Summary
Mycobacterium tuberculosis düşük demir koşullarına yanıt olarak ekstrasellüler üretimi ve salınımını gösterir. Bu çalışma, demir eksikliğine yanıt olarak salınan mikobakteriyel ekstrasellüler saflaştırma ve karakterizasyonu için düşük demir koşulları ve yöntemleri oluşturmak için bir protokol ayrıntıları.
Abstract
Mikobakteriler, Mycobacterium tuberculosis de dahil olmak üzere (Mtb), insan tüberkülozunun nedensel ajan, doğal olarak immünolojik olarak aktif moleküller içeren ekstrasellüler veziküller (EVs) serbest. Vezikül biyogenezinin moleküler mekanizmaları, veziküllerin içeriği ve patojen-konak arabirimindeki fonksiyonları hakkında bilgi çok sınırlıdır. Bu soruların ele alınması, eVs'lerin yalıtımı, saflaştırılması ve doğrulanması için sıkı prosedürler gerektirir. Daha önce, M. tüberküloz demir kısıtlamasına maruz kaldığında vezikül üretiminin artırılmış olduğu bulunmuştur, ev sahibi ortamda Mtb'nin karşılaştığı bir durum. Burada sunulan demir eksikliği mikobakterilerden EVs izole etmek ve arındırmak için tam ve ayrıntılı bir protokoldür. Arındırılmış EVs doğrulamak için nicel ve nitel yöntemler uygulanır.
Introduction
Mikobakteriyel ekstrasellüler (MEV) membrana bağlı nano taneciklerdir, 60−300 nm boyutundadır, doğal olarak hızlı ve yavaş büyüyen mikobakteriler tarafından serbest bırakılır1. Patojenik mikobakteriler tarafından salınan MEV'ler, immünolojik olarak aktif proteinler, lipidler ve konsantre ve korunan bir şekilde salgılanan glikolipidler aracılığıyla konakla etkileşimedebilen bir mekanizma oluşturur2,3,4. MEVs karakterize etmek ve biyogenez ve işlevlerini anlamak için, vezikül arınma ve doğrulama sıkı ve verimli yöntemler çok önemlidir. Şimdiye kadar, MEVs bir demir açısından zengin orta1,5,6,7,8yetiştirilen mikobakterilerin kültür filtrates izole edilmiştir.
Ancak, önceki çalışma demir sınırlama büyük ölçüde Mtb vezikül salınımını uyarır gösterdi, muhtemelen mycobactin üzerinden demir yakalamak için, MEVs salgılanan bir siderophore9. Yüksek demir ortamda yetiştirilen Mtb'lerden MEV izolasyonu prosedürleri tanımlanmış olsa da, düşük demir kültürlerinden MEV elde etmek için etkili bir metodoloji bildirilmemiştir. Bu nedenle, bu yöntemin amacı, biyokimyasal ve fonksiyonel tahliller ve mikobakterilerde vezikül üretiminin genetik belirleyicilerinin analizi için kullanılabilmesi için düşük demir kültürlerinden elde edilen MEV'leri izole etmek, arındırmak ve ölçmektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Demir Tükenmiş Tanımlı Ortamın Hazırlanması
- 5 g KH2PO4,5 g L-asparagin, 20 mL gliserol ve plastik bir kapta 900 mL deiyonize su da dekstroz 2 g dekstroz eriterek minimal orta (MM) 1 L hazırlayın. Demir kontaminasyonunu önlemek için camdan kaçının. PH'ı 5 N NaOH ile 6,8'e, hacmi ni suyla 1 L'ye ayarlayın.
- 50 g metal şelin reşaden (MCR) ekleyin ve 4 °C'de 24 saat boyunca manyetik bir karıştırma çubuğu kullanarak hafifçe çalkalayın. Plastik alıcılı 0,22 μm filtre ünitesi nden sızma yoluyla MCR'yi sterilize edin ve çıkarın. Filtrasyonu hızlandırmak ve filtre tıkanmasını önlemek için, rezorbsün filtrasyondan önce yaklaşık 30 dakika boyunca tortulanmasına izin verin.
NOT: Bu ortam, atomik absorpsiyon spektroskopisi ile belirlenen 2°M'den az demir içerir. - ZnCl 0.5 mg/L ile ek MM2,MgSO4 4 4 mg/L, mnSO40.1 mg/L . Ayrıca, deiyonize suda metal takviyeleri her konsantre stokları (1.000x) hazırlamak ve MM takviyesi önce filtrasyon ile sterilize. Demir-tükenmiş, metal takviyeli MM burada düşük demir MM (LIMM) olarak anılacaktır.
