Summary
Detta systematiska protokoll beskriver en ny djurmodell av posttraumatisk epilepsi efter repetitiva mild traumatisk hjärnskada. Den första delen detaljer steg för traumatisk hjärnskada induktion med hjälp av en modifierad viktminskning modell. Den andra delen ger instruktioner om den kirurgiska metoden för single- och flerkanaliga elektroencefalografiska datainsamlingssystem.
Abstract
Traumatisk hjärnskada (TBI) är en ledande orsak till förvärvad epilepsi. TBI kan resultera i en fokal eller diffus hjärnskada. Focal skada är ett resultat av direkta mekaniska krafter, ibland tränger genom kraniet, skapa en direkt skada i hjärnvävnaden. Dessa är synliga under hjärnavbildning som områden med kontusion, skärsår och blödning. Focal skador inducera neuronal död och gliaärr bildning och finns i 20%−25% av alla människor som ådrar sig en TBI. I de flesta fall av tbi orsakas dock skador av accelerationsretardationskrafter och efterföljande vävnadssklippning, vilket resulterar i icke-fokal, diffus aska. En subpopulation av TBI-patienter fortsätter att utveckla posttraumatisk epilepsi (PTE) efter en latensperiod på månader eller år. För närvarande är det omöjligt att förutsäga vilka patienter som kommer att utveckla PTE, och beslag hos PTE patienter är utmanande att kontrollera, vilket kräver ytterligare forskning. Fram till nyligen var fältet begränsat till endast två djur / gnagare modeller med validerade spontana posttraumatiska anfall, båda presenterar med stora fokal skador med massiv vävnad förlust i cortex och ibland subkortikala strukturer. I motsats till dessa metoder, det fastställdes att diffusa TBI inducerad med hjälp av en modifierad viktminskning modell är tillräcklig för att initiera utvecklingen av spontana konvulsiva och icke-konvulsiva anfall, även i avsaknad av focal skador eller vävnad förlust. I likhet med mänskliga patienter med förvärvad posttraumatisk epilepsi, presenterar denna modell med en latensperiod efter skada före anfall debut. I detta protokoll kommer samhället att förses med en ny modell av posttraumatisk epilepsi, med uppgifter om hur man inducerar diffusa icke-lesional TBI följt av kontinuerlig långsiktig video-elektroencefalografiska djur övervakning under loppet av flera månader. Detta protokoll kommer att detalj djurhantering, viktminskning förfarande, elektrod placering för två förvärvssystem, och de frekventa utmaningar som uppstått under vart och ett av stegen i kirurgi, postoperativ övervakning och datainsamling.
Introduction
Varje år påverkar TBI uppskattningsvis 60 miljoner människor världen över. Drabbade individer löper större risk att utveckla epilepsi, vilket kan manifestera år efter den första skadan. Även allvarliga TBC är förknippade med en högre risk för epilepsi, även mild TBI ökar en individs chans att utveckla epilepsi1,2,3,4. Alla TBI kan klassificeras som focal, diffusa eller en kombination av båda. Diffus hjärnskada, som finns i många om inte alla TBI, är ett resultat av hjärnvävnader av olika densiteter som klipper mot varandra på grund av accelerationsretardation och rotationskrafter. Per definition uppstår diffus skada endast i isolering i mild / hjärnskakning icke-penetrerande hjärnskada, där inga hjärnskador är synliga på datortomografi skanningar5.
Det finns för närvarande två kritiska problem i förvaltningen av patienter som har, eller löper risk att utveckla posttraumatisk epilepsi (PTE). Den första är att när PTE har manifesterat, beslag är resistenta mot tillgängliga antiepileptiska läkemedel (AED)6. För det andra är AED lika ineffektiva när det gäller att förebygga epileptogenes, och det finns inga effektiva alternativa terapeutiska metoder. För att ta itu med detta underskott och hitta bättre terapeutiska mål och kandidater för behandling, kommer det att bli nödvändigt att utforska nya cellulära och molekylära mekanismer vid roten av PTE6.
En av de framträdande dragen i posttraumatisk epilepsi är den latenta perioden mellan den första traumatiska händelsen och uppkomsten av spontana, oprovocerade, återkommande anfall. De händelser som inträffar inom detta tidsmässiga fönster är ett naturligt fokus för forskare, eftersom detta tidsfönster kan möjliggöra behandling och förebyggande av PTE helt och hållet. Djurmodeller används oftast för denna forskning eftersom de erbjuder flera olika fördelar, inte minst är att kontinuerlig övervakning av mänskliga patienter skulle vara både opraktisk och kostsam under så potentiellt lång tid. Dessutom kan cellulära och molekylära mekanismer vid roten av epileptogenes endast utforskas i djurmodeller.
Djurmodeller med spontana posttraumatiska anfall och epilepsi föredras framför modeller där anfall induceras efter TBI med mindre fysiologiskt relevanta medel, såsom genom chemoconvulans eller elektrisk stimulering akut, kroniskt eller genom tändsticka. Spontana posttraumatiska beslag modeller testa hur TBI ändrar friska hjärnan nätverk som leder till epileptogenes. Studier med ytterligare stimulering efter TBI bedöma hur exponering för TBI minskar krampanfall tröskel och påverkar mottaglighet för anfall. Fördelarna med djurmodeller med anfall som orsakas kemiskt eller med elektrisk stimulering är att testa de specifika mekanismerna för brytning till AEDs och effekten av befintliga och nya AEDs. Men graden av relevans och översättning av dessa uppgifter för människor kan vara tvetydig7 på grund av följande: 1) beslagmekanismer kan skilja sig från dem som orsakas av TBI ensam; 2) inte alla dessa modeller leder till spontana anfall7; 3) skador som skapats av konvulsant ansmedlet själv, med kanylen som krävs för dess leverans, eller genom att stimulera elektrodplacering i djupstrukturer (t.ex. hippocampus eller amygdala) kan redan orsaka ökad krampanfall och även hippocampus epileptiform fältpotentialer7. Dessutom producerar vissa konvulsiva medel (dvs. kainsyra) direkta hippocampus lesioner och skleros, vilket inte är typiskt efter diffust TBI.
Fram till nyligen fanns endast två djurmodeller av posttraumatisk epilepsi: kontrollerad när som påverkas (CCI, focal) eller vätskeslagverkskada (FPI, fokal och diffus)8. Båda modellerna resulterar i stora fokalskador vid sidan av vävnadsförlust, blödning och gliosis hos gnagare8. Dessa modeller efterliknar posttraumatisk epilepsi framkallas av stora focal organskador. En färsk studie visade att upprepade (3x) diffusa TBI är tillräcklig för utveckling av spontana anfall och epilepsi hos möss även i avsaknad av fokal skador9, lägga till en tredje gnagare PTE modell med bekräftade spontana återkommande anfall. Denna nya modell härmar cellulära och molekylära förändringar som orsakas av diffusa TBI, bättre representerar den mänskliga befolkningen med milda, hjärnskakning TBI. I denna modell, den latenta perioden på tre veckor eller mer före beslag debut och uppkomsten av sena, spontana, återkommande beslag gör det möjligt att undersöka de grundläggande orsakerna till posttraumatisk epileptogenes, testa effekten av förebyggande metoder och nya terapeutiska kandidater efter beslag debut, och har potential för utveckling av biomarkörer av posttraumatisk epileptogenes eftersom ungefär hälften av djuren utvecklar posttraumatisk epilepsi.
Valet av djurmodell för studier av posttraumatisk epilepsi beror på den vetenskapliga frågan, vilken typ av hjärnskada som undersökts och vilka verktyg som kommer att användas för att bestämma de underliggande cellulära och molekylära mekanismerna. I slutändan måste alla modeller av posttraumatisk epilepsi visa både uppkomsten av spontana anfall efter TBI och en inledande latensperiod i en delmängd av TBI djur, eftersom inte alla patienter som ådrar sig en TBI fortsätta att utveckla epilepsi. För att göra detta används elektroencefalografi (EEG) med samtidig videoanskaffning i detta protokoll. Att förstå de tekniska aspekterna bakom dataanskaffningsmaskinvara och metoder är avgörande för korrekt datatolkning. De kritiska maskinvaruaspekterna omfattar typen av inspelningssystem, typ av elektroder (skruv- eller trådkabel) och material som de är tillverkade av synkroniserade videoförvärv (som en del av EEG-systemet eller tredje parten) och egenskaperna hos datorsystemet. Det är absolut nödvändigt att fastställa lämpliga anskaffningsparametrar i alla typer av system beroende på studiemål, EEG-händelser av intresse, ytterligare analysmetod och hållbarhet för datalagring. Slutligen måste metoden för elektrodkonfiguration (montage) beaktas, eftersom var och en har fördelar och nackdelar och kommer att påverka datatolkningen.
