Summary
이 체계적인 프로토콜은 반복적인 가벼운 외상성 뇌 손상 후에 외상 후 간질의 새로운 동물 모델을 설명합니다. 첫 번째 부분은 수정된 체중 감소 모델을 사용하여 외상성 뇌 손상 유도 단계를 자세히 설명합니다. 두 번째 부분은 단일 및 다중 채널 뇌전도 데이터 수집 시스템에 대한 수술 접근 방식에 대한 지침을 제공합니다.
Abstract
외상성 뇌 손상 (TBI)은 후천성 간질의 주요 원인입니다. TBI는 초점 또는 확산 뇌 손상을 초래할 수 있습니다. 초점 상해는 뇌 조직에 직접적인 병변을 만드는 두개골을 통해 때때로 관통하는 직접적인 기계적 힘의 결과입니다. 이들은 타박상, 열상 및 출혈을 가진 지역으로 두뇌 화상 진찰 도중 보입니다. 국소 병변은 신경 세포 죽음과 신경교 흉터 형성을 유도하고 TBI를 발생 모든 사람들의 20 %-25 %에 존재한다. 그러나, TBI 케이스의 대다수에서, 상해는 비 초점, 확산 손상의 결과로 가속 감속 력 및 후속 조직 전단에 기인합니다. TBI 환자의 소집단은 몇 달 또는 년의 대기 기간 후에 외상 후 간질 (PTE)를 개발하는 것을 계속합니다. 현재, 어떤 환자가 PTE를 개발할지 예측하는 것은 불가능하며, PTE 환자의 발작은 통제하기가 어렵기 때문에 추가 연구가 필요합니다. 최근까지, 필드는 피질에 있는 거대한 조직 손실을 가진 큰 초점 병변및 때때로 피질 구조물을 가진 두 개의 자발적인 외상 후 포착을 가진 두 개의 동물/설치류 모형으로 제한되었습니다. 이러한 접근법과는 대조적으로, 변형된 체중 투하 모델을 사용하여 유도된 확산 TBI가 국소 병변 또는 조직 손실이 없는 경우에도 자발적인 경련성 및 비경련성 발작의 개발을 개시하기에 충분하다고 판단되었다. 후천성 외상 후 간질을 가진 인간 환자와 유사하게, 이 모형은 포착 개시의 앞에 상해 후에 대기 기간으로 제출합니다. 이 프로토콜에서, 지역 사회는 몇 달의 과정을 통해 지속적인 장기 비디오 뇌전도 동물 모니터링 에 이어 확산 비 lesional TBI를 유도하는 방법을 자세히 외상 후 간질의 새로운 모델을 제공 할 것입니다. 이 프로토콜은 동물 취급, 체중 감소 절차, 두 개의 수집 시스템에 대한 전극 배치 및 수술, 수술 후 모니터링 및 데이터 수집의 각 단계에서 발생하는 빈번한 과제를 자세히 설명합니다.
Introduction
매년 TBI는 전 세계적으로 약 6천만 명에게 영향을 미칩니다. 영향 받은 개별은 초기 상해 후에 년을 명시할 수 있는 간질 개발의 고위험에 입니다. 가혹한 TBI는 간질의 고위험과 연관되더라도, 온화한 TBI조차 간질 발전의 개별의 기회를 증가합니다1,2,3,4. 모든 TI는 초점, 확산 또는 둘 다의 조합으로 분류될 수 있습니다. 확산 뇌 손상, 많은 경우 모든 TI에 존재, 때문에 가속 감속 및 회전 힘으로 서로 에 대해 전단 다른 밀도의 뇌 조직의 결과입니다. 정의에 따르면, 확산 상해는 컴퓨터 단층 촬영 스캔에 뇌 병변이 보이지 않는 경증 / 뇌진탕 비 관통 뇌 손상에서 만발생5.
외상 후 간질 (PTE)을 개발하거나 위험에 처한 환자의 관리에는 현재 두 가지 중요한 문제가 있습니다. 첫 번째는 PTE가 나타나면 발작이 사용 가능한 항 간질 약물 (AED)에 내성이 있다는 것입니다6. 둘째, AEDs는 간질 발생을 예방하는 데 동등하게 효과가 없으며 효과적인 대체 치료 접근법이 없습니다. 이 적자를 해결하고 치료를위한 더 나은 치료 목표와 후보를 찾기 위해, PTE6의뿌리에서 새로운 세포 및 분자 메커니즘을 탐구할 필요가있을 것이다.
외상 후 간질의 두드러진 특징 중 하나는 초기 외상 성 사건과 자발적, 도발적이지 않은 재발성 발작의 발병 사이의 잠복 기간입니다. 이 시간 창에서 발생하는 이벤트는 연구원을위한 자연적인 초점입니다, 이 시간 창은 모두 PTE의 치료와 예방을 허용 할 수 있기 때문에. 동물 모델은 몇 가지 뚜렷한 이점을 제공하기 때문에 이 연구에 가장 일반적으로 사용되며, 그 중 가장 적은 것은 인간 환자의 지속적인 모니터링이 잠재적으로 긴 시간 동안 비실용적이고 비용이 많이 들 것이라는 것입니다. 추가적으로, 간질 발생의 루트에 있는 세포와 분자 기계장치는 동물 모형에서만 탐구될 수 있습니다.
자발적인 외상 후 발작 및 간질을 가진 동물 모델은 화학 흡충제 또는 전기 자극에 의해 급성, 만성, 또는 점화에 의해 보다 적게 생리학적으로 관련성이 있는 수단에 의해 TBI 후에 포착이 유도되는 모형에 선호됩니다. 자발적인 외상 후 발작 모델은 TBI가 간질 발생으로 이어지는 건강한 뇌 네트워크를 어떻게 수정하는지 테스트합니다. TBI에 노출이 발작 임계값을 감소시키고 포착에 감수성에 영향을 미치는 방법을 TBI 후에 추가 자극을 사용하는 연구 결과. 화학적으로 또는 전기 자극을 유도한 발작을 가진 동물 모형의 이점은 AEDs에 내화성의 특정 기계장치 및 기존 및 신규 한 AEDs의 효험을 시험하기 에서 입니다. 그러나, 인간에게 이러한 데이터의 관련성 및 번역의 정도는 다음과 같은 이유로 모호한7일 수 있습니다: 1) 발작 메커니즘은 TBI에 의해 유도된 메커니즘과 다를 수 있습니다. 2) 이러한 모델의 모든 자발적인 발작으로 이어질7; 3) 경련제 자체에 의해 생성된 병변은, 캐뉼라가 그 전달에 요구되거나, 또는 깊이 구조(예를 들어, 해마 또는 편도체)에서 전극 배치를 자극함으로써 이미 발작 감수성 및 심지어 해마 간질 전위 잠재력을 증가시킬 수 있다7. 더욱이, 일부 경련제(즉, 카이닉산)는 TBI 확산 후 전형적이지 않은 직접적인 해마 병변 및 경화증을 생성한다.
최근까지, 외상 후 간질의 단지 2개의 동물 모형존재: 통제된 피질 충격 (CCI, 초점) 또는 유체 타악기 상해 (FPI, 초점 및 확산)8. 두 모델 모두 설치류의 조직 손실, 출혈 및 글리오시스와 함께 큰 국소 병변을 초래합니다8. 이 모형은 큰 초점 병변에 의해 유도된 외상 후 간질을 모방합니다. 최근 연구는 반복 (3x) 확산 TBI가 초점 병변의 부재에도 마우스에서 자발적인 발작과 간질의 개발을 위해 충분하다는 것을 입증9,확인 된 자발적인 재발 성 발작과 세 번째 설치류 PTE 모델을 추가. 이 새로운 모형은 온화한, 뇌진탕 TBI를 가진 인간 인구를 더 잘 나타내는 확산 TBI에 의해 유도된 세포와 분자 변경을 모방합니다. 이 모델에서는, 발작 개시 및 늦은, 자발적, 재발성 발작의 출현 의 출현 의 3 주 이상 잠복 기간은 외상 후 간질 발생의 근본 원인을 조사하고, 발작 개시 후 예방 접근법 및 새로운 치료 후보의 효능을 테스트하고, 외상 후 간질 의 바이오 마커의 개발 가능성이 있다.
외상 후 간질 연구를 위한 동물 모델의 선택은 과학적 질문, 조사된 뇌 손상의 유형 및 기본 세포 및 분자 메커니즘을 결정하는 데 사용되는 도구에 따라 달라집니다. 궁극적으로, 외상 후 간질의 모든 모델은 TBI 동물의 하위 집합에서 자발적인 발작의 출현과 TBI 동물의 하위 집합에서 초기 대기 기간 모두를 입증해야합니다, TBI를 발생시키는 모든 환자는 간질을 개발하기 위해 계속하지 않기 때문에. 이를 위해 동시 비디오 수집을 통해 뇌파(EEG)가 이 프로토콜에 사용됩니다. 정확한 데이터 해석을 위해 데이터 수집 하드웨어 및 접근 방식의 기술적 측면을 이해하는 것은 매우 중요합니다. 중요한 하드웨어 측면에는 기록 시스템의 유형, 전극 유형(나사 또는 와이어 리드) 및 이들이 만든 재료, 동기화된 비디오 수집(EEG 시스템 또는 제3자의 일부) 및 컴퓨터 시스템의 특성이 포함됩니다. 연구 목표, 관심 있는 EEG 이벤트, 추가 분석 방법 및 데이터 스토리지의 지속 가능성에 따라 모든 유형의 시스템에서 적절한 수집 매개 변수를 설정하는 것이 필수적입니다. 마지막으로, 각각의 장점과 단점을 가지고 있으며 데이터 해석에 영향을 미치기 때문에 전극 구성 (montage)의 방법을 고려해야합니다.
