Summary
Denne systematiske protokol beskriver en ny dyremodel af posttraumatisk epilepsi efter gentagne mild traumatisk hjerneskade. Den første del detaljer trin for traumatisk hjerneskade induktion ved hjælp af en modificeret vægttab model. Den anden del indeholder instruktioner om den kirurgiske tilgang til enkelt- og multi-kanal elektroencefalografiske dataindsamlingssystemer.
Abstract
Traumatisk hjerneskade (TBI) er en førende årsag til erhvervet epilepsi. TBI kan resultere i en brændvidde eller diffus hjerneskade. Focal skade er et resultat af direkte mekaniske kræfter, undertiden trænge gennem kraniet, hvilket skaber en direkte læsion i hjernevævet. Disse er synlige under hjernebilleddannelse som områder med kontusion, laceration, og blødning. Brændioner fremkalder neuronal død og glial ardannelse og er til stede i 20%−25% af alle mennesker, der pådrager sig en TBI. I de fleste TBI-tilfælde forårsages der imidlertid skade af accelerationsdecelerationskræfter og efterfølgende vævsklipning, hvilket resulterer i nonfocal, diffus skade. En delpopulation af TBI-patienter fortsætter med at udvikle posttraumatisk epilepsi (PTE) efter en ventetid på måneder eller år. I øjeblikket er det umuligt at forudsige, hvilke patienter der vil udvikle PTE, og anfald hos PTE-patienter udfordrer at kontrollere, hvilket kræver yderligere forskning. Indtil for nylig var feltet begrænset til kun to dyre-/gnaveremodeller med validerede spontane posttraumatiske anfald, der begge præsenterede store fokale læsioner med massive vævstab i cortex og undertiden subkortikale strukturer. I modsætning til disse tilgange blev det fastslået, at diffus TBI induceret ved hjælp af en modificeret vægttabsmodel er tilstrækkelig til at indlede udvikling af spontane krampeanfald og ikke-krampeanfald, selv i mangel af fokale læsioner eller vævstab. Svarende til menneskelige patienter med erhvervet post-traumatisk epilepsi, denne model præsenterer med en latenstid efter skade før beslaglæggelse debut. I denne protokol vil samfundet blive forsynet med en ny model for posttraumatisk epilepsi, der beskriver, hvordan man kan fremkalde diffus ikke-læsional TBI efterfulgt af kontinuerlig langsigtet video-elektroencefalografisk overvågning af dyr i løbet af flere måneder. Denne protokol vil indeholde en detaljeret håndtering af dyr, vægtfaldsproceduren, elektrodeplaceringen for to anskaffelsessystemer og de hyppige udfordringer, der er opstået under hvert af trinene i kirurgi, postoperativ overvågning og dataindsamling.
Introduction
Hvert år påvirker TBI anslået 60 millioner mennesker på verdensplan. Påvirket individer har højere risiko for at udvikle epilepsi, som kan manifestere år efter den første skade. Selv om svær TBI er forbundet med en højere risiko for epilepsi, selv mild TBI øger en persons chance for at udvikle epilepsi1,2,3,4. Alle TBI'er kan klassificeres som fokale, diffuse eller en kombination af begge. Diffus hjerneskade, til stede i mange, hvis ikke alle TBI'er, er et resultat af hjernevæv af forskellige tætheder klipning mod hinanden på grund af acceleration-deceleration og roterende kræfter. Pr. definition forekommer diffus skade kun isoleret i mild/concussive ikke-gennemtrængende hjerneskade, hvor der ikke er synlige hjernelæsioner på computertomografiscanninger5.
Der er i øjeblikket to kritiske problemer i forvaltningen af patienter, der har eller er i risiko for at udvikle posttraumatisk epilepsi (PTE). Den første er, at når PTE har manifesteret, anfald er resistente over for tilgængelige anti-epileptiske lægemidler (AED' er)6. For det andet er AED'er lige så ineffektive til at forebygge epileptogenese, og der findes ingen effektive alternative terapeutiske tilgange. For at afhjælpe dette underskud og finde bedre terapeutiske mål og kandidater til behandling, vil det være nødvendigt at udforske nye cellulære og molekylære mekanismer i roden af PTE6.
Et af de fremtrædende træk ved post-traumatisk epilepsi er den latente periode mellem den oprindelige traumatiske begivenhed og udbrud af spontane, uprovokerede, tilbagevendende anfald. De hændelser, der opstår i dette tidsmæssige vindue er et naturligt fokus for forskere, fordi denne tid vindue kan tillade behandling og forebyggelse af PTE helt. Dyremodeller er mest almindeligt anvendt til denne forskning, fordi de tilbyder flere forskellige fordele, ikke mindst som er, at løbende overvågning af menneskelige patienter ville være både upraktisk og dyrt over sådanne potentielt lange perioder. Derudover kan cellulære og molekylære mekanismer ved roden af epileptogenese kun udforskes i dyremodeller.
Dyremodeller med spontane posttraumatiske anfald og epilepsi foretrækkes frem for modeller, hvor anfald fremkaldes efter TBI med mindre fysiologisk relevante midler, såsom ved chemoconvulsants eller elektrisk stimulation akut, kronisk eller ved optænding. Spontane post-traumatiske beslaglæggelse modeller teste, hvordan TBI ændrer den sunde hjerne netværk, der fører til epileptogenese. Undersøgelser, der anvender yderligere stimulation efter TBI, vurderer, hvordan eksponering for TBI reducerer krampetærsklen og påvirker modtagelighed for anfald. Fordelene ved dyremodeller med anfald, der er induceret kemisk eller med elektrisk stimulation, er ved at teste de specifikke mekanismer for refractoriness til AED'er og effekten af eksisterende og nye AED'er. Men graden af relevans og oversættelse af disse data til mennesker kan være tvetydige 7 på grund af følgende: 1) krampemekanismer kan være forskellig fra dem, der frembringes af TBI alene; 2) ikke alle disse modeller fører til spontane anfald7; 3) læsioner skabt af krampemiddel selv, med kanyle, der kræves for dens levering, eller ved at stimulere elektrode placering i dybden strukturer (f.eks hippocampus eller amygdala) kan allerede forårsage øget beslaglæggelse modtagelighed og endda hippocampal epileptiform felt potentialer7. Desuden producerer nogle krampefulde stoffer (dvs. kainicsyre) direkte hippocampale læsioner og sklerose, hvilket ikke er typisk efter diffus TBI.
Indtil for nylig eksisterede der kun to dyremodeller af posttraumatisk epilepsi: kontrolleret kortikal påvirkning (CCI, fokal) eller væskeslagskade (FPI, fokal og diffus)8. Begge modeller resultere i store fokale læsioner sammen med vævstab, blødning, og gliose hos gnavere8. Disse modeller efterligner posttraumatisk epilepsi induceret af store fokale læsioner. En nylig undersøgelse viste, at gentagne (3x) diffus TBI er tilstrækkelig til udvikling af spontane anfald og epilepsi hos mus, selv i mangel af fokale læsioner9, tilføje en tredje gnaver PTE model med bekræftede spontane tilbagevendende anfald. Denne nye model efterligner cellulære og molekylære ændringer fremkaldt af diffus TBI, bedre repræsenterer den menneskelige befolkning med mild, concussive TBI'er. I denne model, den latente periode på tre uger eller mere før beslaglæggelse debut og fremkomsten af sene, spontane, tilbagevendende anfald giver mulighed for at undersøge de grundlæggende årsager til post-traumatisk epileptogenese, teste effekten af forebyggende tilgange og nye terapeutiske kandidater efter beslaglæggelse debut, og har potentiale for udvikling af biomarkører af post-traumatisk epileptogenese fordi omkring halvdelen af dyrene udvikler post-traumatisk epilepsi.
Valget af dyremodel til undersøgelse af posttraumatisk epilepsi afhænger af det videnskabelige spørgsmål, den type hjerneskade, der undersøges, og hvilke værktøjer der vil blive brugt til at bestemme de underliggende cellulære og molekylære mekanismer. I sidste ende skal enhver model af posttraumatisk epilepsi påvise både fremkomsten af spontane anfald efter TBI og en indledende latenstid i en delmængde af TBI-dyr, fordi ikke alle patienter, der pådrager sig en TBI, fortsætter med at udvikle epilepsi. For at gøre dette, elektroencefalografi (EEG) med samtidig video erhvervelse bruges i denne protokol. Det er afgørende for nøjagtig datafortolkning at forstå de tekniske aspekter bag hardware og tilgange til dataindsamling. De kritiske hardware aspekter omfatter den type optagelse system, type elektroder (skrue eller wire bly) og materiale, de er lavet af, synkroniseret video erhvervelse (som en del af EEG-systemet eller tredjepart), og egenskaber af edb-systemet. Det er bydende nødvendigt at fastsætte de relevante anskaffelsesparametre i enhver type system afhængigt af undersøgelsesmål, EEG-hændelser af interesse, yderligere analysemetode og datalagringens bæredygtighed. Endelig skal metoden til elektrodekonfiguration (montage) overvejes, da de hver især har fordele og ulemper og vil påvirke datafortolkningen.
