/L 염화나트륨, 0.2% 글리세롤 및 0.05% 트위든-80)으로 보충된 한천 플레이트를 줄무늬. 식민지가 보일 때까지 37 °C에서 접시를 배양하십시오.
- ADN 농축물로 보충된 진균 육수배지(재료 표)의2 mL에 Mtb10의 단일 콜로니를 접종합니다. 37 °C에서 교반으로 배양하십시오.
- Mtb 배양이 후기 로그 단계(OD540 ~0.8)로 성장하게 한다. 이를 확인하려면 분광광도계를 사용하여 OD540을 측정합니다.
- 0.2% 글리세롤, 0.05% 트웬-80, 및 ADN을 보충된 진균 한천플레이트(재료표)에후기 로그학 배양물의 200 μL을 퍼뜨리고. 적어도 5 개의 접시를 접종하십시오. 박테리아 성장이 동급층으로 보일 때까지 플레이트를 37°C에서 배양합니다. 이것은 Mtb에 대 한 ~ 1 주 걸립니다.
- LIMM에 멸균 면봉을 적시소. 이 면봉을 사용하여 한천 접시에서 박테리아를 수집하고 LIMM의 100 mL을 접종하여 ~ 1.0의 OD540으로 농축 된 세균 현탁액을 준비하십시오.
- 이 현탁액을 LIMM으로 10~1L로 희석하고 2L 멸균 플라스틱 병으로 나누고 각각 500 mL의 배양을 함유합니다.
- 배양 2 mL을 꺼내 5 mL 배양 튜브로 옮김을 옮김. 10% vol/vol tyloxapol의 10 μL을 추가합니다.
- 14일 동안 37°C에서 배양한다.
3. MEV의 컬렉션
- 수집 시 2 mL 배양의OD(540)를 측정한다. ADN과 0.05 % 트웬-80한천 플레이트에 배양 및 플레이트 100 μL의 직렬 희석을 합니다.
- 20°C에서 7분 동안 2,850 x g에서 5개의 225 mL 원원심분리기 및 원심분리기로 배양을 옮긴다.
- 50 mL 파이펫으로 배양 상류를 수집하고 0.22 μm 필터 유닛을 통해 필터를 살균합니다.
4. MEV의 격리
- 배양 여과액을 4°C에 배치한 교반 세포 초여과 시스템으로 옮기고 100 kDa 컷오프 막을 통해 <50 psi에서 농축물을 ~50 mL로 여과한다.
- 농축배양여체를 15,000 x g에서 4°C에서 15분 동안 15분 간 및 상급체를 수집한다.
- 4 °C에서 2 시간 동안 100,000 x g에서 폴리 카보네이트 초원심분리 튜브에서 배양 여과.
- 부드러운 파이펫팅으로 총 1 mL의 멸균 인산완충식염수(PBS)로 밀폐펠릿을 다시 일시 중단합니다.
- 4.4 단계에서 얻은 펠릿 현탁액의 0.5 mL을 60 % 이오디산놀 용액의 1.5 mL로 혼합하여 최종 이오디크산놀 농도를 45 % wt / vol. 13mm x 51mm 폴리 프로필렌 박막 박막 초원각지 튜브의 바닥에서이 혼합물을 분배합니다.
- MEV-이오디산올 45% 서스펜션을 40%, 35%, 30%, 25%, 20%(PBS의 vol/vol) iodixanol 용액과 1 mL의 PBS 상단에 오버레이합니다.
- 4 °C에서 18 시간 동안 100,000 x g의 원심 분리기.
- 1 mL 해밀턴 주사기를 사용하여 상단으로부터 시작하여 1 mL 밀도 그라데이션 분획을 수집합니다.
- 수집된 분획을 PBS 및 원심분리기로 각각 100,000 x g에서 4°C에서 2시간 동안 희석합니다.
- 상급체를 제거하고 PBS의 0.5 mL에서 펠릿을 일시 중단합니다. 이 펠릿을 4°C에 보관하십시오.
5. MEV정량화
- 제조업체의 지침에 따라 브래드포드분석(재료 표)을통해 각 분획의 단백질 농도를 측정합니다.
-
막 지질 분석을 수행합니다.
- 형광막 프로브 1-(4-트리메틸람모니우페닐)-6-페닐-1,3,5-헥사트리엔 p-톨루엔술포네이트(TMA-DPH)를 최종 농도에서 1 μg/mL의 최종 농도에서 90μg/mL의 최종 농도로 90μg/mL의 최종 농도로 각 그라데이션 분획의 배양 격판덮개.
- 플레이트를 33°C에서 20분 동안 배양합니다.
- 360 nm 여기 및 430 nm 방출에서 형광을 측정합니다.
6. MEV의 정성적 분석
-
단백질 전기 동동을 수행합니다.