Detta protokoll beskriver hur man använder den modifierade Marmarou viktdroppmodell10,11 för att inducera diffus skada som resulterar i spontana, oprovocerade, återkommande anfall hos möss, beskriver kirurgiska metoder för att förvärva en enda- och flerkanalskontinuerlig, och synkroniserad video EEG med monopol, bipolär, eller blandade montage.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförfaranden som beskrivs i detta protokoll utfördes i enlighet med institutional animal care and use committee (IACUC) i Virginia Tech och i enlighet med National Institutes of Health's "Guide for the Care and Use of Laboratory Animals" .
1. Protokoll om djurhantering
OBS: Detta protokoll är avsett att vänja djur som beställts från en leverantör till anläggningen efter ankomsten och att villkora dem att hanteras av experimentören. Detta förbättrar djurens välbefinnande genom att minska stress och ångest och förenklar vissa förfaranden som kräver hantering av djur, inklusive förmå TBI, postoperativ övervakning, och ansluta djuret till förvärvssystemet.
- När många djur tas emot från säljaren, öronmärka och slumpmässigt tilldela dem till en experimentell grupp (TBI) eller kontrollgrupp (simulera kirurgi) samtidigt kombinera dem i burar på 2−5 djur. Hus TBI djur separat från skendjur eftersom sham möss ibland agera aggressivt mot möss som genomgick TBI.
- Hantering dag 1 (24−48 h efter öronmärkning): Förbered ett diagram för loggning av djuröronmärken, födelsedatum, datum för hantering, djurvikt på hanteringsdagarna, varaktigheten av hanteringen och ett avsnitt för kommentarer och observationer.
- Blanda försiktigt djuret med båda händerna. Ta inte djuret i svansen eftersom det inducerar försvarsmekanismer och en stressrespons.
- Kontrollera och spela in djurets öronmärke.
- Placera djuret i behållaren på viktskalan och registrera vikten.
- Blanda försiktigt djuret med båda händerna igen och hantera det i 1 min, så att den kan röra sig och utforska i händerna. Utför detta över en bänk i procedurrummet och var noga med att inte släppa djuret på golvet.
- Efter 1 min hantering, placera djuret tillbaka i sin bur.
- Upprepa steg 1,3−1,7 för de andra djuren i buren.
- Hanteringsdag 2 (följande dag): Upprepa steg 1.2−1.5.
- Blanda försiktigt djuret med båda händerna igen och hantera det i 2 min, så att den kan röra sig och utforska i händerna. Utför detta över en bänk i procedurrummet och var noga med att inte släppa djuret på golvet.
- Efter 2 min hantering, placera djuret tillbaka i sin bur.
- Upprepa steg 1.10−1.11 för de andra djuren i buren.
- Hanteringsdag 3 (följande dag): Upprepa steg 1.2−1.5.
- Blanda försiktigt djuret med båda händerna igen och hantera det i 4 min, så att den kan röra sig och utforska i händerna. Utför detta över en bänk i procedurrummet och var noga med att inte släppa djuret på golvet.
- Efter 4 min hantering, placera djuret tillbaka i sin bur.
- Upprepa steg 1.14−1.15 för de andra djuren i buren.
- Hanteringsdag 4 (kontrolldag, 1 vecka från hanteringsdag 1): Upprepa steg 1.2−1.5.
- Blanda försiktigt djuret med båda händerna igen och hantera det i 4 min, så att den kan röra sig och utforska i händerna. Utför detta över en bänk i procedurrummet och var noga med att inte släppa djuret på golvet.
- Efter 4 min hantering, placera djuret tillbaka i sin bur.
- Upprepa steg 1.18-1.19 för de andra djuren i buren.
Obs: Kontrollhanteringsdagen testar bevarandet av det lugna beteendet efter ett tre dagars hanteringsprotokoll.
2. Förfarande för viktminskning
- Placera musen i en induktionskammare. Ställ in flödet av syre och vakuum både till 1 L/min och nivån av isoflurangas till 3%−5%. Bedövning musen i 5 min.
- Ta bort musen från induktionskammaren och placera den på en skumdyna. Test för avsaknad av svar på en tå eller svans nypa.
- Administrera en smärtstillande (0,1 mg/kg buprenorfin) subkutant. Om EEG-operationen utförs samma dag, administrera buprenorfin subkutant i kombination med icke-steroida antiinflammatoriska karprofen (5 mg/kg).
- Administrera natriumlaktatlösningen (3 μL per gram av djurets vikt) subkutant före eller efter den sista kollisionen. Natriumlaktatlösningen kan blandas med analgetikaför snabb administrering i en enda injektion.
OBS: Natriumlaktatlösningen innehåller en blandning av natriumklorid, kaliumklorid, kalciumklorid och natriumlaktat i vatten. Detta steg hjälper till att ersätta vätskor och elektrolyter, medhjälp återhämtning. - Placera musens huvud under viktdroppröret(figur 1A)och placera en platt rostfri skiva (1,3 cm diameter, 1 mm tjock och 880 mg vikt) i mitten av huvudet, mellan linjen i ögon och öron.
OBS: Denna skiva sprider effekten över skallens yta(figur 1B). - Ta bort stiftet i viktdroppröret för att frigöra 100 g viktstången från en höjd av 50 cm. För att framkalla skenskadan för kontrollmössen, ta bort viktstången från röret för att förhindra oavsiktlig frisättning av stiftet och viktfallet.
OBS: Djurets huvud måste placeras platt, så att staven fritt faller på hela skivans yta. - Placera det medvetslösa djuret på ryggen för återhämtning på en värmedyna täckt med en steril polyfodrad absorberande handduk. Den righting reflex återhämtningstid (dvs. den tid det tar musen att rätt sig från ryggen) kan mätas som en avläsning för den tid som tillbringas medvetslös.
- När djuret återfår medvetandet, placera den i en ren bur som har värmts på en värmedyna, med återhämtninggel och några fuktade chow bitar för att återhämta sig i 45 min. Se till att det finns tillräckligt med skräp så att buren inte blir överhettad. Överhettning djuret kan visa sig vara lika stor ett hinder för återhämtning som tillåter musen att bli för kallt.
- Efter 45 min, upprepa steg 2.1−2.8 två gånger, utelämna steg 2.3 (dvs. administrering av smärtstillande medel och antiinflammatoriska läkemedel).
- Låt djuren återhämta sig i 1−2 h om EEG-elektrodimplantationskirurgi utförs samma dag.
3. Kirurgiskfältberedning för implantation av EEG-elektroder
OBS: Autoklav kirurgiska verktyg och skruvar före operation. Rengör operationshandskarna genom att spruta och gnugga med 70% etanol före och efter att ha vidrört djuret, icke-sterila material, och mellan hantering av djuren. Sterilisera de kirurgiska verktygen i 2−3 min i binadsterilisator (se Materialsbord)mellan djur. Byt steril drapering innan du placerar ett nytt djur i stereotaktiskapparaten. Se till att operationsfältet innehåller alla nödvändiga komponenter för operationen (figur 2). Avsaknaden av ett invasivt kirurgiskt ingrepp för att inducera TBI i denna modell har flera fördelar: 1) implantation av elektroderna är flexibel och kan utföras på samma dag som TBI eller efter en definierad tidsperiod; 2) djurets återhämtningstid är snabbare; 3) kraniet förblir intakt, vilket möjliggör mer yta och flexibilitet för implantering elektroder.
- Bedövning musen i 3%−5% isoflurangas i en induktionskammare i 5 min.
- Överför musen från induktionskammaren till stereotaktiska apparaten och placera den på en steril drapering på en värmedyna med isoflurangas och vakuumrör anslutna till noskonen.