Denne protokol beskriver, hvordan man bruger den modificerede Marmarou vægttab model10,11 til at fremkalde diffus skade resulterer i spontane, uprovokerede, tilbagevendende anfald i mus, beskriver kirurgiske tilgange til at erhverve en enkelt- og multi-kanal kontinuerlig, og synkroniseret video EEG ved hjælp af monopolar, bipolar, eller blandet montage.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle de dyreprocedurer, der er beskrevet i denne protokol, blev udført i overensstemmelse med Virginia Techs institutionelle komité for dyrepleje og -anvendelse (IACUC) og i overensstemmelse med National Institutes of Healths »Vejledning til pleje og anvendelse af laboratoriedyr« .
1. Protokol om håndtering af dyr
BEMÆRK: Denne protokol har til formål at vænne dyr, der er bestilt fra en leverandør til anlægget efter ankomsten, og at betingelse dem om at blive håndteret af eksperimentatoren. Dette forbedrer dyrenes trivsel ved at reducere stress og angst og forenkler visse procedurer, der kræver håndtering af dyr, herunder at fremkalde TBI, postoperativ overvågning og forbinde dyret med anskaffelsessystemet.
- Når mange dyr modtages fra leverandøren, øremærke og tilfældigt tildele dem til en eksperimentel gruppe (TBI) eller kontrolgruppe (fingeret kirurgi), mens kombinere dem i bure på 2-5 dyr. Hus TBI dyr adskilt fra fingeret dyr, fordi fingeret mus lejlighedsvis handle aggressivt mod mus, der gennemgik TBI.
- Håndteringsdag 1 (24−48 timer efter øremærkning): Forbered et diagram til logføring af dyreøremærker, fødselsdato, håndteringsdatoer, dyrenes vægt på håndteringsdagene, håndteringens varighed og et afsnit til kommentarer og observationer.
- Bæger dyret forsigtigt med begge hænder. Må ikke få fat i dyret ved halen, da det inducerer forsvarsmekanismer og en stress respons.
- Kontroller og optag dyrets øremærke.
- Placer dyret i beholderen på vægtskalaen og registrere vægten.
- Bæger forsigtigt dyret med begge hænder igen og håndtere det i 1 min, så det kan bevæge sig og udforske i hænderne. Udfør dette over en bænk i procedurerummet og pas på ikke at tabe dyret på gulvet.
- Efter 1 min håndtering skal dyret placeres tilbage i buret.
- Gentag trin 1.3−1.7 for de andre dyr i buret.
- Håndtering dag 2 (den følgende dag): Gentag trin 1.2−1.5.
- Bæger forsigtigt dyret med begge hænder igen og håndtere det i 2 min, så det kan bevæge sig og udforske i hænderne. Udfør dette over en bænk i procedurerummet og pas på ikke at tabe dyret på gulvet.
- Efter 2 min håndtering skal dyret placeres tilbage i buret.
- Gentag trin 1.10−1.11 for de andre dyr i buret.
- Håndtering dag 3 (den følgende dag): Gentag trin 1.2−1.5.
- Bæger forsigtigt dyret med begge hænder igen og håndtere det i 4 min, så det kan bevæge sig og udforske i hænderne. Udfør dette over en bænk i procedurerummet og pas på ikke at tabe dyret på gulvet.
- Efter 4 min håndtering skal dyret placeres tilbage i buret.
- Gentag trin 1.14−1.15 for de andre dyr i buret.
- Håndtering dag 4 (kontroldag, 1 uge fra håndteringsdag 1): Gentag trin 1.2−1.5.
- Bæger forsigtigt dyret med begge hænder igen og håndtere det i 4 min, så det kan bevæge sig og udforske i hænderne. Udfør dette over en bænk i procedurerummet og pas på ikke at tabe dyret på gulvet.
- Efter 4 min håndtering skal dyret placeres tilbage i buret.
- Gentag trin 1.18-1.19 for de andre dyr i buret.
BEMÆRK: Kontrolhåndteringsdagen tester fastholdelsen af den rolige adfærd efter en tre dages håndteringsprotokol.
2. Vægttab procedure
- Placer musen i et induktionskammer. Indstil strømmen af ilt og vakuum både til 1 L/min og niveauet af isoflurangas til 3%−5%. Bedøve musen i 5 min.
- Fjern musen fra induktionkammer og læg den på en skum pude. Test for fravær af respons på en tå eller hale knivspids.
- Påfås et smertestillende middel (0,1 mg/kg buprenorphin) subkutant. Hvis EEG kirurgi udføres samme dag, administrere buprenorphin subkutan i kombination med den ikke-steroide anti-inflammatoriske carprofen (5 mg/kg).
- Natriumlaktatopløsningen (3 μL pr. gram af dyrets vægt) subkutanføreller efter den sidste kollision. Natriumlaktatopløsningen kan blandes med analgetika til hurtig administration i en enkelt injektion.
BEMÆRK: Natriumlaktatopløsningen indeholder en blanding af natriumchlorid, kaliumchlorid, calciumchlorid og natriumlaktat i vand. Dette trin hjælper med at erstatte væsker og elektrolytter, medvirken opsving. - Placer hovedet af musen under vægtdråberøret (figur 1A) og anbring en flad skive i rustfrit stål (1,3 cm i diameter, 1 mm tyk og 880 mg vægt) i midten af hovedet, mellem øjen- og ørernes linje.
BEMÆRK: Denne skive spreder sammenstødet på tværs af kraniets overflade (figur 1B). - Fjern stiften i vægtdråberøret for at frigøre vægtstangen på 100 g fra en højde på 50 cm. For at fremkalde den fingerede skade for kontrolmusene skal du fjerne vægtstangen fra røret for at forhindre utilsigtet frigivelse af stiften og vægttab.
BEMÆRK: Dyrets hoved skal placeres fladt, så stangen falder frit på hele skivens overflade. - Placer det ubevidste dyr på ryggen til nyttiggørelse på en varmepude dækket med en steril polylined absorberende håndklæde. Den retterefleksrestitutionstid (dvs. den tid, det tager musen at rette sig fra ryggen) kan måles som en udlæsning for den tid, der bruges bevidstløs.
- Når dyret genvinder bevidstheden, skal du placere det i et rent bur, der er blevet opvarmet på en varmepude, med restitutionsgel og et par fugtede chow stykker til at inddrive i 45 min. Sørg for, at der er tilstrækkeligt kuld, så buret ikke bliver overophedet. Overophedning dyret kan vise sig lige så stor en hindring for nyttiggørelse som at lade musen til at blive for koldt.
- Efter 45 min gentagetrin 2.1−2.8 to gange, udelade trin 2.3 (dvs. administration af analgetika og anti-inflammatoriske lægemidler).
- Lad dyrene komme sig i 1−2 timer, hvis EEG's elektrodeimplantationsoperation udføres samme dag.
3. Kirurgisk feltforberedelse til implantation af EEG-elektroder
BEMÆRK: Autoklav det kirurgiske værktøj og skruer ne før operationen. Rengør de kirurgiske handsker ved at sprøjte og gnide med 70% ethanol før og efter berøring af dyret, ikke-sterile materialer, og i mellem håndtering af dyrene. Steriliser det kirurgiske værktøj i 2−3 min i perlesterilisatoren (se Materialetabel)mellem dyr. Skift den sterile drapere, før du placerer et nyt dyr i stereotaktisk apparatet. Sørg for, at det kirurgiske felt indeholder alle de nødvendige komponenter til operationen (figur 2). Fraværet af en invasiv kirurgisk procedure for at fremkalde TBI i denne model har flere fordele: 1) implantation af elektroderne er fleksibel og kan udføres samme dag som TBI eller efter en bestemt periode; 2) dyrets restitutionstid er hurtigere; 3) kraniet forbliver intakt, hvilket giver mere overfladeareal og fleksibilitet til implantering af elektroder.
- Bedøve musen i 3%−5% isofluran gas i et induktionskammer i 5 min.
