Summary
Mycobacterium tuberculosis mostra aumento da produção e liberação de vesículas extracelulares em resposta às condições de baixo ferro. Este trabalho detalha um protocolo para gerar condições e métodos baixos de ferro para a purificação e caracterização de vesículas extracelulares micobacterianas liberadas em resposta à deficiência de ferro.
Abstract
Micobactérias, incluindo Mycobacterium tuberculosis (Mtb), o agente causador da tuberculose humana, liberam naturalmente vesículas extracelulares (EVs) contendo moléculas imunologicamente ativas. O conhecimento sobre os mecanismos moleculares da biogênese vesícula, o conteúdo das vesículas e suas funções na interface patógeno-hospedeiro é muito limitado. Abordar essas questões requer procedimentos rigorosos para isolamento, purificação e validação de EVs. Previamente, a produção do vesicle foi encontrada para ser realçada quando a tuberculose de M. foi expor à limitação do ferro, uma circunstância encontrada por Mtb no ambiente do anfitrião. Apresentado aqui é um protocolo completo e detalhado para isolar e purificar EVs de micobactérias deficientes em ferro. Métodos quantitativos e qualitativos são aplicados para validar EVs purificados.
Introduction
As vesículas extracelulares micobacterianas (MEVs) são nanopartículas ligadas à membrana, de 60 a 300 nm de tamanho, naturalmente liberadas por micobactérias de crescimento rápido e lento1. Mevs liberados por micobactérias patogênicas constituem um mecanismo para interagir com o hospedeiro através de proteínas imunologicamente ativas, lipídios e glicolipides secretados de forma concentrada e protegida2,3,4. Para caracterizar MEVs e compreender a sua biogênese e funções, métodos rigorosos e eficientes de purificação e validação de vesículas são cruciais. Até agora, mevs foram isolados da cultura filtrates de micobactérias cultivadas em um meio rico em ferro1,5,6,7,8.
No entanto, trabalhos anteriores demonstraram que a limitação de ferro estimula muito a liberação de vesículas em Mtb, possivelmente para capturar ferro via micobactina, um sideróforo secretado em MEVs9. Embora os procedimentos para o isolamento de MEVs de Mtb cultivados em médio de alto ferro tenham sido descritos, uma metodologia eficiente para obter MEVs de culturas de baixo ferro não foi relatada. Portanto, o objetivo deste método é isolar, purificar e quantificar os MEVs obtidos de culturas de baixo ferro para que possam ser usados para ensaios bioquímicos e funcionais e para a análise de determinantes genéticos da produção de vesículas em micobactérias.
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Protocol
1. Preparação do meio definido empobrecido em ferro
- Prepare 1 L de médio mínimo (MM) dissolvendo 5 g de KH2PO4, 5 g de L-asparagine, 20 mL de glicerol e 2 g de dextrose em 900 mL de água desionizada em um recipiente de plástico. Evite o vidro para evitar a contaminação por ferro. Ajuste o pH para 6,8 com 5 N NaOH e o volume para 1 L com água.
- Adicione 50 g de resina quelante de metal (MCR) e agita-se suavemente usando uma barra de agitação magnética por 24 h a 4 °C. Esterilizar e remover o MCR por filtragem através de uma unidade de filtro de 0,22 μm com um receptor de plástico. Para acelerar a filtragem e evitar entupimento de filtro, deixe o sedimento de resina por cerca de 30 min antes da filtragem.
Nota: Este meio contém menos de 2 μM de ferro residual, conforme determinado pela espectroscopia de absorção atômica. - Suplemento MM com 0,5 mg/L de ZnCl2,40 mg/L de MgSO4,e 0,1 mg/L de MnSO4. Separadamente, prepare estoques concentrados (1.000x) de cada um dos suplementos metálicos em água desionizada e esterilizar por filtragem antes da suplementação mm. O MM suplementado de metal esgotado em ferro será referido aqui como MM de baixo ferro (LIMM).
- A partir de um estoque de 50 mM de FeCl3 dissolvido em 10 mM HCl, adicione 1 mL a 1 L de LIMM (50 μM concentração final) para preparar mm de ferro alto (HIMM).
2. Growing Mycobacteria in Iron-limited Conditions 2. Growing Mycobacteria in Iron-limited Conditions 2. Growing Mycobacteria in Iron-limited Conditions 2.
- Descongele 50 μL de um estoque congelado de 15% de glicerol de Mtb e estria uma placa de ágar complementada com enriquecimento DED 10% (5 g/L albumina, 2 g/L dextrose e 0,85 g/L cloreto de sódio, 0,2% glicerol e 0,05% Tween-80)10. Incubar a placa a 37 °C até que as colônias sejam visíveis.