- Håll kroppstemperaturen vid 37 °C under operationens gång. Placera temperatursensorn så att den får kontakt med musens bröst eller bukvägg.
- Fixa djurets huvud på plats med hjälp av öronstängerna.
- Håll anestesin på 1,5%−3,5% isofluran eller vid ~60 andetag/min i operationsplanet (utan svar på tå eller svans nypa).
- Applicera en ögonsalva på djurets ögon för att hålla dem smorda under hela operationen.
- Administrera en blandning av smärtstillande medel (0,1 mg/kg buprenorfin) och det icke-steroida antiinflammatoriska läkemedlet (5 mg/kg karprofen) i en enda injektion subkutant om inte TBI utfördes tidigare under dagen, i vilket fall djuret redan fått smärtstillande medel och antiinflammatoriska medel.
OBS: Buprenorfin ska administreras igen om tiden mellan den första TBI och EEG-placeringsoperationen överstiger 8 h eller om djuret visar tecken på smärta 8 h efter den första administreringen, men den ska ges utan tillsats av karprofen. - Administrera natriumlaktatlösning (3 μL per gram av djurets vikt) subkutant för att ersätta vätskor och elektrolyter i djuret.
OBS: Om kirurgi utförs omedelbart efter TBI, måste detta steg tidstidas ordentligt. Natriumlaktatlösning ska administreras varannan gång djuret genomgår förfarandena och en gång efter operationen, 2 timmar från föregående injektion. - Ta bort håret från hårbotten med hjälp av en hårborttagningskräm.
- Innan snittet gör snittet desinficerar du hårbottens hud med povidone-jod kirurgisk antiseptisk lösning och 70% etanol i alternerande svabbprover med sterila gasvävkuddar i en cirkulär rörelse 3x (20 s per lösning varje gång).
- Med hjälp av en skalpell, gör en rostral-caudal snitt på hårbotten mittlinjen från strax ovanför ögonen till baksidan av huvudet. Denna metod för hårbotten öppning är att föredra framför att skära hårbotten av, som huden klaffar kan förseglas över eller runt EEG-locket ger mer stabilitet.
OBS: När du förbereder skallen för implantation av 3-EEG huvudfästet, skär hårbotten av krävs, eftersom storleken på huvudfästet inte kommer att möjliggöra stängning av huden klaffar över huvudfästet. - Utöka snittetgenom att applicera små hemostatpå de öppnade hudgränserna. Om någon blödning inträffar efter snittet, rengör med steril bomullsgasbinda eller svabb.
- Ta försiktigt bort periosteum (dvs. det tunna membranet över kranialbenet) med ett skalpellblad. Om någon blödning inträffar under detta steg, tryck på blödningsstället med en steril bomullspinne tills den stannar.
- Använd sterila bomullspinnar för att rengöra kraniet med väteperoxid, men undvik att vidröra mjukvävnaden kring det exponerade kranialområdet. Upprepa detta steg tills kraniet rengörs från någon mjukvävnad och har ett vitaktigt utseende.
- Torka kraniet med steril gasväv eller bomullspinne.
OBS: Steg 3.12−3.15 är viktiga för korrekt fixering av elektroderna och tandcementen. Alla mjukdelar, icke-kauteriserade blödningar och skräp kan orsaka infektion, instabil headmount fixering, förvrängd eller frånvarande signal, och förlust av implantatet inom flera dagar eller veckor efter operationen.
4. Elektrodplacering
- Implantera den enda EEG (1EEG) kanal huvudfäste.
OBS: Förkortningar i stereotaktiska koordinater representerar rumsliga relationer och anger avståndet i millimeter av målet från brasiet vid en given orientering på djurets huvud: främre bakre (AP) och medial-lateral (ML). Dorsala-ventral är inte tillämplig i detta protokoll eftersom alla elektroder placeras i epidural utrymme snarare än i en viss struktur i hjärnan (Bild 3). Vin+ är en aktiv elektrod och Vin- är dess referenselektrod.- Använd en höghastighetsborr med en stålbit (0,5 mm, rund, 1/4 tum) vid ~5 000−6 000 rundor per min (rpm) för att skapa sex grader (tre för stabilitetsskruvar och tre för elektroder) med hjälp av de angivna stereotaktiska koordinaterna12. För de två främre skruvarna: AP = +1,5 mm, ML = ±1,5 mm; För en bakre skruv: AP = -5,2 mm, ML = -1,5 mm; För markelektroden: AP = -5,2 mm, ML = +1,5 mm; för inspelningselektroderna: AP = -2,3 mm, ML = ±2,7 mm, med Vin+ till höger och Vin- till vänster.
- Tillsätt tre skruvar för ökad stabilitet i huvudet scenen. Vrid skruvarna 1−1,5 x var och en med hjälp av en skruvmejsel som ska fästas stabilt i kraniet.
OBS: Placera skruvarna djupare kommer att skada hjärnan. - För in 1EEG-huvudfästet i en stereotaktisk hållare arm och placera huvudfästet så att de tre elektroderna är placerade längs kranial midline. I denna konfiguration är markelektroden och dess respektive öppning ovanpå huvudfästet i ryggen, Vin+ elektroden i mitten och Vinelektroden fram. Ett märke kan göras på huvudfästet med en permanent markör.
- Böj varje elektrod 90° så att änden av varje tråd böjs nedåt och placeras ovanför motsvarande graderingshål. Mät sedan ut 1 mm längd på den del av tråden som nu är vinkelrätt mot burrhålet och trimma bort överskottet(figur 3). Detta kommer att säkerställa epidural placering av elektroderna. Elektroderna ska knappt vidröra duramaterytan.
- Sänk huvudfästet och justera alla tre elektroderna för att matcha respektive graderhål. För epiduralinspelning måste elektroderna placeras ovanför eller knappt vidröra duramatern.
- Förbered tandcement för applicering genom att blanda en 1/2 skopa pulver med flera droppar lösningsmedel. Använd en blandning spatel och rör om tills den slutliga blandningen är kitt-liknande, klibbig men formbara, och stel nog att vara ordentligt kondenserad när de placeras på djurets kranium.
- Applicera tandcementblandning som täcker alla skruvar och elektroder och vänta ~3−5 min för att den ska stelna. Se till att inte täcka plastpiedestalen med tandcement, eftersom det kommer att göra det omöjligt att ansluta djuret till komutatorn med en tjuder.
- Släpp hemostaterna som håller i hudklaffarna och stäng snittet genom att ansluta hudklaffarna runt plastpiedestalen. Applicera flera droppar vävnadslim (se Materialbord)för att täta hudklaffarna.
- Applicera klorhexidin antiseptisk på området runt implantatet för att undvika infektion. Om djuret är under anestesi längre än 2 h efter den tidigare injektionen av natriumlaktatlösning, som ges under TBI-induktionen, administrera en annan injektion subkutant. För att upprätthålla korrekt återfuktning av djuret, upprepa injektionen varannan h som djuret tillbringar under anestesi.
- Efter operationen, ge en slutlig injektion av natrium laktatlösning 2 h efter föregående injektion. Om operationen är mindre än 2 h lång, administrera den slutliga återhämtningsdosen av natriumlaktatlösningen 2 h från den första injektionen.
- Ta bort djuret från stereotaktiska apparaten och mät djurets vikt efter EEG-operationen som referens för framtida övervakning. På grund av implantatet kommer djurets vikt att vara större än före operationen.
- Placera djuret i en ren bur på en varm värmeplatta för återhämtning.
- Implantera de två EEG och en EMG (2EEG/1EMG) kanaler headmount.
- Använd braskant som ett landmärke för placering av huvudfästet. Applicera en liten mängd vävnadslim (se Materialtabell)på undersidan av huvudfästet 2EEG/1EMG, undvika de fyra skruvhålen och placera huvudfästet 2EEG/1EMG på kraniets yta.
OBS: Det finns inga specifika koordinater för placering av detta huvudfäste. Huvudfästet är 8 mm långt och 5 mm brett, som täcker större delen av kranialytan. Att placera huvudfästet med framkanten 3,0 mm främre till brasiet är optimalt och ger god signalkvalitet. Snabb manuell placering är nödvändig innan droppen av vävnadlimbotemedel. Låt ca 5 min för vävnadlim att bota helt. - Använd en steril 23 G nål för att skapa pilothål för skruvarna genom de fyra öppningarna i huvudfästet. För att åstadkomma detta, tryck försiktigt nålen och rotera långsamt tills spetsen på nålen tränger in i skallen utan att skada hjärnan. Ta bort eventuell blödning från pilothålen med hjälp av en steril bomullspinne.
