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Behavior

Induire l’épilepsie post-traumatique dans un modèle de souris de lésions cérébrales traumatiques diffuses répétitives

Published: February 10, 2020 doi: 10.3791/60360
Automatic Translation
1, 1,2,3
1Fralin Biomedical Research Institute at Virginia Tech Carilion, 2School of Neuroscience, Virginia Tech, 3Department of Biological Sciences, Virginia Tech

Summary

Ce protocole systématique décrit un nouveau modèle animal de l’épilepsie post-traumatique après des dommages légers répétitifs de cerveau. La première partie détaille les étapes de l’induction des lésions cérébrales traumatiques à l’aide d’un modèle modifié de baisse de poids. La deuxième partie fournit des instructions sur l’approche chirurgicale pour les systèmes d’acquisition de données électroencéphalographiques à un seul et à plusieurs canaux.

Abstract

Les lésions cérébrales traumatiques (ITT) sont l’une des principales causes d’épilepsie acquise. TBI peut entraîner une lésion cérébrale focale ou diffuse. Les lésions focales sont le résultat de forces mécaniques directes, pénétrant parfois à travers le crâne, créant une lésion directe dans le tissu cérébral. Ceux-ci sont visibles pendant l’imagerie cérébrale comme zones avec la contusion, la cécité, et l’hémorragie. Les lésions focales induisent la mort neuronale et la formation de cicatrices gliales et sont présentes dans 20% -25% de toutes les personnes qui encourent un TBI. Cependant, dans la majorité des cas de TBI, les dommages sont provoqués par des forces d’accélération-décélération et le cisaillement suivant de tissu, ayant pour résultat des dommages non focals et diffus. Une sous-population de patients atteints de TBI continue de développer une épilepsie post-traumatique (TP) après une période de latence de mois ou d’années. Actuellement, il est impossible de prédire quels patients développeront le PTE, et les saisies dans les patients de PTE sont difficiles à commander, nécessitant davantage de recherche. Jusqu’à récemment, le champ était limité à seulement deux modèles d’animaux/rongeurs avec des saisies post-traumatiques spontanées validées, présentant toutes deux de grandes lésions focales avec la perte massive de tissu dans le cortex et parfois les structures subcorticales. Contrairement à ces approches, il a été déterminé que le TBI diffus induit à l’aide d’un modèle modifié de baisse de poids est suffisant pour initier le développement des saisies convulsives spontanées et non convulsives, même en l’absence de lésions focales ou de perte de tissu. Semblable aux patients humains présentant l’épilepsie post-traumatique acquise, ce modèle présente avec une période de latence après des dommages avant le début de saisie. Dans ce protocole, la communauté recevra un nouveau modèle d’épilepsie post-traumatique, détaillant comment induire le TBI diffus non-lésionnel suivi d’une surveillance continue à long terme des animaux vidéo-électroencéphalographiques au cours de plusieurs mois. Ce protocole détaillera la manipulation des animaux, la procédure de chute de poids, le placement d’électrodes pour deux systèmes d’acquisition, et les défis fréquents rencontrés pendant chacune des étapes de la chirurgie, de la surveillance postopératoire et de l’acquisition de données.

Introduction

Chaque année, l’ITC touche environ 60 millions de personnes dans le monde. Les personnes touchées sont plus à risque de développer une épilepsie, qui peut se manifester des années après la blessure initiale. Bien que les TBI graves soient associés à un risque plus élevé d’épilepsie, même l’ITC léger augmente le risque d’épilepsie d’une personne1,2,3,4. Tous les TBI peuvent être classés comme focaux, diffus ou une combinaison des deux. Les lésions cérébrales diffuses, présentes dans de nombreux, sinon tous les TCI, sont le résultat de tissus cérébraux de différentes densités de cisaillement les uns contre les autres en raison de l’accélération-décélération et des forces de rotation. Par définition, les dommages diffus se produit seulement dans l’isolement dans les dommages non-pénétrants doux/châtessifs de cerveau, dans lesquels aucune lésion de cerveau n’est visible sur des balayages de tomographiecalculées 5.

Il y a actuellement deux problèmes critiques dans la prise en charge des patients qui ont, ou sont à risque de développer, l’épilepsie post-traumatique (PTE). La première est qu’une fois que le PTE s’est manifesté, les convulsions sont résistantes aux médicaments antiépileptiques disponibles (DEA)6. Deuxièmement, les DEA sont également inefficaces pour prévenir l’épileptogénèse, et il n’existe pas d’approches thérapeutiques alternatives efficaces. Afin de combler ce déficit et de trouver de meilleures cibles thérapeutiques et des candidats pour le traitement, il sera nécessaire d’explorer de nouveaux mécanismes cellulaires et moléculaires à la racine de PTE6.

Une des caractéristiques principales de l’épilepsie post-traumatique est la période latente entre l’événement traumatique initial et le début des saisies spontanées, non provoquées, récurrentes. Les événements qui se produisent dans cette fenêtre temporelle sont un foyer naturel pour des chercheurs, parce que cette fenêtre de temps pourrait permettre le traitement et la prévention de PTE tout à fait. Les modèles animaux sont le plus couramment utilisés pour cette recherche parce qu’ils offrent plusieurs avantages distincts, dont le moindre n’est pas que la surveillance continue des patients humains serait à la fois peu pratique et coûteux sur de telles périodes potentiellement longues. En outre, les mécanismes cellulaires et moléculaires à la racine de l’épileptogenèse ne peuvent être explorés que dans les modèles animaux.

Les modèles animaux avec des crises post-traumatiques spontanées et l’épilepsie sont préférés aux modèles où les saisies sont induites après TBI par des moyens moins physiologiquement pertinents, tels que par des chimioconvulsants ou la stimulation électrique aigu, chronique, ou par l’allumeur. Les modèles post-traumatiques spontanés de saisie testent comment TBI modifie le réseau sain de cerveau menant à l’épileptogenèse. Les études utilisant la stimulation additionnelle après TBI évaluent comment l’exposition au TBI réduit le seuil de saisie et affecte la susceptibilité aux saisies. Les avantages des modèles animaux avec des saisies induites chimiquement ou avec la stimulation électrique sont en testant les mécanismes spécifiques de réfractaire aux DEA et l’efficacité des DEA existants et nouveaux. Pourtant, le degré de pertinence et de traduction de ces données à l’homme peut être ambigu7 en raison de ce qui suit: 1) les mécanismes de saisie peuvent être différents de ceux induits par TBI seul; 2) tous ces modèles ne conduisent pas à des crises spontanées7; 3) les lésions créées par l’agent convulsif lui-même, avec la canule requise pour sa livraison, ou en stimulant le placement d’électrodes dans les structures de profondeur (par exemple, l’hippocampe ou l’amygdale) peuvent déjà causer une susceptibilité accrue de saisie et même des potentiels épileptiformes hippocampiformes de champ7. En outre, certains agents convulsivants (c.-à-d., acide kainique) produisent des lésions hippocampales directes et la sclérose, qui n’est pas typique après TBI diffus.

Jusqu’à récemment, il n’existait que deux modèles animaux d’épilepsie post-traumatique : l’impact cortical contrôlé (ICC, focal) ou les blessures par percussion selle fluide (FPI, focale et diffuse)8. Les deux modèles ont comme conséquence de grandes lésions focales à côté de la perte de tissu, de l’hémorragie, et de la gliose dans les rongeurs8. Ces modèles imitent l’épilepsie post-traumatique induite par de grandes lésions focales. Une étude récente a démontré que le TBI diffus répété (3x) est suffisant pour le développement des saisies spontanées et de l’épilepsie chez les souris même en l’absence des lésions focales9,ajoutant un troisième modèle de PTE de rongeur avec des saisies récurrentes spontanées confirmées. Ce nouveau modèle imite les changements cellulaires et moléculaires induits par l’ITC diffuse, représentant mieux la population humaine avec des TBI légers et cisussifs. Dans ce modèle, la période latente de trois semaines ou plus avant l’apparition de la crise et l’émergence de crises tardives, spontanées et récurrentes permet d’étudier les causes profondes de l’épileptogenèse post-traumatique, de tester l’efficacité des approches préventives et de nouveaux candidats thérapeutiques après l’apparition de la crise, et a le potentiel pour le développement de biomarqueurs de l’épileptogénèse post-traumatique parce qu’environ la moitié des animaux développent une épilepsie post-traumatique.