- Overfør musen fra induktionskammeret til det stereotaktiske apparat, og læg den på en steril drapere på en varmepude med isoflurangas og vakuumrør, der er forbundet til næsekeglen.
- Kropstemperaturen holdes ved 37 °C i løbet af operationen. Placer temperaturføleren, så den kommer i kontakt med musens bryst- eller bugvæg.
- Fastgør dyrets hoved ved hjælp af ørestængerne.
- Bevar anæstesien ved 1,5%−3,5% isofluran eller ved ~ 60 vejrtrækninger/min i det kirurgiske plan (uden respons på tå eller hale knivspids).
- Påfør en øjensalve på dyrets øjne for at holde dem smurt under hele operationen.
- Administrere en blanding af analgetika (0,1 mg/kg buprenorphin) og det ikke-steroide antiinflammatoriske lægemiddel (5 mg/kg carprofen) i en enkelt injektion subkutant, medmindre TBI blev udført tidligere på dagen, i hvilket tilfælde dyret allerede har modtaget analgetika og anti-inflammatoriske.
BEMÆRK: Buprenorphin bør administreres igen, hvis tiden mellem den første TBI- og EEG-anbringelsesoperation overstiger 8 timer, eller hvis dyret udviser tegn på smerte 8 timer efter den første administration, men det skal gives uden tilsætning af carprofen. - Underkutivt at udskifte væsker og elektrolytter i dyret med natriumlaktat (3 μL pr. gram af dyrets vægt) for at erstatte væsker og elektrolytter i dyret.
BEMÆRK: Hvis operationen udføres umiddelbart efter TBI, skal dette trin tages korrekt tid. Natriumlaktatopløsning bør administreres hver 2 timer, mens dyret gennemgår procedurerne, og en gang efter operationen, 2 timer fra den tidligere injektion. - Fjern håret fra hovedbunden ved hjælp af en hårfjerning creme.
- Før snittet foretages, skal du desinficere hovedbundens hud med povidon-jod kirurgisk antiseptisk opløsning og 70% ethanol i skiftevis podninger med sterile gazepuder i en cirkulær bevægelse 3x (20 s pr. opløsning hver gang).
- Ved hjælp af en skalpel, lave en rostral-caudal snit på hovedbunden midterlinjen fra lige over øjnene til bagsiden af hovedet. Denne metode til hovedbund åbning foretrækkes frem for at skære hovedbunden ud, som hudflapper kan forsegles over eller omkring EEG-cap giver mere stabilitet.
BEMÆRK: Ved forberedelse af kraniet til implantation af 3-EEG headmount, skære hovedbunden af er påkrævet, da størrelsen af headmount ikke vil give mulighed for lukning af hudklapper over headmount. - Udvid indsnitsområdet ved at anvende små hemostater på de åbnede hudgrænser. Hvis der opstår blødning efter snittet, skal du rengøre med en steril bomuldsgaze eller podning.
- Fjern forsigtigt periosteum (dvs. den tynde membran over kranieknoglen) med en skalpelklinge. Hvis der opstår blødning under dette trin, skal du trykke på bløderstedet med en steril vatpind, indtil den stopper.
- Brug sterile vatpinde til at rense kraniet med hydrogenperoxid, men undgå at røre det bløde væv omkring det udsatte kranieområde. Gentag dette trin, indtil kraniet er renset for alle blødt væv og har en hvidlig udseende.
- Tør kraniet med en steril gaze eller vatpind.
BEMÆRK: Trin 3.12−3.15 er vigtige for korrekt fiksering af elektroderne og tandcementen. Ethvert blødt væv, ikke-ætset blødning, og snavs kan forårsage infektion, ustabil headmount fiksering, forvrænget eller fraværende signal, og tab af implantatet inden for flere dage eller uger efter operationen.
4. Placering af elektrode
- Implanter den enkelte EEG (1EEG) kanal headmount.
BEMÆRK: Forkortelser i stereotaktiske koordinater repræsenterer rumlige relationer og angiver afstanden i millimeter af målet fra bregma på en given orientering på dyrets hoved: anterior-posterior (AP) og mediale-lateral (ML). Dorsal-ventral er ikke gældende i denne protokol, fordi alle elektroder er placeret i epidural rummet snarere end i en bestemt struktur i hjernen (Figur 3). Vin+ er en aktiv elektrode, og Vin- er dens referenceelektrode.- Brug en højhastighedsøvelse med en stålbit (0,5 mm, rund, 1/4 i.) ved ~5.000−6.000 runder pr. minut (omdr./min. ) for at skabe seks grathuller (tre til stabilitetsskruer og tre til elektroder) ved hjælp af de medfølgende stereotaktiske koordinater12. For de to teriorskruer: AP = +1,5 mm, ML = ±1,5 mm; for den ene efterfølgende skrue: AP = -5,2 mm, ML = -1,5 mm; for jordelektroden: AP = -5,2 mm, ML = +1,5 mm for optagelseselektroder: AP = -2,3 mm, ML = ±2,7 mm, med Vin+ til højre og Vin - til venstre.
- Tilføj tre skruer for øget stabilitet i hovedfasen. Ved hjælp af en skruetrækker skal du dreje skruerne 1−1,5 x hver for at blive fastgjort stabilt i kraniet.
BEMÆRK: Hvis skruerne placeres dybere, vil det beskadige hjernen. - Sæt 1EEG-hovedbjerget i en stereotaktisk holderarm, og placer hovedmonteringen, så de tre elektroder er placeret langs kraniemidterlinjen. I denne konfiguration jorden elektrode og dens respektive åbning på toppen af headmount er i ryggen, Vin + elektroden i midten, og Vin-elektroden foran. Der kan mærkes på hovedbjerget med en permanent markør.
- Bøj hver elektrode 90°, så enden af hver ledning bøjes nedad og placeres over det tilsvarende grathul. Derefter måles 1 mm længde af den del af ledningen, der nu er vinkelret på grathullet, og beskær det overskydende (figur 3). Dette vil sikre epidural placering af elektroderne. Elektroderne bør næppe røre dura mater overflade.
- Sænk hovedbjerget og juster alle tre elektroder, så de passer til det respektive grathul. Til epiduraloptagelse skal elektroderne placeres over eller knap tikker ved duramateren.
- Forbered dental cement til anvendelse ved at blande en 1 /2 scoop af pulver med flere dråber opløsningsmiddel. Brug en blanding spatel og rør indtil den endelige blanding er kit-lignende, klæbrig, men formbar, og stiv nok til at blive korrekt kondenseret, når de placeres på dyrets kranium.
- Påfør dental cement blanding, der dækker alle skruer og elektroder og vente ~ 3−5 min for at størkne. Sørg for ikke at dække plast piedestal med dental cement, fordi det vil gøre det umuligt at forbinde dyret til pendlerator med en tøjr.
- Slip de hemostater, der holder hudklapperne, og luk snittet ved at forbinde hudklapperne omkring plastpiedestalen. Påfør flere dråber vævsklæbende (se Tabel over materialer)for at forsegle hudklapperne.
- Påfør chlorhexidin antiseptisk på området omkring implantatet for at undgå infektion. Hvis dyret er under bedøvelse i mere end 2 timer efter den tidligere injektion af natriumlaktatopløsning, givet under TBI induktion, gives en anden injektion subkutant. For at opretholde korrekt hydrering af dyret, gentag injektion hver 2 timer, at dyret tilbringer under anæstesi.
- Efter operationen gives en endelig injektion af natriumlaktatopløsning 2 timer efter den foregående injektion. Hvis operationen er mindre end 2 timer lang, skal du administrere den endelige restitutionsdosis af natriumlaktatopløsningen 2 timer fra den første injektion.
- Fjern dyret fra stereotaktisk apparatet, og mål dyrets vægt efter EEG-operationen som reference for fremtidig overvågning. På grund af implantatet vil dyrets vægt være større end før operationen.
- Placer dyret i et rent bur på en varm varmepude til nyttiggørelse.
- Implanter de to EEG- og ene EMG-kanaler (2EEG/1EMG) med hovedmontering.
- Brug bregma som et vartegn for placering af headmount. Påfør en lille mængde vævsklæbende (se Materialetabellen)på den nederste side af 2EEG/1EMG-hovedbjerget, så de fire skruehuller undgås, og 2EEG/1EMG-hovedbjerget placeres på kraniets overflade.