이 프로토콜은 마우스에서 자발적, 도발적이지 않은, 재발성 발작을 초래하는 확산 상해를 유도하기 위해 변형된 Marmarou 중량 투하 모델10,11을 사용하는 방법을 자세히 설명하고, 단극성, 양극성 또는 혼합 몽타주를 사용하여 단일 및 다중 채널 연속 및 동기화된 비디오 EEG를 획득하는 외과적 접근법을 설명한다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
이 프로토콜에 설명된 모든 동물 절차는 버지니아 공대의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 따라 그리고 국립 보건원의 '실험실 동물의 관리 및 사용을위한 가이드'에 따라 수행되었습니다. .
1. 동물 취급 프로토콜
참고: 이 프로토콜은 도착 후 공급업체에서 시설로 주문한 동물을 습관화하고 실험자가 처리하도록 조절하기 위한 것입니다. 이것은 스트레스와 불안을 감소시켜 동물의 복지를 향상시키고 TBI 유도, 수술 후 모니터링 및 획득 시스템에 동물을 연결하는 것을 포함하여 동물을 취급해야 하는 특정 절차를 단순화합니다.
- 많은 동물이 공급 업체로부터 수신될 때, 귀 태그를 무작위로 실험 군 (TBI) 또는 대조군 (가짜 수술)에 할당하면서 2-5 동물의 새장에서 그들을 결합합니다. 집 TBI 동물은 때때로 TBI를 겪은 마우스를 향해 공격적으로 행동하기 때문에 가짜 동물과 별도로.
- 취급 일 1 (귀 태그 후 24-48 시간): 동물 귀 태그, 생년월일, 취급 일자, 취급 일자, 취급 기간 및 의견 및 관찰을위한 섹션을 기록하기위한 차트를 준비하십시오.
- 양손으로 동물을 부드럽게 컵에 마침하십시오. 그것은 방어 메커니즘과 스트레스 응답을 유도로 꼬리에 의해 동물을 잡아하지 마십시오.
- 동물의 귀 태그를 확인하고 기록하십시오.
- 동물을 용기에 넣고 체중계를 기록합니다.
- 동물을 양손으로 다시 부드럽게 컵에 대고 1분간 다루어 손 안에서 움직이고 탐험할 수 있도록 합니다. 절차 실에서 벤치에이 작업을 수행하고 바닥에 동물을 떨어 뜨리지 않도록주의하십시오.
- 1분 후에 동물을 케이지에 다시 놓습니다.
- 케이지에 있는 다른 동물에 대해 1.3-1.7단계를 반복합니다.
- 취급 일 2 (다음 날): 1.2-1.5 단계를 반복합니다.
- 동물을 양손으로 다시 부드럽게 컵에 대고 2분간 다루어 손 안에서 움직이고 탐험할 수 있도록 합니다. 절차 실에서 벤치에이 작업을 수행하고 바닥에 동물을 떨어 뜨리지 않도록주의하십시오.
- 2분 처리 후 동물을 케이지에 다시 놓습니다.
- 케이지에 있는 다른 동물에 대해 1.10-1.11단계를 반복합니다.
- 취급일 3(다음 날): 1.2-1.5단계를 반복한다.
- 동물을 양손으로 다시 부드럽게 컵에 대고 4분간 다루어 손 안에서 움직이고 탐험할 수 있도록 합니다. 절차 실에서 벤치에이 작업을 수행하고 바닥에 동물을 떨어 뜨리지 않도록주의하십시오.
- 4분 후에 동물을 케이지에 다시 놓습니다.
- 케이지에 있는 다른 동물에 대해 1.14-1.15단계를 반복합니다.
- 취급일4일(관리일, 취급일로부터 1주일): 1.2-1.5단계를 반복한다.
- 동물을 양손으로 다시 부드럽게 컵에 대고 4분간 다루어 손 안에서 움직이고 탐험할 수 있도록 합니다. 절차 실에서 벤치에이 작업을 수행하고 바닥에 동물을 떨어 뜨리지 않도록주의하십시오.
- 4분 처리 후 동물을 케이지에 다시 놓습니다.
- 케이지에 있는 다른 동물에 대해 1.18-1.19단계를 반복합니다.
참고: 제어 처리 일은 3일 간의 처리 프로토콜 후에 진정 동작의 보존을 테스트합니다.
2. 체중 감량 절차
- 유도 챔버에 마우스를 놓습니다. 산소와 진공의 흐름을 1L/min으로 설정하고 이소플루란 가스 수준을 3%-5%로 설정합니다. 5 분 동안 마우스를 마취.
- 유도 챔버에서 마우스를 제거하고 폼 패드에 놓습니다. 발가락이나 꼬리 핀치에 대한 반응이 없는지 테스트합니다.
- 피하 진통제 (0.1 mg / kg buprenorphine)를 피하 투여하십시오. EEG 수술이 같은 날 수행되는 경우, 비 스테로이드 성 항 염증 카프로펜 (5 mg / kg)과 함께 피하 피하로 buprenorphine을 투여.
- 마지막 충격 전후에 젖산 나트륨 용액(동물 체중의 그램당 3 μL)을 피하적으로 투여합니다. 젖산 나트륨 용액은 단일 주사로 빠른 투여를 위해 진통제와 혼합 될 수 있습니다.
참고 : 젖산 나트륨 용액에는 염화 나트륨, 염화 칼륨, 염화 칼슘 및 젖산 나트륨이 혼합되어 있습니다. 이 단계는 유체와 전해질을 대체하여 회복을 돕습니다. - 마우스의 머리를 무게 드롭튜브(그림 1A)아래에 놓고 평평한 스테인리스 디스크(직경 1.3cm, 두께 1mm, 무게 880mg)를 머리와 귀 의 선 사이에 놓습니다.
참고: 이 디스크는 두개골 표면에 미치는 영향을 확산시킵니다(그림1B). - 무게 드롭 튜브의 핀을 제거하여 50cm 높이에서 100g의 웨이트 로드를 놓습니다. 대조군 마우스에 대한 가짜 손상을 유도하기 위해, 핀의 우발적 인 방출과 체중 감소를 방지하기 위해 튜브에서 웨이트 로드를 제거하십시오.
참고: 동물의 머리를 평평하게 배치해야 로드가 디스크 의 전체 표면에 자유 낙하되도록하십시오. - 무의식적인 동물을 등에 두어 무균 폴리안드 흡수 수건으로 덮인 가열 패드에 회복하십시오. 오른쪽 반사 복구 시간 (즉, 마우스가 뒤에서 오른쪽으로 걸리는 시간)은 의식이 없는 시간을 판독값으로 측정할 수 있습니다.
- 동물이 의식을 되찾을 때, 45 분 동안 회복하기 위해 복구 젤과 몇 가지 축축한 차우 조각으로 가열 패드에 따뜻하게 된 깨끗한 케이지에 놓습니다. 동물을 과열하면 마우스가 너무 차가워질 수 있으므로 회복에 큰 장애물이 될 수 있습니다.
- 45 분 후, 2.1-2.8 단계를 두 번 반복하고 2.3 단계를 생략하십시오 (즉, 진통제 및 항 염증 약물의 투여).
- EEG 전극 이식 수술이 같은 날에 수행되는 경우 동물이 1-2 시간 동안 회복되도록 하십시오.
3. EEG 전극의 이식을위한 외과 분야 준비
참고: 수술 도구와 나사를 수술 전에 오토클레이브하십시오. 동물, 비멸균 물질, 그리고 동물을 다루기 전과 접촉 후 70% 에탄올로 분무하고 문지르면서 수술용 장갑을 청소합니다. 동물 사이에 2-3 분 동안 수술 도구를 살균하십시오 (재료 표참조). 새 동물을 입체 장치에 넣기 전에 멸균 드레이프를 변경합니다. 수술 장에 수술에 필요한 모든 구성 요소가 포함되어 있는지 확인합니다(그림2). 이 모델에서 TBI를 유도하는 침습적 외과 적 수술의 부재는 몇 가지 장점이 있습니다 : 1) 전극의 이식은 유연하며 TBI와 같은 날 또는 정해진 기간 후에 수행 될 수있다; 2) 동물의 회복 시간이 더 빠릅니다. 3) 두개골은 그대로 유지되어 전극을 이식하기위한 더 많은 표면적과 유연성을 허용합니다.
- 5 분 동안 유도 챔버에서 3 %-5 % 이소플루란 가스에서 마우스를 마취.
- 유도 챔버에서 입체 장치로 마우스를 전송하고 이소플루란 가스와 코 콘에 연결된 진공 튜브와 가열 패드에 멸균 드레이프에 배치합니다.
- 수술 과정 동안 37 °C에서 체온을 유지하십시오. 온도 센서를 놓아 마우스의 가슴이나 복벽과 접촉합니다.