- 10 mM HCl'de çözünmüş 50 mM'lik FeCl3 stoğundan, yüksek demir MM (HIMM) hazırlamak için 1 mL ila 1 L LIMM (50 μM son konsantrasyon) ekleyin.
2. Demir Sınırlı Koşullarda Büyüyen Mikobakteriler
- Mtb dondurulmuş% 15 gliserol stok 50 μL ve çizgi bir agar plaka% 10 ADN zenginleştirme ile desteklenmektedir (5 g / L albumin, 2 g / L dekstroz, ve 0.85 g / L sodyum klorür, 0.2% gliserol ve 0.05% Tween-80)10. Koloniler görünene kadar plakayı 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
- ADN zenginleştirme ile desteklenen mikobakteriyel et suyu ortamının(Malzeme Tablosu)2 mL'lik Mtb10 kolonisini aşılayınız. 37 °C'de ajitasyon ile kuluçka.
- Mtb kültürü geç logaritmik faz (OD540 ~ 0,8) büyümeye izin verin. Bunu kontrol etmek için, bir spektrofotometre kullanarak OD540 ölçün.
- Geç logaritmik kültürün 200 μL'lik kısmını mikobakteriyel agar plakalarına(Malzeme Tablosu)%0.2 gliserol, %0.05 Tween-80 ve ADN ile desteklendi. En az 5 tabak aşılamak. Bakteri üremesi enfluent bir tabaka olarak görülene kadar plakaları 37 °C'de kuluçkaya yatırın. Bu Mtb için ~ 1 hafta sürer.
- LIMM'de steril pamuklu bir bez isledin. Agar plakalarından bakteri toplamak ve 100 mL LIKM aşılamak için bu bezi kullanarak ~1.0'lık Bir OD540 ile konsantre bakteriyel süspansiyon hazırlayın.
- Bu süspansiyonu LIMM ile 10 ila 1 L arasında seyreltin ve her biri 500 mL kültür içeren iki, 2 L steril plastik şişeye bölün.
- 2 mL kültür alın ve 5 mL kültür tüpüne aktarın. %10 vol/vol tyloxapol 10 μL ekleyin.
- Kültürleri 37 °C'de 14 gün bekletin.
3. MEVs koleksiyonu
- Toplama sırasında 2 mL kültürün OD540'ı ölçün. ADN ve%0.05 Tween-80 ile agar plakalar üzerinde kültür ve plaka 100 μL her seyreltme 1:10 seri seyreltme olun.
- Kültürü 20 °C'de 7 dk için 2.850 x g'da beş 225 mL konik santrifüj tüpve santrifüje aktarın.
- 50 mL'lik pipetle kültür supernatant'ını toplayın ve filtre yi 0,22 μm'lik bir filtre ünitesi nden sterilize edin.
4. MEV'lerin İzolasyon
- Kültür filtrasyonunu 4 °C'de yerleştirilen bir pil ultrafiltrasyon sistemine aktarın ve 100 kDa kesme membranından <50 psi'deki konsantreyi ~50 mL'ye filtreleyin.
- Konsantre kültürü 15.000 x g'de 15 dakika 4 °C'de santrifüj edin ve süpernatant toplayın.
- Polikarbonat ultrasantrifüj tüplerinde 4 °C'de 2 saat için 100.000 x g'de kültür filtrasyonunu santrifüj edin.
- Membranöz peletleri toplam 1 mL steril fosfat tamponlu salin (PBS) şeklinde hassas pipetleme ile yeniden askıya alın.
- Adım 4.4'te elde edilen pelet süspansiyonunun 0,5 mL'sini %60 iodixanol çözeltisi ile karıştırın ve %45 wt/vol son iyodixanol konsantrasyonu elde edin.
- MEV-iodixanol%45 süspansiyonu 1 mL %40, %35, %30, %25 ve %20 (PBS'de vol/vol) iodixanol çözeltileri ve 1 mL PBS ile üstte yer akıtın.
- 4 °C'de 18 saat için 100.000 x g santrifüj.
- 1 mL Hamilton şırıngası kullanarak üstten başlayarak 1 mL yoğunluk gradyan fraksiyonları toplayın.