- Sätt i 0,10 i skruvar i pilothålen och rotera dem tills var och en är fast i skallen. Detta kan vara upp till hälften av skruvlängd, men inte hela längden, eftersom detta skulle skada dura mater och cortex. Om huvudfästet är placerat så att det finns ett mellanrum mellan skallytan och den bakre änden av huvudfästet använd två 0,12 i skruvar i den bakre delen.
- Gör liten öppning på sidorna av tvåkomponentens epoxi (silverepoxi) tvåpackpåse. Ta en dubbelsidig spatel och använd varje sida för att ösa en liten och lika stor mängd av varje komponent från påsen och blanda ihop dem. Använd endast en liten mängd som är tillräcklig för en enda operation, eftersom blandningen stelnar inom 20 min. Försegla sidorna av påsen för att förhindra torkning.
OBS: Silver-epoxi möjliggör korrekt elektrisk kontakt mellan skruven och huvudfästet och förbättrar stabiliteten i skruvarna. - Applicera en liten mängd av denna blandning mellan skruvhuvud och skruvhål, dra sedan åt varje skruv tills dess huvud vilar på basen av implantatet. Se till att ingen silver-epoxi gör kontakt mellan de två skruvarna eftersom varje skruv fungerar som en individuell elektrod och, för att säkerställa en korrekt signal, bör det inte komma i kontakt med den andra skruven.
- Om silver-epoxi blandningen var felplacerad, det finns några andra gången fönster för att noggrant ösa ut överskottet för att separera anslutningen. Böj försiktigt båda EMG leder från den bakre kanten av huvudfästet för att följa konturerna av djurets huvud och hals, och sedan förindem i nuchal musklerna.
- Förbered tandcement för applicering genom att blanda en 1/2 skopa pulver med flera droppar lösningsmedel. Använd en blandning spatel och rör om tills den slutliga blandningen är kitt-liknande, klibbig men formbara, och stel nog att vara ordentligt kondenserad när de placeras på djurets kranium.
- Applicera tandcementblandning som täcker hela huvudfästet samtidigt som du undviker att täcka de sex stifthålen, eftersom detta gör det omöjligt att ansluta förförstärkaren. Vänta ~3−5 min på att cementen ska stelna. Se till att huden inte är förseglad till huvudfästet med tandcement.
- Släpp hemostaterna som håller i hudklaffarna och stäng snittet genom att ansluta hudklaffarna runt plastpiedestalen. Applicera flera droppar vävnadslim för att täta hudklaffarna.
OBS: Om huden snittet gjordes längre för att möjliggöra uträtning av EMG trådledningar, kan huden förseglas med vävnad lim eller sutured. Tätning huden med vävnad lim är oftast tillräckligt. Om det vid postoperativ övervakning rekommenderas dock i stället att snittet suppförs. - Applicera klorhexidin antiseptisk på området runt implantatet för att undvika infektion. Administrera natriumlaktatlösning (3 μL per gram av djurets vikt) subkutant för att ersätta vätskor och elektrolyter om djuret är under anestesi längre än 2 h efter föregående injektion.
- Ta bort djuret från stereotaktiska apparaten och mät djurets vikt efter EEG-operationen som referens för framtida övervakning. På grund av implantatet kommer djurets vikt att vara större än före operationen.
- Placera djuret i en ren bur på en varm värmeplatta, med återhämtninggel och några fuktade chow bitar för återhämtning.
- Använd braskant som ett landmärke för placering av huvudfästet. Applicera en liten mängd vävnadslim (se Materialtabell)på undersidan av huvudfästet 2EEG/1EMG, undvika de fyra skruvhålen och placera huvudfästet 2EEG/1EMG på kraniets yta.
- Implantera en tre EEG-kanaler (3EEG) huvudfäste.
- Använd höghastighetsborr med en stålbit (0,5 mm, rund, 1/4) vid ~5 000−6 000 varv/min för att skapa sex grader (tre för stabilitetsskruvar och tre för elektroder) med hjälp av de angivna stereotaktiska koordinaterna12. För grund- och gemensam referens för EEG1 och EEG2: AP = 5,2 mm, ML = ±1,5 mm; För EEG1 och EEG2: AP = -3,0 mm, ML = ±3,0 mm; för oberoende EEG3: AP =-1,4 mm, ML = ±1,5 mm.
- Placera de sex skruvelektroderna i graderhålen.
OBS: Placera skruvarna djupare kommer att skapa betydande skador på hjärnan. Skruvelektroder ger bättre stabilitet i huvudfästet. - Förbered tandcement för applicering genom att blanda en 1/2 skopa pulver med flera droppar lösningsmedel. Använd en blandning spatel och rör om tills den slutliga blandningen är kitt-liknande, klibbig men formbara, och stel nog att vara ordentligt kondenserad när de placeras på djurets kranium.
- Applicera tandcementblandning som täcker kraniets hela exponerade yta och varje skruvelektrod. Se till att huden inte är förseglad till huvudfästet med tandcement. Vänta ~1−2 min på att cementen ska stelna lindrigt. Det finns ingen anledning att vänta tills fullständig stelhet innan du går vidare till nästa steg.
- Slå på lödjärnet för att värma upp det. Placera 3EEG-huvudfästet i en stereotaktisk hållare arm.
OBS: Placera huvudfästet så att de sex ledningarna matchar placeringen av trådledningarna för varje skruvelektrod. - Sänk huvudfästet så att dess ventrala del vilar ovanpå tandcementen.
- Vrid tråden i varje ledning från var och en av skruvelektroderna med motsvarande trådledning på huvudfästet.
Obs: Vrida fel trådledningar kommer att göra datatolkning komplicerat eller omöjligt. - Trimma försiktigt bort överflödig tråd med sax. Löd varje vriden par tråd för korrekt signalledning.
OBS: Varje par av ledningar måste ta kontakt med ett annat par, annars signalkvalitet och datatolkning äventyras. - Böj varje löddpar trådledningar runt huvudfästet och undvik kontakt mellan varje par.
OBS: Om trådledningarna inte trimmas tillräckligt kort kan det vara svårt att böja dem runt huvudfästet utan att röra vid en annan tråd. I detta fall böj ett par först, täck det med tandcement blandning, vänta ~ 1−2 min att stelna, fortsätt sedan med nästa par på samma sätt. - Avsluta täcker alla tråd med tandcement lämnar endast den svarta delen av huvudfästet exponeras.
OBS: Var noga med att inte applicera något tandcementpulver eller blandning på toppen av den exponerade delen av huvudfästet som skräp eller cement i hålen kommer att blockera kontakten och kommer att leda till antingen signalfrånvaro eller buller. - Släpp hemostaterna som håller i hudklaffarna. Applicera klorhexidin antiseptisk på området runt implantatet för att undvika infektion.
- Administrera natriumlaktatlösning (3 μL per gram av djurets vikt) subkutant för att ersätta vätskor och elektrolyter om djuret har varit under anestesi längre än 2 timmar efter den tidigare injektionen.
- Ta bort djuret från stereotaktiska apparaten och mät djurets vikt efter EEG-operationen som referens för framtida övervakning. På grund av implantatet kommer djurets vikt att vara större än före operationen.
- Placera djuret i en ren bur på en varm värmeplatta, med återhämtninggel och några fuktade chow bitar för återhämtning.
Obs: Väteperoxid stöd för att ta bort eventuella återstående mjukdelar från kraniet.
5. Ansluta djur till förvärvssystemet
- Kopp djuret med båda händerna för att ta bort den från förvärvburen och överföra den till ett rent område med en plan yta, som en Djuröverföringsstation (ATS).
- Ta försiktigt tag i musen vid huden på ryggen. Ta inte djuret i svansen, eftersom detta orsakar ångest.
- Identifiera öppningen i EEG-huvudfästet som motsvarar markelektroden och matcha respektive stift på tjuder för korrekt anslutning.