- 이어 바를 사용하여 동물의 머리를 제자리에 고정시하십시오.
- 마취를 1.5%-3.5% 이소플루란 또는 수술면에서 ~60회 호흡/분(발가락이나 꼬리 핀치에 반응하지 않고)으로 유지하십시오.
- 동물의 눈에 눈 연고를 바르고 수술 내내 윤활유를 유지합니다.
- 진통제 (0.1 mg / kg buprenorphine)와 비 스테로이드 성 항 염증 약물 (5 mg / kg 카프로펜)의 혼합물을 하루 일찍 TBI를 수행하지 않는 한 피하적으로 단일 주사로 투여하고, 이 경우 동물은 이미 진통제 및 항 염증을 받았다.
참고 : 부프레 노르핀은 첫 번째 TBI와 EEG 배치 수술 사이의 시간이 8 시간을 초과하거나 동물이 첫 번째 투여 후 통증의 징후를 표시하는 경우 다시 투여해야하지만, 카프로펜을 추가하지 않고 주어져야한다. - 젖산 나트륨 용액 (동물 의 무게의 그램 당 3 μL)을 피하적으로 투여하여 동물의 유체와 전해질을 대체하십시오.
참고: TBI 직후에 수술을 시행하는 경우 이 단계는 적절한 시간 지정을 받아야 합니다. 젖산 나트륨 용액은 동물이 수술을 받은 후 한 번, 이전 주사로부터 2 시간마다 투여되어야합니다. - 제모 크림을 사용하여 두피에서 머리카락을 제거하십시오.
- 절개를하기 전에, povidone-요오드 수술 방부제로 두피의 피부를 소독하고 70 % 에탄올을 원형 운동3 x (매번 용액 당 20 s)로 멸균 거즈 패드로 번갈아 가며 소독하십시오.
- 메스를 사용하여 눈 바로 위에서 머리 뒤쪽까지 두피 미드 라인에 로스트랄 코달 절개를합니다. 피부 플랩이 더 많은 안정성을 제공하는 EEG 캡 위에 또는 주위에 밀봉 될 수 있기 때문에 두피를 절단하는 이 방법은 두피를 절단하는 것이 바람직합니다.
참고 : 3-EEG 헤드 마운트의 이식을 위해 두개골을 준비 할 때 헤드 마운트의 크기로 헤드 마운트의 크기로 헤드 마운트를 통해 피부 플랩의 폐쇄를 허용하지 않기 때문에 두피를 절단해야합니다. - 열린 피부 테두리에 작은 지혈을 적용하여 절개 영역을 확장합니다. 절개 후 출혈이 발생하면 멸균 면 거즈 또는 면봉으로 청소하십시오.
- 메스 블레이드로 골막 (즉, 두개골 뼈 위에 얇은 막)을 부드럽게 제거하십시오. 이 단계에서 출혈이 발생하면 멸균 면봉으로 출혈 부위를 눌러 멈출 때까지 누르십시오.
- 멸균 면봉을 사용하여 과산화수소로 두개골을 청소하지만 노출 된 두개골 영역을 둘러싼 연조직을 만지지 마십시오. 두개골이 연조직에서 깨끗이 씻어 내고 희끄무레한 모양이 될 때까지이 단계를 반복하십시오.
- 멸균 거즈 또는 면봉으로 두개골을 건조시면 됩니다.
참고: 3.12-3.15 단계는 전극과 치과 시멘트의 적절한 고정에 중요합니다. 연조직, 소작되지 않은 출혈 및 파편은 감염, 불안정한 헤드마운트 고정, 왜곡되거나 결석한 신호, 수술 후 며칠 또는 몇 주 이내에 임플란트 의 손실을 일으킬 수 있습니다.
4. 전극 배치
- 단일 EEG(1EEG) 채널 헤드마운트를 이식합니다.
참고: 입체 좌표의 약어는 공간 관계를 나타내고 동물의 머리에 지정된 방향에서 브레그마에서 대상의 밀리미터 거리를 지정합니다: 전방 후방(AP) 및 내측 측면(ML). 모든 전극이 뇌 내의 특정 구조가 아닌 경막외 공간에 배치되기 때문에 등쪽 복부는이 프로토콜에 적용되지 않습니다 .그림 3). Vin+는 활성 전극이며 Vin-는 기준 전극입니다.- 강철 비트(0.5 mm, 원형, 1/4인치)가 있는 고속 드릴을 사용하여 ~5,000-6,000회(rpm)에서 6개의 버 홀(안정성 나사의 경우 3개, 전극의 경우 3개)을 생성하여 제공된 스테레오 좌표12를사용합니다. 두 개의 전방 나사: AP = +1.5 mm, ML = ±1.5 mm; 하나의 후방 나사에 대한 : AP = -5.2 mm, ML = -1.5 mm; 접지 전극의 경우: AP = -5.2 mm, ML = +1.5 mm; 기록 전극의 경우: AP = -2.3 mm, ML = ±2.7 mm, 빈+를 오른쪽으로, 빈은 왼쪽에 있습니다.
- 헤드 스테이지의 안정성향상을 위해 3개의 나사를 추가합니다. 드라이버를 사용하여 나사를 각각 1-1.5 x 회전하여 두개골에 안정적으로 고정하십시오.
참고: 나사를 더 깊게 놓면 뇌가 손상됩니다. - 1EEG 헤드마운트를 입체 홀더 암에 삽입하고 헤드마운트를 배치하여 세 개의 전극이 두개골 중간선을 따라 배치되도록 합니다. 이 구성에서 접지 전극과 헤드 마운트의 상단에 각각의 개구부는 뒤쪽에, 중간에 Vin + 전극, 전면에 Vin- 전극. 영구 마커로 헤드마운트에 마크를 만들 수 있습니다.
- 각 전선의 끝이 아래쪽으로 구부러지고 해당 버 구멍 위에 위치되도록 각 전극을 90° 구부립니다. 그런 다음 버 구멍에 수직인 와이어 부분의 길이가 1mm를 측정하고 초과를잘라냅니다(그림 3). 이것은 전극의 경막 외 배치를 보장합니다. 전극은 경막 미더 표면에 거의 닿지 않아야 합니다.
- 헤드마운트를 낮추고 세 개의 전극을 모두 조정하여 각 버 구멍에 맞춥습니다. 경막외 기록의 경우, 전극을 위에 놓거나 경막미를 거의 만지지 않아야 합니다.
- 용매 의 여러 방울과 분말의 1/2 스쿱을 혼합하여 응용 프로그램에 대한 치과 시멘트를 준비합니다. 혼합 주걱을 사용하고 최종 혼합물이 퍼티와 비슷하지만 끈적거리지만 가단성이 높고 동물의 두개골에 놓일 때 제대로 응축될 정도로 뻣뻣해질 때까지 저어줍니다.
- 모든 나사와 전극을 덮고 있는 치과 용 시멘트 혼합물을 적용하고 고형화 될 때까지 ~ 3-5 분 기다립니다. 그것은 불가능 밧줄로 통근에 동물을 연결하게하기 때문에, 치과 시멘트플라스틱 받침대를 커버하지 않도록하십시오.
- 피부 플랩을 들고 지혈을 해제하고 플라스틱 받침대 주위에 피부 플랩을 연결하여 절개를 닫습니다. 여러 방울의 티슈접착제를 바르고(재료 표참조) 피부 플랩을 밀봉합니다.
- 감염을 피하기 위해 임플란트 주변 부위에 클로르헨시딘 방부제를 적용하십시오. 동물이 TBI 유도 중에 주어진 젖산 나트륨 용액을 이전 주입 한 후 2 시간 이상 마취를 받으면 다른 주사를 피하투여하십시오. 동물의 적절한 수분을 유지하려면 동물이 마취하에 소비하는 2 시간마다 주사를 반복하십시오.
- 수술 후, 이전 주사 후 젖산 나트륨 용액 2 h의 최종 주사를 준다. 수술이 2시간 미만이면, 첫 번째 주사로부터 젖산 나트륨 용액의 최종 회복 용량을 2시간 투여한다.
- 입체 장치에서 동물을 제거하고 향후 모니터링을 위한 참고 자료로 EEG 수술 후 동물의 체중을 측정합니다. 임플란트로 인해 동물의 체중은 수술 전보다 더 큽할 것입니다.
- 회복을 위해 동물을 따뜻한 가열 패드에 깨끗한 케이지에 놓습니다.
- 2개의 EEG 및 1개의 EMG(2EEG/1EMG) 채널을 헤드마운트에 이식합니다.
- 헤드 마운트의 배치를위한 랜드 마크로 bregma를 사용합니다. 2EEG/1EMG 헤드마운트의 하단에 소량의 티슈 접착제(재료 표참조)를 적용하여 4개의 나사 구멍을 피하고 2EEG/1EMG 헤드마운트를 두개골 표면에 놓습니다.