- MEV 시료 약 1 μg를 16 μL에서 5x 시료 로딩 버퍼 4 μL(10% w/v SDS, 10 mM dithiothreitol, 20% v/v 글리세롤 0.2 M Tris-HCl, pH 6.8 0.05% w/v/v 브로모펜 올 블루)에 혼합하고 샘플 샘플을 C5°C에서 가열합니다.
- 10% 트리스/글리신 SDS-폴리아크릴아미드 젤11을 적재하고 완충완충(25mMTris 베이스, 190 mM 글리신, 0.1% SDS)에서 10V/cm에서 실행하여 청색 염료 전면이 겔의 바닥에 도달할 때까지 실행합니다.
- 젤을 초민감성 단백질 염색 용액(재료 표)으로염색하십시오.
-
도트 블롯을 수행합니다.
- 약 0.5 μg/μL의 농도로 MEV 서스펜션의 2 μL을 적재하고, 니트로셀룰로오스 멤브레인에 2중 직렬 희석을 하고 제조업체의 지침에 따라 도트 블롯을 처리합니다.
- 1:5,000의 희석에서 MEV의 제조에 대하여 마우스에서 기르는 항세럼을 1:5,000의 1차 항체및 고추냉이 과산화증(HRP)에 결합된 염소 항마우스를 1:10,000 희석된 이차 항체로서 사용한다. 적절한 HRP 기판 블로팅 검출 시약 및 이미징 시스템으로 항원 항체 복합체를 검출합니다.
-
네거티브 염색 및 전자 현미경 검사를 수행합니다.
- 250 μL의 MEV를 실온에서 0.1M 의 글루타랄데히드와 함께 2%의 글루타랄데히드를 2시간 동안 체온에서 수정하고 포름알데히드 4%, 글루타랄데히드 1%, PBS 0.1%로 밤새 배양합니다.
- 90 분 동안 2 % 오스뮴 테트 옥사이드로 고정 된 샘플을 염색하십시오.
- 샘플을 에탄올로 연속적으로 탈수시키고 Spurr의 에폭시 수지에 포함시다.
- 투과 전자 현미경으로 MEV를 관찰합니다.
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Representative Results
MEV는 밀도 구배에서 차등 침전물을 정제하였다(도1, 도 2). 설명된 조건하에서, MEV는 대부분 25% 이오디산올에 해당하는 그라데이션 분획 3(F3)으로 분리되었다. 이러한 결론은 단백질, 막 지질, 손상되지 않은 MEV의 현미경 시각화, 나노입자 크기 분포, 및 항베제 항혈전을 통한 양성 반응성의 검출에 기초한다(도2, 도 3). 콜로니 형성 단위(CFUs)로 정규화된 단백질 및 지질 농도는 높은 철 조건에 비해 낮은 철분에서 MEV 수율의 약 8배 증가를 보였다(50 μM FeCl3)(그림 3). 한 가지 대표적인 실험의 결과가 제시되었지만, 이는 MEV의 다중(>10) 격리를 기반으로 매우 재현가능한 결과입니다. 이 방법에 의해 1 L 낮은 철 배양으로부터 얻은 순수한 MEV 수율은 약 500 μg의 단백질이었다.
그림 1: MEV 정제 및 정량화에 사용되는 방법론의 도식적 표현. 한천 플레이트에서 자란 마이코박테리아는 철분고갈을 막고 최소 배지를 접종하고 EV 격리를 위해 Mtb를 성장시키는 데 사용되었습니다. MEV는 무세포 배양 여과액으로부터 불연속 밀도 구배를 정제하였다. 정제된 MEV를 특성화하기 위해 막 지질 및 소포 단백질 측정, 현미경 검사법 및 나노입자 분석의 조합이 구현되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 정제된 MEV의 특성화. (A)도시된 사진은 그라데이션 분획 3(F3)의 초원심분리에 의해 수집된 정제된 MEV의 실제 밀도 구배 분리 및 정제된 MEV의 펠릿의 사진이다. (B)다양한 밀도 구배 분획의 단백질 프로파일을 나타내는 SDS-겔 염색. (C)F3에 농축된 소포 관련 단백질을 나타내는 도트 블롯 분석. (D)F3에 존재하는 MEV는 부정적인 염색에 의해 관찰된다. (E)나노 입자 분석 (NTA)에 따라 MEV 크기 분포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 저철 배양물에서 MEV 수율의 비교 분석. 대표적인 결과(A)단백질 및 지질 정량화 및(B)정제된 MEV의 도트 블롯 분석은 철분 제한 및 철분 충분한 Mtb 배양으로부터 분리되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
진핵 세포 유래 엑소좀을 정화하는 여러 방법이12가지개발되었다. 이에 반해, 박테리아 유래 EV7을정화하는 효과적인 방법에 대한 정보는 제한적이다. Mtb 유래 전기 EV의 효율적인 격리는 이 병원성 진균을 성장에 있는 본질적인 어려움을 고려할 필요가 있습니다. Mtb는 긴 분할 시간 (~24 h)을 가지고 있으며 생물 안전 성 수준 3 (BSL-3) 조건에서 처리해야합니다. 따라서 MEV 절연 방법의 효율을 최적화하는 것이 중요합니다. 진균은 조잡한 MEV 제제를 배지로 쉽게 응집하고 쉽게 오염시키는 글리콜리파이드 및 기타 소수성 분자를 방출하기 때문에 생화학 및 기능적 연구를 수행하기 전에 MEV를 정화하고 검증하는 것이 중요합니다. Mtb가 철 제한 조건하에서 MEV의 방출을 향상시킨다는 것을 입증한 이전 관찰에 기초하여, 철 제한 진균에서 EV 정제를 위한 프로토콜이 설치되었습니다. 또한 비악성 M. 스메그마티스는 또한 낮은 철 조건 (데이터가 표시되지 않음)에 대한 응답으로 전기 EV의 방출을 증가시키는 것으로 확인되었다. 따라서, 동일한 프로토콜BSL-2 조건에서이 박테리아에서 전기 를 정화 하는 데 사용할 수 있습니다.
