Summary
Этот систематический протокол описывает новую модель животных посттравматической эпилепсии после повторяющихся легкой черепно-мозговой травмы. Первая часть детали шаги для индукции черепно-мозговой травмы с использованием модифицированной модели падения веса. Вторая часть содержит инструкции по хирургическому подходу к одно- и многоканальным системам получения электроэнцефалографических данных.
Abstract
Травматическая черепно-мозговая травма (ТБИ) является основной причиной приобретенной эпилепсии. TBI может привести к очаговой или диффузной черепно-мозговой травмы. Фокусная травма является результатом прямых механических сил, иногда проникающих через череп, создавая прямое повреждение в тканях мозга. Они видны во время визуализации мозга как области с ушибами, рваной раной и кровоизлиянием. Очаговые поражения вызывают гибель нейронов и образование глиальных шрамов и присутствуют у 20%-25% всех людей, которые несут TBI. Однако в большинстве случаев ТБИ, травмы вызваны ускорением силы замедления и последующего стрижки тканей, в результате чего нефокальные, диффузные повреждения. Субпопуляция пациентов ТБИ продолжает развиваться посттравматическая эпилепсия (ПТЭ) после периода задержки месяцев или лет. В настоящее время невозможно предсказать, какие пациенты будут развиваться PTE, и судороги у пациентов PTE являются сложными для контроля, что требует дальнейших исследований. До недавнего времени поле ограничивалось только двумя моделями животных/грызунов с проверенными спонтанными посттравматическими припадками, оба из них представляли большие очаговые повреждения с массивной потерей тканей в коре, а иногда и подкорковых структурах. В отличие от этих подходов, было установлено, что диффузный TBI индуцированных с помощью модифицированной модели падения веса достаточно, чтобы инициировать развитие спонтанного судорожных и не судорожных припадков, даже при отсутствии очаговых поражений или потери тканей. Подобно пациентам с приобретенными посттравматическими эпилепсией, эта модель представляет собой период задержки после травмы до начала захвата. В этом протоколе, сообщество будет предоставлено с новой моделью посттравматической эпилепсии, подробно, как вызвать диффузные не-повреждение TBI следуют непрерывный долгосрочный видео-электроэнцефалографический мониторинг животных в течение нескольких месяцев. Этот протокол будет подробно обработки животных, процедура падения веса, размещение электродов для двух систем приобретения, а также частые проблемы, возникающие во время каждого из этапов операции, послеоперационный мониторинг, и приобретение данных.
Introduction
Каждый год TBI затрагивает, по оценкам, 60 миллионов человек во всем мире. Воздействие лиц подвергаются более высокому риску развития эпилепсии, которая может проявляться лет после первоначальной травмы. Хотя тяжелые TBIs связаны с более высоким риском эпилепсии, даже мягкий ТБИ увеличивает шансы человека на развитие эпилепсии1,2,3,4. Все TBIs могут быть классифицированы как координационные, диффузные, или сочетание того и другого. Диффузная черепно-мозговая травма, присутствуюая во многих, если не во всех ТБО, является результатом стрижки мозгов различной плотности друг против друга из-за ускорения замедления и вращательных сил. По определению, диффузная травма происходит только в изоляции в мягкой / сотрясение не проникающей черепно-мозговой травмы, в которой не поражения головного мозга видны на компьютерной томографии5.
В настоящее время существуют две критические проблемы в области ведения пациентов, у которых развивается посттравматическая эпилепсия (ПТЭ). Во-первых, как только ПТЭ проявляется, судороги устойчивы к имеющимся противоэпилептических препаратов (AED)6. Во-вторых, AEDs одинаково неэффективны в профилактике эпилептогенеза, и нет эффективных альтернативных терапевтических подходов. Для того, чтобы решить этот дефицит и найти лучшие терапевтические цели и кандидатов на лечение, необходимо будет изучить новые клеточные и молекулярные механизмы в корне PTE6.
Одной из характерных особенностей посттравматической эпилепсии является скрытый период между первоначальным травматическим событием и наступлением спонтанных, неспровоцированных, периодических припадков. События, которые происходят в этом временном окне являются естественным фокусом для исследователей, потому что это время окно может позволить лечение и профилактика PTE в целом. Модели животных наиболее часто используются для этого исследования, потому что они предлагают несколько различных преимуществ, не последним из которых является то, что непрерывный мониторинг человеческих пациентов будет непрактичным и дорогостоящим в течение таких потенциально длительных периодов времени. Кроме того, клеточные и молекулярные механизмы, лежащие в основе эпилептогенеза, могут быть исследованы только в моделях животных.
Модели животных со спонтанными посттравматическими припадками и эпилепсией предпочтительнее перед моделями, где припадки индуцируются после ТБИ менее физиологически значимыми средствами, такими как хемоконвульяторы или электрическая стимуляция остро, хронически или разжиганием. Спонтанные посттравматические модели припадков тест, как TBI изменяет здоровую сеть мозга, что приводит к эпилептогенезу. Исследования с использованием дополнительной стимуляции после TBI оценить, как воздействие TBI снижает порог захвата и влияет на восприимчивость к судорогам. Преимущества животных моделей с изъятиями, вызванными химически или с электрической стимуляцией, заключаются в тестировании специфических механизмов огнеупорности к AED и эффективности существующих и новых AED. Тем не менее, степень релевантности и перевода этих данных на людей может быть неоднозначной7 из-за следующего: 1) механизмы захвата могут отличаться от тех, которые индуцируются только ТБИ; 2) не все из этих моделей приводят к спонтанным припадков7; 3) поражения, созданные судорожным агентом себя, с канюлей, необходимых для его доставки, или путем стимулирования размещения электродов в глубинных структурах (например, гиппокампа или миндалины) уже может вызвать повышенную восприимчивость захвата и даже гиппокампа эпилептиформных потенциалов эпилептиформных7. Кроме того, некоторые судорожные агенты (т.е. кайновая кислота) производят прямые поражения гиппокампа и склероз, что не характерно после диффузного ТБИ.
До недавнего времени существовали только две животные модели посттравматической эпилепсии: контролируемое воздействие корки (CCI, фокус) или жидкие ударные травмы (FPI, фокусные и диффузные)8. Обе модели приводят к большим очаговым поражениям наряду с потерей тканей, кровоизлиянием и глиозом у грызунов8. Эти модели имитируют посттравматическую эпилепсию, вызванную крупными очаговыми поражениями. Недавнее исследование показало, что повторный (3x) диффузный ТБИ достаточен для развития спонтанных припадков и эпилепсии у мышей даже при отсутствии очаговых поражений9,добавляя третью модель грызунов PTE с подтвержденными спонтанными периодическими припадками. Эта новая модель имитирует клеточные и молекулярные изменения, вызванные диффузной TBI, лучше представляя население с мягкими, сотрясением туберкулеза. В этой модели, скрытый период в три недели или более до начала захвата и появление поздних, спонтанных, повторяющихся изъятий позволяет исследовать коренные причины посттравматического эпилептогенеза, тестирование эффективности профилактических подходов и новых терапевтических кандидатов после начала захвата, и имеет потенциал для развития биомаркеров посттравматического эпилепгенеза, потому что примерно половина животных развиваются посттравматического эпилепсии.
Выбор животной модели для изучения посттравматической эпилепсии зависит от научного вопроса, типа исследуемой черепно-мозговой травмы и того, какие инструменты будут использоваться для определения основных клеточных и молекулярных механизмов. В конечном счете, любая модель посттравматической эпилепсии должна продемонстрировать как появление спонтанных припадков после ТБИ, так и начальный период задержки в подмножестве животных ТБИ, потому что не все пациенты, которые несут ТБИ, переходят к развитию эпилепсии. Для этого в этом протоколе используется электроэнцефалография (ЭЭГ) с одновременным приобретением видео. Понимание технических аспектов, лежащих в основе оборудования и подходов к сбору данных, имеет решающее значение для точной интерпретации данных. Важнейшие аппаратные аспекты включают тип системы записи, тип электродов (винт или провод свинца) и материал, из которого они сделаны, синхронизированное приобретение видео (как часть системы ЭЭГ или третьей стороны), а также свойства компьютерной системы. Крайне важно установить соответствующие параметры приобретения в любом типе системы в зависимости от цели исследования, событий ЭЭГ, представляющих интерес, метода дальнейшего анализа и устойчивости хранения данных. Наконец, необходимо учитывать метод конфигурации электрода (монтаж), так как каждый из них имеет преимущества и недостатки и повлияет на интерпретацию данных.