참고: 이 헤드마운트의 배치에 대한 특정 좌표는 없습니다. 헤드마운트는 길이 8mm, 너비 5mm로 대부분의 두개골 표면을 덮습니다. 헤드마운트를 앞쪽 가장자리로 배치하면 브레그마에 3.0mm 전방에 위치하는 것이 최적이고 좋은 신호 품질을 제공합니다. 조직 접착제 치료제를 떨어 뜨리기 전에 빠른 수동 배치가 필요합니다. 조직 접착제가 완전히 치료될 때 약 5분 정도 두도록 두드리라. - 멸균 23G 바늘을 사용하여 헤드마운트의 네 개의 구멍을 통해 나사에 대한 파일럿 구멍을 만듭니다. 이를 위해 바늘을 부드럽게 밀고 바늘 끝이 뇌를 손상시키지 않고 두개골에 침투 할 때까지 천천히 회전하십시오. 멸균 면봉을 사용하여 파일럿 구멍에서 출혈을 제거하십시오.
- 파일럿 구멍에 나사에 0.10을 삽입하고 각각 두개골에 고정 될 때까지 회전. 이것은 나사 길이의 절반까지 될 수 있지만 전체 길이는 아닐 수 있습니다. 헤드마운트가 배치되어 두개골 표면과 헤드마운트의 후면 끝 사이에 간격이 있도록 위치하는 경우 후방 부에 2개의 0.12 나사를 사용한다.
- 두 성분 에폭시 (실버 에폭시) 트윈 팩 파우치의 측면에 작은 구멍을 확인합니다. 양면 주걱을 가지고 파우치에서 각 구성 요소의 작은 동일한 양을 국자와 함께 혼합하기 위해 각 측면을 사용합니다. 혼합물이 20 분 이내에 고형화되기 때문에 단일 수술에 충분한 소량만 사용하십시오.
참고 : 실버 에폭시는 나사와 헤드 마운트 사이의 적절한 전기 접촉을 허용하고 나사의 안정성을 향상시킵니다. - 나사와 나사 구멍 사이에 소량의 혼합물을 적용한 다음 머리가 임플란트 바닥에 놓일 때까지 각 나사를 조입니다. 각 나사가 개별 전극역할을 하기 때문에 은색 에폭시가 두 나사 사이에 접촉하지 않도록 하고 정확한 신호를 보장하기 위해 다른 나사와 접촉해서는 안 됩니다.
- 은-에폭시 혼합물이 잘못 배치된 경우, 연결을 분리하기 위해 과량의 것을 조심스럽게 떠낼 수 있는 몇 번째 창이 있습니다. 조심스럽게 동물의 머리와 목의 윤곽을 따라 헤드 마운트의 후방 가장자리에서 두 EMG 리드를 구부린 다음 nuchal 근육에 삽입합니다.
- 용매 의 여러 방울과 분말의 1/2 스쿱을 혼합하여 응용 프로그램에 대한 치과 시멘트를 준비합니다. 혼합 주걱을 사용하고 최종 혼합물이 퍼티와 비슷하지만 끈적거리지만 가단성이 높고 동물의 두개골에 놓일 때 제대로 응축될 정도로 뻣뻣해질 때까지 저어줍니다.
- 6 개의 핀 구멍을 덮는 것을 피하면서 전체 헤드 마운트를 덮는 치과 시멘트 혼합물을 적용하면 사전 증폭기를 연결하는 것이 불가능합니다. 시멘트가 굳어지때까지 ~3-5분 간 기다립니다. 피부가 치과 시멘트와 헤드 마운트에 밀봉되지 않았는지 확인하십시오.
- 피부 플랩을 들고 지혈을 해제하고 플라스틱 받침대 주위에 피부 플랩을 연결하여 절개를 닫습니다. 피부 플랩을 밀봉하기 위해 조직 접착제의 여러 방울을 적용합니다.
참고 : 피부 절개가 EMG 와이어 리드의 교정을 허용하기 위해 더 이상 만들어진 경우, 피부는 조직 접착제 또는 봉합로 밀봉 될 수있다. 조직 접착제로 피부를 밀봉하는 것은 일반적으로 충분하다. 그러나 수술 후 모니터링 개구부가 관찰되는 경우 봉합사를 권장합니다. - 감염을 피하기 위해 임플란트 주변 부위에 클로르헨시딘 방부제를 적용하십시오. 젖산 나트륨 용액 (동물 의 무게의 그램 당 3 μL)을 피하적으로 투여하여 동물이 이전 주사 후 2 시간 이상 마취를 하고 있는 경우 체액과 전해질을 대체합니다.
- 입체 장치에서 동물을 제거하고 향후 모니터링을 위한 참고 자료로 EEG 수술 후 동물의 체중을 측정합니다. 임플란트로 인해 동물의 체중은 수술 전보다 더 큽할 것입니다.
- 동물을 따뜻한 가열 패드에 깨끗한 케이지에 놓고 회복을 위해 회복 젤과 촉촉한 차우 조각 몇 개를 놓습니다.
- 헤드 마운트의 배치를위한 랜드 마크로 bregma를 사용합니다. 2EEG/1EMG 헤드마운트의 하단에 소량의 티슈 접착제(재료 표참조)를 적용하여 4개의 나사 구멍을 피하고 2EEG/1EMG 헤드마운트를 두개골 표면에 놓습니다.
- 3개의 EEG 채널(3EEG) 헤드마운트를 이식합니다.
- ~5,000-6,000 rpm에서 강철 비트(0.5 mm, 원형, 1/4)가 있는 고속 드릴을 사용하여 제공된 입체 좌표12를사용하여 6개의 버 구멍(안정성 나사의 경우 3개, 전극용 3개)을 생성합니다. EEG1 및 EEG2에 대한 접지 및 공통 참조: AP = 5.2 mm, ML = ±1.5 mm; EEG1 및 EEG2의 경우: AP = -3.0 mm, ML = ±3.0 mm; 독립 EEG3의 경우: AP =-1.4 mm, ML = ±1.5 mm.
- 6개의 나사 전극을 버 구멍에 넣습니다.
참고 : 나사를 더 깊게 배치하면 뇌에 심각한 손상을 입힐 수 있습니다. 나사 전극은 헤드마운트의 안정성을 더 잘 제공합니다. - 용매 의 여러 방울과 분말의 1/2 스쿱을 혼합하여 응용 프로그램에 대한 치과 시멘트를 준비합니다. 혼합 주걱을 사용하고 최종 혼합물이 퍼티와 비슷하지만 끈적거리지만 가단성이 높고 동물의 두개골에 놓일 때 제대로 응축될 정도로 뻣뻣해질 때까지 저어줍니다.
- 두개골과 각 나사 전극의 전체 노출 된 표면을 덮는 치과 시멘트 혼합물을 적용합니다. 피부가 치과 시멘트와 헤드 마운트에 밀봉되지 않았는지 확인하십시오. 시멘트가 약간 고형화될 때까지 ~1-2분 간 기다립니다. 다음 단계로 진행하기 전에 전체 응고 될 때까지 기다릴 필요가 없습니다.
- 납땜 인두를 켜서 가열하십시오. 3EEG 헤드마운트를 입체 홀더 암에 놓습니다.
참고: 6개의 와이어 리드 위치가 각 나사 전극의 와이어 리드 위치와 일치되도록 헤드마운트를 배치합니다. - 복부 부분이 치과 시멘트 위에 놓이게 되도록 헤드마운트를 낮춥춥습니다.
- 헤드마운트의 해당 와이어 리드로 각 나사 전극에서 각 리드의 와이어를 비틀어 보세요.
참고: 잘못된 와이어 리드를 비틀면 데이터 해석이 복잡하거나 불가능해집니다. - 가위를 사용하여 여분의 와이어를 조심스럽게 다듬습니다. 적절한 신호 전도를 위해 각 꼬인 와이어 쌍을 납땜합니다.
참고 : 전선의 각 쌍은 그렇지 않으면 신호 품질과 데이터 해석이 손상될 것이다, 다른 쌍과 접촉해야합니다. - 헤드마운트 주변에 납땜된 와이어 리드의 각 쌍을 구부려 각 쌍 간의 접촉을 피합니다.
참고: 와이어 리드가 충분히 짧게 트리밍되지 않으면 다른 와이어를 건드리지 않고 헤드마운트 주변을 구부리기가 어려울 수 있습니다. 이 경우, 먼저 한 쌍을 구부리고 치과 시멘트 혼합물로 덮고 ~ 1-2 분 동안 기다렸다가 고형화 한 다음 같은 방식으로 다음 쌍을 진행하십시오. - 치과 시멘트로 모든 와이어를 덮는 것을 마치면 헤드 마운트의 검은 부분만 노출됩니다.
참고 : 구멍에 파편이나 시멘트가 접촉을 차단하고 신호 부재 또는 소음중 하나를 초래할 것 같은 헤드 마운트의 노출 된 부분의 상단에 치과 시멘트 분말이나 혼합물을 적용하지 않도록주의하십시오. - 피부 플랩을 들고 지혈을 해제합니다. 감염을 피하기 위해 임플란트 주변 부위에 클로르헨시딘 방부제를 적용하십시오.
- 젖산 나트륨 용액 (동물 의 무게의 그램 당 3 μL)을 피하적으로 투여하여 동물이 이전 주사 후 2 시간 이상 마취를 한 경우 체액과 전해질을 대체하십시오.
- 입체 장치에서 동물을 제거하고 향후 모니터링을 위한 참고 자료로 EEG 수술 후 동물의 체중을 측정합니다. 임플란트로 인해 동물의 체중은 수술 전보다 더 큽할 것입니다.