BEMÆRK: Der er ingen specifikke koordinater for placeringen af denne hovedmontering. Hovedholderen er 8 mm lang og 5 mm bred, som dækker det meste af kranieoverfladen. Placering af hovedmonteringen med forkanten på 3,0 mm forreste til bregma er optimal og giver god signalkvalitet. Hurtig manuel placering er nødvendig, før dråbe væv lim kur. Tillad ca 5 min for væv lim til at helbrede helt. - Brug en steril 23 G nål til at skabe pilothuller til skruerne gennem de fire åbninger i hovedbjerget. For at opnå dette, forsigtigt skubbe nålen og langsomt rotere, indtil spidsen af nålen trænger ind i kraniet uden at beskadige hjernen. Fjern blødningfra pilothullerne ved hjælp af en steril vatpind.
- Sæt 0,10 i skruer i pilothullerne, og drej dem, indtil de hver er fastgjort i kraniet. Dette kan være op til halvdelen af skruen længde, men ikke den fulde længde, da dette ville skade dura mater og cortex. Hvis hovedholderen er placeret således, at der er et mellemrum mellem kraniets overflade og bagenden af hovedbjerget, skal du bruge to 0,12 i skruer i den bageste del.
- Lav lille åbning på siderne af den to-komponent epoxy (sølv-epoxy) twin-pack pose. Tag en dobbeltsidet spatel og bruge hver side til at øse en lille og lige stor mængde af hver komponent fra posen og bland dem sammen. Brug kun en lille mængde tilstrækkelig til en enkelt operation, fordi blandingen størkner inden for 20 min. Seal siderne af posen for at forhindre tørring.
BEMÆRK: Sølv-epoxyen giver mulighed for korrekt elektrisk kontakt mellem skruen og hovedmonteringen og forbedrer skruernes stabilitet. - Påfør en lille mængde af denne blanding mellem skruehoved og skrue hul, derefter stramme hver skrue, indtil hovedet hviler på bunden af implantatet. Sørg for, at der ikke kommer sølv-epoxy i kontakt mellem de to skruer, fordi hver skrue fungerer som en individuel elektrode, og for at sikre et nøjagtigt signal bør den ikke komme i kontakt med den anden skrue.
- Hvis sølv-epoxy blandingen var malplaceret, er der et par sekunder vindue til omhyggeligt øse ud overskydende at adskille forbindelsen. Bøj forsigtigt begge EMG fører fra den bageste kant af headmount at følge konturen af dyrets hoved og hals, og derefter indsætte dem i de nuchal muskler.
- Forbered dental cement til anvendelse ved at blande en 1 /2 scoop af pulver med flere dråber opløsningsmiddel. Brug en blanding spatel og rør indtil den endelige blanding er kit-lignende, klæbrig, men formbar, og stiv nok til at blive korrekt kondenseret, når de placeres på dyrets kranium.
- Påfør dental cement blanding, der dækker hele headmount og samtidig undgå at dække de seks pin huller, da dette vil gøre det umuligt at forbinde forforstærkeren. Vent ~ 3−5 min for cement en størkne. Sørg for, at huden ikke er forseglet til hovedbjerget med tandcement.
- Slip de hemostater, der holder hudklapperne, og luk snittet ved at forbinde hudklapperne omkring plastpiedestalen. Påfør flere dråber vævsklæbende at forsegle hudklapperne.
BEMÆRK: Hvis hudsnittet blev gjort længere for at give mulighed for glatning af EMG-ledningen, kan huden forsegles med vævsklæbemiddel eller sutureres. Forsegling huden med væv lim er normalt tilstrækkelig. Hvis der under postoperativ overvågning observeres åbning af snittet, anbefales suturer i stedet. - Påfør chlorhexidin antiseptisk på området omkring implantatet for at undgå infektion. Underkutivt at administrere natriumlaktatopløsning (3 μL pr. gram af dyrets vægt) for at erstatte væsker og elektrolytter, hvis dyret er underbedøvelse i mere end 2 timer efter den foregående injektion.
- Fjern dyret fra stereotaktisk apparatet, og mål dyrets vægt efter EEG-operationen som reference for fremtidig overvågning. På grund af implantatet vil dyrets vægt være større end før operationen.
- Placer dyret i et rent bur på en varm varmepude, med nyttiggørelse gel og et par fugtet chow stykker til nyttiggørelse.
- Brug bregma som et vartegn for placering af headmount. Påfør en lille mængde vævsklæbende (se Materialetabellen)på den nederste side af 2EEG/1EMG-hovedbjerget, så de fire skruehuller undgås, og 2EEG/1EMG-hovedbjerget placeres på kraniets overflade.
- Implanter en tre EEG kanaler (3EEG) headmount.
- Brug højhastighedsbor med en stålbit (0,5 mm, rund, 1/4) ved ~5.000−6.000 omdr./min. for at skabe seks grathuller (tre til stabilitetsskruer og tre til elektroder) ved hjælp af de medfølgende stereotaktiske koordinater12. For jord og fælles reference for EEG1 og EEG2: AP = 5,2 mm, ML = ±1,5 mm; for EEG1 og EEG2: AP = -3,0 mm, ML = ±3,0 mm for uafhængige EEG3: AP =-1,4 mm, ML = ±1,5 mm.
- Læg de seks skrueelektroder i grathullerne.
BEMÆRK: Hvis skruerne placeres dybere, vil det medføre betydelig skade på hjernen. Skrueelektroder giver bedre stabilitet i hovedbjerget. - Forbered dental cement til anvendelse ved at blande en 1 /2 scoop af pulver med flere dråber opløsningsmiddel. Brug en blanding spatel og rør indtil den endelige blanding er kit-lignende, klæbrig, men formbar, og stiv nok til at blive korrekt kondenseret, når de placeres på dyrets kranium.
- Påfør dental cement blanding, der dækker hele den eksponerede overflade af kraniet og hver skrue elektrode. Sørg for, at huden ikke er forseglet til hovedbjerget med tandcement. Vent ~1−2 min for cementen til mildt størkne. Der er ingen grund til at vente, indtil fuld størkning, før du går videre til næste trin.
- Tænd loddejernet for at varme det op. Anbring 3EEG-hovedmonteringen i en stereotaktisk holderarm.
BEMÆRK: Placer hovedmonteringen, så de seks ledningsføringspositioner svarer til placeringen af trådledningerne i hver skrueelektrode. - Sænk hovedbjerget, så dens ventrale del hviler oven på tandcement.
- Drej ledningen af hver ledning fra hver af skrueelektroderne med den tilsvarende ledningsledning af hovedbjerget.
BEMÆRK: Hvis du vrider de forkerte ledningsledninger, vil datafortolkningen blive kompliceret eller umulig. - Trim forsigtigt den overskydende ledning af ved hjælp af en saks. Lodde hver snoet par ledning for korrekt signal ledning.
BEMÆRK: Hvert par ledninger skal komme i kontakt med et andet par, ellers vil signalkvaliteten og datafortolkningen blive kompromitteret. - Bøj hvert loddet par tråd fører rundt om hovedbjerget, undgå kontakt mellem hvert par.
BEMÆRK: Hvis ledningsledningerne ikke er trimmet kort nok, kan det være svært at bøje dem rundt om hovedbjerget uden at røre en anden ledning. I dette tilfælde skal du bøje et par først, dække det med dental cement blanding, vente ~ 1−2 min at størkne, derefter gå videre med det næste par på samme måde. - Afslut dækker alle wiren med dental cement forlader kun den sorte del af headmount udsat.
BEMÆRK: Pas på ikke at påføre noget tandcementpulver eller -blanding på toppen af den eksponerede del af hovedbjerget, da snavs eller cement i hullerne blokerer kontakten og vil føre til enten signalfravær eller støj. - Slip de hemostater, der holder hudklapperne. Påfør chlorhexidin antiseptisk på området omkring implantatet for at undgå infektion.
- Underkutivt at administrere natriumlaktatopløsning (3 μL pr. gram af dyrets vægt) for at erstatte væsker og elektrolytter, hvis dyret har været under bedøvelse i mere end 2 timer efter den foregående injektion.
- Fjern dyret fra stereotaktisk apparatet, og mål dyrets vægt efter EEG-operationen som reference for fremtidig overvågning. På grund af implantatet vil dyrets vægt være større end før operationen.
- Placer dyret i et rent bur på en varm varmepude, med nyttiggørelse gel og et par fugtet chow stykker til nyttiggørelse.
BEMÆRK: Hydrogenperoxidhjælpemidler til fjernelse af det resterende bløde væv fra kraniet.
5. Tilslutning af dyr til anskaffelsessystemet
- Kæp dyret med begge hænder til at fjerne det fra erhvervelse bur og overføre det til et rent område med en flad overflade, som en Animal Transfer Station (ATS).