이 절차의 중요한 단계는 낮은 철 배지의 제조입니다. 이 매체는 여기에 설명된 대로 제조되어야하며 철 오염을 방지하기 위해 유리가 아닌 플라스틱 용기에 보관해야합니다. 세균 성장을 자극 하 고 특성 진균 덩어리를 방지 하기 위해 Mtb 성장 매체에 일반적으로 사용 되는 보충 교재, 소 혈 청 알 부 민 등, Tween-80, 또는 tyloxapol, 피해 야 한다. 이 첨가제는 소포와 공고하고 소포 수율을 감소시키는 지단백질 복잡한 유물로 이끌어 내보어집니다. CFU 판정을 위해, 세제(Tween-80 또는 tyloxapol)로 보충된 배지의 작은 배양액은 세제없는 큰 배양과 병행하여 설정될 수 있다. 배양 여과액 중의 MEV는 며칠 동안 4°C에서 안정하다. 따라서, 즉시 처리되지 않으면, 배양 여과액은 냉장 보관될 수 있다.
배양 1L로부터 정제된 MEV의 총 수율은 약 500 μg/L 단백질이었으며, 이는 프로테오믹스, 지질학 및 기능성 분석과 같은 여러 분석을 수행하기에 충분합니다. 분석 의 유형에 따라, 충분한 ME는 더 작은 볼륨 (즉, 250 mL)에서 분리 될 수있다. 이는 MEV 방출에 영향을 미치는 조건 및 요인의 비교 분석을 용이하게 합니다.
이것은 MEV를 정화하는 효과적인 방법이지만 한계가 있습니다. 그것은 여러 초원심분리 단계가있는 긴 절차입니다. 미래에, 이 방법은 젤 여과 크로마토그래피와 비교될 것이고, MEV의 분자 마커가 발견될 때, 친화성 포착 방법이 구현될 수 있었다. 숙주 환경은 철 제한적이므로 낮은 철 배지에서 Mtb에 의해 생성된 MEV는 감염 중에 생성된 MEV와 더 밀접하게 관련되어 있으며 결핵 발병기전에서 MEV의 역할에 대한 관련 통찰력을 제공할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 이해관계의 충돌이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 나노 입자 추적 분석을 수행하기위한 안티 MEV 항 세라와 Navneet 도그라를 공유 라파엘 프라도스 - 로살레스에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amicon stirred cell Model 108 | EMD Milipore | UFSC40001 | Cell Ultrafiltration system |
| BD Polypropilene 225 mL conical tubes | Fisher | 05-538-61 | Conical centrifuge tubes |
| Biomax 100 kDa cut-off ultrafiltration membrane | EMD Milipore | PBHK07610 | Ultrafiltration membrane |
| Chelex-100 resin | Bio-Rad | 142-2842 | Metal chelating resin |
| Middlebrook 7H10 Agar | BD Difco | 262710 | Mycobacterial Agar plates |
| Middlebrook 7H9 Broth | BD Difco | 271310 | Mycobacterial broth medium |
| Nitro cellulose blotting membrane | GE Healthcare | 10600001 | Blotting Membrane |
| Optiprep | Sigma | D1556 | Iodixanol |
| Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 mm x 89 mm | Beckman Coulter | 355618 | Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 mm x 89 mm |
| Polypropylene thin walled centrifuge tube 13 mm x 15 mm | Beckman Coulter | 344059 | Polypropylene thin walled centrifuge tube 13 mm x 15 mm |
| Protein Assay dye | BioRad | 5000006 | Bradford Protein Staining |
| SYPRO Ruby | Molecular Probes | S12000 | Ultrasensitive protein stain |
| TMA-DPH | Molecular Probes | T204 | 1-(4-Trimethylammoniumphenyl)-6-Phenyl-1,3,5-Hexatriene p-Toluenesulfonate |
| Vacuum filtration flasks | CellPro | V50022 | Filter Unit |
References
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