Le choix du modèle animal pour l’étude de l’épilepsie post-traumatique dépend de la question scientifique, du type de lésions cérébrales étudiées et des outils qui seront utilisés pour déterminer les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents. En fin de compte, tout modèle d’épilepsie post-traumatique doit démontrer à la fois l’émergence de crises spontanées après TBI et une période de latence initiale dans un sous-ensemble d’animaux TBI, parce que pas tous les patients qui encourent un TBI continuer à développer l’épilepsie. Pour ce faire, l’électroencéphalographie (EEG) avec acquisition vidéo simultanée est utilisée dans ce protocole. Comprendre les aspects techniques qui sous-tendent le matériel et les approches d’acquisition de données est essentiel pour une interprétation précise des données. Les aspects matériels critiques comprennent le type de système d’enregistrement, le type d’électrodes (plomb visousé ou fil) et le matériel dont ils sont faits, l’acquisition vidéo synchronisée (dans le cadre du système EEG ou tiers), et les propriétés du système informatique. Il est impératif de définir les paramètres d’acquisition appropriés dans n’importe quel type de système en fonction de l’objectif de l’étude, des événements d’intérêt de l’EEG, de la méthode d’analyse plus poussée et de la durabilité du stockage des données. Enfin, la méthode de configuration des électrodes (montage) doit être envisagée, car chacune présente des avantages et des inconvénients et affectera l’interprétation des données.

Ce protocole détaille comment utiliser le modèle modifié de chute de poids de Marmarou10,11 pour induire des dommages diffus ayant pour résultat des saisies spontanées, non provoquées, récurrentes chez les souris, décrit des approches chirurgicales pour acquérir un EEG continu et multicanal simple et multicanal, et l’EEG continu et synchronisé de vidéo utilisant le montage monopolaire, bipolaire, ou mélangé.

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Protocol

Toutes les procédures animales décrites dans ce protocole ont été exécutées conformément au Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de Virginia Tech et conformément au « Guide for the Care and Use of Laboratory Animals » des National Institutes of Health. .

1. Protocole de manipulation des animaux

REMARQUE : Ce protocole vise à s’habituer aux animaux commandés par un vendeur à l’installation après l’arrivée et à les conditionner à être manipulés par l’expérimentateur. Cela améliore le bien-être des animaux en réduisant le stress et l’anxiété et simplifie certaines procédures qui nécessitent la manipulation des animaux, y compris l’induire le TBI, la surveillance postopératoire, et la connexion de l’animal au système d’acquisition.

  1. Lorsque de nombreux animaux sont reçus du vendeur, l’étiquette d’oreille et les assignent au hasard à un groupe expérimental (TBI) ou à un groupe témoin (chirurgie fictive) tout en les combinant dans des cages de 2 à 5 animaux. Les animaux de TBI de maison séparément des animaux faux parce que les souris de bidon agissent de temps en temps agressivement vers des souris qui ont subi TBI.
  2. Manipulation du jour 1 (24 à 48 h après le marquage des oreilles) : Préparer un tableau pour l’enregistrement des étiquettes d’oreilles des animaux, la date de naissance, les dates de manipulation, le poids des animaux les jours de manipulation, la durée de la manipulation et une section pour les commentaires et les observations.
  3. Coupez doucement l’animal à l’aide des deux mains. Ne saisissez pas l’animal par la queue car il induit des mécanismes de défense et une réponse au stress.
  4. Vérifier et enregistrer l’étiquette d’oreille de l’animal.
  5. Placez l’animal dans le récipient sur l’échelle de poids et enregistrez le poids.
  6. Coupez doucement l’animal avec les deux mains à nouveau et manipulez-le pendant 1 min, lui permettant de se déplacer et d’explorer dans les mains. Effectuez ceci au-dessus d’un banc dans la salle d’intervention et faites attention de ne pas laisser tomber l’animal sur le plancher.
  7. Après 1 min de manipulation, remettre l’animal dans sa cage.
  8. Répétez les étapes 1.3-1.7 pour les autres animaux dans la cage.
  9. Manipulation du jour 2 (le lendemain) : Répétez les étapes 1,2 à 1,5.
  10. Coupez doucement l’animal avec les deux mains à nouveau et manipulez-le pendant 2 min, lui permettant de se déplacer et d’explorer dans les mains. Effectuez ceci au-dessus d’un banc dans la salle d’intervention et faites attention de ne pas laisser tomber l’animal sur le plancher.
  11. Après 2 min de manipulation, remettre l’animal dans sa cage.
  12. Répétez les étapes 1.10-1.11 pour les autres animaux dans la cage.
  13. Manipulation du jour 3 (le lendemain) : Répétez les étapes 1,2 à 1,5.
  14. Coupez doucement l’animal avec les deux mains à nouveau et manipulez-le pendant 4 min, lui permettant de se déplacer et d’explorer dans les mains. Effectuez ceci au-dessus d’un banc dans la salle d’intervention et faites attention de ne pas laisser tomber l’animal sur le plancher.
  15. Après 4 min de manipulation, remettre l’animal dans sa cage.
  16. Répétez les étapes 1.14-1.15 pour les autres animaux dans la cage.
  17. Manipulation du jour 4 (jour de contrôle, 1 semaine à partir du jour de manutention 1) : Répétez les étapes 1.2-1.5.
  18. Coupez doucement l’animal avec les deux mains à nouveau et manipulez-le pendant 4 min, lui permettant de se déplacer et d’explorer dans les mains. Effectuez ceci au-dessus d’un banc dans la salle d’intervention et faites attention de ne pas laisser tomber l’animal sur le plancher.
  19. Après 4 min de manipulation, remettre l’animal dans sa cage.
  20. Répétez les étapes 1.18-1.19 pour les autres animaux dans la cage.
    REMARQUE : Le jour de manipulation de commande teste la conservation du comportement calme après un protocole de manipulation de trois jours.