Этот протокол подробно, как использовать модифицированные Marmarou падение веса модели10,11, чтобы вызвать диффузные травмы в результате спонтанного, неспровоцированные, периодические судороги у мышей, описывает хирургические подходы к приобретению одного и многоканального непрерывного, и синхронизированные видео ЭЭГ с использованием монополярного, биполярного или смешанного монтажа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры для животных, описанные в этом протоколе, были выполнены в соответствии с Институциональным Комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) Технологического университета Вирджинии и в соответствии с «Руководством по уходу и использованию лабораторных животных» Национальных институтов здравоохранения. .
1. Протокол обращения с животными
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол предназначен для привыкание животных, заказанных от поставщика на объект после прибытия и условие их к обработке экспериментатором. Это улучшает благополучие животных за счет снижения стресса и тревоги и упрощает определенные процедуры, которые требуют обращения с животными, в том числе индуцирование TBI, послеоперационный мониторинг, и подключение животного к системе приобретения.
- Когда многие животные получают от поставщика, ухо-тег и случайно назначить их в экспериментальной группы (TBI) или контрольной группы (фиктивная хирургия) при объединении их в клетках от 2 до 5 животных. Дом TBI животных отдельно от фиктивных животных, потому что фиктивные мыши иногда действуют агрессивно по отношению к мышам, которые прошли TBI.
- Обработка день 1 (24'48 h после уха пометки): Подготовьте диаграмму для журналов животных ухо метки, дата рождения, даты обработки, вес животных на обработке дней, продолжительность обработки, и раздел для комментариев и замечаний.
- Аккуратно чашку животное с помощью обеих рук. Не хватай животное за хвост, так как оно индуцирует защитные механизмы и стрессовую реакцию.
- Проверьте и запишите ушную бирку животного.
- Поместите животное в контейнер на весовой шкале и запишите вес.
- Аккуратно чашку животное обеими руками снова и обрабатывать его в течение 1 мин, что позволяет ему двигаться и исследовать в руках. Выполните это над скамейкой в процедурной комнате и будьте осторожны, чтобы не уронить животное на пол.
- После 1 мин обработки, поместите животное обратно в клетку.
- Повторите шаги 1.3'1.7 для других животных в клетке.
- Обработка день 2 (на следующий день): Повторите шаги 1.2'1.5.
- Аккуратно чашку животное обеими руками снова и обрабатывать его в течение 2 минут, что позволяет ему двигаться и исследовать в руках. Выполните это над скамейкой в процедурной комнате и будьте осторожны, чтобы не уронить животное на пол.
- После 2 минут обработки, поместите животное обратно в клетку.
- Повторите шаги 1.10-1.11 для других животных в клетке.
- Обработка день 3 (на следующий день): Повторите шаги 1.2'1.5.
- Аккуратно чашку животное обеими руками снова и обрабатывать его в течение 4 минут, что позволяет ему двигаться и исследовать в руках. Выполните это над скамейкой в процедурной комнате и будьте осторожны, чтобы не уронить животное на пол.
- После 4 минут обработки, поместите животное обратно в клетку.
- Повторите шаги 1.14-1.15 для других животных в клетке.
- Обработка день 4 (контрольный день, 1 неделя с момента обработки день 1): Повторите шаги 1.2'1.5.
- Аккуратно чашку животное обеими руками снова и обрабатывать его в течение 4 минут, что позволяет ему двигаться и исследовать в руках. Выполните это над скамейкой в процедурной комнате и будьте осторожны, чтобы не уронить животное на пол.
- После 4 минут обработки, поместите животное обратно в клетку.
- Повторите шаги 1.18-1.19 для других животных в клетке.
ПРИМЕЧАНИЕ: День обработки управления проверяет сохранение спокойного поведения после трехдневного протокола обработки.
2. Процедура снижения веса
- Поместите мышь в индукционную камеру. Установите поток кислорода и вакуума как до 1 л/мин, так и уровень изофлуранского газа до 3%-5%. Анестезируйте мышь в течение 5 мин.
- Снимите мышь с индукционной камеры и поместите ее на пенную площадку. Тест на отсутствие ответа на нос или хвост щепотку.
- Подкожно вводить анальгетик (0,1 мг/кг бупренорфин). Если ЭЭГ хирургия выполняется в тот же день, вводить бупренорфин подкожно в сочетании с нестероидным противовоспалительным карпрофеном (5 мг/кг).
- Подкожно администрирование раствора лактата натрия (3 л на грамм веса животного) подкожно до или после последнего удара. Раствор лактата натрия можно смешивать с анальгетиками для быстрого введения в одну инъекцию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор лактата натрия содержит смесь хлорида натрия, хлорида калия, хлорида кальция и лактата натрия в воде. Этот шаг помогает заменить жидкости и электролиты, помогая восстановлению. - Расположите головку мыши под трубкой падения веса(рисунок 1А)и поместите плоский диск из нержавеющей стали (диаметр 1,3 см, толщина 1 мм и вес 880 мг) в центре головы, между линией глаз и ушей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот диск рассеивает воздействие на поверхность черепа (Рисунок 1B). - Удалите штырь в трубке падения веса, чтобы освободить 100 г вес стержня с высоты 50 см. Чтобы вызвать фиктивную травму для контрольных мышей, удалите штангу веса из трубки, чтобы предотвратить случайное высвобождение штифта и падение веса.
ПРИМЕЧАНИЕ: Голова животного должна быть расположена плоской, так что стержень свободно падает на всю поверхность диска. - Поместите бессознательное животное на спину для восстановления на грелке, покрытой стерильным полиподалистым абсорбирующим полотенцем. Время восстановления исправив рефлектор (т.е. время, необходимое мыши, чтобы исправить себя со спины) может быть измерено как считывание за время, проведенное без сознания.
- Когда животное приходит в сознание, поместите его в чистую клетку, которая была подогрета на грелке, с восстановлением гель и несколько увлажненных частей чау, чтобы восстановить в течение 45 мин. Убедитесь, что есть достаточный мусор, чтобы клетка не перегреться. Перегрев животного может оказаться столь же большим препятствием для восстановления, как позволяет мыши стать слишком холодно.
- После 45 мин повторите шаги 2,1–2,8 дважды, опустив шаг 2.3 (т.е. введение анальгетиков и противовоспалительных препаратов).
- Разрешить животным, чтобы восстановить сява в течение 1 х 2 ч, если ЭЭГ электрод имплантации операция проводится в тот же день.
3. Хирургическая полевой подготовка для имплантации эЭГ-электродов
ПРИМЕЧАНИЕ: Автоклав хирургических инструментов и винтов до операции. Очистите хирургические перчатки путем распыления и трения с 70% этанола до и после прикосновения к животному, нестерильных материалов, а также между обращением с животными. Стерилизовать хирургические инструменты в течение 2-3 минут в стерилизаторе биса (см. Таблица материалов)между животными. Измените стерильную драпировку перед размещением нового животного в стереотактический аппарат. Убедитесь, что хирургическое поле содержит все необходимые компоненты для операции(рисунок 2). Отсутствие инвазивной хирургической процедуры для индуцирования ТБИ в этой модели имеет ряд преимуществ: 1) имплантация электродов является гибкой и может быть выполнена в тот же день, что и ТБИ, или после определенного периода времени; 2) время восстановления животного быстрее; 3) череп остается нетронутым, что позволяет больше площади поверхности и гибкости для имплантации электродов.
- Анестезируйка мыши в изофлуранском газе в индукционной камере в течение 5 минут.
- Перенесите мышь из индукционной камеры в стереотактический аппарат и поместите ее на стерильную драпировку на грелку с изофрурановым газом и вакуумными трубками, подключенными к носовому конусу.