OBS: Omvänd anslutning av tjuder från komutatorn till djurhuvudfästet kommer att resultera i en annan avläsning från elektroderna och potentiellt förvrängda vågformer. - Återlämna djuret till förvärvsburen och anslut den andra änden av tjuder (EEG-system 1) eller förförstärkare (EEG-system 2) till komutatorn.
OBS: När du ansluter förförstärkaren (EEG System 2) till tjuder från komutatorn, matcha de vita märkena på ändarna av båda tjuder. Omvänd anslutning kommer att resultera i permanenta skador på förstärkaren och kräver reparationer av tillverkaren, som är dyra. - Rotera försiktigt tjuder som förbinder djuret med komutatorn för att säkerställa att mekanismen fungerar som den ska och djuret kan röra sig fritt.
6. EEG-inställningar för datainsamling
- Ange anskaffningsparametrar för EEG System 1.
- Ange samplingsfrekvens till 500 Hz; få 5 000; läge Norm 35 Hz; LPN av. Ställ in högpasserfilter till 0,5 Hz.
OBS: 100 Hz (låg pass) är inbyggd och kräver inte manuell ingång.
- Ange samplingsfrekvens till 500 Hz; få 5 000; läge Norm 35 Hz; LPN av. Ställ in högpasserfilter till 0,5 Hz.
- Ange anskaffningsparametrar för EEG System 2.
- Ange samplingsfrekvens till 600 Hz; preamp vinst 100; vinst 1 (EEG1,2). Ställ in lågpassfilter till 100 Hz.
1 Hz (hög pass) är inbyggt och kräver ingen manuell ingång.
- Ange samplingsfrekvens till 600 Hz; preamp vinst 100; vinst 1 (EEG1,2). Ställ in lågpassfilter till 100 Hz.
7. Inställningar för datainsamling av videodata
- Ange anskaffningsparametrar för EEG System 1.
ETT videoförvärvssystem från tredje part behövs för att erhålla samtidiga videodata.- Ställ in bildrutehastighet mellan 15 (rekommenderas minimum) och 30 (högsta tillgängliga) för lämplig videokvalitet. Ställ in upplösningen på 640 x 640 pixlar. Ange typ av komprimering på H.264H.
- Ange anskaffningsparametrar för EEG System 2.
OBS: Detta EEG-system erbjuder ett videosystem och programvara som synkroniserar video- och EEG-data tillsammans i en enda fil för upp till fyra djur (se Materialtabell).- Ställ in bildrutehastighet mellan 15 (rekommenderas minimum) och 30 (högsta tillgängliga) för lämplig videokvalitet. Ställ in upplösningen på 640 x 480 pixlar. Ange typ av komprimering i WebM-filformatet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollet som beskrivs här beskriver metoden för induktion av en diffus skada i isolering (t.ex. i avsaknad av en brännviddlesion) med hjälp av en musmodell av repetitiv diffus tbi (figur 1). Figur 1A visar viktdroppsanordningen och dess komponenter ( figur1A, a1−a5) som används för induktion av TBI i denna modell och viktiga steg under proceduren(figur 1B, b1−b5).
Egenskaper hos denna modell inkluderar bristen på en fokal lesion till hjärnan som ett resultat av TBI, medvetslöshet, en hög överlevnad, uppkomsten av sena beslag debut (> 1 vecka av TBI), och spontana, oprovocerade, återkommande beslag i en delmängd av TBI möss efter en latensperiod på minst tre veckor efter TBI.
Detta protokoll visar detaljerade förfaranden för att inrätta ett rent kirurgiskt fält(figur 2), ger en steg-för-steg-metod för att implantera olika elektrodmatriser(figur 3), och innehåller en detaljerad guide om hur du använder två olika EEG-förvärvssystem (se materialförteckningen) för att upptäcka anfall(figur 4 och figur 5)i denna modell. Den spektrala kraften hos ett typiskt anfall indikerar högsta densitet i frekvensområdet på 10 till 40 Hz med en topp på 15 Hz (figur 4). Majoriteten av anfallen hos möss är konvulsiva, med en genomsnittlig varaktighet på 12−15 s. Endast en liten del av anfallen är icke-konvulsiv. En grundlig jämförelse av fördelarna och nackdelarna med att använda något av systemen beskrivs i avsnittet Diskussion. Dessutom visar detta protokoll tidsfristerna för beslag insjuknandet hos djur efter upprepad vikt droppe TBI, som visar beslag klustring hos vissa djur(figur 6)som betonar vikten av att förvärva kontinuerliga snarare än intermittenta inspelningar, eftersom detta kommer att säkerställa en korrekt stratifiering av djur som utvecklar spontana anfall efter TBI från dem som inte gör det. Viktigt, detta protokoll diskuterar också fördelarna och nackdelarna med gnagare modeller av PTE och deras förmåga att representera en specifik population av människor efter TBI.
Figur 1: Musmodellen av repetitivdiffust TBI. (A)Viktsläppningsanordning. (a1) Vikt dropprör. (a2) En 100 g viktstång. (a3) Fäst fast att hålla stången. (a4) Sträng för att höja staven upp om du ändrar höjden eller tar bort staven från viktdroppröret. (A5). Skumdyna för att placera djuret under viktdroppröret. (B)Förfarandet för viktminskning. (b1) Den rostfria skivan är placerad i mitten av huvudet mellan linjen av ögon och öron. (b2 och b3) Efter visuell bekräftelse på att djurets huvud är i det platta läget och skumdynan flyttas, placera djurets huvud under viktdroppröret. (b4) Frisättning av stift som håller viktstången, slår mitten av rostfria skivan. (b5) Musen placeras på en steril handduk omedelbart efter påverkan och medvetslöshet bedöms genom att mäta den tid det tar för djuret att återhämta sig och rätt sig själv. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 2: Kirurgiskfältberedning och EEG-elektrodplaceringsschema. Autoklaverade verktyg och nödvändiga material för kirurgi och elektrodimplantation bereds innan bedövning av djuret för att säkerställa tillgängligheten av alla nödvändiga delar. Detta är en steril zon och det är absolut nödvändigt att inte förorena denna zon med icke-sterila material. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 3: Stereotaktiska landmärken och schematisk representation av elektrodplacering med EEG-system 1 och 2. Den övre panelen skildrar metoderna för att implantera de tre olika huvudmounts som beskrivs i detta protokoll. (A)Single EEG-kanal, bipolär montage. (B)Två EEG-kanaler med gemensam referens, bipolär montage och en EMG-kanal. (C)Tre EEG-kanaler med monopolar (kanal 1−2) och bipolär montage (kanal 3). Den nedre panelen visar huvudfästena och skruvarna som implanteras som i den övre panelen. De tre typer av skruvar som används i detta protokoll för två ändamål: som stabilitetsskruvar (EEG-system 1) eller både stabilitet och som elektrod (EEG System 2). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 4: Spontant beslag som förvärvats med EEG-system 1. Den övre panelen visar ett spontant anfall i en mus 23 dagar efter upprepad viktfall TBI med hjälp av data som förvärvats med hjälp av 1EEG huvudfäste. (A)Pre-ictal (pre-beslag) aktivitet. (B)Ictal (beslag) aktivitet. (C)Post-ictal (post-beslag) depression. Nedersta panelen: Effektspektrumdensitetberäknas med hjälp av anpassade skript och programvara (se Materialtabell). Medeleffekt = medeleffekt av effektspektrumet inom epoken (enheter: V2/Hz). Medianfrekvens = frekvens vid vilken 50 % av den totala effekten inom epoken uppnås (enheter: Hz). Medelfrekvens = frekvens vid vilken den genomsnittliga effekten inom epoken uppnås (enheter: Hz). Spektral kant = frekvens under vilken en användarspecificerad procentandel av den totala effekten inom epoken uppnås (enheter: Hz). Toppfrekvens = frekvens vid vilken den maximala effekten uppstår under epoken. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 5: Spontana anfall som förvärvats med EEG System 2. (A)Spontant icke-konvulsivt (elektrografiskt) beslag i en mus 65 dagar efter upprepad viktfall TBI. Data som förvärvats med hjälp av 2EEG/1EMG-huvudfäste. (B)Spontant krampanfall i en mus 97 dagar efter viktfall TBI. Data som förvärvats med hjälp av 3EEG-huvudfäste. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Beslag incidens tidslinje hos möss efter upprepade vikt fall TBI. Det tidigaste anslaget observerades tre veckor efter skada. Vissa djur utvecklar kluster av anfall inom samma dag följt av flera veckor utan anfall. Djur registrerades upp till fyra månader efter TBI. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I motsats till CCI- och FPI-modeller som inducerar antingen fokal eller kombination av fokal och diffus skada, möjliggör modellen av repetitivdiffust TBI som beskrivs i detta protokoll för induktion av diffus skada i avsaknad av brännvidd svaroskada och kräver inte hårbotten eller kranialöppningar och tillhörande inflammation. En extra fördel med frånvaron av traniectomy i denna modell är att det gör det möjligt att inte bara implantera elektroderna för kronisk kontinuerlig EEG-inspelning, men också skapandet av en förtunnad skalle kranial fönster för kronisk in vivo 2-foton avbildning av djuren före, omedelbart efter, och upprepade gånger i dagar, veckor, och även månader efter TBI som beskrivs i Shandra och Robel 201913.