- 동물을 따뜻한 가열 패드에 깨끗한 케이지에 놓고 회복을 위해 회복 젤과 촉촉한 차우 조각 몇 개를 놓습니다.
참고 : 과산화수소는 두개골에서 남아있는 연조직을 제거하는 데 도움을 주었습니다.
5. 동물을 획득 시스템에 연결
- 양손으로 동물을 컵에 넣어 수집 케이지에서 제거하고 동물 이송 스테이션(ATS)과 같이 평평한 표면으로 깨끗한 지역으로 옮김을 옮니다.
- 부드럽게 뒷면의 피부에 의해 마우스를 잡아. 이 고통을 야기로, 꼬리에 의해 동물을 잡아하지 마십시오.
- 접지 전극에 해당하는 EEG 헤드마운트의 개구부를 식별하고 적절한 연결을 위해 밧줄의 각 핀을 일치시다.
참고: 통근기에서 동물 헤드마운트로 밧줄이 반대로 연결되면 전극과 잠재적으로 왜곡된 파형이 다르게 판독됩니다. - 동물을 수집 케이지로 되돌리고 테더(EEG System 1) 또는 프리 앰프(EEG System 2)의 다른 쪽 끝을 통근기에 연결합니다.
참고: 사전 증폭기(EEG System 2)를 통근기의 밧줄에 연결할 때 두 테더의 끝에 있는 흰색 표시와 일치합니다. 역연결은 앰프가 영구적으로 손상되어 제조업체가 수리해야 하므로 비용이 많이 듭니다. - 동물을 통근기와 연결하는 밧줄이 부드럽게 회전하여 메커니즘이 제대로 작동하고 동물이 자유롭게 움직일 수 있도록 합니다.
6. 뇌파 데이터 수집 설정
- EEG 시스템 1 수집 매개 변수를 설정합니다.
- 샘플링 속도를 500Hz로 설정합니다. 이득 5,000; 모드 규범 35 Hz; LPN 끄기. 하이 패스 필터를 0.5Hz로 설정합니다.
참고: 100Hz(로우 패스)가 내장되어 있으며 수동 입력이 필요하지 않습니다.
- 샘플링 속도를 500Hz로 설정합니다. 이득 5,000; 모드 규범 35 Hz; LPN 끄기. 하이 패스 필터를 0.5Hz로 설정합니다.
- EEG 시스템 2 획득 매개변수를 설정합니다.
- 샘플링 속도를 600Hz로 설정합니다. 프리앰프 게인 100; 게인 1 (EEG1,2) 로우 패스 필터를 100Hz로 설정합니다.
참고: 1Hz(하이 패스)가 내장되어 있으며 수동 입력이 필요하지 않습니다.
- 샘플링 속도를 600Hz로 설정합니다. 프리앰프 게인 100; 게인 1 (EEG1,2) 로우 패스 필터를 100Hz로 설정합니다.
7. 비디오 데이터 수집 설정
- EEG 시스템 1에 대한 수집 매개 변수를 설정합니다.
참고: 동시 비디오 데이터를 얻기 위해서는 타사 비디오 수집 시스템이 필요합니다.- 적절한 비디오 품질을 위해 프레임 속도를 최소 15(최소 권장)에서 30(최대 사용 가능)으로 설정합니다. 해상도를 640 x 640 픽셀로 설정합니다. 압축 유형을 H.264H로 설정합니다.
- EEG 시스템 2에 대한 수집 매개 변수를 설정합니다.
참고: 이 EEG 시스템은 최대 4개의 동물에 대해 비디오 및 EEG 데이터를 단일 파일로 동기화하는 비디오 시스템과 소프트웨어를 제공합니다(재료 표참조).- 적절한 비디오 품질을 위해 프레임 속도를 최소 15(최소 권장)에서 30(최대 사용 가능)으로 설정합니다. 해상도를 640 x 480 픽셀로 설정합니다. 압축 유형을 WebM 파일 형식으로 설정합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
여기서 설명된 프로토콜은 반복적인 확산 TBI의 마우스 모델을 사용하여 격리된 확산 상해의 유도 방법(예를 들어, 국소 병변이 없는 경우)을설명한다(도 1). 그림 1A는 이 모델에서 TBI의 유도에 사용되는 중량 투하 장치 및 그 구성 요소(그림1A, a1−a5)와절차 동안의 중요한 단계를 도시한다(그림1B, b1−b5).
이 모델의 특성은 TBI의 결과로 뇌에 국소 병변의 부족을 포함, 의식상실, 높은 생존율, 늦은 발작의 출현 (>1 TBI의 주), 그리고 자발적, 도발, 재발성 발작의 하위 집합에 TBI 마우스는 TBI 를 따르는 적어도 3주 간의 대기 기간 후에.
이 프로토콜은 클린 수술 필드를 설정하기 위한 상세한 절차를 보여 주며(그림2),상이한 전극 어레이를 이식하는 단계별 접근법을제공하고(그림 3),발작 을 검출하기 위한 두 개의 서로 다른 EEG 획득 시스템(재료 표참조)을 사용하는 방법에 대한 상세한 가이드를 포함하고 있다(도4 및 도 5). 일반적인 발작의 스펙트럼 전력은 10~40Hz의 주파수 범위에서 가장 높은 밀도를 나타내며피크는 15Hz(그림 4)입니다. 마우스에 있는 포착의 대다수는 경련, 12-15 s의 평균 기간으로. 발작의 작은 부분만 비 경련성입니다. 두 시스템 중 하나를 사용하는 데 의한 장점과 단점을 면밀하게 비교하는 것은 토론 섹션에 자세히 설명되어 있습니다. 더욱이, 이 프로토콜은 반복적인 체중 투하 TBI 후 동물에서 발작 발병에 대한 타임라인을 보여 주며, 일부 동물에서 발작 군집화를보여주는(도 6)이는 간헐적인 기록보다는 연속적 획득의 중요성을 강조하는 것으로, 이는 TBI 후 자발적인 발작을 개발하는 동물의 정확한 계층화를 보장할 것이다. 중요한 것은, 이 프로토콜은 또한 PTE의 설치류 모형의 장단점 및 TBI 후에 인간의 특정 인구를 대표하는 그들의 기능에 대해 설명합니다.
그림 1: 반복 확산 TBI의 마우스 모델입니다. (A)무게 떨어뜨리기 장치. (a1) 무게 드롭 튜브. (a2) 100g 의 무게 막대. (a3) 막대를 잡고 핀. (a4) 스트링은 높이를 변경하거나 중량 낙하 튜브에서 막대를 제거하는 경우 막대를 올립니다. (a5). 무게를 떨어뜨리는 튜브 아래에 동물을 배치하기위한 폼 패드. (B)체중 감량 절차. (b1) 스테인레스 스틸 디스크는 눈과 귀 의 라인 사이의 머리의 중심에 위치한다. (b2 및 b3) 동물의 머리가 평평한 위치에 있고 폼 패드가 이동된다는 시각적 확인 후 동물의 머리를 체중 강하 관 아래에 놓습니다. (b4) 스테인레스 스틸 디스크의 중앙에 부딪치고, 무게 막대를 들고 핀의 릴리스. (b5) 마우스는 동물의 충격과 의식 상실직후 멸균 수건에 놓이게 되며, 동물이 회복하는 데 걸리는 시간을 측정하여 스스로 를 측정한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 외과 현장 준비 및 EEG 전극 배치 방식. 오토클레이브 공구와 수술 및 전극 이식에 필요한 재료는 동물을 마취하기 전에 준비되어 필요한 모든 부품의 가용성을 보장합니다. 이것은 멸균 영역이며 이 구역을 비멸균 물질로 오염시키지 않는 것이 필수적입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: EEG 시스템 1 및 2를 사용한 전극 배치의 입체 적 랜드 마크 및 회로도 표현. 상단 패널은 이 프로토콜에 설명된 세 가지 다른 헤드마운트를 이식하는 방법을 설명합니다. (A)단일 EEG 채널, 양극성 몽타주. (B)공통 참조, 양극성 몽타주 및 하나의 EMG 채널과 두 개의 EEG 채널. (C)모노폴라(채널 1−2)와 양극성(채널 3) 몽타주를 사용하여 3개의 EEG 채널을 사용한다. 하단 패널은 상단 패널에서와 같이 이식 된 헤드 마운트와 나사를 묘사합니다. 안정성 나사 (EEG 시스템 1) 또는 안정성과 전극 (EEG 시스템 2)로 모두 : 두 가지 목적을 위해이 프로토콜에 사용되는 나사의 세 가지 유형. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: EEG 시스템 1을 사용하여 취득된 자발적인 발작. 상부 패널은 1EEG 헤드마운트를 사용하여 획득한 데이터를 사용하여 반복된 체중 감소 TBI 후 23일 후에 마우스에서 자발적인 발작을 묘사한다. (A)사전 ictal (사전 발작) 활동. (B)알약 (발작) 활동. (C)포스트 ictal (포스트 발작) 우울증. 하단 패널: 파워 스펙트럼 밀도는 사용자 지정 스크립트 및 소프트웨어를 사용하여 계산됩니다(재료 표참조). 평균 전력 = 시대 내의 전력 스펙트럼의 평균전력(단위: V2/Hz). 중간 주파수 = epoch 내의 총 전력의 50%에 도달하는 주파수(단위: Hz). 평균 주파수 = epoch 내의 평균 전력에 도달하는 주파수(단위: Hz). 스펙트럼 에지 = 시대 내의 총 전력의 사용자가 지정한 백분율에 도달하는 빈도(단위: Hz). 피크 주파수 = 획기적인 동안 최대 전력이 발생하는 주파수입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: EEG 시스템 2를 사용하여 획득한 자발적인 발작. (a)마우스에서 자발적인 비경련성(electrographic) 발작을 반복한 후 65일 간 반복된 체중 감소 TBI. 2EEG/1EMG 헤드마운트를 사용하여 수집한 데이터. (B)체중 이떨어지는 TBI 후 97일 후에 마우스에서 자발적인 경련성 발작. 3EEG 헤드마운트를 사용하여 수집된 데이터. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 6: 반복된 체중 감소 TBI 후 마우스에서 발작 발생률 타임라인. 초기 발작은 부상 후 3주 동안 관찰되었다. 몇몇 동물은 포착 없이 몇 주 뒤에 같은 날 안에 포착의 클러스터를 개발합니다. 동물은 TBI 후 4개월까지 기록되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
초점 과 확산 상해의 초점 또는 조합을 유도하는 CCI 및 FPI 모형과는 대조적으로, 이 프로토콜에 기술된 반복적인 확산 TBI의 모형은 초점 두뇌 상해의 부재에 확산 상해의 유도를 허용하고 두피 또는 두개골 개구부 및 관련염증을 요구하지 않습니다. 이 모델에서 두개골 절제술의 부재의 추가 장점은 만성 연속 EEG 기록을 위한 전극을 이식할 수 있다는 것입니다, 또한 동물의 만성 생체 내 2 광자 화상 진찰을 위한 얇은 두개골 두개골 창의 창조, 직후, 그리고 Shandra와 Robel2019에기술된 대로 TBI를 따르는 달, 직후, 및 반복적으로.