- Поддерживайте температуру тела на уровне 37 градусов по Цельсию в течение операции. Поместите датчик температуры так, чтобы он контактировал с грудной клеткой или брюшной стенкой мыши.
- Исправьте голову животного на месте с помощью ушных прутьев.
- Поддерживайте анестезию на уровне 1,5%-3,5% изофлюрани или при 60 вдохах/мин в хирургической плоскости (без реакции на нос или хвостовую щепотку).
- Нанесите глазную мазь на глаза животного, чтобы держать их смазанным на протяжении всей операции.
- Администрирование смеси анальгетиков (0,1 мг/кг бупренорфин) и нестероидных противовоспалительных препаратов (5 мг/кг карпрофена) в одной инъекции подкожно, если TBI была выполнена ранее в течение дня, и в этом случае животное уже получило анальгетики и противовоспалительные средства.
ПРИМЕЧАНИЕ: Бупренорфин следует вводить снова, если время между первой TBI и ЭЭГ размещения хирургии превышает 8 ч или если животное отображает признаки боли 8 ч после первого введения, но она должна быть предоставлена без добавления карпрофена. - Подкожно администрирование раствора лактата натрия (3 л на грамм веса животного) для замены жидкостей и электролитов у животного.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если операция выполняется сразу после TBI, этот шаг должен быть приурочен должным образом. Раствор лактата натрия следует вводить каждые 2 ч, пока животное проходит процедуры и один раз после операции, 2 ч от предыдущей инъекции. - Удалите волосы с головы с помощью крема для удаления волос.
- Перед тем, как сделать разрез, дезинфицировать кожу кожи головы с повидон-йод хирургического антисептического раствора и 70% этанола в чередующихся тампонах с стерильными марлевыми прокладками в круговом движении 3x (20 s на раствор каждый раз).
- С помощью скальпеля, сделать рострал-каудальный разрез на коже головы средней линии от чуть выше глаз до задней части головы. Этот метод открытия кожи головы является предпочтительным по сравнению с резки кожи головы, как кожи лоскуты могут быть запечатаны над или вокруг ЭЭГ-шапка обеспечения большей стабильности.
ПРИМЕЧАНИЕ: При подготовке черепа к имплантации 3-EEG headmount, отрезав кожу головы не требуется, так как размер головки не позволит для закрытия кожи закрылки над головой. - Расширьте область разреза, применяя небольшие гемостаты на открытых границах кожи. Если кровотечение происходит после разреза, очистить стерильной галей хлопка или тампоном.
- Аккуратно удалите периостеум (т.е. тонкую мембрану над черепной костью) с помощью скальпеля. Если какое-либо кровотечение происходит во время этого шага, нажмите на место кровотечения с стерильной ватным тампоном, пока он не остановится.
- Используйте стерильные ватные тампоны, чтобы очистить череп перекисью водорода, но не касаясь мягких тканей, окружающих открытые черепной области. Повторите этот шаг до тех пор, пока череп очищается от каких-либо мягких тканей и имеет беловатый вид.
- Высушите череп стерильной марлей или ватным тампоном.
ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 3.12-3.15 важны для правильной фиксации электродов и зубного цемента. Любые мягкие ткани, не приспущенные кровотечения, и мусор может вызвать инфекцию, нестабильную фиксацию головы, искаженный или отсутствующий сигнал, и потерю имплантата в течение нескольких дней или недель после операции.
4. Размещение электрода
- Имплантировать единый ЭЭГ (1EEG) канал headmount.
ПРИМЕЧАНИЕ: Аббревиативы в стереотаксических координатах представляют пространственные отношения и указывают расстояние в миллиметрах цели от брегмы при заданной ориентации на голову животного: передняя задняя (AP) и медиально-боковая (ML). Дорсаль-вентраль не применим в этом протоколе, потому что все электроды помещаются в эпидуральное пространство, а не в определенную структуру в головном мозге (Рисунок 3). Винз является активным электродом, а Вин- является его эталонным электродом.- Используйте высокоскоростную дрель со стальным битом (0,5 мм, круглый, 1/4 дюйма) по цене 5000-6000 патронов за минуту (об/ ч) для создания шести отверстий заусенцев (три для винтов стабильности и три для электродов) с использованием предусмотренных стереотактических координат12. Для двух передних винтов: А.. - 1,5 мм, МЛ - 1,5 мм; для одного заднего винта: АП -5,2 мм, МЛ -1,5 мм; для наземного электрода: А.. -5,2 мм, МЛ - 1,5 мм; для записывающих электродов: А.. -2,3 мм, МЛ - 2,7 мм, с Вином вправо и Вин- влево.
- Добавьте три винта для повышения устойчивости головной ступени. Используя отвертку, поверните винты 1'1.5 x каждый, чтобы быть исправлены заступнися в черепе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Размещение винтов глубже повредит мозг. - Вставьте головную очку 1EEG в стереотаксическую руку держателя и расположите голову так, чтобы три электрода располагались вдоль средней линии черепа. В этой конфигурации наземный электрод и его соответствующее отверстие в верхней части головки находится в задней части, электрод Вине в середине и Вин-электрод спереди. На головном уходе можно нанести отметку с помощью перманентного маркера.
- Согните каждый электрод 90 ", так что конец каждого провода согнут вниз и расположен выше соответствующего отверстия заусенцев. Затем измерьте длину 1 мм части провода, которая теперь перпендикулярно отверстию заусенки, и обрезать излишки(рисунок 3). Это обеспечит эпидуральное размещение электродов. Электроды должны едва касаться поверхности dura mater.
- Опустите головной убор и отрегулируйте все три электрода в соответствии с соответствующим отверстием заусенец. Для эпидуральной записи электроды должны быть размещены выше или едва касаясь матер дюра.
- Подготовка зубного цемента для применения путем смешивания 1/2 мерной ложки порошка с несколькими каплями растворителя. Используйте перемешивание шпателя и перемешать, пока окончательная смесь шальто-как, липкий, но податливый, и достаточно жесткой, чтобы быть правильно конденсируется при размещении на черепе животного.
- Нанесите зубную цементную смесь, покрывающую все винты и электроды, и подождите 3-5 минут, чтобы она затвердела. Убедитесь в том, чтобы не покрыть пластиковый пьедестал зубным цементом, потому что это сделает невозможным подключение животного к коммутатору с тросом.
- Отпустите гемостаты, держащие кожные лоскуты, и закройте разрез, соединив кожные лоскуты вокруг пластикового пьедестала. Нанесите несколько капель ткани клея (см. таблицу материалов), чтобы запечатать кожу закрылки.
- Нанесите хлоргексидин антисептик на область вокруг имплантата, чтобы избежать инфекции. Если животное находится под наркозом дольше 2 ч после предыдущей инъекции раствора лактата натрия, данного во время индукции ТБИ, вводят еще одну инъекцию подкожно. Для поддержания правильной гидратации животного, повторите инъекцию каждые 2 ч, которые животное проводит под наркозом.
- После операции, дать окончательный инъекции раствора лактата натрия 2 ч после предыдущей инъекции. Если операция менее 2 ч в длину, ввести окончательную дозу восстановления раствора лактата натрия 2 ч с первой инъекции.
- Удалить животное из стереотаксического аппарата и измерить вес животного после операции ЭЭГ в качестве эталона для будущего мониторинга. Благодаря имплантату вес животного будет больше, чем до операции.
- Поместите животное в чистую клетку на теплую грелку для восстановления.
- Имплантировать два ЭЭГ и один EMG (2EEG/1EMG) каналы headmount.
- Используйте bregma в качестве ориентира для размещения головной уклад. Нанесите небольшое количество клей ткани (см. Таблица материалов)на нижнюю сторону головки 2EEG/1EMG, избегая четырех винтовых отверстий и поместите головную установку 2EEG/1EMG на поверхность черепа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Нет никаких конкретных координат для размещения этой головной уклады. Высота головы составляет 8 мм в длину и 5 мм в ширину, что покрывает большую часть черепной поверхности. Позиционирование головки с передним краем 3,0 мм переднюю часть к брегме является оптимальным и обеспечивает хорошее качество сигнала. Быстрое ручное размещение необходимо перед падением ткани клея лечит. Разрешить примерно 5 мин для ткани клея, чтобы вылечить полностью. - Используйте стерильную иглу 23 G для создания пилотных отверстий для винтов через четыре отверстия в головном уходе. Для достижения этой цели, осторожно нажмите иглу и медленно вращаться, пока кончик иглы проникает в череп, не повреждая мозг. Удалите кровотечение из отверстия пилота с помощью стерильного ватного тампона.