Oavsett vilken djurmodell som väljs är den metod för datainsamling som antagits en avgörande del av en framgångsrik och omfattande studie. I gnagare modeller av posttraumatisk epilepsi frekvensen av anfall är låg14, mellan 0,3−0,4 beslag per dag9,15, och den latenta perioden innan det första anfallet kan pågå var som helst från dagar eller veckor till jämna månader efter det ursprungliga TBI förfarandet. Slutligen, i motsats till icke-traumatiska modeller, som har en generellt högre förekomst av anfall under en kortare tidsperiod, i genomsnitt endast 9%−50% av djur med TBI kommer att få spontana anfall under en period på upp till sex månader8,16. Detta tyder på att meningsfulla studier kräver kontinuerlig långsiktig video-EEG inspelning.
Det övergripande målet för varje djurmodell av TBI är att så nära som möjligt återge de olika formerna av TBI som finns hos mänskliga patienter, för att bättre undersöka de cellulära och molekylära mekanismer som ligger till grund för PTE. Tekniker i detta protokoll kommer att bidra till att underlätta upptäckten av terapeutiska mål, testning av effekt och tolerabilitet av nya förebyggande och terapeutiska kandidater, och utvecklingen av tillförlitliga biomarkörer eller prediktorer för epilepsi efter Tbi.
Potentiella utmaningar under viktminskningsförfarandet
Eftersom huvudet inte är fast i en stereotaktisk ram, måste extra försiktighet iakttas för att säkerställa ett platt läge på huvudet och metallplattan. Om den viktade staven träffar metallplattan eller huvudet i en vinkel eller om vikten glider av till sidan av mushuvudet, kommer skada biomekaniken att skilja sig åt, vilket kan leda till en mildare eller ingen skada. Förr i tiden var metallplattan limmad på skallen för att minimera variabiliteten. Borttagning av metallplattan och lim från musskallen efter viktfall, även om den utförs med försiktighet, inducerad skada på hjärnhinnorna, vilket resulterar i vaskulär skada och efterföljande skador på hjärnvävnaden även hos skendjur. Vidare kräver snittet helande, potentiellt med ett perifert immunsvar, som kan införa variationer. Av dessa skäl valdes det att utelämna limning metallplattan till skallen. Djur kan dö med upprepad (dvs. 3x i detta protokoll) skada. Möss med en kroppsvikt under 25 g kan inte tolerera upprepade effekter. Medan enstaka skador nästan aldrig resultera i dödlighet, upp till 7% av C57BL /6 djur dör efter upprepade effekter9. Motorunderskott kan observeras hos vissa djur. Dessa underskott manifesteras som bakbenpares eller gång avvikelser. Detta är vanligtvis en prognostisk faktor för dålig återhämtning och det rekommenderas att djuret offras. Tecken på smärta eller ångest inkluderar viktminskning, dålig grooming, uttorkning, ökad ångest, låg eller frånvarande undersökande aktivitet (hydrogel / återhämtning, chow och / eller nestlet förblir orörd). Räddningsanalgesi (0,1 mg/kg buprenorfin) kan administreras subkutant var annan var 8 t i tre dagar från TBI för att lindra smärtan och hindra djuret från att nå humana effektmått. Subkutan natriumlaktatlösning (3 μL per gram av djurets vikt) kan administreras två gånger om dagen för återfuktning. Djur återhämtar sig vanligtvis inom tre dagar efter TBI. Användning av en fem steg kroppskondition poäng (BCS) för djurövervakning efter experimentella förfaranden rekommenderas. Etapperna omfattar (1) Utmärglade (skelettstrukturer är extremt framträdande, kotor extremt segmenterade); (2) Underkonditionerat (segmentering av ryggraden är uppenbar, dorsala bäckenben är lätt påtagliga). (3) Välkonditionerad (kotor och ryggbäcken är inte framträdande påtagligmed lätt tryck). (4) Överkonditionerat (ryggraden är en kontinuerlig kolonn, kotor påtaglig endast med fast tryck). (5) Överviktiga (musen är slät och skrymmande, benstruktur försvinner under kött och subkutant fett). Den humana effektpunkten uppnås när BCS är 1−2, 20% eller mer viktminskning i en vuxen mus jämfört med dess pre-TBI vikt, symtom på smärta eller ångest lindras inte av smärtstillande medel, tecken på självstympning, symtom på uttorkning, hypotermi, förekomst av neurologiska underskott (onormal gång eller motorisk pares). Flera möjliga resultat av missbruksadministrering bör beaktas. Buprenorfin injiceras subkutant når den första toppen av sin smärtstillande effekt vid 10 min efter injektion17. Den första effekten inträffar sekunder efter buprenorfin administreras, vilket tyder på att den första mätningen av rättningstiden är osannolikt att påverkas. Detta kan dock inte helt uteslutas som en variabel. Därför uppmanas experimentörer att utöva sin egen bedömning. Om viktdroppen följs av stereotaktisk kirurgi och karprofen administreras är det viktigt att notera att karprofen är ett antiinflammatoriskt medel som kan påverka anfallincidensen, därför uppmanas experimentörer att överväga dess användning noggrant.
Potentiella utmaningar under operationen
Risken för kontaminering eller infektion kommer att sänkas med användning av 70% etanol, men det kommer inte att resultera i sterila förhållanden. Alternativt kan sterila operationshandskar användas. Stereotaktiska apparaten är dock inte steril, så all manuell manipulation kommer att leda till förlust av handskarnas sterila tillstånd. Därför krävs sprutning med 70% etanol efter kontakt med något osterilt material under operationen. Borrning genom kraniet i hjärnan skapar skador på hjärnvävnaden och kan orsaka ymnig blödning. Att skapa burr hål tar extrem försiktighet. Att fästa handborren i stereotaktiskarmen och gradvis sänka den är att föredra framför borrning av hålen samtidigt som borren hålls manuellt. Elektroder och fixeringsskruvar kan sjunka djupare än planerat, skada dura mater (subdural placering) eller cortex (när som är i sig placering). Detta kan orsaka ymnig blödning och en fokal lesion. Experimentören måste undvika överhettning av djuret under operationen. Om temperatursensorn inte är korrekt fast kommer den inte att bibehålla den nödvändiga temperaturen på 37 °C, vilket orsakar överhettning, brännskador och ibland djurets död som följd. Djurets ögon blir torra, irriterade eller skadade under operationen om de inte smörjs så snart djuret placeras i stereotaktiskapparaten.