2. Procédure de chute de poids

  1. Placer la souris dans une chambre d’induction. Définir le flux d’oxygène et de vide à la fois à 1 L/min et le niveau de gaz isoflurane à 3% à 5%. Anesthésiez la souris pendant 5 min.
  2. Retirez la souris de la chambre d’induction et placez-la sur un tampon en mousse. Test ezif pour l’absence de réponse à un pincement à l’orteil ou à la queue.
  3. Administrer un analgésique (0,1 mg/kg de buprénorphine) sous-cutané. Si la chirurgie de l’EEG est effectuée le même jour, administrer la buprénorphine sous-cutanée en combinaison avec le carprofène anti-inflammatoire non stéroïdien (5 mg/kg).
  4. Administrer la solution de lactate de sodium (3 ll par gramme de poids de l’animal) sous-cutanée avant ou après le dernier impact. La solution de lactate de sodium peut être mélangée avec les analgésiques pour une administration rapide en une seule injection.
    REMARQUE : La solution de lactate de sodium contient un mélange de chlorure de sodium, de chlorure de potassium, de chlorure de calcium et de lactate de sodium dans l’eau. Cette étape aide à remplacer les fluides et les électrolytes, ce qui facilite la récupération.
  5. Placez la tête de la souris sous le tube de chute de poids (Figure 1A) et placez un disque plat en acier inoxydable (1,3 cm de diamètre, 1 mm d’épaisseur et 880 mg de poids) au centre de la tête, entre la ligne des yeux et des oreilles.
    REMARQUE : Ce disque diffuse l’impact sur la surface du crâne (Figure 1B).
  6. Retirez la goupille dans le tube de chute de poids pour libérer la tige de poids de 100 g d’une hauteur de 50 cm. Pour induire la blessure de faux pour les souris témoins, retirez la tige de poids du tube pour empêcher la libération accidentelle de la goupille et la baisse de poids.
    REMARQUE : La tête de l’animal doit être placée à plat, de sorte que la tige tombe librement sur toute la surface du disque.
  7. Placez l’animal inconscient sur le dos pour la récupération sur un coussin chauffant recouvert d’une serviette absorbante polydoublée stérile. Le temps de récupération réflexe de redressement (c.-à-d., le temps qu’il prend la souris à droite elle-même de son dos) peut être mesuré comme une lecture pour le temps passé inconscient.
  8. Lorsque l’animal reprend conscience, placez-le dans une cage propre qui a été réchauffée sur un coussin chauffant, avec du gel de récupération et quelques morceaux de chow humidifiés pour récupérer pendant 45 min. Assurez-vous qu’il y a suffisamment de litière pour que la cage ne soit pas surchauffée. La surchauffe de l’animal peut s’avérer tout aussi grand obstacle à la récupération que de permettre à la souris de devenir trop froide.
  9. Après 45 min, répétez les étapes 2,1 à 2,8 deux fois, en omettant l’étape 2.3 (c.-à-d. l’administration d’analgésiques et d’anti-inflammatoires).
  10. Permettre aux animaux de récupérer pendant 1 h et 2 h si la chirurgie d’implantation d’électrodes EEG est effectuée le même jour.

3. Préparation chirurgicale sur le terrain pour l’implantation d’électrodes EEG

REMARQUE : Autoclave zona les outils chirurgicaux et les vis avant la chirurgie. Nettoyez les gants chirurgicaux en pulvérisant et en frottant avec 70 % d’éthanol avant et après avoir touché l’animal, les matériaux non stériles et entre la manipulation des animaux. Stériliser les outils chirurgicaux pendant 2 à 3 min dans le stérilisateur de perles (voir Tableau des matériaux) entre les animaux. Changez le drapé stérile avant de placer un nouvel animal dans l’appareil stéréotaxique. S’assurer que le champ chirurgical contient tous les composants nécessaires à la chirurgie (Figure 2). L’absence d’une intervention chirurgicale invasive pour induire le TBI dans ce modèle présente plusieurs avantages : 1) l’implantation des électrodes est flexible et peut être effectuée le même jour que le TBI ou après une période de temps définie; 2) le temps de récupération de l’animal est plus rapide; 3) le crâne reste intact, permettant plus de surface et de flexibilité pour implanter des électrodes.

  1. Anesthésiez la souris en gaz isoflurane de 3 % à 5 % dans une chambre à induction pendant 5 min.
  2. Transférer la souris de la chambre d’induction à l’appareil stéréotaxique et la placer sur un drapé stérile sur un coussin chauffant avec du gaz isoflurane et des tubes à vide reliés au cône du nez.
  3. Maintenir la température corporelle à 37 oC au cours de la chirurgie. Placez le capteur de température de sorte qu’il entre en contact avec la poitrine ou la paroi abdominale de la souris.
  4. Fixer la tête de l’animal en place à l’aide des barres d’oreilles.
  5. Maintenir l’anesthésie à 1,5 % à 3,5 % d’isoflurane ou à 60 respirations/min dans l’avion chirurgical (sans réponse à l’orteil ou au pincement de la queue).
  6. Appliquez une pommade pour les yeux de l’animal pour les garder lubrifiés tout au long de la chirurgie.
  7. Administrer un mélange d’analgésiques (0,1 mg/kg de buprénorphine) et de l’anti-inflammatoire non stéroïdien (5 mg/kg de carprofène) en une seule injection sous-cutanée à moins que le TBI n’ait été effectué plus tôt dans la journée, auquel cas l’animal a déjà reçu des analgésiques et des anti-inflammatoires.
    REMARQUE: Buprenorphine doit être administré à nouveau si le temps entre la première chirurgie de placement TBI et EEG dépasse 8 h ou si l’animal affiche des signes de douleur 8 h après la première administration, mais il doit être donné sans l’ajout de carprofène.
  8. Administrer la solution de lactate de sodium (3 ll par gramme du poids de l’animal) sous-cutanée pour remplacer les liquides et les électrolytes chez l’animal.
    REMARQUE : Si la chirurgie est effectuée immédiatement après le TBI, cette étape doit être chronométrée correctement. La solution de lactate de sodium doit être administrée tous les 2 h pendant que l’animal subit les procédures et une fois après la chirurgie, 2 h de l’injection précédente.
  9. Retirer les cheveux du cuir chevelu à l’aide d’une crème d’épilation.
  10. Avant de faire l’incision, désinfecter la peau du cuir chevelu avec la solution antiseptique chirurgicale povidone-iode et 70% d’éthanol en alternant les écouvillons avec des tampons de gaze stériles dans un mouvement circulaire 3x (20 s par solution à chaque fois).
  11. À l’aide d’un scalpel, faire une incision rostrale-caudale sur la ligne médiane du cuir chevelu, juste au-dessus des yeux jusqu’à l’arrière de la tête. Cette méthode d’ouverture du cuir chevelu est préférable à la coupe du cuir chevelu, car les rabats de la peau peuvent être scellés sur ou autour de l’EEG-cap offrant plus de stabilité.
    REMARQUE : Lors de la préparation du crâne pour l’implantation du front 3-EEG, il est nécessaire de couper le cuir chevelu, car la taille du front ne permettra pas la fermeture des ailerons de la peau au-dessus du front.
  12. Élargir la zone d’incision en appliquant de petits hemostats sur les bordures de peau ouvertes. Si un saignement survient après l’incision, nettoyez avec une gaze ou un écouvillon de coton stérile.
  13. Enlever délicatement le périosteume (c.-à-d. la fine membrane au-dessus de l’os crânien) à l’arme à scalpel. Si un saignement se produit au cours de cette étape, appuyez sur le site de saignement avec un coton-tige stérile jusqu’à ce qu’il s’arrête.
  14. Utilisez des cotons-tiges stériles pour nettoyer le crâne avec du peroxyde d’hydrogène, mais évitez de toucher les tissus mous entourant la zone crânienne exposée. Répétez cette étape jusqu’à ce que le crâne soit nettoyé de tout tissu mou et ait un aspect blanchâtre.
  15. Séchez le crâne à l’œil d’une gaze stérile ou d’un coton-tige.
    REMARQUE : Les étapes 3.12-3.15 sont importantes pour la fixation appropriée des électrodes et du ciment dentaire. Tout tissu mou, saignement non cautérisé, et les débris peuvent causer une infection, fixation instable du front, signal déformé ou absent, et la perte de l’implant dans les jours ou les semaines suivant la chirurgie.