- Вставьте 0.10 в винты в пилотных отверстий и поверните их, пока каждый не будет зафиксирован в черепе. Это может быть до половины длины винта, но не по всей длине, так как это повредит дюра матер и коры головного мозга. Если высота расположена таким образом, что есть зазор между поверхностью черепа и задней части головки использовать два 0,12 в винтах в задней части.
- Сделайте небольшое отверстие по бокам двухкомпонентной эпоксидной (серебряно-эпоксидной) сумки с двумя пакетами. Возьмите двусторонний шпатель и использовать каждую сторону, чтобы зачерпнуть небольшое и равное количество каждого компонента из мешка и смешать их вместе. Используйте только небольшое количество, достаточное для одной операции, потому что смесь затвердевает в течение 20 мин. Запечатать стороны сумки, чтобы предотвратить сушки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Серебристая эпоксидная сигнал обеспечивает надлежащий электрический контакт между винтом и головой и повышает стабильность винтов. - Нанесите небольшое количество этой смеси между винтом и винтом отверстие, а затем затяните каждый винт, пока его голова лежит на базе имплантата. Убедитесь, что ни одна серебристо-эпоксидная не контактирует между двумя винтами, потому что каждый винт служит индивидуальным электродом и, чтобы обеспечить точный сигнал, он не должен входить в контакт с другим винтом.
- Если серебристо-эпоксидная смесь была неуместна, есть несколько вторых временных окон, чтобы тщательно вычерпывать избыток, чтобы отделить соединение. Тщательно согните оба ЭМГ ведет от задней кромки головки, чтобы следовать контуру головы и шеи животного, а затем вставьте их в нуклеальные мышцы.
- Подготовка зубного цемента для применения путем смешивания 1/2 мерной ложки порошка с несколькими каплями растворителя. Используйте перемешивание шпателя и перемешать, пока окончательная смесь шальто-как, липкий, но податливый, и достаточно жесткой, чтобы быть правильно конденсируется при размещении на черепе животного.
- Нанесите зубную цементную смесь, покрывающую всю головную гору, избегая при этом покрывающих шесть отверстий, так как это сделает невозможным подключение предварительного усилителя. Подождите 3-5 минут, чтобы цемент затвердеть. Убедитесь, что кожа не запечатана до головы зубным цементом.
- Отпустите гемостаты, держащие кожные лоскуты, и закройте разрез, соединив кожные лоскуты вокруг пластикового пьедестала. Нанесите несколько капель ткани клея, чтобы запечатать кожу закрылки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если разрез кожи был сделан дольше, чтобы позволить для выпрямление провода ЭмГ приводит, кожа может быть запечатана с клей ткани или зашедают. Запечатывание кожи с помощью клея ткани, как правило, достаточно. Однако, если во время послеоперационного мониторинга наблюдается открытие разреза, вместо этого рекомендуется швы. - Нанесите хлоргексидин антисептик на область вокруг имплантата, чтобы избежать инфекции. Подкожно администрирование раствора лактата натрия (3 л на грамм веса животного) для замены жидкостей и электролитов, если животное находится под наркозом дольше 2 ч после предыдущей инъекции.
- Удалить животное из стереотаксического аппарата и измерить вес животного после операции ЭЭГ в качестве эталона для будущего мониторинга. Благодаря имплантату вес животного будет больше, чем до операции.
- Поместите животное в чистую клетку на теплой грелкой, с гель восстановления и несколько увлажненных кусочков чау для восстановления.
- Используйте bregma в качестве ориентира для размещения головной уклад. Нанесите небольшое количество клей ткани (см. Таблица материалов)на нижнюю сторону головки 2EEG/1EMG, избегая четырех винтовых отверстий и поместите головную установку 2EEG/1EMG на поверхность черепа.
- Имплантировать три ЭЭГ-канала (3EEG) головной убор.
- Используйте высокоскоростную дрель со стальным битом (0,5 мм, круглый, 1/4) при 5000-6000 об/мин, чтобы создать шесть отверстий заусенцев (три для винтов стабильности и три для электродов) с использованием предоставленных стереотактических координат12. Для наземных и общих ссылок для ЭЭГ1 и ЭЭГ2: AP - 5,2 мм, МЛ - 1,5 мм; для ЭЭГ1 и ЭЭГ2: А.П. - 3,0 мм, МЛ - 3,0 мм; для независимого ЭЭГ3: А.. -1,4 мм, МЛ - 1,5 мм.
- Поместите шесть винтовых электродов в отверстия заусенцев.
ПРИМЕЧАНИЕ: Размещение винтов глубже создаст значительные повреждения мозга. Винтовые электроды обеспечивают лучшую стабильность головки. - Подготовка зубного цемента для применения путем смешивания 1/2 мерной ложки порошка с несколькими каплями растворителя. Используйте перемешивание шпателя и перемешать, пока окончательная смесь шальто-как, липкий, но податливый, и достаточно жесткой, чтобы быть правильно конденсируется при размещении на черепе животного.
- Нанесите зубную цементную смесь, покрывающую всю обнажаемую поверхность черепа и каждый винтэлектрод. Убедитесь, что кожа не запечатана до головы зубным цементом. Подождите, чтобы цемент мягко затвердел, подождите 1,2 мин. Нет необходимости ждать полного затвердевания, прежде чем переходить к следующему шагу.
- Включите паяльник, чтобы нагреть его. Поместите голову 3EEG в стереотаксическую руку держателя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Позиция headmount так, что шесть провода свинца позиции соответствуют положению провода приводит каждого винта электрода. - Опустите головной уклад так, чтобы его брюшная часть покоится поверх зубного цемента.
- Твист провода каждого свинца от каждого из винтовых электродов с соответствующим проводом свинца головной уклад.
ПРИМЕЧАНИЕ: Скручивание неправильных проводов сделает интерпретацию данных сложной или невозможной. - Тщательно обрезать избыток проволоки с помощью ножниц. Солдер каждая витая пара проводов для правильного сигнала дирижированной.
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая пара проводов должна встыкаться в контакт с другой парой, в противном случае качество сигнала и интерпретация данных будут скомпрометированы. - Согните каждую припаячную пару проводов вокруг головки, избегая контакта между каждой парой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если провод приводит не обрезается достаточно коротким может быть трудно согнуть их вокруг головки, не касаясь другого провода. В этом случае сначала согните одну пару, накройте ее зубной цементной смесью, подождите, чтобы затвердеть, а затем приступайте к следующей паре таким же образом. - Готовое покрытие всей проволоки зубным цементом, оставляя только черную часть головки открытой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не применять любой зубной цементный порошок или смесь в верхней части открытой части headmount как любой мусор или цемент в отверстиях будет блокировать контакт и приведет либо отсутствие сигнала или шума. - Отпустите гемостаты, держащие кожные лоскуты. Нанесите хлоргексидин антисептик на область вокруг имплантата, чтобы избежать инфекции.
- Администрирование раствора лактата натрия (3 л на грамм веса животного) подкожно заменить жидкости и электролиты, если животное находилось под наркозом дольше 2 ч после предыдущей инъекции.
- Удалить животное из стереотаксического аппарата и измерить вес животного после операции ЭЭГ в качестве эталона для будущего мониторинга. Благодаря имплантату вес животного будет больше, чем до операции.
- Поместите животное в чистую клетку на теплой грелкой, с гель восстановления и несколько увлажненных кусочков чау для восстановления.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перекись водорода помогает в удалении любых оставшихся мягких тканей из черепа.
5. Подключение животных к системе приобретения
- Кубок животное обеими руками, чтобы удалить его из клетки приобретения и передать его в чистую область с плоской поверхностью, как animal Transfer Station (ATS).