- Tag forsigtigt musen ved huden på ryggen. Tag ikke fat i dyret ved halen, da dette forårsager nød.
- Identificer åbningen i EEG-hovedbjerget svarende til jorden elektrode og matche de respektive pin af tøjret for korrekt tilslutning.
BEMÆRK: Omvendt tilslutning af tøjren fra pendlertil dyrets hovedmontering vil resultere i en anden aflæsning end elektroderne og potentielt forvrængede bølgeformer. - Hjemfør dyret til anskaffelsesburet, og tilslut den anden ende af tøjren (EEG System 1) eller forforstærkeren (EEG System 2) til pendleroren.
BEMÆRK: Når forforstærkeren (EEG System 2) tilsluttes til garderen fra pendleratoren, skal du matche de hvide mærker på enderne af begge tetherer. Omvendt forbindelse vil resultere i permanent skade på forstærkeren og kræver reparationer af producenten, som er dyre. - Drej forsigtigt tøjret, der forbinder dyret med pendleroren, for at sikre, at mekanismen fungerer korrekt, og at dyret kan bevæge sig frit.
6. Indstillinger for dataindsamling af EEG
- Angiv parametre for anskaffelse af EEG System 1.
- Angiv samplinghastigheden til 500 Hz. gevinst 5.000; tilstand Norm 35 Hz; LPN slukket. Indstil filter et højt gennemløb til 0,5 Hz.
BEMÆRK: 100 Hz (low pass) er indbygget og kræver ikke manuel input.
- Angiv samplinghastigheden til 500 Hz. gevinst 5.000; tilstand Norm 35 Hz; LPN slukket. Indstil filter et højt gennemløb til 0,5 Hz.
- Angiv parametre for anskaffelse af EEG System 2.
- Angiv samplinghastigheden til 600 Hz. preamp vinde 100; gevinst 1 (EEG1,2). Indstil filter et lavt pasfilter til 100 Hz.
BEMÆRK: 1 Hz (high pass) er indbygget og kræver ikke manuel input.
- Angiv samplinghastigheden til 600 Hz. preamp vinde 100; gevinst 1 (EEG1,2). Indstil filter et lavt pasfilter til 100 Hz.
7. Indstillinger for erhvervelse af videodata
- Angiv anskaffelsesparametre for EEG System 1.
BEMÆRK: Der er behov for et videoanskaffelsessystem fra tredjepart til at hente samtidige videodata.- Angiv billedhastighed mellem 15 (minimum anbefales) og 30 (maksimalt tilgængeligt) for at opnå en passende videokvalitet. Indstil opløsningen til 640 x 640 pixel. Angiv komprimeringstype til H.264H.
- Angiv anskaffelsesparametre for EEG System 2.
BEMÆRK: Dette EEG-system tilbyder et videosystem og software, der synkroniserer video- og EEG-data sammen i en enkelt fil for op til fire dyr (se Materialetabel).- Angiv billedhastighed mellem 15 (minimum anbefales) og 30 (maksimalt tilgængeligt) for at opnå en passende videokvalitet. Indstil opløsningen til 640 x 480 pixel. Angiv komprimeringen til WebM-filformatet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den protokol, der er skitseret her, beskriver metoden til induktion af en diffus skade isoleret (f.eks. i mangel af en fostlæsion) ved hjælp af en musemodel af gentagne diffuse TBI (Figur 1). Figur 1A viser vægtdråbeanordningen og dens komponenter ( figur1A, a1−a5), der anvendes til induktion af TBI i denne model, og afgørende trin under proceduren (figur 1B, b1−b5).
Karakteristika af denne model omfatter manglen på en fokale læsion til hjernen som følge af TBI, tab af bevidsthed, en høj overlevelsesrate, fremkomsten af sene anfald debut (>1 uge af TBI), og spontane, uprovokerede, tilbagevendende anfald i en delmængde af TBI mus efter en latenstid på mindst tre uger efter TBI.
Denne protokol viser detaljerede procedurer for oprettelse af et rent kirurgisk felt (figur 2), giver en trinvis tilgang til implantering af forskellige elektrodearrays(figur 3) og indeholder en detaljeret vejledning om anvendelse af to forskellige EEG-anskaffelsessystemer (se materialetabellen) til påvisning af krampeanfald (figur 4 og figur 5) i denne model. Den spektrale effekt af en typisk beslaglæggelse indikerer højeste tæthed i frekvensområdet på 10 til 40 Hz med et højdepunkt på 15 Hz (figur 4). Størstedelen af anfaldene hos mus er krampende, med en gennemsnitlig varighed på 12-15 s. Kun en lille brøkdel af anfald er ikke-krampeanfald. En grundig sammenligning af fordele og ulemper ved at bruge begge systemer er beskrevet i diskussionsafsnittet. Desuden viser denne protokol tidsfristerne for anfaldsdebut hos dyr efter gentagne vægttabTBI, der viser beslaglæggelsesklyngedannelse hos visse dyr(figur 6),hvilket understreger betydningen af at erhverve kontinuerlige snarere end periodiske optagelser, da dette vil sikre en nøjagtig stratificering af dyr, der udvikler spontane anfald efter TBI fra dem, der ikke gør. Vigtigere er det, at denne protokol også diskuterer fordele og ulemper ved gnaver modeller af PTE og deres evne til at repræsentere en bestemt population af mennesker efter TBI.
Figur 1: Musemodellen for gentagne diffuse TBI. (A) Vægtdråbeenhed. (a1) Vægt dråbe rør. (a2) En vægtstang på 100 g. (a3) Pin holder stangen. (a4) Streng til at hæve stangen op, hvis du ændrer højden eller fjerne stangen fra vægtdråberøret. (a5). Skum pude til placering af dyret under vægten dråberør. (B) Vægttab procedure. (b1) Den rustfri stål skive er placeret i midten af hovedet mellem linjen af øjne og ører. (b2 og b3) Efter visuel bekræftelse af, at dyrets hoved er i den flade position, og skumpuden flyttes, placeres dyrets hoved under vægtdråberøret. (b4) Frigivelse af pin holde vægten stang, rammer midten af rustfrit stål disken. (b5) Musen placeres på et sterilt håndklæde umiddelbart efter påvirkningen og tabet af bevidsthed vurderes ved at måle den tid, det tager for dyret at komme sig og rette sig selv. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Kirurgisk feltforberedelse og EEG elektrodeplaceringsordning. Autoclaved værktøjer og nødvendige materialer til kirurgi og elektrode implantation er forberedt før bedøve dyret for at sikre tilgængeligheden af alle nødvendige dele. Dette er en steril zone, og det er bydende nødvendigt ikke at forurene denne zone med ikke-sterile materialer. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Stereotaktiske landemærker og skematisk repræsentation af elektrodeplacering ved hjælp af EEG System 1 og 2. Det øverste panel viser metoderne til implantering af de tre forskellige hovedmonter, der er beskrevet i denne protokol. (A) Enkelt EEG kanal, bipolar montage. (B) To EEG-kanaler med fælles reference, bipolar montage og en EMG-kanal. (C) Tre EEG-kanaler ved hjælp af monopolar (kanal 1−2) og bipolar (kanal 3) montage. Det nederste panel viser hovedmonteringer og skruer implanteret som i det øverste panel. De tre typer skruer, der anvendes i denne protokol til to formål: som stabilitetsskruer (EEG System 1) eller både stabilitet og som elektrode (EEG System 2). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Spontan beslaglæggelse erhvervet ved hjælp af EEG System 1. Det øverste panel viser en spontan beslaglæggelse i en mus 23 dage efter gentagne vægttab TBI ved hjælp af data erhvervet ved hjælp af 1EEG headmount. A) Preictal (pre-beslaglæggelse) aktivitet. B) Ictal -aktivitet (beslaglæggelse). (C) Post-ictal (post-beslaglæggelse) depression. Nederste panel: Power spectrum tæthed beregnes ved hjælp af brugerdefinerede script og software (se Tabel over materialer). Gennemsnitlig effekt = effektspektrets gennemsnitlige effekt i epoke (enheder: V2/Hz). Medianfrekvens = frekvens, hvor 50 % af den samlede effekt i epoke nås (enheder: Hz). Gennemsnitlig frekvens = frekvens, hvor den gennemsnitlige effekt i epoke nås (enheder: Hz). Spektrale kant = frekvens, under hvilken en brugerspecificeret procentdel af den samlede effekt i epoke nås (enheder: Hz). Spidsfrekvens = frekvens, hvor den maksimale effekt opstår under epoke. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Spontane anfald erhvervet ved hjælp af EEG System 2. (A) Spontan ikke-krampeanfald (elektrografisk) anfald i en mus 65 dage efter gentagne vægttab TBI. Data, der er anskaffet ved hjælp af 2EEG/1EMG headmount. B) Spontankrampeanfald i en mus 97 dage efter vægttab TBI. Data, der er anskaffet ved hjælp af 3EEG-hovedbjerget. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Tidslinje for krampeforekomst hos mus efter gentagne vægttabTBI. Det tidligste anfald blev observeret tre uger efter skaden. Nogle dyr udvikler klynger af anfald inden for samme dag efterfulgt af flere uger uden anfald. Dyr blev registreret op til fire måneder efter TBI. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I modsætning til CCI- og FPI-modeller, der inducerer enten fokal eller kombination af fokale og diffuse skader, giver modellen for gentagne diffuse TBI, der er beskrevet i denne protokol, mulighed for induktion af diffus skade i mangel af fokal hjerneskade og kræver ikke hovedbunds- eller kranieåbninger og den tilhørende inflammation. En ekstra fordel ved fraværet af kraniektomi i denne model er, at det gør det muligt at ikke kun implantere elektroder til kronisk kontinuerlig EEG optagelse, men også oprettelsen af en fortyndet kranievindue for kronisk in vivo 2-foton billeddannelse af dyrene før, umiddelbart efter, og gentagne gange i dage, uger, og endda måneder efter TBI som beskrevet i Shandra og Robel 201913.