4. Placement d’électrode

  1. Implanter le front unique eEG (1EEG).
    REMARQUE : Les abréviations dans les coordonnées stéréotaxiques représentent les relations spatiales et spécifient la distance en millimètres de la cible à partir du bregma à une orientation donnée sur la tête de l’animal : antérieure-postérieure (AP) et médial-latérale (ML). Dorsal-ventral n’est pas applicable dans ce protocole parce que toutes les électrodes sont placées dans l’espace épidurale plutôt que dans une certaine structure dans le cerveau (Figure 3). Vineste est une électrode active et Vin- est son électrode de référence.
    1. Utilisez une perceuse à grande vitesse avec un bit d’acier (0,5 mm, rond, 1/4 po) à 5 000 à 6 000 tours par min (rpm) pour créer six trous de bavures (trois pour les vis de stabilité et trois pour les électrodes) en utilisant les coordonnées stéréotaxiquesfournies 12. Pour les deux vis antérieures : AP 1,5 mm, ML et 1,5 mm; pour la vis postérieure : AP -5,2 mm, ML -1,5 mm; pour l’électrode au sol : AP -5,2 mm, ML et 1,5 mm; pour les électrodes d’enregistrement : AP -2,3 mm, ML et 2,7 mm, avec Vinà vers la droite et Vin- à gauche.
    2. Ajouter trois vis pour une meilleure stabilité de l’étage de la tête. À l’aide d’un tournevis, tourner les vis 1 à 1,5 x chacune pour qu’elles soient fixées de façon stable dans le crâne.
      REMARQUE : Placer les vis plus profondément endommagera le cerveau.
    3. Insérez le front 1EEG dans un bras stéréotaxique et placez le front de sorte que les trois électrodes soient situées le long de la ligne médiane crânienne. Dans cette configuration, l’électrode au sol et son ouverture respective au-dessus du front se trouve à l’arrière, l’électrode VinmD au milieu et l’électrode Vin-à-l’avant. Une marque peut être faite sur le front avec un marqueur permanent.
    4. Pliez chaque électrode de 90 degrés de sorte que l’extrémité de chaque fil soit pliée vers le bas et placée au-dessus du trou de bavure correspondant. Ensuite, mesurez 1 mm de longueur de la partie du fil qui est maintenant perpendiculaire au trou de bavure et coupez l’excédent(figure 3). Cela assurera le placement péridural des électrodes. Les électrodes doivent toucher à peine la surface du dura mater.
    5. Abaissez le front et ajustez les trois électrodes pour qu’elles correspondent au trou de bavure respectif. Pour l’enregistrement péridural, les électrodes doivent être placées au-dessus ou à peine toucher le dura mater.
    6. Préparer le ciment dentaire pour l’application en mélangeant une demi-cuillère de poudre avec plusieurs gouttes de solvant. Utilisez une spatule de mélange et remuer jusqu’à ce que le mélange final soit mastic-like, collant mais malléable, et assez raide pour être correctement condensé une fois placé sur le crâne de l’animal.
    7. Appliquer le mélange de ciment dentaire couvrant toutes les vis et les électrodes et attendre 3 à 5 min pour qu’il se solidifie. Assurez-vous de ne pas recouvrir le piédestal en plastique de ciment dentaire, car il sera impossible de connecter l’animal au navetteur avec une attache.
    8. Relâchez les hemostats tenant les rabats de peau et fermez l’incision en connectant les rabats de peau autour du piédestal en plastique. Appliquer plusieurs gouttes d’adhésif tissulaire (voir Tableau des matériaux) pour sceller les ailerons de la peau.
    9. Appliquer la chlorhexidine antiseptique à la zone autour de l’implant pour éviter l’infection. Si l’animal est sous anesthésie pendant plus de 2 h après l’injection précédente de solution de lactate de sodium, administrée lors de l’induction du TBI, administrer une autre injection sous-cutanée. Pour maintenir une bonne hydratation de l’animal, répétez l’injection tous les 2 h que l’animal passe sous anesthésie.
    10. Après la chirurgie, donner une injection finale de lactate de sodium solution 2 h après l’injection précédente. Si la chirurgie est inférieure à 2 h de long, administrer la dose finale de récupération de la solution de lactate de sodium 2 h à partir de la première injection.
    11. Retirez l’animal de l’appareil stéréotaxique et mesurez le poids de l’animal après la chirurgie de l’EEG comme référence pour la surveillance future. En raison de l’implant, le poids de l’animal sera plus grand qu’avant la chirurgie.
    12. Placez l’animal dans une cage propre sur un coussin chauffant chaud pour la récupération.
  2. Implanter les deux EEG et un EMG (2EEG/1EMG) canaux headmount.
    1. Utilisez le bregma comme point de repère pour le placement du mont de la tête. Appliquer une petite quantité d’adhésif tissulaire (voir Tableau des matériaux) sur le côté inférieur du front 2EEG/1EMG, en évitant les quatre trous de vis et placez le mont de tête 2EEG/1EMG sur la surface du crâne.
      REMARQUE : Il n’y a pas de coordonnées spécifiques pour le placement de ce front. Le front est de 8 mm de long et 5 mm de large, ce qui couvre la majeure partie de la surface crânienne. Positionner le front avec son bord avant de 3,0 mm antérieur au bregma est optimal et fournit une bonne qualité de signal. Un placement manuel rapide est nécessaire avant la goutte de cures adhésives tissulaires. Laisser environ 5 min pour que la colle de tissu guérisse complètement.
    2. Utilisez une aiguille stérile de 23 G pour créer des trous pilotes pour les vis à travers les quatre ouvertures du front. Pour ce faire, poussez doucement l’aiguille et tournez lentement jusqu’à ce que la pointe de l’aiguille pénètre dans le crâne sans endommager le cerveau. Enlever tout saignement des trous du pilote à l’aide d’un coton-tige stérile.
    3. Insérez le 0,10 dans les vis dans les trous du pilote et faites-les pivoter jusqu’à ce que chacun soit fixé dans le crâne. Cela peut être jusqu’à la moitié de la longueur de la vis, mais pas la longueur complète, car cela endommagerait la dura mater et le cortex. Si le front est positionné de sorte qu’il y ait un espace entre la surface du crâne et l’extrémité arrière du front, utilisez deux 0,12 de vis dans la partie postérieure.
    4. Faire une petite ouverture sur les côtés de la pochette bi-pack à deux composants époxy (argent-époxy). Prendre une spatule à double face et utiliser chaque côté pour ramasser une petite quantité égale de chaque composant de la poche et les mélanger ensemble. Utilisez seulement une petite quantité suffisante pour une seule chirurgie, parce que le mélange se solidifie dans les 20 min. Sceller les côtés de la poche pour éviter le séchage.
      REMARQUE : L’époxy argenté permet un bon contact électrique entre la vis et le front et améliore la stabilité des vis.
    5. Appliquer une petite quantité de ce mélange entre la tête de vis et le trou à vis, puis serrer chaque vis jusqu’à ce que sa tête repose sur la base de l’implant. Assurez-vous qu’aucun époxy argenté n’entre les deux vis parce que chaque vis sert d’électrode individuelle et, pour assurer un signal précis, elle ne doit pas entrer en contact avec l’autre vis.
    6. Si le mélange argent-époxy a été égaré, il y a une fenêtre de quelques secondes pour enlever soigneusement l’excédent pour séparer la connexion. Pliez soigneusement les deux pistes EMG à partir du bord postérieur du front pour suivre le contour de la tête et du cou de l’animal, puis insérez-les dans les muscles nuchaux.
    7. Préparer le ciment dentaire pour l’application en mélangeant une demi-cuillère de poudre avec plusieurs gouttes de solvant. Utilisez une spatule de mélange et remuer jusqu’à ce que le mélange final soit mastic-like, collant mais malléable, et assez raide pour être correctement condensé une fois placé sur le crâne de l’animal.
    8. Appliquer le mélange de ciment dentaire couvrant tout le front tout en évitant de couvrir les trous à six broches, car cela rendra impossible de connecter le pré-amplificateur. Attendez que le ciment se solidifie. Assurez-vous que la peau n’est pas scellée au front avec du ciment dentaire.
    9. Relâchez les hemostats tenant les rabats de peau et fermez l’incision en connectant les rabats de peau autour du piédestal en plastique. Appliquer plusieurs gouttes d’adhésif tissulaire pour sceller les rabats cutanés.
      REMARQUE : Si l’incision de peau a été faite plus longtemps pour permettre le redressement des fils de fil d’EMG, la peau peut être scellée avec l’adhésif de tissu ou suture. Sceller la peau avec de l’adhésif tissulaire est généralement suffisant. Cependant, si pendant l’ouverture postopératoire de surveillance de l’incision est observée, des sutures sont recommandées à la place.
    10. Appliquer la chlorhexidine antiseptique à la zone autour de l’implant pour éviter l’infection. Administrer la solution de lactate de sodium (3 ll par gramme du poids de l’animal) sous-cutané pour remplacer les liquides et les électrolytes si l’animal est sous anesthésie pendant plus de 2 h après l’injection précédente.
    11. Retirez l’animal de l’appareil stéréotaxique et mesurez le poids de l’animal après la chirurgie de l’EEG comme référence pour la surveillance future. En raison de l’implant, le poids de l’animal sera plus grand qu’avant la chirurgie.
    12. Placer l’animal dans une cage propre sur un coussin chauffant chaud, avec un gel de récupération et quelques morceaux de chow humidifiés pour la récupération.
  3. Implanter un front de trois canaux EEG (3EEG).
    1. Utilisez une perceuse à grande vitesse avec un bit d’acier (0,5 mm, rond, 1/4) à 5 000 à 6 000 tr/min pour créer six trous de bavures (trois pour les vis de stabilité et trois pour les électrodes) à l’aide des coordonnées stéréotaxiques fournies12. Pour le sol et la référence commune pour l’EEG1 et l’EEG2 : AP 5,2 mm, ML et 1,5 mm; pour eEG1 et EEG2: AP -3,0 mm, ML - 3,0 mm; pour l’EEG3 indépendant : AP -1,4 mm, ML et 1,5 mm.
    2. Placez les six électrodes à vis dans les trous de bavure.
      REMARQUE : Placer les vis plus profondément créera des dommages significatifs au cerveau. Les électrodes à vis offrent une meilleure stabilité du front.
    3. Préparer le ciment dentaire pour l’application en mélangeant une demi-cuillère de poudre avec plusieurs gouttes de solvant. Utilisez une spatule de mélange et remuer jusqu’à ce que le mélange final soit mastic-like, collant mais malléable, et assez raide pour être correctement condensé une fois placé sur le crâne de l’animal.
    4. Appliquer le mélange de ciment dentaire couvrant toute la surface exposée du crâne et chaque électrode à vis. Assurez-vous que la peau n’est pas scellée au front avec du ciment dentaire. Attendez que le ciment se solidifie légèrement. Il n’est pas nécessaire d’attendre jusqu’à la solidification complète avant de passer à l’étape suivante.
    5. Allumez le fer à souder pour le réchauffer. Placez le front 3EEG dans un bras porte-supports stéréotaxique.
      REMARQUE : Placez le front de sorte que les six positions de plomb de fil correspondent à la position des fils de chaque électrode de vis.
    6. Baisser le front de sorte que sa partie ventrale repose sur le ciment dentaire.
    7. Tournez le fil de chaque plomb de chacune des électrodes à vis avec le fil correspondant du front.
      REMARQUE : Le fait de tourner les mauvaises pistes de fil rendra l’interprétation des données compliquée ou impossible.
    8. Couper soigneusement l’excédent de fil à l’aide de ciseaux. Souder chaque paire de fil tordue pour une conduction appropriée du signal.
      REMARQUE : Chaque paire de fils doit entrer en contact avec une autre paire, sinon la qualité du signal et l’interprétation des données seront compromises.
    9. Pliez chaque paire de fils soudé autour du front, évitant le contact entre chaque paire.
      REMARQUE : Si les fils de fil ne sont pas coupés assez courts, il peut être difficile de les plier autour du front sans toucher un autre fil. Dans ce cas, pliez d’abord une paire, couvrez-la d’un mélange de ciment dentaire, attendez une heure et deux min pour se solidifier, puis procédez avec la paire suivante de la même façon.
    10. Terminer de couvrir tout le fil avec du ciment dentaire en ne laissant que la partie noire du front exposé.
      REMARQUE : Veillez à ne pas appliquer de poudre de ciment dentaire ou de mélange sur le dessus de la partie exposée du mont, car tout débris ou ciment dans les trous bloquera le contact et entraînera une absence ou un bruit de signal.
    11. Relâchez les hemostats tenant les rabats de peau. Appliquer la chlorhexidine antiseptique à la zone autour de l’implant pour éviter l’infection.
    12. Administrer la solution de lactate de sodium (3 ll par gramme du poids de l’animal) sous-cutané pour remplacer les liquides et les électrolytes si l’animal a été sous anesthésie pendant plus de 2 h après l’injection précédente.
    13. Retirez l’animal de l’appareil stéréotaxique et mesurez le poids de l’animal après la chirurgie de l’EEG comme référence pour la surveillance future. En raison de l’implant, le poids de l’animal sera plus grand qu’avant la chirurgie.
    14. Placer l’animal dans une cage propre sur un coussin chauffant chaud, avec un gel de récupération et quelques morceaux de chow humidifiés pour la récupération.
      REMARQUE : Le peroxyde d’hydrogène aide à enlever les tissus mous restants du crâne.