- Аккуратно возьмите мышь за кожу спины. Не хватай животное за хвост, так как это вызывает бедствие.
- Определите отверстие в гоме ЭЭГ, соответствующем наземному электроду, и сопостройте соответствующий штифт троса для правильного соединения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обратное соединение троса от коммутатора к животному головному убору приведет к различному чтению электродов и потенциально искаженных волновых форм. - Верните животное в клетку приобретения и соедините другой конец троса (ЭЭГ-система 1) или предварительно усилителя (Система ЭЭГ 2) к коммутатору.
ПРИМЕЧАНИЕ: При подключении предварительного усилителя (ЭЭГ-система 2) к тросу от коммутатора, сопоставляют белые метки на концах обоих тросов. Обратное соединение приведет к необратимому повреждению усилителя и требует ремонта со стороны производителя, которые являются дорогостоящими. - Аккуратно поверните трос, соединяющий животное с коммутатором, чтобы обеспечить работу механизма должным образом и, чтобы животное может свободно перемещаться.
6. Настройки получения данных ЭЭГ
- Установите параметры приобретения Системы ЭЭГ 1.
- Установить частоту выборки до 500 Гц; получить 5000; режим Норм 35 Гц; LpN свыключен. Установите фильтр высокого прохода до 0,5 Гц.
ПРИМЕЧАНИЕ: 100 Гц (низкий проход) является встроенным и не требует ручного ввода.
- Установить частоту выборки до 500 Гц; получить 5000; режим Норм 35 Гц; LpN свыключен. Установите фильтр высокого прохода до 0,5 Гц.
- Установите параметры приобретения EEG System 2.
- Установить частоту выборки до 600 Гц; предусилитель усиления 100; получить 1 (EEG1,2). Установите фильтр низкого прохода до 100 Гц.
ПРИМЕЧАНИЕ: 1 Гц (высокий проход) встроен и не требует ручного ввода.
- Установить частоту выборки до 600 Гц; предусилитель усиления 100; получить 1 (EEG1,2). Установите фильтр низкого прохода до 100 Гц.
7. Настройки сбора видеоданных
- Устанавливаем параметры приобретения для системы ЭЭГ 1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения одновременных видеоданных необходима система приобретения видео третьей стороной.- Установите частоту кадров между 15 (минимум рекомендуется) и 30 (максимум доступны) для соответствующего качества видео. Установите разрешение на 640 x 640 пикселей. Установите тип сжатия до H.264H.
- Устанавливаем параметры приобретения для системы ЭЭГ 2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта система ЭЭГ предлагает видеосистему и программное обеспечение, которые синхронизируют видео и ЭЭГ данные вместе в одном файле для четырех животных (см. Таблица материалов).- Установите частоту кадров между 15 (минимум рекомендуется) и 30 (максимум доступны) для соответствующего качества видео. Установите разрешение на 640 x 480 пикселей. Установите тип сжатия в формате файла WebM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В описанном здесь протоколе описывается метод индукции диффузной травмы в изоляции (например, при отсутствии очагового поражения) с помощью мышиной модели повторяющихся диффузных TBI (Рисунок 1). На рисунке 1А изображено устройство для снижения веса и его компоненты(рисунок 1А, a1'a5), используемый для индукции TBI в этой модели и критических шагов во время процедуры(Рисунок 1B, b1'b5).
Характеристики этой модели включают отсутствие очагового поражения мозга в результате ТБИ, потеря сознания, высокая выживаемость, появление позднего начала захвата (Зтт;1 неделя ТБИ), и спонтанные, неспровоцированные, периодические припадки в подмножестве TBI мышей после периода задержки, по крайней мере три недели после TBI.
Этот протокол демонстрирует подробные процедуры для создания чистого хирургического поля(рисунок 2), обеспечивает пошаговый подход к имплантации различных электродных массивов(рисунок 3),и включает в себя подробное руководство по использованию двух различных систем приобретения ЭЭГ (см. Таблица материалов) для обнаружения изъятий(Рисунок 4 и Рисунок 5) в этой модели. Спектральная мощность типичного захвата указывает на самую высокую плотность в частотном диапазоне от 10 до 40 Гц с пиком в 15 Гц(рисунок 4). Большинство изъятий у мышей являются судорожными, со средней продолжительностью 12-15 с. Лишь небольшая часть изъятий не является судорожным. Тщательное сравнение преимуществ и недостатков использования любой системы подробно описано в разделе Обсуждения. Кроме того, этот протокол демонстрирует сроки начала захвата у животных после повторного падения веса TBI, показывая захват кластеризации в некоторых животных(Рисунок 6), который подчеркивает важность приобретения непрерывной, а не прерывистые записи, так как это обеспечит точное стратификации животных, которые развиваются спонтанные изъятия после TBI от тех, которые этого не делают. Важно отметить, что в этом протоколе также рассматриваются преимущества и недостатки моделей грызунов PTE и их способность представлять определенную популяцию людей после ТБИ.
Рисунок 1: Модель мыши повторяющихся диффузных TBI. (A) Устройство падения веса. (a1) Трубка падения веса. (a2) 100 г весовой стержня. (a3) Пин, держащий стержень. (a4) Строка, чтобы поднять стержень вверх при изменении высоты или удаления стержня из трубки падения веса. (a5). Пена площадку для размещения животного под трубку падения веса. (B) Процедура падения веса. (b1) Диск из нержавеющей стали расположен в центре головы между линией глаз и ушей. (b2 и b3) После визуального подтверждения того, что голова животного находится в ровном положении и пенная подушечка перемещается, помещая голову животного под трубку падения веса. (b4) Освобождение булавки, держащей вес стержня, попав в центр диска из нержавеющей стали. (b5) Мышь помещается на стерильное полотенце сразу после удара и потери сознания оценивается путем измерения времени, необходимого для животного, чтобы восстановить и право себя. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Хирургическая подготовка поля и схема размещения эЭГ-электрода. Автоматические инструменты и необходимые материалы для хирургического вмешательства и имплантации электрода готовятся перед анестезией животного для обеспечения наличия всех необходимых деталей. Это стерильная зона, и крайне важно не загрязнять эту зону нестерильными материалами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Стереотаксические ориентиры и схематическое представление размещения электродов с помощью ЭЭГ-системы 1 и 2. Верхняя панель изображает методы имплантации трех различных головных укладов, описанных в этом протоколе. (A) Единый канал ЭЭГ, биполярный монтаж. (B) Два эЭГ-канала с общей ссылкой, биполярный монтаж и один EMG-канал. (C) Три ЭЭГ-канала, используя монополярный (канал 1'2) и биполярный (канал 3) монтаж. Нижняя панель изображает головные уклады и винты, имплантированные как в верхнюю панель. Три типа винтов, используемых в этом протоколе для двух целей: как стабильные винты (ЭЭГ-система 1) или как стабильность, так и электрод (ЭЭГ-система 2). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Спонтанный захват, приобретенный с помощью системы ЭЭГ 1. Верхняя панель изображает спонтанный захват в мыши 23 дней после повторного падения веса TBI с использованием данных, полученных с помощью 1EEG headmount. (A)Пре-иктальная (предзахватная) активность. (B) Итальная (конфискация) активность. (C) Пост-иктальная (пост-припадок) депрессия. Нижняя панель: Плотность спектра мощности рассчитывается с помощью пользовательского скрипта и программного обеспечения (см. Таблицу Материалов). Средняя мощность - средняя мощность спектра мощности в эпоху (единицы: V2/Hz). Медианная частота - частота, при которой достигается 50% от общей мощности в эпоху (единицы: Гц). Средняя частота - частота, при которой достигается средняя мощность в эпоху (единицы: Гц). Спектральный край - частота, ниже которой достигается определенный пользователем процент от общей мощности в эпоху (единицы: Гц). Пиковая частота - частота, при которой максимальная мощность происходит в эпоху. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Спонтанные изъятия, приобретенные с помощью системы ЭЭГ 2. (A) Спонтанный несудорожный (электрографический) припадок у мыши через 65 дней после повторного падения веса TBI. Данные, полученные с помощью headmount 2EEG/1EMG. (B) Спонтанный судорожный припадок у мыши 97 дней после падения веса TBI. Данные, полученные с помощью headmount 3EEG. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: Изъятие частоты сроки у мышей после повторного падения веса TBI. Самый ранний приступ наблюдался через три недели после травмы. Некоторые животные развиваются кластеры изъятий в течение того же дня, а затем несколько недель без судорог. Затравливали животных в течение четырех месяцев после ТБИ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В отличие от моделей CCI и FPI, вызывающих либо фокусные или комбинации фокусных и диффузных травм, модель повторяющихся диффузных TBI, описанная в данном протоколе, позволяет индукцию диффузной травмы при отсутствии очаговой черепно-мозговой травмы и не требует переломов кожи головы или черепа и связанного с ней воспаления. Дополнительным преимуществом отсутствия краниэктомии в этой модели является то, что она позволяет не только имплантировать электроды для хронической непрерывной записи ЭЭГ, но и создание истонченного черепа черепного окна для хронического in vivo 2-фотонной визуализации животных до, сразу после, и неоднократно в течение нескольких дней, недель и даже месяцев после TBI, как описано в Шандре и Робел 201913.