어떤 동물 모델을 선택하든, 채택된 데이터 수집 접근 방식은 성공적이고 포괄적인 연구의 중요한 요소입니다. 외상 후 간질의 설치류 모델에서 발작의 빈도는낮으며,하루에 0.3-0.4 발작에 이르기까지9,15,첫 번째 발작 전의 잠복 기간은 초기 TBI 절차 후 며칠 또는 몇 주에서 몇 달까지 지속될 수 있습니다. 마지막으로, 짧은 기간 동안 일반적으로 발작 발생률이 높은 비 외상 모델과 는 달리, 평균적으로 TBI를 가진 동물의 평균 9 %-50 %만이 최대 6 개월8,16의기간 동안 자발적인 발작을 가질 것이다. 이것은 의미있는 연구 결과가 지속적인 장기 비디오 EEG 기록을 요구한다는 것을 건의합니다.
TBI의 각 동물 모델의 가장 중요한 목표는 PTE의 근본적인 세포 및 분자 메커니즘을 더 잘 조사하기 위해 인간 환자에서 발견되는 다양한 형태의 TBI를 가능한 한 가깝게 재현하는 것입니다. 이 프로토콜의 기술은 치료 표적의 발견, 새로운 예방 및 치료 후보의 효능 및 내성 테스트, 그리고 다음 간질의 신뢰할 수있는 바이오 마커 또는 예측 변수의 개발을 용이하게하는 데 도움이 될 것입니다 Tbi.
체중 감소 절차 중 잠재적인 과제
헤드가 입체 프레임에 고정되어 있지 않기 때문에 머리와 금속 판의 평평한 위치를 보장하기 위해 각별한주의를 기울여야합니다. 가중치가 있는 막대가 금속 판이나 머리에 비스듬히 부딪히거나 무게가 마우스 헤드 의 측면으로 미끄러지면 부상 생체 역학이 달라져 더 온화하거나 부상을 입을 수 있습니다. 과거에는 금속판이 두개골에 붙어 가변성을 최소화했습니다. 그러나, 금속판과 접착제를 마우스 두개골로부터 제거한 후 체중 이감소하고, 주의해서 수행하더라도, 수막에 손상을 유도하여, 가짜 동물에서도 뇌 조직에 혈관 손상 및 후속 손상을 초래한다. 추가, 절개는 치유를 요구합니다, 잠재적으로 가변성을 소개할 수 있는 말초 면역 반응을 관련시키는. 이러한 이유로 금속 판을 두개골에 붙이는 것을 생략하도록 선택되었습니다. 동물은 반복 (즉,이 프로토콜에서 3 배) 부상으로 죽을 수 있습니다. 체중이 25g 미만인 마우스는 반복되는 충격을 용납하지 않을 수 있습니다. 단일 부상은 거의 사망을 초래하지 않지만, C57BL / 6 동물의 최대 7 %는 반복 충격 후 사망9. 운동 적자는 일부 동물에서 관찰 될 수있다. 이 적자는 뒷다리 마비 또는 보행 이상으로 명시합니다. 이것은 일반적으로 가난한 복구에 대 한 예 후 요인 이며 동물을 희생 하는 것이 좋습니다. 고통 또는 고민의 표시는 체중 감소를 포함, 가난한 그루밍, 탈수, 증가 불안, 낮은 또는 결석 탐구 활동 (하이드로 겔/복구, 차우 및/또는 네슬렛 그대로 유지). 구조 진통 (0.1 mg/kg의 buprenorphine)은 통증을 완화하고 동물이 인도적 종점에 도달하는 것을 방지하기 위해 TBI에서 3 일 동안 8 시간마다 피하투여 할 수 있습니다. 피하 젖산 나트륨 용액 (동물 의 무게의 그램 당 3 μL)은 수화를 위해 하루에 두 번 투여 할 수 있습니다. 동물은 전형적으로 TBI 후에 3 일 안에 복구합니다. 실험 절차 후 동물 모니터링을 위한 5단계 신체 상태 점수(BCS)를 사용하는 것이 좋습니다. 단계는 (1) Emaciated (골격 구조는 매우 눈에 띄는, 척추는 매우 분할); (2) 조건부 (척추 기둥의 세분화가 분명하고 등쪽 골반 뼈는 쉽게 만져볼 수 있음); (3) 컨디셔닝 (척추와 등쪽 골반은 약간의 압력으로 눈에 띄는 것이 아닙니다); (4) 과도 조절 (척추는 연속 컬럼, 단단한 압력으로만 만져볼 수있는 척추); (5) 비만 (마우스는 부드럽고 부피가 크며, 뼈 구조는 살과 피하 지방 에서 사라집니다). BCS가 1-2, 20% 또는 그 이전 TBI 무게에 비해 성인 마우스에 있는 더 많은 체중 감소, 고통 또는 고민의 현상은 진통제에 의해 완화되지 않을 때 인도적인 종점은 도달됩니다, 자기 절단의 표시, 탈수의 현상, 저체온증, 신경학상 적자의 존재 (이상한 걸음걸이 또는 운동 마비). 물질 관리의 몇 가지 가능한 결과 고려 되어야 한다. Buprenorphine 주입 피하 주사17후 10 분에서 진통 효과의 첫 번째 피크에 도달합니다. 첫 번째 충격은 buprenorphine가 관리된 후에 초 생깁니다, 적당한 시간의 첫번째 측정이 영향을 받을 가능성이 없다는 것을 건의합니다. 그러나 변수로 완전히 제외될 수는 없습니다. 따라서, 실험자는 자신의 판단을 행사하는 것이 좋습니다. 체중 감소 절차가 입체 수술에 선행되고 카프로펜이 관리되는 경우에 카프로펜은 발작 부각에 영향을 미칠 수 있는 항염증제이다는 것을 주의하는 것이 중요합니다, 그러므로 실험자는 신중하게 그것의 사용을 고려하는 것이 좋습니다.
수술 중 잠재적인 도전
70% 에탄올을 사용하면 오염이나 감염의 위험이 낮아지지만 멸균 상태가 되지는 않습니다. 대안적으로, 멸균 수술 용 장갑을 사용할 수 있다. 그러나, 입체 장치는 그 자체가 멸균되지 않으므로 수동 조작으로 장갑의 멸균 상태가 손실됩니다. 따라서 수술 중 무균 물질과 접촉 한 후 70 % 에탄올로 분무해야합니다. 뇌에 두개골을 통해 드릴링은 뇌 조직에 손상을 생성하고 출혈을 일으킬 수 있습니다. 버 구멍을 만드는 것은 매우 주의를 기울여야 합니다. 입체 암에 핸드 드릴을 고정하고 점차적으로 낮추면 드릴을 수동으로 유지하면서 구멍을 뚫는 것이 바람직합니다. 전극 및 고정 나사는 계획보다 더 깊이 가라 앉을 수 있으며, 경막하(경막하 배치) 또는 피질(피질 배치)을 손상시킬 수 있습니다. 이것은 불출혈과 초점 병변을 일으키는 원인이 될 수 있습니다. 실험자는 수술 중 동물의 과열을 피해야합니다. 온도 센서가 올바르게 고정되지 않으면 필요한 37 °C 온도를 유지하지 못하여 과열, 화상 및 때로는 동물의 사망을 초래합니다. 동물의 눈은 건조, 자극, 또는 동물이 입체 장치에 배치되는 즉시 윤활하지 않을 경우 수술 중에 손상.