5. Connecter les animaux au système d’acquisition

  1. Coupez l’animal avec les deux mains pour le retirer de la cage d’acquisition et le transférer dans une zone propre avec une surface plane, comme une station de transfert d’animaux (ATS).
  2. Saisissez doucement la souris par la peau de son dos. Ne prenez pas l’animal par la queue, car cela provoque de la détresse.
  3. Identifiez l’ouverture dans le front eEG correspondant à l’électrode au sol et faites correspondre la broche respective de l’attache pour une connexion appropriée.
    REMARQUE : La connexion inversée de l’attache entre le navetteur et le front des animaux entraînera une lecture différente des électrodes et des formes d’onde potentiellement déformées.
  4. Retournez l’animal dans la cage d’acquisition et connectez l’autre extrémité de l’attache (EEG System 1) ou préamplificateur (EEG System 2) au commutateur.
    REMARQUE : Lorsque vous connectez le préamplificateur (EEG System 2) à l’attache du navetteur, faites correspondre les marques blanches aux extrémités des deux attaches. La connexion inversée entraînera des dommages permanents de l’amplificateur et nécessite des réparations par le fabricant, qui sont coûteux.
  5. Faites pivoter doucement l’attache reliant l’animal au navetteur pour s’assurer que le mécanisme fonctionne correctement et que l’animal peut se déplacer librement.

6. Paramètres d’acquisition de données EEG

  1. Définir les paramètres d’acquisition d’EEG System 1.
    1. Définir le taux d’échantillonnage à 500 Hz; 5 000; mode Norm 35 Hz; LPN éteint. Définir le filtre passe élevé à 0,5 Hz.
      REMARQUE : 100 Hz (passage bas) est intégré et ne nécessite pas d’entrée manuelle.
  2. Définir les paramètres d’acquisition d’EEG System 2.
    1. Définir le taux d’échantillonnage à 600 Hz; gain de préampli 100; 1 (EEG1,2). Définir le filtre passe bas à 100 Hz.
      REMARQUE : 1 Hz (passage élevé) est intégré et ne nécessite pas d’entrée manuelle.