Независимо от того, какая модель животных выбрана, принятый подход к сбору данных является важнейшим элементом любого успешного и всестороннего исследования. В моделях грызунов посттравматической эпилепсии частота изъятий низка14, в диапазоне от 0,3 до 0,4 изъятий в день9,15,и скрытый период до первого изъятия может длиться от дней или недель до даже месяцев после первоначальной процедуры TBI. Наконец, в отличие от нетравматических моделей, которые имеют в целом более высокую частоту изъятий в течение более короткого периода времени, в среднем только 9%-50% животных с TBI будет иметь спонтанные судороги в течение до шести месяцев8,16. Это говорит о том, что значимые исследования требуют непрерывной долгосрочной записи видео-ЭЭГ.
Всеобъемлющая цель каждой животной модели TBI заключается в том, чтобы как можно ближе воспроизвести различные формы ТБИ, найденные у пациентов с человеком, для того, чтобы лучше исследовать клеточные и молекулярные механизмы, лежащие в основе PTE. Методы в этом протоколе помогут облегчить открытие терапевтических целей, тестирование эффективности и переносимости новых профилактических и терапевтических кандидатов, а также разработку надежных биомаркеров или предикторов эпилепсии Tbi.
Потенциальные проблемы во время процедуры снижения веса
Поскольку голова не закреплена в стереотаксической раме, необходимо проявлять особую осторожность, чтобы обеспечить плоское положение головы и металлической пластины. Если взвешенный стержень попадает в металлическую пластину или голову под углом или если вес соскальзывает в сторону головы мыши, травма биомеханики будет отличаться, возможно, в результате мягкой или без травм. В прошлом металлическая пластина была приклеена к черепу, чтобы свести к минимуму изменчивость. Тем не менее, удаление металлической пластины и клея из черепа мыши после падения веса, даже если выполняется с осторожностью, индуцированных повреждений обезвождений, в результате повреждения сосудов и последующего повреждения ткани мозга даже у фиктивных животных. Кроме того, разрез требует исцеления, потенциально с участием периферического иммунного ответа, который может ввести изменчивость. По этим причинам было выбрано, чтобы опустить склеивания металлической пластины к черепу. Звери могут умереть с повторной (т.е. 3x в этом протоколе) травмы. Мыши с массой тела ниже 25 г могут не допускать повторных ударов. Хотя одиночные травмы почти никогда не приводят к смертности, до 7% C57BL/6 животных умирают после повторных ударов9. Моторный дефицит можно наблюдать у некоторых животных. Эти дефициты проявляются как задний парез или походка аномалии. Это, как правило, прогностической фактор для плохого восстановления, и рекомендуется, чтобы животное было принесено в жертву. Признаки боли или бедствия включают потерю веса, плохой уход, обезвоживание, повышенную тревожность, низкую или отсутствующие исследовательскую активность (гидрогель/восстановление, чау и/или гнездо остаются нетронутыми). Спасательная анальгезия (0,1 мг/кг бупренорфина) может вводиться подкожно каждые 8 ч в течение трех дней от TBI, чтобы облегчить боль и предотвратить животное от достижения гуманной конечной точки. Подкожный раствор лактата натрия (3 л на грамм веса животного) можно вводить два раза в день для увлажнения. Как правило, животные восстанавливаются в течение трех дней после TBI. Использование пятиступенчатой оценки состояния тела (BCS) для мониторинга животных после экспериментальных процедур рекомендуется. Этапы включают (1) Изможденные (скелетные структуры чрезвычайно заметны, позвонки чрезвычайно сегментированы); (2) Неудовлетворительно (сегментация позвоночного столба очевидна, торсальные тазовые кости легко ощутимы); (3) Хорошо кондиционированные (позвонки и позовые и подонзные таз не заметны с легким давлением); (4) Чрезмерно кондиционированный (позвоночник представляет собой непрерывный столб, позвонки ощутимы только при твердом давлении); (5) Ожирение (мышь гладкая и громоздкая, костная структура исчезает под плотью и подкожным жиром). Гуманная конечная точка достигается, когда BCS составляет 1'2, 20% или более потеря веса у взрослой мыши по сравнению с его до TBI вес, симптомы боли или бедствия не смягчаются анальгетиков, признаки членовредительства, симптомы обезвоживания, гипотермия, наличие неврологического дефицита (аномальный поход или моторный парез). Следует принять во внимание ряд возможных результатов введения по существу. Бупренорфин вводят подкожно достигает первого пика его обезболивательного эффекта на 10 мин после инъекции17. Первое воздействие происходит через несколько секунд после введения бупренорфина, что говорит о том, что первое измерение времени высыхания вряд ли будет затронуто. Однако это не может быть полностью исключено в качестве переменной. Поэтому экспериментаторам рекомендуется самостоятельно выносить суждения. Если процедура падения веса сопровождается стереотаксической хирургии и ранпрофена вводят важно отметить, что карпрофен является противовоспалительным агентом, которые могут повлиять на частоту судорог, поэтому экспериментаторы рекомендуется рассмотреть его использование тщательно.
Потенциальные проблемы во время операции
Риск заражения или инфекции будет снижен с использованием 70% этанола, но это не приведет к стерилизным условиям. Кроме того, могут использоваться стерильные хирургические перчатки. Однако стереотактический аппарат сам по себе не стерилен, поэтому любая ручная манипуляция приведет к потере стерильного состояния перчаток. Таким образом, опрыскивание 70% этанола требуется после контакта с любым нестерильным материалом во время операции. Бурение через череп в мозг создает повреждения тканей мозга и может привести к обильным кровотечениям. Создание заусенцев отверстия занимает крайнюю осторожность. Фиксация ручной сверла в стереотаксической руке и постепенное снижение предпочтительнее бурения отверстий при проведении сверла вручную. Электроды и крепления винты могут утонуть глубже, чем планировалось, повреждая dura mater (субдуральное размещение) или коры (кора). Это может вызвать обильное кровотечение и очаговое поражения. Экспериментатор должен избегать перегрева животного во время операции. Если датчик температуры не зафиксирован правильно, он не будет поддерживать необходимую температуру 37 градусов по Цельсию, вызывая перегрев, ожоги, а иногда и смерть животного в результате. Глаза животного высохают, раздражаются или повреждаются во время операции, если не смазываются, как только животное помещается в стереотактический аппарат.