수술 후 모니터링
수술 후 모니터링은 절차 또는 수술이 끝난 직후에 시작됩니다. 마취에서 깨어날 때까지 동물을 관찰하고 출혈이나 모바늘을 포함한 수술 관련 합병증의 유무를 찾습니다. 불완전한 절개 폐쇄에서 출혈이 관찰되면 동물을 마취시키고, 클로르헨시딘으로 출혈 부위를 청소하고, 위에서 설명한 바와 같이 상처 폐쇄를 수행하고 동물을 회복 케이지로 되돌려 놓습니다. 수술 후 약 1-2 시간 동안 동물은 무감각이나 통증의 징후없이 케이지에서 자유롭게 움직이면서 마취에서 완전히 깨어 있어야합니다. 동물은 그루밍 자체를 시작하므로 절개를 밀봉하는 것이 동물이 그루밍 중에 개통되는 것을 방지할 필요가 있습니다. 동물이 회복되면 EEG 데이터 수집에 사용할 케이지 /챔버로 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 더합니다. 이것은 동물이 새로운 환경에 습관화 얻을 수 있습니다. 이는 장기 기록(개월)에 특히 중요합니다. 동물 케이지에는 회수 젤(재료 표참조), 축축한 차우, 네슬렛 및 물병이 있어야 합니다. 이것은 적절한 회복을 허용하고 영양분과 물에 동물에게 액세스를 제공 할 것입니다. 매일 동물을 계속 모니터링하십시오. 평가는 (a) 체중 감소, 가난한 손질, 증가 된 불안, 낮거나 결석 한 탐구 활동 (하이드로 겔 / 회복, 차우 및 / 또는 네슬렛이 손길이 닿지 않은 상태로 유지)을 포함하여 통증이나 고통의 징후에 대한 동물의 행동을 육안 검사하고 EEG 임플란트 주변의 절개 부위의 적절한 치유를 포함해야합니다. (b) 탈수와 영양 실조의 징후에 대한 BCS의 평가; (c) 동물의 무게. 젖산 나트륨 용액 (동물의 체중 그램 당 3 μL)을 피하 적으로 동물이 탈수의 징후를 보이는 경우 투여하십시오 (재료 표참조). 동물이 통증이나 고민의 징후를 보이는 경우 피하 (0.1 mg / kg)를 피하 투여하십시오. 고통의 표시가 지속되는 경우에 buprenorphine는 매 8 h. 동물이 고통 및/또는 고민의 표시를 보여주는 경우에 감시는 하루에 두 번으로 증가되어야 합니다. 동물이 밧줄로 획득 시스템에 연결하기 전에 EEG 수술 후 적어도 3 일 동안 회복할 수 있도록 하십시오. 인도적 엔드포인트 기준은 위의 중량 감소 절차 동안 잠재적인 과제와 동일합니다.
인수 시스템 및 헤드마운트의 장점과 단점
단일 EEG 채널 헤드마운트를 갖춘 EEG 시스템 1의 주요 장점은 하드웨어, 구성 요소 및 서비스의 상대적으로 저렴한 비용입니다. 간단하고 간단한 구성은 또한 사용자가 자신의 환경 설정에 시스템을 사용자 정의 할 수 있습니다. 각 차동 증폭기는 단일 EEG 채널을 제공하지만 여러 차동 증폭기가 서로 연결될 수 있지만 각 동물에 대한 채널 수가 증가합니다. 이 시스템에서, 동물당 단일 채널 구성은 20마리의 동물의 만성 장기 EEG 기록을 동시에 획득하는데 사용되었다. 외상 후 발작은 전형적으로 일반화되고, 전극의 양측 양극성 몽타주와 함께 간질 활성의이 유형을 검출하기 쉽습니다. 그러나 이 접근법의 단점은 여러 채널이 필요하기 때문에 초점성, 측면화 또는 간질 활성의 전파를 안정적으로 감지하는 것은 불가능하다는 것입니다. 또 다른 잠재적인 과제는 시간이 지남에 따라 단일 채널의 노이즈 오염이 될 수 있으므로 동물로부터 유용한 데이터를 수집할 수 없습니다. 이것은 동물 당 채널의 수를 두 배로 두 배 인 두 개 이상의 차동 증폭기를 결합하여 극복 할 수 있습니다. 마지막으로, 단일 채널에서 수집한 데이터는 잠재적인 아티팩트와 구별하기가 더 어두고 간질 활성은 동물의 행동을 비디오 로 녹화하여 가장 잘 지원됩니다. 이러한 이유로, 모든 기록은 EEG 획득과 동기화된 연속 비디오 모니터링을 결합했다. 이 시스템과 소프트웨어의 한계는 비디오 수집 시스템을 포함하지 않으므로 동기 비디오를 수집하기 위한 사용자 지정 타사 시스템이 필요하다는 것입니다.
멀티 채널 헤드마운트를 갖춘 EEG System 2의 주요 장점은 증폭기로 통근기를 통과하기 전에 프리앰프에 의해 획득된 신호의 사전 여과(재료 표참조)로 인해 신호의 높은 품질입니다. 이 시스템의 증폭기를 사용하면 2개의 EEG+1 EMG 채널 또는 3개의 EEG 채널(재료 표참조)의 세 가지 구성으로 3개의 채널로 데이터를 수집할 수 있습니다. 이것은 일반화 된 활동뿐만 아니라 잠재적으로 초점 간질 활성을 감지 할 수 있습니다. 또 다른 주요 장점은이 시스템은 동물 연구를 위해 특별히 설계되었기 때문에 단일 파일에서 최대 4 개의 동물에 대한 EEG 및 비디오 채널을 동기화 할 수있는 비디오 녹화 시스템 및 소프트웨어를 제공하므로 EEG 시스템 1보다 보다 쉽고 편리합니다. 이 시스템은 사용되는 헤드마운트 유형 이외의 시스템을 수정하지 않고도 발작 및 수면 분석을 위한 데이터 수집에 사용하기 쉽습니다. 2EEG/1EMG 헤드마운트는 회로 기판의 크기와 구성으로 인해 고정된 위치에만 전극을 이식할 수 있습니다. 3EEG 헤드마운트의 와이어 리드가 있는 스크류 전극은 기준 전극이 배치된 위치에 따라 단극성 또는 양극성 수집을 수행할 수 있는 유연성을 제공합니다. 그러나 3EEG 헤드마운트를 이식하려면 납땜이 필요하며, 이는 수술에 더 많은 단계를 추가하고 추가적인 주의와 정밀도가 필요합니다. 연결 밧줄과 프리앰프피어는 쥐와 미성숙한 쥐와 같은 작은 설치류를 위해 특별히 설계되었으며, 동물의 머리에 약간의 압력을 유발하는 얇고 낮은 무게의 케이블입니다. 시스템의 단점은 하드웨어, 소프트웨어, 비디오 라이센스 및 구성 요소(예: 프리앰프 및 헤드마운트)의 비용이 상대적으로 높다는 것입니다.
EEG 데이터 수집의 중요성 및 중요 단계
통근기는 동물의 움직임 방향에 따라 밧줄이 회전 할 수 있도록 회전 메커니즘을 가지고 있습니다. 이 메커니즘이 실패하면 동물의 움직임이 제한되어 EEG 캡이 제거 될 수 있습니다. 새로운 전극을 배치하는 반복 수술을 시도 할 수 있습니다. 그러나, 이것은 이전 EEG 모자의 제거가 두개골과 두뇌에 손상을 일으키는 원인이 되는 경우에 도전적 또는 불가능할 수 있습니다. EEG 데이터 수집을 위한 샘플링 속도는 관심 도가 가장 높은 2-2.5 배 이상이어야 합니다. 샘플링 속도가 높을수록 파일 크기가 증가하여 데이터의 해상도가 높아지므로 여러 동물의 연속 기록을 수집할 때 저장 및 처리하기가 어려울 수 있습니다. 따라서 파일 크기를 최소화하면서 품질 손실 없이 필요한 데이터를 얻을 수 있는 수준으로 샘플링 속도를 최적화해야 합니다.