- Inocular uma única colônia de Mtb10 em 2 mL de meio de caldo micobacteriano(Tabela de Materiais)complementada com enriquecimento ADN. Incubar com agitação a 37 °C.
- Deixe a cultura Mtb crescer até a fase logarítica tardia (OD540 é ~ 0,8). Para verificar isso, medir o OD540 usando um espectrômetro.
- Espalhe 200 μL da cultura logarítica tardia nas placas de ágar micobacterianas(Tabela de Materiais)complementadas com glicerol de 0,2%, 0,05% Tween-80 e ADN. Inocular pelo menos 5 placas. Incubar as placas a 37 °C até que o crescimento bacteriano seja visível como uma camada de confluente. Isso leva ~ 1 semana para Mtb.
- Molhe um cotonete estéril em LIMM. Use este cotonete para coletar bactérias das placas de ágar e inocular 100 mL de LIMM para preparar uma suspensão bacteriana concentrada com um OD540 de ~1.0.
- Diluir esta suspensão 10 vezes a 1 L com LIMM e dividi-lo em dois, 2 L garrafas de plástico estéreis, cada um contendo 500 mL de cultura.
- Tire 2 mL de cultura e transferi-lo para um tubo de cultura 5 mL. Adicione 10 μL de 10% vol/vol tyloxapol.
- Incubar as culturas a 37 °C de pé por 14 dias.
3. Coleção de MEVs
- Medir o OD540 da cultura 2 mL no momento da coleta. Faça 1:10 diluições em série da cultura e placa 100 μL de cada diluição em placas de ágar com ADN e 0,05% Tween-80.
- Transfira a cultura para cinco tubos cônicos de centrífuga de 225 mL e centrífugaa a 2.850 x g por 7 min a 20 °C.
- Colete o supernatant da cultura com uma pipeta de 50 mL e o filtro o esterilizaa através de uma unidade do filtro de 0.22 μm.
4. Isolamento de MEVs
- Transfira a filtragem da cultura para um sistema de ultrafiltração de células agitadas colocada a 4 °C e filtre o concentrado em <50 psi através de uma membrana de corte de 100 kDa para ~50 mL.
- Centrífuga a cultura concentrada filtrar a 15.000 x g por 15 min a 4 °C e recolher o supernatant.
- Centrífuga a cultura filtrada em tubos de ultracentrífugade de policarbonato a 100.000 x g para 2 h a 4 °C.
- Resuspende as pelotas membranosas em um total de 1 mL de soline tampão de fosfato estéril (PBS) por pipetting suave.
- Misture 0,5 mL da suspensão de pelota obtida na etapa 4.4 com 1,5 mL de solução iodixanol de 60%, produzindo uma concentração final de iodixanol de 45% wt/vol. Dispense esta mistura na parte inferior de um tubo de ultracentrífuga de paredefina de 13 mm x 51 mm.
- Sobreposição do MEV-iodixanol 45% suspensão com 1 mL de 40%, 35%, 30%, 25%, e 20% (vol/ vol em PBS) soluções iodixanol e 1 mL de PBS no topo.
- Centrífuga a 100.000 x g para 18 h a 4 °C.
- Colete as frações de gradiente de densidade de 1 mL a partir do topo usando uma seringa Hamilton de 1 mL.
- Diluir cada fração coletada a 20 mL com PBS e centrífuga em 100.000 x g para 2 h em 4 °C.
- Retire o supernatant e suspender a pelota em 0,5 mL de PBS. Guarde esta pelota a 4 °C.
5. Quantificação de MEVs
- Medir a concentração de proteínaem cada fração por um ensaio de Bradford(Tabela de Materiais),seguindo as diretrizes do fabricante.
-
Realizar análise lipídica de membrana.
- Incubar 10 μL de cada fração de gradiente com a sonda de membrana fluorescente 1-(4-Trimethylammoniumphenyl)-6-Phenyl-1,3,5-Hexatriene p-Toluenesulfonato (TMA-DPH) em uma concentração final de 1 μg/mL em um volume final de 50 μL da PBS em 96 bem preto Placas.
- Incubar as placas a 33 °C por 20 min.
- Medir a fluorescência em 360 nm excitação e 430 nm emissão.
6. Análise qualitativa de MEVs
-
Realizar eletroforese de proteína.