- Toplanan her bir fraksiyonu 20 mL'ye, PBS ile 20 mL'ye seyreltin ve 4 °C'de 2 saat için 100.000 x g'de santrifüj edin.
- Supernatant çıkarın ve PBS 0,5 mL pelet askıya. Bu peleti 4 °C'de saklayın.
5. MEV'lerin Nicelleştirilmesi
- Üreticinin yönergelerini izleyerek, her fraksiyondaki protein konsantrasyonunu bir Bradford tonu(Malzeme Tablosu)ile ölçün.
-
Membran lipid analizi yapın.
- Floresan membran probu 1-(4-Trimethylamonniumphenyl)-6-Phenyl-1,3,5-Heksatriene p-Toluenesulfonat (TMA-DPH) ile her degrade fraksiyonun 10 μL inkübat 10 μL pBS son 50 μL hacmi nde 96 iyi siyah Plaka.
- Plakaları 33 °C'de 20 dk kuluçkaya yatırın.
- Floresan'ı 360 nm uyarma ve 430 nm emisyonda ölçün.
6. MEV'lerin nitel analizi
-
Protein elektroforezi gerçekleştirin.
- 16°L'de yaklaşık 1 μL'lik MEV numunelerini 4 μL 5x numune yükleme tamponu (%10 w/v SDS, 10 mM dithiothreitol, %20 v/v gliserol 0,2 M Tris-HCl, pH 6.8 0.05% w/v bromophenol mavi) ile karıştırın ve numune tamponunda numune tamponunda 85 °C'de 85 °C'de ısıtın.
- %10 Tris/Glisin SDS-poliakrilamid jel11 yükve çalışan tampon (25 mM Tris baz, 190 mM glisin, 0.1% SDS) çalıştırın mavi boya ön jel in altına ulaşana kadar.
- Jeli ultrahassas bir protein boyama solüsyonu(Malzeme Tablosu)ile lekele.
-
Nokta lekesini gerçekleştirin.
- Yaklaşık 0,5 g/μL konsantrasyonu olan bir MEV süspansiyonunun 2 μL'sini ve bir nitroselüloz membranüzerinde iki kat seri seyreltme ler yükleyin ve üreticinin talimatlarına göre nokta lekesi için proses yapın.
- Birincil antikor ve bir keçi anti-fare horseradish peroksidaz (HRP) birleştiğinde 1:10.000 ikincil antikor olarak bir seyreltme olarak 1:5.000 bir seyreltme mevs bir hazırlık karşı farelerde yükseltilmiş bir antiserum kullanın. Uygun bir HRP substrat Blotting Algılama Reaktifi ve görüntüleme sistemi ile antijen-antikor komplekslerini sapta.
-
Negatif boyama ve elektron mikroskobu gerçekleştirin.
- 250 μL'lik MEV'leri %2 glutaraldehit ile 0,1 M oda sıcaklığında 2 saat kacodylate ve gece boyunca %4 formaldehit, %1 glutaraldehit ve %0,1 PBS'de kuluçkaya yatırın.
- 90 dk için% 2 osmiyum tetroksit ile sabit örnekleri leke.
- Seri etanol örnek dehydrate ve Spurr epoksi reçine gömmek.
- Bir iletim elektron mikroskobu altında MEVs gözlemleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MEV'ler bir yoğunluk gradyanda diferansiyel sedimantasyon ile saflaştırılmıştı (Şekil 1, Şekil 2). Açıklanan koşullar altında, MEVs çoğunlukla degrade kesir 3 (F3), hangi% 25 iodixanol karşılık ayrılmıştır. Bu sonuç protein, membran lipid, bozulmamış MEV'lerin mikroskobik görüntülemesi, nanopartikül boyut dağılımı ve antivezile antiserum ile pozitif reaktivitenin saptanması üzerine kuruludur(Şekil 2, Şekil 3). Koloni oluşturan birimlere (CPU) normalleştirilen protein ve lipid konsantrasyonu, yüksek demir koşullarına göre düşük demirde MEV veriminde yaklaşık sekiz kat artış göstermiştir (50 μM FeCl3)(Şekil 3). Bir temsili denemenin sonuçları sunulsa da, bu, MEV'lerin birden fazla (>10) yalıtımına dayalı olarak son derece tekrarlanabilir bir sonuçtur. Bu yöntemle 1 L düşük demir kültüründen elde edilen saf MEV verimi yaklaşık 500 μg protein dir.