7. Paramètres d’acquisition de données vidéo

  1. Définir les paramètres d’acquisition pour EEG System 1.
    REMARQUE : Un système d’acquisition vidéo tiers est nécessaire pour obtenir des données vidéo simultanées.
    1. Définir la fréquence d’image entre 15 (minimum recommandé) et 30 (maximum disponible) pour une qualité vidéo appropriée. Définir la résolution à 640 x 640 pixels. Définir le type de compression à H.264H.
  2. Définir les paramètres d’acquisition pour EEG System 2.
    REMARQUE : Ce système D’EEG offre un système vidéo et un logiciel qui synchronisent les données vidéo et EEG ensemble dans un seul fichier pour un plus grand pas de quatre animaux (voir Tableau des matériaux).
    1. Définir la fréquence d’image entre 15 (minimum recommandé) et 30 (maximum disponible) pour une qualité vidéo appropriée. Définir la résolution à 640 x 480 pixels. Définir le type de compression dans le format de fichier WebM.

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Representative Results

Le protocole décrit ici la méthode d’induction d’une blessure diffuse dans l’isolement (p. ex., en l’absence d’une lésion focale) à l’aide d’un modèle de souris de TBI diffus répétitif(figure 1). La figure 1A représente le dispositif de chute de poids et ses composants (Figure 1A, a1-a5) utilisés pour l’induction de tBI dans ce modèle et des étapes cruciales au cours de la procédure (Figure 1B, b1-b5).

Les caractéristiques de ce modèle comprennent l’absence d’une lésion focale au cerveau à la suite de l’ITC, la perte de conscience, un taux de survie élevé, l’émergence de l’apparition tardive de la crise (-1 semaine de l’ITC), et spontanée, non provoquée, saisies récurrentes dans un sous-ensemble de Souris de TBI après une période de latence d’au moins trois semaines suivant TBI.

Ce protocole démontre des procédures détaillées pour la mise en place d’un champ chirurgical propre (figure 2), fournit une approche étape par étape pour implanter différents réseaux d’électrodes (figure 3), et comprend un guide détaillé sur l’utilisation de deux différents systèmes d’acquisition de l’EEG (voir le tableau des matériaux) pour détecter les crises (figure 4 et figure 5) dans ce modèle. La puissance spectrale d’une saisie typique indique la densité la plus élevée dans la gamme de fréquence de 10 à 40 Hz avec un pic à 15 Hz (Figure 4). La majorité des crises chez la souris sont convulsives, avec une durée moyenne de 12 à 15 s. Seule une petite fraction des crises n’est pas convulsive. Une comparaison approfondie des avantages et des inconvénients de l’utilisation de l’un ou l’autre système est détaillée dans la section Discussion. En outre, ce protocole démontre les délais d’apparition de la saisie chez les animaux après une baisse répétitive du poids TBI, montrant le regroupement de la saisie chez certains animaux (figure 6) qui souligne l’importance d’acquérir des enregistrements continus plutôt que intermittents, car cela assurera une stratification précise des animaux qui développent des crises spontanées après TBI de ceux qui ne le font pas. Fait important, ce protocole traite également des avantages et des inconvénients des modèles de rongeurs de LTE et de leur capacité à représenter une population spécifique d’humains après tBI.

Figure 1
Figure 1 : Le modèle de souris du TBI diffus répétitif. (A) Dispositif de chute de poids. (a1) Tube de chute de poids. (a2) Une tige de poids de 100 g. (a3) Épingle tenant la tige. (a4) Corde pour soulever la tige si changer la hauteur ou enlever la tige du tube de chute de poids. (a5). Plaquede en mousse pour placer l’animal sous le tube de chute de poids. (B) Procédure de chute de poids. (b1) Le disque en acier inoxydable est placé au centre de la tête entre la ligne des yeux et des oreilles. (b2 et b3) Après confirmation visuelle que la tête de l’animal est en position plate et que le tampon de mousse est déplacé, plaçant la tête de l’animal sous le tube de chute de poids. (b4) Relâchez la goupille tenant la tige de poids, frappant le centre du disque en acier inoxydable. (b5) La souris est placée sur une serviette stérile immédiatement après l’impact et la perte de conscience est évaluée en mesurant le temps qu’il faut pour que l’animal récupère et se redresse. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Préparation chirurgicale sur le terrain et système de placement d’électrodes EEG. Des outils autoclaved et le matériel nécessaire pour la chirurgie et l’implantation d’électrodes sont préparés avant d’anesthésier l’animal afin d’assurer la disponibilité de toutes les pièces requises. Il s’agit d’une zone stérile et il est impératif de ne pas contaminer cette zone avec des matériaux non stériles. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Repères stéréotaxiques et représentation schématique du placement des électrodes à l’aide du système EEG 1 et 2. Le panneau supérieur décrit les méthodes d’implantation des trois frontales différentes décrites dans ce protocole. (A) Chaîne EEG unique, montage bipolaire. (B) Deux canaux EEG avec référence commune, montage bipolaire et un canal EMG. (C) Trois canaux EEG, utilisant le montage monopolaire (canal 1/2) et bipolaire (canal 3). Le panneau inférieur représente les montures et les vis implantées comme dans le panneau supérieur. Les trois types de vis utilisées dans ce protocole à deux fins : comme vis de stabilité (système EEG 1) ou à la fois stabilité et électrode (EEG System 2). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Saisie spontanée acquise à l’aide du système EEG 1. Le panneau supérieur représente une crise spontanée chez une souris 23 jours après une baisse de poids répétée TBI à l’aide des données acquises à l’aide de la tête 1EEG. (A) Activité pré-ictale (pré-saisie). (B) Activité ticale (saisie). (C) Dépression post-ictale (post-saisie). Panneau de fond : La densité du spectre de puissance est calculée à l’aide d’un script et d’un logiciel personnalisés (voir Tableau des matériaux). Puissance moyenne et puissance moyenne du spectre de puissance à l’époque (unités : V2/Hz). Fréquence médiane - fréquence à laquelle 50% de la puissance totale à l’époque est atteinte (unités: Hz). Fréquence moyenne et fréquence à laquelle la puissance moyenne à l’intérieur de l’époque est atteinte (unités : Hz). Bord spectral - fréquence en dessous de laquelle un pourcentage spécifié par l’utilisateur de la puissance totale dans l’époque est atteint (unités: Hz). Fréquence de pointe et fréquence à laquelle la puissance maximale se produit pendant l’époque. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Saisies spontanées acquises à l’aide du système EEG 2. (A) Saisie spontanée non convulsive (électrographique) chez une souris 65 jours après une baisse de poids répétée TBI. Données acquises à l’aide de 2EEG/1EMG headmount. (B) Saisie convulsive spontanée chez une souris 97 jours après la baisse de poids TBI. Données acquises à l’aide de la monture 3EEG. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6
Figure 6 : Chronologie de l’incidence des crises chez les souris après une baisse répétée du poids TBI. La saisie la plus tôt a été observée trois semaines après la blessure. Certains animaux développent des grappes de convulsions dans le même jour suivie de plusieurs semaines sans convulsions. Les animaux ont été enregistrés jusqu’à quatre mois après TBI. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

   

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Discussion

Contrairement aux modèles de l’ICC et du FPI induisant des lésions focales ou diffuses, le modèle de TBI diffus répétitif décrit dans ce protocole permet l’induction de lésions diffuses en l’absence de lésions cérébrales focales et ne nécessite pas d’ouvertures du cuir chevelu ou crâniennes et de l’inflammation associée. Un avantage supplémentaire de l’absence de craniectomy dans ce modèle est qu’il permet non seulement d’implanter les électrodes pour l’enregistrement continu chronique d’EEG, mais également la création d’une fenêtre crânienne mince-crâne pour l’imagerie in vivo chronique de 2-photon des animaux avant, immédiatement après, et à plusieurs reprises pendant des jours, des semaines, et même des mois suivant TBI comme décrit dans Shandra et Robel 201913.