- Misture aproximadamente 1 μg de amostras de MEV em 16 μL com 4 μL de buffer de carregamento de amostras 5x (10% w/v SDS, 10 mM dithiothreitol, 20% v/v glicerol 0,2 M Tris-HCl, pH 6,8 0,05% w/v bromehenol azul) e aqueça as amostras no buffer de amostras a 85 °C por 5 min.
- Carregue em um gel 10% Tris/Glycine SDS-poliacrilamida11 e funcione a 10 V/cm no tampão de corrida (base de 25 mM Tris, 190 mM glicina, 0,1% SDS) até que a frente de tininho azul atinja o fundo do gel.
- Manchar o gel com uma solução de coloração de proteína ultrasensível(Tabela de Materiais).
-
Executar a mancha de pontos.
- Load 2 μL de uma suspensão mevs com uma concentração de aproximadamente 0,5 μg/μL, e duas vezes diluições em série em uma membrana nitrocelulose e processo para uma mancha de pontos de acordo com as instruções do fabricante.
- Use um antiserum criado em camundongos contra uma preparação de MEVs em uma diluição de 1:5,000 como o anticorpo primário e um anti-rato de cabra acoplado à peroxidase rábano (HRP) em uma diluição 1:10,000 como anticorpo secundário. Detecte complexos de anticorpos-antígenos com um reagente apropriado de detecção de borrato de substrato de SAREM e um sistema de imagem.
-
Realizar coloração negativa e microscopia eletrônica.
- Fix 250 μL de MEVs com 2% glutaraldeído em 0,1 M cacodylate à temperatura ambiente por 2 h e incubar durante a noite em 4% de formaldeído, 1% glutaraldeído e 0,1% PBS.
- Manchar as amostras fixas com 2% de tetróxido de osmium por 90 min.
- Desidratar seriamente a amostra em etanol e incorporar a resina epóxi de Spurr.
- Observe os MEVs um microscópio eletrônico de transmissão.
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Representative Results
Os MEVs foram purificados por sedimentação diferencial em um gradiente de densidade (Figura 1, Figura 2). Nas condições descritas, os MEVs se separaram principalmente na fração de gradiente 3 (F3), o que corresponde a 25% de iodixanol. Esta conclusão baseia-se na detecção de proteínas, lipídios de membrana, visualização microscópica de MEVs intactos, distribuição de tamanho de nanopartículas e reatividade positiva com antiserum de analgésicos (Figura 2, Figura 3). A concentração de proteínas e lipídios normalizada para unidades formadoras de colônias (CFUs) apresentou um aumento de aproximadamente oito vezes no rendimento de MEV em baixo ferro em relação às altas condições de ferro (50 μM FeCl3)(Figura 3). Embora os resultados de um experimento representativo sejam apresentados, este é um resultado altamente reproduzível com base em múltiplos isolamentos (>10) de MEVs. O rendimento puro do MEV obtido a partir de uma cultura de ferro baixo de 1 L por este método foi de aproximadamente 500 μg de proteína.
Figura 1: Representação diagramática da metodologia utilizada para purificação e quantificação do MEV. Miobactérias cultivadas em placas de ágar foram usadas para inocular ferro empobrecido médio mínimo e crescer Mtb para isolamento EV. Mevs foram purificados por um gradiente de densidade descontínua da cultura livre de células filtrada. Uma combinação de determinação de lipídico da membrana e proteína vesícula, microscopia e análise de nanopartículas foi implementada para caracterizar MEVs purificados. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 2: Caracterização de MEVs purificados. (A)São mostradas fotografias de uma separação de gradiente de densidade real de MEVs brutos e a pelota de MEVs purificados coletados por ultracentrifugação da fração de gradiente 3 (F3). (B) SDS-gel manchado mostrando o perfil de proteína das várias frações de gradiente de densidade. (C)Dot blot análise mostrando proteínas associadas à vesícula concentrada na F3. (D)MEVs presentes na F3 observadapor manchas negativas. (E)Mev distribuição de tamanho de acordo com a análise de nanopartículas (NTA). Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 3: Análise comparativa do rendimento do MEV em culturas de ferro baixo e alto. Um resultado representativo de(A)proteína e quantificação lipídico e (B)análise de borrão de pontos de MEVs purificados isolados de culturas mtb de ferro limitadas e de ferro suficientes. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
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Discussion
Vários métodos para purificar exossomos derivados de células eucarióticas foram desenvolvidos12. Em contraste, há informações limitadas sobre métodos eficazes para purificar EVs derivados de bactérias7. O isolamento eficiente dos EVs derivados de Mtb precisa considerar as dificuldades intrínsecas no crescimento dessa micobactéria patogênica. Mtb tem um longo tempo de divisão (~ 24 h) e deve ser tratado em condições de nível de biossegurança três (BSL-3). Portanto, é importante otimizar a eficiência dos métodos de isolamento do MEV. Como as micobactérias liberam glicolipides e outras moléculas hidrofóbicas que agregam e contaminam facilmente as preparações de MEV bruto no meio, é importante purificar e validar MEVs antes de realizar estudos bioquímicos e funcionais. Com base em observações anteriores que demonstraram que mtb aumenta a liberação de MEVs em condições de limitação de ferro, um protocolo foi estabelecido para a purificação EV de micobactérias de ferro limitado. Também foi confirmado que a não virulenta M. smegmatis também aumenta a liberação de EVs em resposta às baixas condições de ferro (dados não mostrados). Portanto, o mesmo protocolo poderia ser usado para purificar EVs desta bactéria em condições BSL-2.