Şekil 1: MEV saflaştırma ve nicelleştirme için kullanılan metodolojinin diyagramatik gösterimi. Agar plakalarında yetişen mikobakteriler, demirle tükenmiş minimal ortamı aşılamak ve EV izolasyonu için Mtb'yi büyütmek için kullanılmıştır. MEV'ler hücreiçermeyen kültür filtratından gelen kesintili yoğunluk gradyanı ile arındırıldı. Saflaştırılmış MEV'leri karakterize etmek için membran lipid ve vezikül protein tayini, mikroskopi ve nanopartikül analizi kombinasyonu uygulandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Saflaştırılmış MEV'lerin karakterizasyonu. (A) Gösterilen ham MEVs gerçek bir yoğunluk gradyan ayırma ve gradyan kesir ultracentrifugation tarafından toplanan saflaştırılmış MEVs pelet fotoğrafları 3 (F3). (B) Çeşitli yoğunluk gradyan fraksiyonlarının protein profilini gösteren SDS-jel lekeli. (C) F3'te vezikül ilişkili proteinleri gösteren nokta leke analizi. (D) F3'te negatif boyama ile gözlenen MEV'ler. (E) Nanopartikül analizine (NTA) göre MEV boyut dağılımı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Düşük ve yüksek demir kültürlerinde MEV veriminin karşılaştırmalı analizi. Demir ile sınırlı ve demir yeterli Mtb kültürlerinden izole saflaştırılmış MEV'lerin(A)protein ve lipid nicelemesi ve (B) nokta leke analizinin temsili bir sonucudur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ökaryotik hücre kaynaklı ekzozomları arındırmak için birden fazla yöntem geliştirilmiştir12. Buna karşılık, bakteri kaynaklı EVs7arındırmak için etkili yöntemler hakkında sınırlı bilgi vardır. Mtb kaynaklı EV'lerin verimli bir şekilde izole edilmesi, bu patojenik mikobacterium'un yetiştirimindeki içsel zorlukları göz önünde bulundurmak gerekir. Mtb uzun bir bölünme süresine sahiptir (~24 saat) ve biyogüvenlik seviyesi üç (BSL-3) koşullarda kullanılmalıdır. Bu nedenle, MEV izolasyon yöntemlerinin verimliliğini optimize etmek önemlidir. Mikobakteriler glikolipidleri ve ham MEV preparatlarını kolayca ortama toplayan ve kolayca kontamine eden diğer hidrofobik molekülleri serbest bırakmasınedeniyle, biyokimyasal ve fonksiyonel çalışmalar yapmadan önce MEV'leri arındırmak ve doğrulamak önemlidir. Mtb demir sınırlama koşulları altında MEVs salınımını artırır göstermiştir önceki gözlemlere dayanarak, demir sınırlı mikobakterilerden EV arıtma için bir protokol kurulmuştur. Ayrıca öldürücü olmayan M. smegmatis de düşük demir koşullarına yanıt olarak EVs salınımını artırır teyit edilmiştir (veri gösterilmez). Bu nedenle, aynı protokol BSL-2 koşullarında bu bakteri den EVs arındırmak için kullanılabilir.
Bu prosedürün kritik bir adım düşük demir orta hazırlanmasıdır. Bu ortam burada açıklandığı şekilde hazırlanmalı ve demir kontaminasyonunu önlemek için camda değil plastik bir kapta saklanmalıdır. Yaygın bakteriyel büyümeyi teşvik etmek ve karakteristik mikobakteriyel kümelenme önlemek için Mtb büyüme orta kullanılan takviyeleri, sığır serum albumin gibi, Tween-80, veya tyloxapol, kaçınılmalıdır. Bu katkı maddeleri veziküller ile copurify ve ziküller ile azaltmak lipoprotein kompleksi eserleryol. CFU tayini için, orta deterjan (Tween-80 veya tyloxapol) ile desteklenen küçük bir kültür deterjansız büyük kültüre paralel olarak ayarlanabilir. Kültür filtratındaki MEV'ler birkaç gün boyunca 4 °C'de stabildir. Bu nedenle, hemen işlenmezise, kültür filtrasyon buzdolabında saklanabilir.
1 L kültüründen saflaştırılmış MEV'in toplam verimi 500 μg/L civarındaydı ve bu protein proteomik, lipidomik ve fonksiyonel tahliller gibi birden fazla analiz yapmak için yeterliydi. Titrenin türüne bağlı olarak, daha küçük hacimlerden (yani 250 mL) yeterli MEV izole edilebilir. Bu, MEV salınımını etkileyen koşulların ve faktörlerin karşılaştırmalı analizini kolaylaştırır.