Uanset hvilken dyremodel der vælges, er den anvendte dataindsamlingsmetode et afgørende element i enhver vellykket og omfattende undersøgelse. I gnavere modeller af post-traumatisk epilepsi hyppigheden af anfald er lav14, der spænder mellem 0,3−0,4 anfald per dag9,15, og den latente periode før den første beslaglæggelse kan vare alt fra dage eller uger til selv måneder efter den første TBI procedure. Endelig vil i modsætning til ikke-traumatiske modeller, som har en generelt højere forekomst af anfald over en kortere periode, i gennemsnit kun 9%−50 % af dyrene med TBI få spontane anfald over en periode på op til seks måneder8,16. Dette tyder på, at meningsfulde undersøgelser kræver kontinuerlig langsigtet video-EEG optagelse.
Det overordnede mål for hver dyremodel af TBI er at reproducere de forskellige former for TBI, der findes hos humane patienter, så vidt muligt reproducerer de forskellige former for TBI, der findes hos humane patienter, for bedre at undersøge de cellulære og molekylære mekanismer, der ligger til grund for PTE. Teknikker i denne protokol vil bidrage til at lette opdagelsen af terapeutiske mål, afprøvning af effekten og tolerancen af nye forebyggende og terapeutiske kandidater, og udviklingen af pålidelige biomarkører eller prædiktorer for epilepsi følgende Tbi.
Potentielle udfordringer under vægttabsproceduren
Da hovedet ikke er fastgjort i en stereotaktisk ramme, skal der udvises ekstra forsigtighed for at sikre en flad placering af hoved- og metalpladen. Hvis den vægtede stang rammer metalpladen eller hovedet i en vinkel, eller hvis vægten glider ud til siden af musehovedet, vil skadebiomekanikken variere, hvilket muligvis resulterer i en mildere eller ingen skade. Tidligere var metalpladen limet til kraniet for at minimere variabiliteten. Men fjernelse af metalplade og lim fra musen kraniet efter vægttab, selv om udført med omhu, induceret skade på meninges, resulterer i vaskulære skader og efterfølgende skader på hjernevævet selv i fingeret dyr. Endvidere kræver snittet healing, potentielt involverer en perifer immunrespons, som kan indføre variabilitet. Af disse grunde blev det valgt at udelade limning metalplade til kraniet. Dyr kan dø med gentagne (dvs. 3x i denne protokol) skade. Mus med en kropsvægt under 25 g tåler muligvis ikke gentagne påvirkninger. Mens enkeltskader næsten aldrig resulterer i dødelighed, dør op til 7 % af C57BL/6-dyrene efter gentagne påvirkninger9. Motoriske underskud kan observeres hos nogle dyr. Disse underskud manifesterer sig som hindlimb paresis eller gangart abnormiteter. Dette er normalt en prognosefaktor for dårlig helbredelse, og det anbefales, at dyret ofres. Tegn på smerte eller angst omfatter vægttab, dårlig grooming, dehydrering, øget angst, lav eller fraværende sonderende aktivitet (hydrogel / nyttiggørelse, chow og / eller nestlet forblive uberørt). Rescue analgesi (0,1 mg/kg buprenorphin) kan administreres subkutant hver 8 timer i tre dage fra TBI for at lindre smerten og forhindre dyret i at nå det humane endepunkt. Subkutan natriumlaktatopløsning (3 μL pr. gram af dyrets vægt) kan administreres to gange om dagen til hydrering. Dyrene kommer sig typisk inden for tre dage efter TBI. Anvendelse af en femtrins kropstilstandsscore (BCS) til dyreovervågning efter eksperimentelle forsøg anbefales. Faserne omfatter (1) Afmagrede (skeletstrukturer er ekstremt fremtrædende, ryghvirvler ekstremt segmenteret); (2) Underkonditioneret (segmentering af rygsøjlen er indlysende, rygbækken knogler er let håndgribelige); (3) Velkonditioneret (ryghvirvler og rygbækken er ikke fremtrædende med let tryk); (4) Overkonditioneret (rygsøjlen er en kontinuerlig søjle, ryghvirvler kun håndgribelig med fast tryk); (5) Fede (musen er glat og omfangsrig, knoglestruktur forsvinder under kød og subkutan fedt). Det humane endepunkt nås, når BCS er 1−2, 20% eller mere vægttab i en voksen mus i forhold til dens pre-TBI vægt, symptomer på smerte eller angst afhjælpes ikke af analgetika, tegn på selv-lemlæstelse, symptomer på dehydrering, hypotermi, tilstedeværelseaf neurologiske underskud (unormal gangart eller motor paresis). Der bør tages hensyn til flere mulige resultater af stofadministration. Buprenorphin injiceres subkutant når den første top af sin smertestillende virkning ved 10 min efter injektion17. Den første kollision opstår sekunder efter buprenorphin administreres, hvilket tyder på, at den første måling af den retmæssige tid er usandsynligt, at blive påvirket. Dette kan dog ikke udelukkes fuldt ud som variabel. Derfor rådes eksperimentatorer til at udøve deres egen dømmekraft. Hvis vægttab procedure efterfølges af stereotaktisk kirurgi og carprofen administreres er det vigtigt at bemærke, at carprofen er en anti-inflammatorisk middel, der kan påvirke beslaglæggelse forekomst, derfor eksperimentatorer rådes til at overveje dens anvendelse omhyggeligt.
Potentielle udfordringer under operationen
Risikoen for kontaminering eller infektion vil blive sænket med brug af 70% ethanol, men det vil ikke resultere i sterile forhold. Alternativt kan der anvendes sterile kirurgiske handsker. Stereotactic apparatet er dog ikke selv sterilt, så enhver manuel manipulation vil resultere i tab af handskernes sterile tilstand. Derfor er sprøjtning med 70% ethanol påkrævet efter kontakt med usterilt materiale under operationen. Boring gennem kraniet ind i hjernen skaber skade på hjernevævet og kan forårsage kraftig blødning. Oprettelse af burr huller tager ekstrem omhu. Fastsættelse af håndboret i stereotaktisk armen og gradvist sænke det foretrækkes frem for boring af hullerne, mens du holder boret manuelt. Elektroder og fikseringsskruer kan synke dybere end planlagt og skade duramateren (subdural placering) eller cortex (kortikal placering). Dette kan forårsage kraftig blødning og en foskeion. Eksperimentatoren skal undgå overophedning af dyret under operationen. Hvis temperaturføleren ikke er korrekt, vil den ikke opretholde den krævede 37 °C temperatur, der forårsager overophedning, forbrændinger, og nogle gange dyrets død som følge heraf. Dyrets øjne bliver tørre, irriterede eller beskadiget under operationen, hvis de ikke smøres, så snart dyret er anbragt i det stereotaktiske apparat.