비디오 데이터 수집의 중요성 및 중요한 단계
설치류에서, 인간에서와 같이, PTE는 관련 증상 및 전기 사진 상관관계에서 넓은 가변성으로 명시할 수 있습니다, 제대로 해석하고 관찰된 EEG 사건을 분류하기 위하여 EEG 취득 도중 동시 비디오를 장악하는 것을 필요하게 만들기. 동기화된 비디오가 없는 경우 EEG 데이터의 해석은 단일 EEG 채널을 사용할 때 특히 어렵습니다. 이 경우, 다른 증거(비디오)가 발작으로서 분류를 지지하지 않는 한, EEG 파형이 아티팩트인지 여부를 판단하기 어려울 수 있다. 모션 아티팩트는 발작의 전기학적 패턴과 유사하게 나타날 수 있다. 따라서 EMG 확인 유무에 관계없이 비디오가 필요합니다. 비디오 녹화는 밝은 주기와 어두운 주기 모두에서 수행되지만 어두운 시간 동안 비디오 품질이 항상 만족스럽고 선명하지않을 수 있습니다. 또한, 동물이 ictal 같은 EEG 이벤트 동안 카메라에서 외면하는 경우, 그 행동을 평가하는 것이 어려울 수 있습니다. 이러한 경우, EEG 및 비디오 이외에 근전도(EMG) 신호를 획득하면 온화한 행동 발작(낮은 운동 성분)동안 근육 활동에 대한 정보를 제공하거나 EEG에서 스파이크와 같은 스파이크 및 슬로우 웨이브 방전 시 동물 운동의 부족을 확인함으로써 문제를 해결할 수 있습니다. EMG 채널의 잠재적인 과제는 소음 오염, 전극의 잘못된 배치 또는 녹음 시간 동안 느슨해지거나 표면 접촉을 잃는 전극과 같은 EEG 채널의 과제와 유사합니다. EEG 분석과 함께 비디오를 사용하는 것은 두 가지 목적이 있습니다: EEG 이벤트가 동물의 움직임 (탐구 행동, 음주, 치명타, 긁힘, 스트레칭, 그루밍, 또는 빠른 / 노동 호흡)에 의해 발생하는 유물이 아니라는 것을 확인하고 경련성 및 비 경련성 발작을 구별합니다. 경련성 또는 비경련성 발작을 특성화하기 위해 변형된 라신 스케일을 사용하는 것이 좋습니다. 단계는 (0) 어떤 식별 가능한 모터 표현 없이 순수한 전기체 발작을 포함합니다; (1) 안면 자동 및 머리 끄덕임; (2) 앞다리 클로닉 바보; (3) 양측 앞다리 클론; (4) 앞다리 클론 및 사육; (5) 사육 및 떨어지는 앞다리 클론. 각 비디오 채널은 케이지에 있는 동물, 동물 식별 번호, 물병 팁, 음식 및 다이어트/회복 젤이 있는 라벨과 함께 전체 표면을 명확하게 표시해야 합니다. 어두운 시간에 비디오 수집을 보장하려면 적외선 야간 소스를 사용하십시오. (일부 카메라에는 장치가 내장되어 있거나 추가 부품이 필요할 수 있습니다. 재료 표)를참조하십시오. 초당 프레임 속도와 이미지 해상도를 조정합니다. 프레임 속도와 해상도가 높을수록 파일 크기가 커야 합니다. 장기간의 만성 연속 실험 중에 비디오를 수집하는 주요 단점은 매우 많은 양의 데이터를 저장해야 할 필요성과 대용량 파일 처리와 관련된 기술적 어려움을 포함합니다. 실험자가 EEG와 함께 행동 데이터를 효과적으로 해석하는 능력도 고려해야 합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 작품은 R01 NS105807/NS/NINDS NIH HHS/미국 및 CURE에 의해 지원되었다 미국 육군 의학 연구 및 마테리엘 사령부에서 받은 보조금 CURE에 따라, 국방부 (국방부), 수상 No. W81XWH-15-2-0069. 이반 주이드후크는 원고를 교정해 주신 것에 대해 높이 평가받고 있습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.10" screw | Pinnacle Technology Inc., KS, USA | 8209 | 0.10 inch long stainless steel |
| 0.10" screw | Pinnacle Technology Inc., KS, USA | 8403 | 0.10 inch long with pre-soldered wire lead |
| 0.12" screw | Pinnacle Technology Inc., KS, USA | 8212 | 0.12 inch long stainless steel |
| 1EEG headmount | Invitro1 (subsidiary of Plastics One), VA, USA | MS333/8-A/SPC | 3 individually Teflon-insulated platinum iridium wire electrodes (twisted or untwisted, 0.005 inch diameter) extending below threaded plastic pedestal |
| 2EEG/1EMG headmount | Pinnacle Technology Inc., KS, USA | 8201 | 2EEG/1EMG channels |
| 3% hydrogen peroxide | Pharmacy | ||
| 3EEG headmount | Pinnacle Technology Inc., KS, USA | 8235-SM-C | custom 6-Pin Connector for 3EEG channels |
| Buprenorphine | Par Pharmaceuticals, Cos. Inc., Spring Valley, NY, USA | 060969 | |
| Buprenorphine | Par Pharmaceuticals, Cos. Inc., Spring Valley, NY, USA | 060969 | |
| C57BL/6 mice | Harlan/Envigo Laboratories Inc | male, 12-16 weeks old | |
| C57BL/6 mice | The Jackson Laboratory | male, 12-16 weeks old | |
| Carprofen | Zoetis Services LLC, Parsippany, NJ, USA | 026357 | NOTE: this drug is added during weight drop only if stereotactic electrode implantation will be performed on the same day |
| Chlorhexidine antiseptic | Pharmacy | ||
| Dental cement and solvent kit | Stoelting Co., USA | 51459 | |
| Drill | Foredom | HP4-917 | |
| Drill bit | Meisinger USA, LLC, USA | HM1-005-HP | 0.5 mm, Round, 1/4, Steel |
| Dry sterilizer | Cellpoint Scientific, USA | Germinator 500 | |
| EEG System 1 | Biopac Systems, CA, USA | ||
| EEG System 2 | Pinnacle Technology Inc., KS, USA | ||
| Ethanol ≥70% | VWR, USA | 71001-652 | KOPTEC USP, Biotechnology Grade (140 Proof) |
| Eye ointment | Pro Labs Ltd, USA | Puralube Vet Ointment Sterile Ocular Lubricant available in general online stores and pharmacies | |
| Fluriso liquid for inhalation anesthesia | MWI Veterinary Supply Co., USA | 502017 | |
| Hair removal product | Church & Dwight Co., Inc., USA | Nair cream | |
| Isoflurane | MWI Veterinary Supply Co., USA | 502017 | |
| Povidone-iodine surgical solution | Purdue Products, USA | 004677 | Betadine |
| Rimadyl/Carprofen | Zoetis Services LLC, Parsippany, NJ, USA | 026357 | |
| Solder | Harware store | ||
| Soldering iron | Weller, USA | WP35 | ST7 tip, 0.8mm |
| Stainless steel disc | Custom made | ||
| Sterile cotton swabs | |||
| Sterile gauze pads | Fisher Scientific, USA | 22362178 | |
| Sterile poly-lined absorbent towels pads | Cardinal Health, USA | 3520 | |
| Tissue adhesive | 3M Animal Care Products, USA | 1469SB |
References
- Christensen, J., et al. Long-term risk of epilepsy after traumatic brain injury in children and young adults: a population-based cohort study. Lancet. 373 (9669), 1105-1110 (2009).
- Lowenstein, D. H. Epilepsy after head injury: an overview. Epilepsia. 50, Suppl 2 4-9 (2009).
- Ferguson, P. L., et al. A population-based study of risk of epilepsy after hospitalization for traumatic brain injury. Epilepsia. 51 (5), 891-898 (2010).
- Abou-Abbass, H., et al. Epidemiology and clinical characteristics of traumatic brain injury in Lebanon: A systematic review. Medicine (Baltimore). 95 (47), 5342 (2016).
- Management of Concussion/mTBI Working Group. VA/DoD Clinical Practice Guideline for Management of Concussion/Mild Traumatic Brain Injury. The Journal of Rehabilitation Research and Development. 46 (6), 1-68 (2009).
- Piccenna, L., Shears, G., O'Brien, T. J. Management of post-traumatic epilepsy: An evidence review over the last 5 years and future directions. Epilepsia Open. 2 (2), 123-144 (2017).
- Loscher, W., Brandt, C. Prevention or modification of epileptogenesis after brain insults: experimental approaches and translational research. Pharmacological Reviews. 62 (4), 668-700 (2010).
- Ostergard, T., Sweet, J., Kusyk, D., Herring, E., Miller, J. Animal models of post-traumatic epilepsy. Journal of Neuroscience Methods. 272, 50-55 (2016).
- Shandra, O., et al. Repetitive Diffuse Mild Traumatic Brain Injury Causes an Atypical Astrocyte Response and Spontaneous Recurrent Seizures. Journal of Neuroscience. 39 (10), 1944-1963 (2019).
- Foda, M. A., Marmarou, A. A new model of diffuse brain injury in rats. Part II: Morphological characterization. Journal of Neurosurgery. 80 (2), 301-313 (1994).
- Marmarou, A., et al. A new model of diffuse brain injury in rats. Part I: Pathophysiology and biomechanics. Journal of Neurosurgery. 80 (2), 291-300 (1994).
- Paxinos, G., Keith, B. J., Franklin, M. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Elsevier Science. (2007).
- Shandra, O., Robel, S. Imaging and Manipulating Astrocyte Function In Vivo in the Context of CNS Injury. Methods in Molecular Biology. 1938, 233-246 (2019).
- Pitkanen, A., Immonen, R. Epilepsy related to traumatic brain injury. Neurotherapeutics. 11 (2), 286-296 (2014).
- Kharatishvili, I., Nissinen, J. P., McIntosh, T. K., Pitkanen, A. A model of posttraumatic epilepsy induced by lateral fluid-percussion brain injury in rats. Neuroscience. 140 (2), 685-697 (2006).
- Pitkanen, A., Bolkvadze, T., Immonen, R. Anti-epileptogenesis in rodent post-traumatic epilepsy models. Neuroscience Letters. 497 (3), 163-171 (2011).
- Gades, N. M., Danneman, P. J., Wixson, S. K., Tolley, E. A. The magnitude and duration of the analgesic effect of morphine, butorphanol, and buprenorphine in rats and mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 39 (2), 8-13 (2000).