Bu, MEV'leri arındırmak için etkili bir yöntemdir, ancak sınırlamaları vardır. Birden fazla ultracentrifugation adımları ile uzun bir işlemdir. Gelecekte bu yöntem jel filtrasyon kromatografisi ile karşılaştırılacaktır ve MEV'lerin moleküler belirteçleri keşfedildikçe, yakınlık yakalama yöntemleri uygulanabilir. Ev sahibi ortam demir sınırlıdır, bu nedenle Mtb tarafından düşük demir ortamında üretilen MEV'ler muhtemelen enfeksiyon sırasında üretilen MEV'lerle daha yakından ilişkilidir ve tüberküloz patogenezinde MEV'lerin rolü hakkında ilgili bilgiler sağlayabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların çıkar çatışması yok.
Acknowledgments
Rafael Prados-Rosales'e nanopartikül izleme analizi ni gerçekleştiren anti-MEV antisera ve Navneet Dogra'yı paylaştığı için minnettarız.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amicon stirred cell Model 108 | EMD Milipore | UFSC40001 | Cell Ultrafiltration system |
| BD Polypropilene 225 mL conical tubes | Fisher | 05-538-61 | Conical centrifuge tubes |
| Biomax 100 kDa cut-off ultrafiltration membrane | EMD Milipore | PBHK07610 | Ultrafiltration membrane |
| Chelex-100 resin | Bio-Rad | 142-2842 | Metal chelating resin |
| Middlebrook 7H10 Agar | BD Difco | 262710 | Mycobacterial Agar plates |
| Middlebrook 7H9 Broth | BD Difco | 271310 | Mycobacterial broth medium |
| Nitro cellulose blotting membrane | GE Healthcare | 10600001 | Blotting Membrane |
| Optiprep | Sigma | D1556 | Iodixanol |
| Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 mm x 89 mm | Beckman Coulter | 355618 | Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 mm x 89 mm |
| Polypropylene thin walled centrifuge tube 13 mm x 15 mm | Beckman Coulter | 344059 | Polypropylene thin walled centrifuge tube 13 mm x 15 mm |
| Protein Assay dye | BioRad | 5000006 | Bradford Protein Staining |
| SYPRO Ruby | Molecular Probes | S12000 | Ultrasensitive protein stain |
| TMA-DPH | Molecular Probes | T204 | 1-(4-Trimethylammoniumphenyl)-6-Phenyl-1,3,5-Hexatriene p-Toluenesulfonate |
| Vacuum filtration flasks | CellPro | V50022 | Filter Unit |
References
- Prados-Rosales, R., et al. Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice. Journal of Clinical Investigation. 121, 1471-1483 (2011).
- Gupta, S., Rodriguez, G. M. Mycobacterial extracellular vesicles and host pathogen interactions. Pathogens and Disease. 76 (4), (2018).
- Athman, J. J., et al. Bacterial Membrane Vesicles Mediate the Release of Mycobacterium tuberculosis Lipoglycans and Lipoproteins from Infected Macrophages. Journal of Immunology. 195, 1044-1053 (2015).
- Athman, J. J., et al. Mycobacterium tuberculosis Membrane Vesicles Inhibit T Cell Activation. Journal of Immunology. 198, 2028-2037 (2017).
- Rath, P., et al. Genetic regulation of vesiculogenesis and immunomodulation in Mycobacterium tuberculosis. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 110, E4790-E4797 (2013).
- White, D. W., Elliott, S. R., Odean, E., Bemis, L. T., Tischler, A. D. Mycobacterium tuberculosis Pst/SenX3-RegX3 Regulates Membrane Vesicle Production Independently of ESX-5 Activity. mBio. 9, pii 00778 (2018).
- Dauros Singorenko, P., et al. Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity. Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1324731 (2017).
- Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quiros, S., Luque-Garcia, J. L. Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria. MethodsX. 1, 124-129 (2014).
- Prados-Rosales, R., et al. Role for Mycobacterium tuberculosis membrane vesicles in iron acquistion. Journal of Bacteriology. 196, 1250-1256 (2014).
- Sanders, E. Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods. Journal of Visualized Experiments. 63, e3064 (2012).
- Harlow, E., Lane, L. Antibodies. A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory. (1988).
- Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).