Postoperativ overvågning
Postoperativ overvågning begynder umiddelbart efter, at proceduren eller operationen er afsluttet. Overhold dyret, indtil det vågner op fra anæstesi og kigge efter tilstedeværelsen eller fraværet af kirurgi-relaterede komplikationer, herunder blødning eller paresis. Hvis der observeres blødning fra det ufuldstændige snitlukning, bedøvedyret, renses på blødningsstedet med chlorhexidin, udfør sårlukning som beskrevet ovenfor, og dyret returneres til bjærgningsburet. Ca. 1−2 timer efter operationen skal dyret være helt vågent fra anæstesi, der bevæger sig frit i buret uden tegn på parese eller smerte. Dyret vil begynde grooming sig selv, hvilket er grunden til forsegling snittet er nødvendigt for at forhindre dyret i at åbne det under grooming. Når dyret er kommet sig, overføres det til buret/kammeret, der vil blive anvendt til eeg-dataindsamling. Dette vil gøre det muligt for dyret at vænne sig til det nye miljø. Dette er især vigtigt for langtidsoptagelse (måneder). Dyreburet skal have en genvindingsgel (se Materialetabellen),fugtet chow, en nestlet og en vandflaske. Dette vil give mulighed for korrekt genopretning og vil give dyret adgang til næringsstoffer og vand. Fortsæt med at overvåge dyret dagligt. Vurderingen skal omfatte (a) Visuel inspektion af dyrets adfærd for tegn på smerte eller angst, herunder vægttab, dårlig grooming, øget angst, lav eller fraværende sonderende aktivitet (hydrogel / nyttiggørelse, chow og / eller nestlet forblive uberørt) og korrekt heling af snitområdet omkring EEG implantatet; b) vurdering af BCS for tegn på dehydrering og underernæring c) Dyrets vægt. Genopgiv natriumlaktatopløsning (3 μL pr. gram af dyrets vægt) subkutant, hvis dyret viser tegn på dehydrering (se Materialetabel). Administrere buprenorphin (0,1 mg/kg) subkutant, hvis dyret viser tegn på smerte eller angst. Hvis der fortsat er tegn på smerte, kan buprenorphin administreres hver 8. Monitorering skal øges til to gange dagligt, hvis et dyr viser tegn på smerte og/eller angst. Lad dyret komme sig i mindst tre dage efter EEG-operationen, inden det forbindes til anskaffelsessystemet via en tøjr. De humane endepunktskriterier er de samme som i potentielle udfordringer under vægtfaldsproceduren ovenfor.
Fordele og ulemper ved anskaffelsessystemer og headmounts
Den største fordel ved EEG System 1 med en enkelt EEG kanal headmount er de relativt lave omkostninger ved hardware, komponenter og service. Den enkle og enkle konfiguration giver også brugerne mulighed for at tilpasse systemet til deres præferencer. Hver differentialforstærker giver en enkelt EEG-kanal, selv om flere differentialforstærkere kan forbindes med hinanden, hvilket øger antallet af kanaler for hvert dyr. I dette system blev en konfiguration pr. enkelt kanal pr. dyr brugt til at erhverve kroniske langtids-EEG-optagelser af 20 dyr samtidigt. Posttraumatiske anfald er typisk generaliseret, og med en bilateral bipolar montage af elektroderne er det let at opdage denne type epileptiform aktivitet. Ulempen ved denne fremgangsmåde er imidlertid, at det er umuligt pålideligt at opdage brændvidde, lateralisering eller udbredelse af epileptiform aktivitet, da dette ville kræve flere kanaler. En anden potentiel udfordring kan være støjforurening af den enkelte kanal over tid, hvilket gør den ude af stand til at erhverve nyttige data fra dyret. Dette kan overvindes ved at kombinere to eller flere differentiale forstærkere, som fordobler antallet af kanaler pr dyr. Endelig er data, der er erhvervet fra en enkelt kanal, sværere at skelne fra potentielle artefakter, og epileptiform aktivitet understøttes bedst af videooptagelser af dyrets adfærd. Af denne grund kombinerede alle optagelserne kontinuerlig videoovervågning med EEG-erhvervelse. En begrænsning af dette system og dets software er, at det ikke omfatter video erhvervelse system, og derfor kræver en brugerdefineret tredjeparts system til at erhverve synkron video.
Den største fordel ved EEG System 2 med multi-kanal skørter er den høje kvalitet af signalet på grund af sin forfiltrering af det erhvervede signal af forforstærkeren (se Tabel over materialer),før de passeres gennem pendleratoren til forstærkeren. Forstærkere i dette system giver mulighed for erhvervelse af data i tre kanaler i følgende konfigurationer: 2 EEG+1 EMG-kanaler eller tre EEG-kanaler (se Materialetabel). Dette giver mulighed for påvisning ikke kun af generaliseret aktivitet, men også, potentielt, brændvidde epileptiform aktivitet. En anden stor fordel er, at dette system er designet specielt til dyreforsøg og dermed tilbyder en videooptagelse system og software i stand til at synkronisere EEG og video-kanaler for op til fire dyr i en enkelt fil, hvilket gør analysen lettere og mere bekvemt end EEG system 1. Dette system er let at bruge til erhvervelse af data til beslaglæggelse og søvn analyse uden ændringer af systemet, bortset fra den type headmount anvendes. 2EEG/1EMG headmount tillader kun implantering af elektroderne på faste steder på grund af kredsløbets størrelse og konfiguration. Skrueelektroderne med trådledninger i 3EEG-hovedmonteringer giver fleksibilitet i implanteringen på det ønskede sted med mulighed for at foretage enten monopolar eller bipolar erhvervelse afhængigt af, hvor referenceelektroden er placeret. Men implantering af 3EEG headmount kræver lodning, som tilføjer flere trin til operationen og kræver ekstra forsigtighed og præcision. De forbundne tethers og forforstærkere var specielt designet til små gnavere som mus og umodne rotter, og er tynde, lav vægt kabler, der forårsager lidt pres på dyrets hoved. En ulempe ved systemet er de relativt høje omkostninger ved hardware, software, video licens, og komponenter (dvs. forforstærkere og headmounts).
Betydning og kritiske trin i EEG-dataindsamling
Pendleratoren har en roterende mekanisme, der gør det muligt for tøjren at rotere afhængigt af retningen af flytning af dyr. Hvis denne mekanisme mislykkes, vil dyrets bevægelse blive begrænset, hvilket kan resultere i fjernelse af EEG-hætten. Gentagne kirurgi for at placere nye elektroder kan forsøges. Men, Dette kan være udfordrende eller umuligt, hvis fjernelse af den tidligere EEG cap forårsaget skader på kraniet og hjernen. Stikprøver for EEG-dataindsamling skal være mindst 2−2,5 x den højeste rentefrekvens. Højere prøveudtagningsrater resulterer i en højere opløsning af dataene til prisen for en stigning i filstørrelsen, hvilket kan blive vanskeligt at oplagre og behandle, når der erhverves kontinuerlige optagelser af flere dyr. Derfor er det nødvendigt at optimere samplinghastigheden til et niveau, der gør det muligt at opnå de nødvendige data uden tab af kvalitet og samtidig minimere filstørrelser.