Послеоперационный мониторинг
Послеоперационный мониторинг начинается сразу после завершения процедуры или операции. Наблюдайте за животным до тех пор, пока оно не проснется от наркоза и ищите наличие или отсутствие каких-либо осложнений, связанных с хирургическим вмешательством, включая кровотечение или парез. Если кровотечение наблюдается от неполного разреза закрытия, анестезируют животное, очищают место кровотечения хлоргексидином, выполняют замыкание раны, как описано выше, и верните животное в клетку восстановления. Приблизительно через 1 ч 2 ч после операции животное должно быть полностью бодрствующим от анестезии, свободно перемещаясь в клетке без признаков пареза или боли. Зверь начнет ухаживать за собой, поэтому герметизация разреза необходима для того, чтобы животное не открывало его во время ухода. После того, как животное выздоровеет, перенесите его в клетку/камеру, которая будет использоваться для получения данных ЭЭГ. Это позволит животному привыкнуть к новой среде. Это особенно важно для долгосрочной записи (месяцев). Клетка животного должна иметь гель восстановления (см. Таблица материалов),увлажненный чау, гнездо, и бутылку воды. Это позволит обеспечить надлежащее восстановление и даст животному доступ к питательным веществам и воде. Продолжайте ежедневно следить за животным. Оценка должна включать в себя (а) визуальный осмотр поведения животного на наличие признаков боли или бедствия, включая потерю веса, плохой уход, повышенную тревожность, низкую или отсутствующую исследовательскую активность (гидрогель/восстановление, чау и/или гнездо остаются нетронутыми) и правильное заживление области разреза вокруг имплантата ЭЭГ; b) оценка БКС на наличие признаков обезвоживания и недоедания; c) Вес животного. Подкожно администрирование раствора лактата натрия (3 л на грамм веса животного) если животное проявляет признаки обезвоживания (см. Таблицу материалов). Администрирование бупренорфин (0,1 мг/кг) подкожно, если животное показывает признаки боли или бедствия. Если признаки боли сохраняются бупренорфин может быть введен каждые 8 ч. Мониторинг должен быть увеличен до двух раз в день, если животное проявляет признаки боли и / или бедствия. Разрешить животному, чтобы восстановить, по крайней мере три дня после операции ЭЭГ до подключения к системе приобретения через трос. Гуманные критерии конечных точек такие же, как и в потенциальных проблемах во время процедуры снижения веса выше.
Преимущества и недостатки систем приобретения и headmounts
Основным преимуществом системы ЭЭГ 1 с одним хедмаунтом канала ЭЭГ является относительно низкая стоимость оборудования, компонентов и сервиса. Простая и простая конфигурация также позволяет пользователям настроить систему под свои предпочтения. Каждый дифференциальный усилитель обеспечивает единый эЭГ-канал, хотя несколько дифференциальных усилителей могут быть соединены друг с другом, увеличивая количество каналов для каждого животного. В этой системе, одноканальная конфигурация на одно животное была использована для приобретения хронических долгосрочных Записей ЭЭГ 20 животных одновременно. Посттравматические припадки, как правило, обобщены, и при двустороннем биполярном монтаже электродов легко обнаружить этот тип эпилептиформной активности. Недостатком такого подхода, однако, является то, что невозможно достоверно определить фокус, латерализацию или распространение эпилептиформной активности, поскольку для этого потребуется несколько каналов. Другой потенциальной проблемой может быть шумовое загрязнение одного канала с течением времени, что делает его неспособным получить полезные данные от животного. Это можно преодолеть путем объединения двух или более дифференциальных усилителей, что удваивает количество каналов на одно животное. Наконец, данные, полученные из одного канала, труднее отличить от потенциальных артефактов, а эпилептиформная активность лучше всего поддерживается видеозаписями поведения животного. По этой причине все записи сочетались в синхронизированном непрерывном видеомониторинге с приобретением ЭЭГ. Ограничение этой системы и ее программного обеспечения заключается в том, что она не включает в себя систему приобретения видео, и поэтому требует пользовательской сторонней системы для приобретения синхронного видео.
Основным преимуществом системы ЭЭГ 2 с многоканальными головными уборами является высокое качество сигнала благодаря его предварительному фильтрации приобретенного сигнала преусилителем (см. Таблица материалов)до прохождения через коммутатор на усилитель. Усилители этой системы позволяют осуществлять сбор данных по трем каналам в следующих конфигурациях: 2 канала ЭЭГ-1 ЭМГ или три канала ЭЭГ (см. Таблицу материалов). Это позволяет выявлять не только обобщенную активность, но и, потенциально, фокусную эпилептипную активность. Еще одним важным преимуществом является то, что эта система была разработана специально для исследований на животных и, следовательно, предлагает систему видеозаписи и программное обеспечение, способное синхронизировать ЭЭГ и видеоканалы для до четырех животных в одном файле, что делает анализ проще и удобнее, чем система ЭЭГ 1. Эта система проста в использовании для получения данных для захвата и анализа сна без каких-либо изменений в системе, кроме типа используемой головки. Головной убор 2EEG/1EMG позволяет имплантировать электроды только в фиксированных местах, в зависимости от размера и конфигурации печатной платы. Винтовые электроды с проводами в головных уборах 3EEG позволяют гибко имплантировать в нужном месте с возможностью сделать либо монополярное, либо биполярное приобретение в зависимости от того, где находится эталонный электрод. Тем не менее, имплантация 3EEG headmount требует пайки, что добавляет больше шагов к операции и требует дополнительной осторожности и точности. Соединительные тросы и предусилители были специально разработаны для мелких грызунов, таких как мыши и незрелые крысы, и являются тонкими, низковесными кабелями, которые вызывают небольшое давление на голову животного. Недостатком системы является относительно высокая стоимость оборудования, программного обеспечения, видео-лицензии и компонентов (т.е. предусилители и головные умы).
Значение и критические шаги в получении данных ЭЭГ
Коммутатор имеет вращающийся механизм, позволяющий тросу вращаться в зависимости от направления движения животных. Если этот механизм не сработает, движение животного будет ограничено, что может привести к снятию эЭГ-колпачка. Повторные операции по поставить новые электроды могут быть предприняты попытки. Однако, это может быть сложным или невозможным, если удаление предыдущей крышки ЭЭГ вызвало повреждение черепа и мозга. Коэффициент выборки для получения данных ЭЭГ должен быть не менее 2–2,5 х самой высокой частотой процентов. Более высокие показатели выборки приводят к более высокому разрешению данных по цене увеличения размера файла, который может стать трудным для хранения и обработки при приобретении непрерывных записей нескольких животных. Следовательно, необходимо оптимизировать частоту выборки до уровня, который позволяет получать необходимые данные без потери качества при минимизации размеров файлов.