Postoperativ övervakning
Postoperativ övervakning börjar omedelbart efter ingreppet eller kirurgi avslutas. Observera djuret tills det vaknar upp från anestesi och leta efter närvaro eller frånvaro av eventuella kirurgi-relaterade komplikationer, inklusive blödning eller pares. Om blödning observeras från den ofullständiga snittet stängning, bedövning djuret, rengöra blödningsstället med klorhexidin, utföra sårstängning enligt beskrivningen ovan och återför djuret till återvinning bur. Ungefär 1−2 h efter operationen ska djuret vara helt vaken från anestesi, röra sig fritt i buren utan tecken på pares eller smärta. Djuret kommer att börja grooming själv, vilket är anledningen till att försegla snittet är nödvändigt för att förhindra att djuret från att öppna den under grooming. När djuret har återhämtat sig, överföra den till buren / kammaren som kommer att användas för EEG datainsamling. Detta gör det möjligt för djuret att vänja sig vid den nya miljön. Detta är särskilt viktigt för långsiktig inspelning (månader). Djurburen måste ha en återvinningsgel (se Materialsbord),fuktad chow, en nestlet och en vattenflaska. Detta kommer att möjliggöra ordentlig återhämtning och kommer att ge djuret tillgång till näringsämnen och vatten. Fortsätt att övervaka djuret dagligen. Bedömningen skall omfatta (a) Visuell inspektion av djurets beteende för tecken på smärta eller ångest, inklusive viktminskning, dålig grooming, ökad ångest, låg eller frånvarande undersökande aktivitet (hydrogel/återhämtning, chow och/eller nestlet förblir orörda) och korrekt läkning av snittet området runt EEG implantatet; b) Bedömning av bcs för tecken på uttorkning och undernäring. c) Djurets vikt. Administrera natriumlaktatlösning (3 μL per gram av djurets vikt) subkutant om djuret visar tecken på uttorkning (se Materialtabell). Administrera buprenorfin (0,1 mg/kg) subkutant om djuret visar tecken på smärta eller ångest. Om tecken på smärta kvarstår buprenorfin kan administreras var 8 h. Övervakningen måste ökas till två gånger om dagen om ett djur uppvisar tecken på smärta och/eller ångest. Låt djuret återhämta sig i minst tre dagar efter EEG-operation innan du ansluter till förvärvssystemet via en tjuder. De humana slutpunktskriterierna är desamma som i potentiella utmaningar under förfarandet för viktminskning ovan.
Fördelar och nackdelar med förvärvssystem och huvudmonteringar
Den största fördelen med EEG System 1 med en enda EEG-kanal huvudmontering är den relativt låga kostnaden för hårdvara, komponenter och service. Den enkla och enkla konfigurationen gör det också möjligt för användare att anpassa systemet efter sina önskemål. Varje differentialförstärkare ger en enda EEG-kanal, även om flera differentialförstärkare kan anslutas till varandra, vilket ökar antalet kanaler för varje djur. I detta system användes en enda kanalkonfiguration per djur för att förvärva kroniska eeg-inspelningar på lång sikt med 20 djur samtidigt. Posttraumatiska anfall är vanligtvis generaliserade, och med en bilateral bipolär montage av elektroderna är det lätt att upptäcka denna typ av epileptiform aktivitet. Nackdelen med detta tillvägagångssätt är dock att det är omöjligt att tillförlitligt upptäcka brännvidd, lateralisering, eller förökning av epileptiform aktivitet, eftersom detta skulle kräva flera kanaler. En annan potentiell utmaning kan vara bullerförorening av den enda kanalen över tiden, vilket gör den oförmögen att skaffa användbara data från djuret. Detta kan övervinnas genom att kombinera två eller flera differentialförstärkare, vilket fördubblar antalet kanaler per djur. Slutligen, data som förvärvats från en enda kanal är svårare att skilja från potentiella artefakter, och epileptiform aktivitet stöds bäst av videoinspelningar av djurets beteende. Av denna anledning kombinerade alla inspelningar synkroniserad kontinuerlig videoövervakning med EEG-anskaffning. En begränsning av detta system och dess programvara är att det inte inkluderar videoförvärvssystemet, och därför kräver ett anpassat tredjepartssystem för att förvärva synkron video.
Den största fördelen med EEG System 2 med flerkanaliga huvudband är den höga kvaliteten på signalen på grund av dess förfiltrering av den förvärvade signalen av förförstärkaren (se Table of Materials)innan de skickas genom komutatorn till förstärkaren. Förstärkarei detta system gör det möjligt att förvärva data i tre kanaler i följande konfigurationer: 2 EEG+1 EMG-kanaler eller tre EEG-kanaler (se Materialtabell). Detta möjliggör detektion inte bara av generaliserad aktivitet utan också, potentiellt, fokal epileptiform aktivitet. En annan stor fördel är att detta system har utformats speciellt för djurforskning och därmed erbjuder en videoinspelning system och programvara som kan synkronisera EEG och videokanaler för upp till fyra djur i en enda fil, vilket gör analysen enklare och bekvämare än EEG-systemet 1. Detta system är lätt att använda för förvärv av data för beslag och sömnanalys utan några ändringar i systemet än den typ av huvudmontering som används. Huvudfästet 2EEG/1EMG tillåter implantering av elektroderna endast på fasta platser på grund av kretskortets storlek och konfiguration. Skruvelektroderna med trådledningar i 3EEG-huvudfästen möjliggör flexibilitet i implantationen på önskad plats med möjlighet att göra antingen monopoleller bipolär förvärv beroende på var referenselektroden placeras. Implantering av 3EEG-huvudfästet kräver dock lödning, vilket ger fler steg till operationen och kräver extra försiktighet och precision. De anslutande tjuder och förförstärkare var speciellt utformade för små gnagare som möss och omogna råttor, och är tunna, lågviktkablar som orsakar lite tryck på djurets huvud. En nackdel med systemet är den relativt höga kostnaden för hårdvara, mjukvara, videolicens och komponenter (dvs. förförstärkare och huvudband).
Signifiska och kritiska steg vid eeg-datainsamling
Pendlingsföretaget har en roterande mekanism som gör det möjligt för tjuder att rotera beroende på djurrörelsers riktning. Om denna mekanism misslyckas kommer djurets rörelse att begränsas, vilket kan leda till avlägsnande av EEG-locket. Upprepad operation för att placera nya elektroder kan försökas. Detta kan dock vara utmanande eller omöjligt om avlägsnandet av det tidigare EEG-locket orsakade skador på skallen och hjärnan. Provtagningsfrekvensen för EEG-datainsamling skall vara minst 2−2,5 x den högsta räntefrekvensen. Högre provtagningsfrekvenser leder till högre upplösning av uppgifterna till priset av en ökning av filstorleken, vilket kan bli svårt att lagra och bearbeta när kontinuerliga inspelningar av flera djur förvärvas. Därför är det nödvändigt att optimera samplingsfrekvensen till en nivå som gör det möjligt att erhålla nödvändiga data utan förlust av kvalitet samtidigt minimera filstorlekar.