Betydning og kritiske trin i videodatakøb
Hos gnavere, som hos mennesker, PTE kan manifestere sig med en bred variation i tilhørende symptomatologi og elektrografiske korreler, hvilket gør det nødvendigt at opnå en samtidig video under EEG erhvervelse for at korrekt fortolke og klassificere de observerede EEG begivenheder. Fortolkning af EEG-data i mangel af synkroniseret video er særligt udfordrende, når en enkelt EEG-kanal bruges. I dette tilfælde kan det være svært at afgøre, om EEG bølgeform er en artefakt, medmindre andre beviser (video) understøtter klassificeringen som et anfald. Bevægelse artefakter kan synes ligner det elektrografiske mønster af beslaglæggelse. Derfor, video med eller uden EMG bekræftelse er et krav. Mens videooptagelse udføres under både lyse og mørke cyklusser, er videokvaliteten muligvis ikke altid tilfredsstillende og klar i de mørke timer. Hertil kommer, at hvis dyret er vendt væk fra kameraet under ictal-lignende EEG begivenhed, kan det være udfordrende at vurdere sin adfærd. I disse tilfælde kan erhvervelse af en elektromyografi (EMG) signal ud over EEG og video løse udfordringen ved at give oplysninger om muskelaktivitet under mildere adfærdsmæssige anfald (med lave motoriske komponenter) eller for at bekræfte den manglende flytning af dyr under fravær-lignende spike-og-slow-wave udledninger på EEG. De potentielle udfordringer med EMG-kanalen svarer til udfordringerne med EEG-kanalerne, såsom støjforurening, forkert placering af elektroder eller elektroder, der løsner sig (eller mister overfladekontakt) i løbet af den forlængede tid af optagelsen. Brugen af video sammen med EEG analyse har to formål: at bekræfte, at en EEG begivenhed ikke er en artefakt forårsaget af dyrets bevægelse (sonderende adfærd, drikke, tygge, skrabe, strække, grooming, eller hurtig / anstrengt vejrtrækning) og at skelne mellem kramper og ikke-krampeanfald. Det anbefales at anvende en modificeret Racine-skala til at karakterisere krampeanfald eller ikke-krampeanfald. Faserne omfatter (0) Pure elektrografiske anfald uden nogen identificerbar motor manifestation; (1) Orofacial automatismer og hoved nikker; (2) Forelimb klononiske ryk; (3) Bilateral forelimb clonus; (4) Forelimb clonus og opdræt (5) Forelimb clonus med opdræt og nedfald. Hver videokanal skal tydeligt vise hele overfladen med dyret i buret, en etiket med et dyreidentifikationsnummer, vandflaskespids, mad og kost/nyttiggørelsesgel. Brug en infrarød natkilde for at sikre videoanskaffelse i de mørke timer. (Nogle kameraer har indbyggede enheder eller kan kræve yderligere dele. Se materialetabellen). Juster rammen pr. sekundhastighed og billedopløsning. Den højere billedhastighed og opløsning kommer på bekostning af større filstørrelse. De største ulemper ved at erhverve video under langvarige kroniske kontinuerlige eksperimenter omfatter behovet for at lagre meget store mængder data og de tekniske vanskeligheder i forbindelse med behandlingen af de store filer. Eksperimentatorens færdigheder til effektivt at fortolke adfærdsdataene sammen med EEG skal også overvejes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af R01 NS105807/NS/NINDS NIH HHS / USA og CURE baseret på et tilskud CURE modtaget fra United States Army Medical Research and Materiel Command, Department of Defense (DoD), gennem Psychological Health og Traumatic Brain Injury Research Program under Award No. W81XWH-15-2-0069. Ivan Zuidhoek er meget værdsat for korrekturlæsning af manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.10" screw | Pinnacle Technology Inc., KS, USA | 8209 | 0.10 inch long stainless steel |
| 0.10" screw | Pinnacle Technology Inc., KS, USA | 8403 | 0.10 inch long with pre-soldered wire lead |
| 0.12" screw | Pinnacle Technology Inc., KS, USA | 8212 | 0.12 inch long stainless steel |
| 1EEG headmount | Invitro1 (subsidiary of Plastics One), VA, USA | MS333/8-A/SPC | 3 individually Teflon-insulated platinum iridium wire electrodes (twisted or untwisted, 0.005 inch diameter) extending below threaded plastic pedestal |
| 2EEG/1EMG headmount | Pinnacle Technology Inc., KS, USA | 8201 | 2EEG/1EMG channels |
| 3% hydrogen peroxide | Pharmacy | ||
| 3EEG headmount | Pinnacle Technology Inc., KS, USA | 8235-SM-C | custom 6-Pin Connector for 3EEG channels |
| Buprenorphine | Par Pharmaceuticals, Cos. Inc., Spring Valley, NY, USA | 060969 | |
| Buprenorphine | Par Pharmaceuticals, Cos. Inc., Spring Valley, NY, USA | 060969 | |
| C57BL/6 mice | Harlan/Envigo Laboratories Inc | male, 12-16 weeks old | |
| C57BL/6 mice | The Jackson Laboratory | male, 12-16 weeks old | |
| Carprofen | Zoetis Services LLC, Parsippany, NJ, USA | 026357 | NOTE: this drug is added during weight drop only if stereotactic electrode implantation will be performed on the same day |
| Chlorhexidine antiseptic | Pharmacy | ||
| Dental cement and solvent kit | Stoelting Co., USA | 51459 | |
| Drill | Foredom | HP4-917 | |
| Drill bit | Meisinger USA, LLC, USA | HM1-005-HP | 0.5 mm, Round, 1/4, Steel |
| Dry sterilizer | Cellpoint Scientific, USA | Germinator 500 | |
| EEG System 1 | Biopac Systems, CA, USA | ||
| EEG System 2 | Pinnacle Technology Inc., KS, USA | ||
| Ethanol ≥70% | VWR, USA | 71001-652 | KOPTEC USP, Biotechnology Grade (140 Proof) |
| Eye ointment | Pro Labs Ltd, USA | Puralube Vet Ointment Sterile Ocular Lubricant available in general online stores and pharmacies | |
| Fluriso liquid for inhalation anesthesia | MWI Veterinary Supply Co., USA | 502017 | |
| Hair removal product | Church & Dwight Co., Inc., USA | Nair cream | |
| Isoflurane | MWI Veterinary Supply Co., USA | 502017 | |
| Povidone-iodine surgical solution | Purdue Products, USA | 004677 | Betadine |
| Rimadyl/Carprofen | Zoetis Services LLC, Parsippany, NJ, USA | 026357 | |
| Solder | Harware store | ||
| Soldering iron | Weller, USA | WP35 | ST7 tip, 0.8mm |
| Stainless steel disc | Custom made | ||
| Sterile cotton swabs | |||
| Sterile gauze pads | Fisher Scientific, USA | 22362178 | |
| Sterile poly-lined absorbent towels pads | Cardinal Health, USA | 3520 | |
| Tissue adhesive | 3M Animal Care Products, USA | 1469SB |
References
- Christensen, J., et al. Long-term risk of epilepsy after traumatic brain injury in children and young adults: a population-based cohort study. Lancet. 373 (9669), 1105-1110 (2009).
- Lowenstein, D. H. Epilepsy after head injury: an overview. Epilepsia. 50, Suppl 2 4-9 (2009).
- Ferguson, P. L., et al. A population-based study of risk of epilepsy after hospitalization for traumatic brain injury. Epilepsia. 51 (5), 891-898 (2010).
- Abou-Abbass, H., et al. Epidemiology and clinical characteristics of traumatic brain injury in Lebanon: A systematic review. Medicine (Baltimore). 95 (47), 5342 (2016).
- Management of Concussion/mTBI Working Group. VA/DoD Clinical Practice Guideline for Management of Concussion/Mild Traumatic Brain Injury. The Journal of Rehabilitation Research and Development. 46 (6), 1-68 (2009).
- Piccenna, L., Shears, G., O'Brien, T. J. Management of post-traumatic epilepsy: An evidence review over the last 5 years and future directions. Epilepsia Open. 2 (2), 123-144 (2017).
- Loscher, W., Brandt, C. Prevention or modification of epileptogenesis after brain insults: experimental approaches and translational research. Pharmacological Reviews. 62 (4), 668-700 (2010).
- Ostergard, T., Sweet, J., Kusyk, D., Herring, E., Miller, J. Animal models of post-traumatic epilepsy. Journal of Neuroscience Methods. 272, 50-55 (2016).
- Shandra, O., et al. Repetitive Diffuse Mild Traumatic Brain Injury Causes an Atypical Astrocyte Response and Spontaneous Recurrent Seizures. Journal of Neuroscience. 39 (10), 1944-1963 (2019).
- Foda, M. A., Marmarou, A. A new model of diffuse brain injury in rats. Part II: Morphological characterization. Journal of Neurosurgery. 80 (2), 301-313 (1994).
- Marmarou, A., et al. A new model of diffuse brain injury in rats. Part I: Pathophysiology and biomechanics. Journal of Neurosurgery. 80 (2), 291-300 (1994).
- Paxinos, G., Keith, B. J., Franklin, M. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Elsevier Science. (2007).
- Shandra, O., Robel, S. Imaging and Manipulating Astrocyte Function In Vivo in the Context of CNS Injury. Methods in Molecular Biology. 1938, 233-246 (2019).
- Pitkanen, A., Immonen, R. Epilepsy related to traumatic brain injury. Neurotherapeutics. 11 (2), 286-296 (2014).
- Kharatishvili, I., Nissinen, J. P., McIntosh, T. K., Pitkanen, A. A model of posttraumatic epilepsy induced by lateral fluid-percussion brain injury in rats. Neuroscience. 140 (2), 685-697 (2006).
- Pitkanen, A., Bolkvadze, T., Immonen, R. Anti-epileptogenesis in rodent post-traumatic epilepsy models. Neuroscience Letters. 497 (3), 163-171 (2011).
- Gades, N. M., Danneman, P. J., Wixson, S. K., Tolley, E. A. The magnitude and duration of the analgesic effect of morphine, butorphanol, and buprenorphine in rats and mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 39 (2), 8-13 (2000).