Значение и критические шаги в приобретении видеоданных
У грызунов, как и у людей, ПТЭ может проявляться с широкой изменчивостью в связанных с ними симптоматологических и электрографических коррелятах, что делает необходимым получить одновременный видео во время приобретения ЭЭГ, чтобы правильно интерпретировать и классифицировать наблюдаемые события ЭЭГ. Интерпретация данных ЭЭГ при отсутствии синхронизированного видео особенно сложна при использовании единого канала ЭЭГ. В этом случае может быть трудно определить, является ли волновая форма ЭЭГ артефактом, если только другие доказательства (видео) не поддержат классификацию как припадок. Артефакты движения могут появиться похожими на электрографический узор захвата. Таким образом, видео с или без подтверждения ЭмГ является обязательным требованием. В то время как видеозапись выполняется во время световых и темных циклов, качество видео не всегда может быть удовлетворительным и ясным в темное время суток. Кроме того, если животное отвернулось от камеры во время иктального ЭЭГ, то оценить его поведение может быть сложно. В этих случаях приобретение электромиографии (ЭМГ) сигнала в дополнение к ЭЭГ и видео может решить проблему, предоставив информацию о мышечной активности во время более мягких поведенческих припадков (с низкими двигательными компонентами) или подтвердить отсутствие движения животных во время отсутствия, как шип-и-медленно-волновых разрядов на ЭЭГ. Потенциальные проблемы с каналом ЭМГ аналогичны проблемам с каналами ЭЭГ, такими как шумовое загрязнение, неправильное размещение электродов или ослабление электродов (или потеря контакта поверхности) в течение длительного времени записи. Использование видео вместе с анализом ЭЭГ имеет две цели: подтвердить, что событие ЭЭГ не является артефактом, вызванным движением животного (исследующее поведение, употребление алкоголя, жевание, царапины, растяжение, уход или быстрое/тяжелое дыхание) и различать судорожные и несудорожные припадки. Рекомендуется использовать модифицированную расовую шкалу для характеристики судорожных или несудорожных припадков. Этапы включают (0) Чистый электрографический захват без каких-либо идентифицируемых проявлений двигателя; (1) орофациальные автоматизмы и кивок головы; (2) Передний клонический рывок; (3) Двусторонний клонус передних конечностей; (4) Клонус и воспитание; (5) Передний клонус с воспитанием и падением. Каждый видеоканал должен четко показать всю поверхность с животным в клетке, этикетку с идентификационным номером животного, наконечник бутылки с водой, пищу и диету / гель восстановления. Для обеспечения приобретения видео в темное время суток используйте инфракрасный ночной источник. (Некоторые камеры имеют встроенные устройства или могут потребовать дополнительных деталей. Смотрите таблицу материалов). Отрегулируйте рамку по секунде и разрешение изображения. Более высокая частота кадров и разрешение приходят за счет большего размера файла. Основными недостатками приобретения видео во время длительных хронических непрерывных экспериментов являются необходимость хранения очень больших объемов данных и технические трудности, связанные с обработкой больших файлов. Необходимо также учитывать квалификацию экспериментатора для эффективного интерпретации поведенческих данных вместе с ЭЭГ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана R01 NS105807/NS/NINDS NIH HHS/United States и CURE на основе гранта CURE, полученного от Армии США медицинских исследований и материальных средств командования, Министерство обороны (DOD), через психологическое здоровье и травматического мозга программы исследований в соответствии с премией No. W81XWH-15-2-0069. Иван Квидхук высоко ценится за коррективы рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.10" screw | Pinnacle Technology Inc., KS, USA | 8209 | 0.10 inch long stainless steel |
| 0.10" screw | Pinnacle Technology Inc., KS, USA | 8403 | 0.10 inch long with pre-soldered wire lead |
| 0.12" screw | Pinnacle Technology Inc., KS, USA | 8212 | 0.12 inch long stainless steel |
| 1EEG headmount | Invitro1 (subsidiary of Plastics One), VA, USA | MS333/8-A/SPC | 3 individually Teflon-insulated platinum iridium wire electrodes (twisted or untwisted, 0.005 inch diameter) extending below threaded plastic pedestal |
| 2EEG/1EMG headmount | Pinnacle Technology Inc., KS, USA | 8201 | 2EEG/1EMG channels |
| 3% hydrogen peroxide | Pharmacy | ||
| 3EEG headmount | Pinnacle Technology Inc., KS, USA | 8235-SM-C | custom 6-Pin Connector for 3EEG channels |
| Buprenorphine | Par Pharmaceuticals, Cos. Inc., Spring Valley, NY, USA | 060969 | |
| Buprenorphine | Par Pharmaceuticals, Cos. Inc., Spring Valley, NY, USA | 060969 | |
| C57BL/6 mice | Harlan/Envigo Laboratories Inc | male, 12-16 weeks old | |
| C57BL/6 mice | The Jackson Laboratory | male, 12-16 weeks old | |
| Carprofen | Zoetis Services LLC, Parsippany, NJ, USA | 026357 | NOTE: this drug is added during weight drop only if stereotactic electrode implantation will be performed on the same day |
| Chlorhexidine antiseptic | Pharmacy | ||
| Dental cement and solvent kit | Stoelting Co., USA | 51459 | |
| Drill | Foredom | HP4-917 | |
| Drill bit | Meisinger USA, LLC, USA | HM1-005-HP | 0.5 mm, Round, 1/4, Steel |
| Dry sterilizer | Cellpoint Scientific, USA | Germinator 500 | |
| EEG System 1 | Biopac Systems, CA, USA | ||
| EEG System 2 | Pinnacle Technology Inc., KS, USA | ||
| Ethanol ≥70% | VWR, USA | 71001-652 | KOPTEC USP, Biotechnology Grade (140 Proof) |
| Eye ointment | Pro Labs Ltd, USA | Puralube Vet Ointment Sterile Ocular Lubricant available in general online stores and pharmacies | |
| Fluriso liquid for inhalation anesthesia | MWI Veterinary Supply Co., USA | 502017 | |
| Hair removal product | Church & Dwight Co., Inc., USA | Nair cream | |
| Isoflurane | MWI Veterinary Supply Co., USA | 502017 | |
| Povidone-iodine surgical solution | Purdue Products, USA | 004677 | Betadine |
| Rimadyl/Carprofen | Zoetis Services LLC, Parsippany, NJ, USA | 026357 | |
| Solder | Harware store | ||
| Soldering iron | Weller, USA | WP35 | ST7 tip, 0.8mm |
| Stainless steel disc | Custom made | ||
| Sterile cotton swabs | |||
| Sterile gauze pads | Fisher Scientific, USA | 22362178 | |
| Sterile poly-lined absorbent towels pads | Cardinal Health, USA | 3520 | |
| Tissue adhesive | 3M Animal Care Products, USA | 1469SB |
References
- Christensen, J., et al. Long-term risk of epilepsy after traumatic brain injury in children and young adults: a population-based cohort study. Lancet. 373 (9669), 1105-1110 (2009).
- Lowenstein, D. H. Epilepsy after head injury: an overview. Epilepsia. 50, Suppl 2 4-9 (2009).
- Ferguson, P. L., et al. A population-based study of risk of epilepsy after hospitalization for traumatic brain injury. Epilepsia. 51 (5), 891-898 (2010).
- Abou-Abbass, H., et al. Epidemiology and clinical characteristics of traumatic brain injury in Lebanon: A systematic review. Medicine (Baltimore). 95 (47), 5342 (2016).
- Management of Concussion/mTBI Working Group. VA/DoD Clinical Practice Guideline for Management of Concussion/Mild Traumatic Brain Injury. The Journal of Rehabilitation Research and Development. 46 (6), 1-68 (2009).
- Piccenna, L., Shears, G., O'Brien, T. J. Management of post-traumatic epilepsy: An evidence review over the last 5 years and future directions. Epilepsia Open. 2 (2), 123-144 (2017).
- Loscher, W., Brandt, C. Prevention or modification of epileptogenesis after brain insults: experimental approaches and translational research. Pharmacological Reviews. 62 (4), 668-700 (2010).
- Ostergard, T., Sweet, J., Kusyk, D., Herring, E., Miller, J. Animal models of post-traumatic epilepsy. Journal of Neuroscience Methods. 272, 50-55 (2016).
- Shandra, O., et al. Repetitive Diffuse Mild Traumatic Brain Injury Causes an Atypical Astrocyte Response and Spontaneous Recurrent Seizures. Journal of Neuroscience. 39 (10), 1944-1963 (2019).
- Foda, M. A., Marmarou, A. A new model of diffuse brain injury in rats. Part II: Morphological characterization. Journal of Neurosurgery. 80 (2), 301-313 (1994).
- Marmarou, A., et al. A new model of diffuse brain injury in rats. Part I: Pathophysiology and biomechanics. Journal of Neurosurgery. 80 (2), 291-300 (1994).
- Paxinos, G., Keith, B. J., Franklin, M. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Elsevier Science. (2007).
- Shandra, O., Robel, S. Imaging and Manipulating Astrocyte Function In Vivo in the Context of CNS Injury. Methods in Molecular Biology. 1938, 233-246 (2019).
- Pitkanen, A., Immonen, R. Epilepsy related to traumatic brain injury. Neurotherapeutics. 11 (2), 286-296 (2014).
- Kharatishvili, I., Nissinen, J. P., McIntosh, T. K., Pitkanen, A. A model of posttraumatic epilepsy induced by lateral fluid-percussion brain injury in rats. Neuroscience. 140 (2), 685-697 (2006).
- Pitkanen, A., Bolkvadze, T., Immonen, R. Anti-epileptogenesis in rodent post-traumatic epilepsy models. Neuroscience Letters. 497 (3), 163-171 (2011).
- Gades, N. M., Danneman, P. J., Wixson, S. K., Tolley, E. A. The magnitude and duration of the analgesic effect of morphine, butorphanol, and buprenorphine in rats and mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 39 (2), 8-13 (2000).