Um passo crítico deste procedimento é a preparação do meio de ferro baixo. Este meio deve ser preparado como descrito aqui e armazenado em um recipiente plástico, não em vidro, para evitar a contaminação por ferro. Suplementos comumente usados no meio de crescimento mtb para estimular o crescimento bacteriano e evitar a aglomeração micobacteriana característica, como albumina de soro bovina, tween-80, ou tyloxapol, devem ser evitados. Esses aditivos levam a artefatos complexos de lipoproteína que se copurificam com vesículas e reduzem o rendimento da vesícula. Para a determinação da UTI, uma pequena cultura em médio complementada com detergente (Tween-80 ou tyloxapol) pode ser definida paralelamente à grande cultura livre de detergentes. Mevs na cultura filtrada são estáveis em 4 °C por vários dias. Portanto, se não for processado imediatamente, a cultura filtrada pode ser armazenada refrigerada.
O rendimento total do MEV purificado de 1 L de cultura foi de cerca de 500 μg/L proteína, o que é suficiente para realizar múltiplas análises, tais como proteômica, lipidomics e ensaios funcionais. Dependendo do tipo de ensaio, MEVs suficientes podem ser isolados de volumes menores (ou seja, 250 mL). Isso facilita a análise comparativa das condições e fatores que influenciam a liberação do MEV.
Este é um método eficaz para purificar MEVs, mas tem limitações. É um procedimento longo com etapas múltiplas do ultracentrifugation. No futuro, este método será comparado à cromatografia de filtragem de gel, e à medida que os marcadores moleculares de MEVs forem descobertos, os métodos de captura de afinidade poderiam ser implementados. O ambiente de acolhimento é limitado em ferro, portanto, os MEVs produzidos por Mtb em um meio de ferro baixo estão provavelmente mais intimamente relacionados aos MEVs produzidos durante a infecção e podem fornecer insights relevantes sobre o papel dos MEVs na patogênese da tuberculose.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse.
Acknowledgments
Somos gratos a Rafael Prados-Rosales por compartilhar o anti-MEV antisera e Navneet Dogra para a realização de análise de rastreamento de nanopartículas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amicon stirred cell Model 108 | EMD Milipore | UFSC40001 | Cell Ultrafiltration system |
| BD Polypropilene 225 mL conical tubes | Fisher | 05-538-61 | Conical centrifuge tubes |
| Biomax 100 kDa cut-off ultrafiltration membrane | EMD Milipore | PBHK07610 | Ultrafiltration membrane |
| Chelex-100 resin | Bio-Rad | 142-2842 | Metal chelating resin |
| Middlebrook 7H10 Agar | BD Difco | 262710 | Mycobacterial Agar plates |
| Middlebrook 7H9 Broth | BD Difco | 271310 | Mycobacterial broth medium |
| Nitro cellulose blotting membrane | GE Healthcare | 10600001 | Blotting Membrane |
| Optiprep | Sigma | D1556 | Iodixanol |
| Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 mm x 89 mm | Beckman Coulter | 355618 | Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 mm x 89 mm |
| Polypropylene thin walled centrifuge tube 13 mm x 15 mm | Beckman Coulter | 344059 | Polypropylene thin walled centrifuge tube 13 mm x 15 mm |
| Protein Assay dye | BioRad | 5000006 | Bradford Protein Staining |
| SYPRO Ruby | Molecular Probes | S12000 | Ultrasensitive protein stain |
| TMA-DPH | Molecular Probes | T204 | 1-(4-Trimethylammoniumphenyl)-6-Phenyl-1,3,5-Hexatriene p-Toluenesulfonate |
| Vacuum filtration flasks | CellPro | V50022 | Filter Unit |
References
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