Quel que soit le modèle animal choisi, l’approche d’acquisition de données adoptée est un élément crucial de toute étude approfondie et réussie. Dans les modèles de rongeurs de l’épilepsie post-traumatique la fréquence des saisies est basse14, s’étendant entre 0.3-0.4 saisies par jour9,15, et la période latente avant la première saisie peut durer n’importe où des jours ou des semaines à même des mois après la procédure initiale de TBI. Enfin, contrairement aux modèles non traumatiques, qui ont une incidence généralement plus élevée de crises sur une période plus courte, en moyenne seulement 9% à 50% des animaux atteints d’ITC auront des crises spontanées sur une période allant jusqu’à six mois8,16. Ceci suggère que les études significatives exigent l’enregistrement continu à long terme de vidéo-EEG.

L’objectif principal de chaque modèle animal de TBI est de reproduire aussi étroitement que possible les différentes formes de TBI trouvées chez les patients humains, afin de mieux étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents à l’ETC. Les techniques de ce protocole faciliteront la découverte de cibles thérapeutiques, l’essai de l’efficacité et de la tolérabilité de nouveaux candidats préventifs et thérapeutiques, et le développement de biomarqueurs ou de prédicteurs fiables de l’épilepsie suivant TBI.

Défis potentiels lors de la procédure de baisse de poids
Étant donné que la tête n’est pas fixée dans un cadre stéréotaxique, il faut faire très attention pour assurer une position plate de la tête et de la plaque métallique. Si la tige pondérée frappe la plaque métallique ou la tête à un angle ou si le poids glisse sur le côté de la tête de la souris, la biomécanique des blessures sera différente, ce qui peut entraîner une blessure plus légère ou nulle. Dans le passé, la plaque métallique était collée au crâne pour minimiser la variabilité. Cependant, l’enlèvement de la plaque métallique et de la colle du crâne de la souris après la baisse de poids, même s’il est effectué avec soin, a induit des dommages aux méninges, entraînant des dommages vasculaires et des dommages subséquents au tissu cérébral, même chez les animaux fictifs. En outre, l’incision nécessite une guérison, impliquant potentiellement une réponse immunitaire périphérique, ce qui pourrait introduire la variabilité. Pour ces raisons, il a été choisi pour omettre coller la plaque de métal au crâne. Les animaux peuvent mourir avec des blessures répétées (c.-à-d. 3x dans ce protocole). Les souris dont le poids corporel est inférieur à 25 g peuvent ne pas tolérer les impacts répétés. Bien que les blessures simples n’entraînent presque jamais de mortalité, jusqu’à 7 % des animaux C57BL/6 meurent après des impacts répétés9. Des déficits moteurs peuvent être observés chez certains animaux. Ces déficits se manifestent sous forme de paresis postérieuroue ou d’anomalies de la démarche. Il s’agit généralement d’un facteur pronostique pour une mauvaise récupération et il est recommandé que l’animal soit sacrifié. Les signes de douleur ou de détresse comprennent la perte de poids, un mauvais toilettage, la déshydratation, une anxiété accrue, une activité exploratoire faible ou absente (hydrogel/récupération, chow et/ou nichoir restent intacts). L’analgésie de sauvetage (0,1 mg/kg de buprénorphine) peut être administrée sous-cutanée tous les 8 heures pendant trois jours à partir de TBI pour soulager la douleur et empêcher l’animal d’atteindre le point de terminaison humain. La solution sous-cutanée de lactate de sodium (3 ll par gramme du poids de l’animal) peut être administrée deux fois par jour pour l’hydratation. Les animaux se rétablissent généralement dans les trois jours suivant le TBI. L’utilisation d’un score de condition corporelle en cinq étapes (BCS) pour la surveillance animale après des procédures expérimentales est recommandée. Les étapes comprennent (1) Emaciated (structures squelettiques sont extrêmement proéminentes, vertèbres extrêmement segmentées); (2) Sous-conditionné (la segmentation de la colonne vertébrale est évidente, les os pelviens dorsaux sont facilement palpables); (3) Bien conditionné (les vertèbres et le bassin dorsal ne sont pas palpables avec une légère pression); (4) Surconditionné (la colonne vertébrale est une colonne continue, vertèbres palpables seulement avec une pression ferme); (5) Obèse (la souris est lisse et encombrante, la structure osseuse disparaît sous la chair et la graisse sous-cutanée). Le point final humain est atteint lorsque le SBC est de 1 à 2, 20 % ou plus de perte de poids chez une souris adulte par rapport à son poids pré-TBI, les symptômes de douleur ou de détresse ne sont pas atténués par des analgésiques, des signes d’automutilation, des symptômes de déshydratation, d’hypothermie, de présence de déficits neurologiques (démarche anormale ou parésie motrice). Plusieurs résultats possibles de l’administration des substances devraient être pris en considération. Buprénorphine injecté sous-cutanée atteint le premier pic de son effet analgésique à 10 min après injection17. Le premier impact survient quelques secondes après l’administration de la buprénorphine, ce qui suggère que la première mesure du temps de raccordement est peu susceptible d’être affectée. Toutefois, cela ne peut pas être totalement exclu comme variable. Par conséquent, les expérimentateurs sont invités à exercer leur propre jugement. Si la procédure de chute de poids est suivie d’une chirurgie stéréotaxique et le carprofen est administré, il est important de noter que le carprofène est un agent anti-inflammatoire qui peut affecter l’incidence des crises, d’où les expérimentateurs sont invités à examiner son utilisation avec soin.

Défis potentiels pendant la chirurgie
Le risque de contamination ou d’infection sera réduit avec l’utilisation de 70% d’éthanol, mais il n’entraînera pas de conditions stériles. Alternativement, des gants chirurgicaux stériles peuvent être employés. Cependant, l’appareil stéréotaxique n’est pas lui-même stérile, de sorte que toute manipulation manuelle entraînera la perte de l’état stérile des gants. Par conséquent, la pulvérisation avec 70% d’éthanol est nécessaire après le contact avec tout matériau non stérile pendant la chirurgie. Percer à travers le crâne dans le cerveau crée des dommages au tissu cérébral et peut causer des saignements abondants. La création des trous de bavure prend un soin extrême. Fixer la perceuse dans le bras stéréotaxique et l’abaisser progressivement est préférable au forage des trous tout en maintenant la perceuse manuellement. Les électrodes et les vis de fixation peuvent s’enfoncer plus profondément que prévu, blessant le dura mater (placement sous-dural) ou le cortex (placement cortical). Cela peut causer des saignements abondants et une lésion focale. L’expérimentateur doit éviter la surchauffe de l’animal pendant la chirurgie. Si le capteur de température n’est pas fixé correctement, il ne maintiendra pas la température requise de 37 oC, ce qui causera une surchauffe, des brûlures et parfois la mort de l’animal. Les yeux de l’animal deviennent secs, irrités ou endommagés pendant la chirurgie s’ils ne sont pas lubrifiés dès que l’animal est placé dans l’appareil stéréotaxique.