Signifiska och kritiska steg i datainsamlingsförvärv
Hos gnagare, som hos människor, kan PTE manifestera med en bred variation i tillhörande symptomatologi och elektrografiska korrelerar, vilket gör det nödvändigt att få en samtidig video under EEG-förvärv för att korrekt tolka och klassificera de observerade EEG-händelserna. Tolkning av EEG-data i avsaknad av synkroniserad video är särskilt utmanande när en enda EEG-kanal används. I det här fallet kan det vara svårt att avgöra om EEG vågformen är en artefakt, om inte andra bevis (video) stöder klassificeringen som ett beslag. Rörelseartefakter kan likna det elektrografiska mönstret i anslaget. Därför video med eller utan EMG bekräftelse är ett krav. Även videoinspelning utförs under både ljusa och mörka cykler, kan videokvaliteten inte alltid vara tillfredsställande och tydlig under de mörka timmarna. Dessutom, om djuret vänder sig bort från kameran under ictal-liknande EEG händelse, kan det vara svårt att bedöma dess beteende. I dessa fall kan förvärva en elektromyografi (EMG) signal utöver EEG och video lösa utmaningen genom att ge information om muskelaktivitet under mildare beteendemässiga anfall (med låga motorkomponenter) eller för att bekräfta bristen på djurrörelser under frånvaro-liknande spike-och-slow-wave utsläpp på EEG. De potentiella utmaningarna med EMG-kanalen liknar utmaningarna med EEG-kanalerna, såsom bullerförorening, felaktig placering av elektroder eller elektroderna som lossnar (eller förlorar ytkontakt) under registreringens längre tid. Användningen av video tillsammans med EEG analys har två syften: att bekräfta att en EEG händelse är inte en artefakt som orsakas av djurets rörelse (utforskande beteende, dricka, tugga, repor, stretching, grooming, eller snabb / ansträngd andning) och att skilja mellan konvulsiva och icke-krampanfall. Användning av en modifierad Racine-skala för att karakterisera konvulsiva eller icke-konvulsiva anfall rekommenderas. Etapperna inkluderar (0) Ren elektrografisk beslag utan någon identifierbar motor manifestation; (1) Orofacial automatisms och huvud nickade; 2. Frambensklit, (3) Bilaterala förbensmedel clonus; 4. Frambensklonos och uppfödning. (5) Frambensklonnötter med uppfödning och fallande. Varje videokanal måste tydligt visa hela ytan med djuret i buren, en etikett med ett djuridenifikationsnummer, vattenflaskspets, mat och diet/återvinningsgel. Om du vill säkerställa videoförvärv under de mörka timmarna använder du en infraröd nattkälla. (Vissa kameror har inbyggda enheter eller kan kräva ytterligare delar. Se materialförteckningen). Justera ramen per sekund hastighet och bildupplösning. Den högre bildrutehastigheten och upplösningen kommer till anskaffningsvärde av större filstorlek. De största nackdelarna med att skaffa video under långvariga kroniska kontinuerliga experiment är behovet av att lagra mycket stora mängder data och de tekniska svårigheterna med att behandla de stora filerna. Experimentörens kompetens för att effektivt tolka beteendedata tillsammans med EEG måste också beaktas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av R01 NS105807/NS/NINDS NIH HHS/UNITED STATES och CURE baserat på ett bidragCURE som mottagits från United States Army Medical Research and Materiel Command, Department of Defense (DoD), genom Psychological Health and Traumatic Brain Injury Research Program under Award No. W81XWH-15-2-0069. Ivan Zuidhoek är mycket uppskattad för korrektur läsa manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.10" screw | Pinnacle Technology Inc., KS, USA | 8209 | 0.10 inch long stainless steel |
| 0.10" screw | Pinnacle Technology Inc., KS, USA | 8403 | 0.10 inch long with pre-soldered wire lead |
| 0.12" screw | Pinnacle Technology Inc., KS, USA | 8212 | 0.12 inch long stainless steel |
| 1EEG headmount | Invitro1 (subsidiary of Plastics One), VA, USA | MS333/8-A/SPC | 3 individually Teflon-insulated platinum iridium wire electrodes (twisted or untwisted, 0.005 inch diameter) extending below threaded plastic pedestal |
| 2EEG/1EMG headmount | Pinnacle Technology Inc., KS, USA | 8201 | 2EEG/1EMG channels |
| 3% hydrogen peroxide | Pharmacy | ||
| 3EEG headmount | Pinnacle Technology Inc., KS, USA | 8235-SM-C | custom 6-Pin Connector for 3EEG channels |
| Buprenorphine | Par Pharmaceuticals, Cos. Inc., Spring Valley, NY, USA | 060969 | |
| Buprenorphine | Par Pharmaceuticals, Cos. Inc., Spring Valley, NY, USA | 060969 | |
| C57BL/6 mice | Harlan/Envigo Laboratories Inc | male, 12-16 weeks old | |
| C57BL/6 mice | The Jackson Laboratory | male, 12-16 weeks old | |
| Carprofen | Zoetis Services LLC, Parsippany, NJ, USA | 026357 | NOTE: this drug is added during weight drop only if stereotactic electrode implantation will be performed on the same day |
| Chlorhexidine antiseptic | Pharmacy | ||
| Dental cement and solvent kit | Stoelting Co., USA | 51459 | |
| Drill | Foredom | HP4-917 | |
| Drill bit | Meisinger USA, LLC, USA | HM1-005-HP | 0.5 mm, Round, 1/4, Steel |
| Dry sterilizer | Cellpoint Scientific, USA | Germinator 500 | |
| EEG System 1 | Biopac Systems, CA, USA | ||
| EEG System 2 | Pinnacle Technology Inc., KS, USA | ||
| Ethanol ≥70% | VWR, USA | 71001-652 | KOPTEC USP, Biotechnology Grade (140 Proof) |
| Eye ointment | Pro Labs Ltd, USA | Puralube Vet Ointment Sterile Ocular Lubricant available in general online stores and pharmacies | |
| Fluriso liquid for inhalation anesthesia | MWI Veterinary Supply Co., USA | 502017 | |
| Hair removal product | Church & Dwight Co., Inc., USA | Nair cream | |
| Isoflurane | MWI Veterinary Supply Co., USA | 502017 | |
| Povidone-iodine surgical solution | Purdue Products, USA | 004677 | Betadine |
| Rimadyl/Carprofen | Zoetis Services LLC, Parsippany, NJ, USA | 026357 | |
| Solder | Harware store | ||
| Soldering iron | Weller, USA | WP35 | ST7 tip, 0.8mm |
| Stainless steel disc | Custom made | ||
| Sterile cotton swabs | |||
| Sterile gauze pads | Fisher Scientific, USA | 22362178 | |
| Sterile poly-lined absorbent towels pads | Cardinal Health, USA | 3520 | |
| Tissue adhesive | 3M Animal Care Products, USA | 1469SB |
References
- Christensen, J., et al. Long-term risk of epilepsy after traumatic brain injury in children and young adults: a population-based cohort study. Lancet. 373 (9669), 1105-1110 (2009).
- Lowenstein, D. H. Epilepsy after head injury: an overview. Epilepsia. 50, Suppl 2 4-9 (2009).
- Ferguson, P. L., et al. A population-based study of risk of epilepsy after hospitalization for traumatic brain injury. Epilepsia. 51 (5), 891-898 (2010).
- Abou-Abbass, H., et al. Epidemiology and clinical characteristics of traumatic brain injury in Lebanon: A systematic review. Medicine (Baltimore). 95 (47), 5342 (2016).
- Management of Concussion/mTBI Working Group. VA/DoD Clinical Practice Guideline for Management of Concussion/Mild Traumatic Brain Injury. The Journal of Rehabilitation Research and Development. 46 (6), 1-68 (2009).
- Piccenna, L., Shears, G., O'Brien, T. J. Management of post-traumatic epilepsy: An evidence review over the last 5 years and future directions. Epilepsia Open. 2 (2), 123-144 (2017).
- Loscher, W., Brandt, C. Prevention or modification of epileptogenesis after brain insults: experimental approaches and translational research. Pharmacological Reviews. 62 (4), 668-700 (2010).
- Ostergard, T., Sweet, J., Kusyk, D., Herring, E., Miller, J. Animal models of post-traumatic epilepsy. Journal of Neuroscience Methods. 272, 50-55 (2016).
- Shandra, O., et al. Repetitive Diffuse Mild Traumatic Brain Injury Causes an Atypical Astrocyte Response and Spontaneous Recurrent Seizures. Journal of Neuroscience. 39 (10), 1944-1963 (2019).
- Foda, M. A., Marmarou, A. A new model of diffuse brain injury in rats. Part II: Morphological characterization. Journal of Neurosurgery. 80 (2), 301-313 (1994).
- Marmarou, A., et al. A new model of diffuse brain injury in rats. Part I: Pathophysiology and biomechanics. Journal of Neurosurgery. 80 (2), 291-300 (1994).
- Paxinos, G., Keith, B. J., Franklin, M. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Elsevier Science. (2007).
- Shandra, O., Robel, S. Imaging and Manipulating Astrocyte Function In Vivo in the Context of CNS Injury. Methods in Molecular Biology. 1938, 233-246 (2019).
- Pitkanen, A., Immonen, R. Epilepsy related to traumatic brain injury. Neurotherapeutics. 11 (2), 286-296 (2014).
- Kharatishvili, I., Nissinen, J. P., McIntosh, T. K., Pitkanen, A. A model of posttraumatic epilepsy induced by lateral fluid-percussion brain injury in rats. Neuroscience. 140 (2), 685-697 (2006).
- Pitkanen, A., Bolkvadze, T., Immonen, R. Anti-epileptogenesis in rodent post-traumatic epilepsy models. Neuroscience Letters. 497 (3), 163-171 (2011).
- Gades, N. M., Danneman, P. J., Wixson, S. K., Tolley, E. A. The magnitude and duration of the analgesic effect of morphine, butorphanol, and buprenorphine in rats and mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 39 (2), 8-13 (2000).