Surveillance postopératoire
La surveillance postopératoire commence immédiatement après la fin de l’intervention ou de la chirurgie. Observez l’animal jusqu’à ce qu’il se réveille de l’anesthésie et recherchez la présence ou l’absence de toute complication liée à la chirurgie, y compris les saignements ou la parésie. Si des saignements sont observés à la suite de la fermeture incomplète de l’incision, anesthésiez l’animal, nettoyez le saignement avec de la chlorhexidine, observez la fermeture des plaies comme décrit ci-dessus et renvoyez l’animal à la cage de récupération. Environ 1/2 h après la chirurgie, l’animal doit être complètement éveillé de l’anesthésie, se déplaçant librement dans la cage sans signes de parésie ou de douleur. L’animal commencera à se toiletter, c’est pourquoi sceller l’incision est nécessaire pour empêcher l’animal de l’ouvrir pendant le toilettage. Une fois que l’animal a récupéré, transférez-le dans la cage ou la chambre qui sera utilisée pour l’acquisition de données EEG. Cela permettra à l’animal de s’habituer au nouvel environnement. Ceci est particulièrement important pour l’enregistrement à long terme (mois). La cage animale doit avoir un gel de récupération (voir Tableau des matériaux),chow humidifié, un nid et une bouteille d’eau. Cela permettra un rétablissement adéquat et donnera à l’animal l’accès aux nutriments et à l’eau. Continuer à surveiller l’animal tous les jours. L’évaluation doit inclure (a) L’inspection visuelle du comportement de l’animal pour détecter les signes de douleur ou de détresse, y compris la perte de poids, un mauvais toilettage, une anxiété accrue, une activité exploratoire faible ou absente (hydrogel/récupération, chow et/ou ni nestlet restent intacts) et une bonne guérison de la zone d’incision autour de l’implant EEG; b Évaluation du BCS pour déceler les signes de déshydratation et de malnutrition; c) Poids de l’animal. Administrer la solution de lactate de sodium (3 ll par gramme du poids de l’animal) sous-cutanée si l’animal présente des signes de déshydratation (voir Tableau des matériaux). Administrer la buprénorphine (0,1 mg/kg) sous-cutanée si l’animal présente des signes de douleur ou de détresse. Si des signes de douleur persistent, la buprénorphine peut être administrée tous les 8 h. La surveillance doit être augmentée à deux fois par jour si un animal montre des signes de douleur et/ou de détresse. Permettre à l’animal de récupérer pendant au moins trois jours après la chirurgie de l’EEG avant de se connecter au système d’acquisition par l’intermédiaire d’une attache. Les critères de critères de critères de fin humains sont les mêmes que dans les défis potentiels au cours de la procédure de baisse de poids ci-dessus.

Avantages et inconvénients des systèmes d’acquisition et des supports
Le principal avantage de l’EEG System 1 avec un seul front de canal EEG est le coût relativement faible du matériel, des composants et du service. La configuration simple et simple permet également aux utilisateurs de personnaliser le système à leurs préférences. Chaque amplificateur différentiel fournit un seul canal EEG, bien que plusieurs amplificateurs différentiels peuvent être connectés les uns aux autres, augmentant le nombre de canaux pour chaque animal. Dans ce système, une configuration de canal unique par animal a été utilisée pour acquérir des enregistrements chroniques à long terme de l’EEG de 20 animaux simultanément. Les crises post-traumatiques sont généralement généralisées, et avec un montage bipolaire bilatéral des électrodes, il est facile de détecter ce type d’activité épileptiforme. L’inconvénient de cette approche, cependant, est qu’il est impossible de détecter de façon fiable la focalité, la latéralisation ou la propagation de l’activité épileptiforme, car cela nécessiterait plusieurs canaux. Un autre défi potentiel peut être la contamination sonore du canal unique au fil du temps, le rendant incapable d’acquérir des données utiles de l’animal. Cela peut être surmonté en combinant deux amplificateurs différentiels ou plus, ce qui double le nombre de canaux par animal. Enfin, les données acquises à partir d’un seul canal sont plus difficiles à distinguer des artefacts potentiels, et l’activité épileptiforme est mieux soutenue par des enregistrements vidéo du comportement de l’animal. Pour cette raison, tous les enregistrements combinés synchronisé surveillance vidéo continue avec l’acquisition EEG. Une limitation de ce système et de son logiciel est qu’il n’inclut pas le système d’acquisition vidéo, et nécessite donc un système tiers personnalisé pour l’acquisition de vidéo synchrone.

Le principal avantage de l’EEG System 2 avec des fronts multicanaux est la haute qualité du signal dû à son préfiltrage du signal acquis par le préamplificateur (voir Tableau des Matériaux)avant d’être passé par le navetteur à l’amplificateur. Les amplificateurs de ce système permettent l’acquisition de données dans trois canaux dans les configurations suivantes : 2 canaux EMG EEG 1 ou trois canaux EEG (voir Tableau des Matériaux). Cela permet la détection non seulement de l’activité généralisée, mais aussi, potentiellement, l’activité épileptiforme focale. Un autre avantage majeur est que ce système a été conçu spécifiquement pour la recherche animale et offre donc un système d’enregistrement vidéo et un logiciel capable de synchroniser l’EEG et les canaux vidéo pour un jusqu’à quatre animaux dans un seul fichier, ce qui rend l’analyse plus facile et plus pratique que le système EEG 1. Ce système est facile à utiliser pour l’acquisition de données pour la saisie et l’analyse du sommeil sans aucune modification du système autre que le type de headmount utilisé. Le frontmonite 2EEG/1EMG permet d’implanter les électrodes à des endroits fixes seulement, en raison de la taille et de la configuration du circuit imprimé. Les électrodes à vis avec fils métalliques dans les monts principaux 3EEG permettent la flexibilité dans l’implantation à l’endroit désiré avec la possibilité de faire l’acquisition monopolaire ou bipolaire selon l’endroit où l’électrode de référence est placée. Cependant, l’implantation du front 3EEG nécessite une soudure, ce qui ajoute plus d’étapes à la chirurgie et nécessite une prudence et une précision supplémentaires. Les attaches et les préamplificateurs de connexion ont été spécialement conçus pour les petits rongeurs comme les souris et les rats immatures, et sont des câbles minces et de faible poids qui causent peu de pression sur la tête de l’animal. Un inconvénient du système est le coût relativement élevé du matériel, du logiciel, de la licence vidéo et des composants (c.-à-d. préamplificateurs et monts de tête).

Importance et étapes critiques dans l’acquisition de données EEG
Le commutateur a un mécanisme rotatif, permettant à l’attache de tourner en fonction de la direction du mouvement animal. Si ce mécanisme échoue, le mouvement de l’animal sera limité, ce qui peut entraîner l’enlèvement du bouchon EEG. La chirurgie répétée pour placer de nouvelles électrodes peut être essayée. Cependant, cela peut être difficile ou impossible si l’ablation du plafond eEG précédent a causé des dommages au crâne et au cerveau. Le taux d’échantillonnage pour l’acquisition de données EEG doit être d’au moins 2 à 2,5 x la fréquence d’intérêt la plus élevée. Des taux d’échantillonnage plus élevés entraînent une résolution plus élevée des données au prix d’une augmentation de la taille des fichiers, qui peut devenir difficile à stocker et à traiter lorsque des enregistrements continus de plusieurs animaux sont acquis. Par conséquent, il est nécessaire d’optimiser le taux d’échantillonnage à un niveau qui permet d’obtenir les données nécessaires sans perte de qualité tout en minimisant la taille des fichiers.

Importance et étapes critiques dans l’acquisition de données vidéo
Chez les rongeurs, comme chez l’homme, le PTE peut se manifester avec une grande variabilité dans les symptomatologies associées et les corrélations électrographiques, ce qui rend nécessaire l’obtention d’une vidéo simultanée lors de l’acquisition de l’EEG afin d’interpréter et de classer correctement les événements EEG observés. L’interprétation des données de l’EEG en l’absence de vidéo synchronisée est particulièrement difficile lorsqu’un seul canal EEG est utilisé. Dans ce cas, il peut être difficile de déterminer si la forme d’onde EEG est un artefact, à moins que d’autres éléments de preuve (vidéo) appuient la classification en tant que saisie. Les artefacts de mouvement peuvent sembler semblables au modèle électrographique de la saisie. Par conséquent, la vidéo avec ou sans confirmation EMG est une exigence. Bien que l’enregistrement vidéo soit effectué pendant les cycles de la lumière et de l’obscurité, la qualité de la vidéo peut ne pas toujours être satisfaisante et claire pendant les heures sombres. En outre, si l’animal est détourné de la caméra pendant l’événement Deeg de forme ticale, il peut être difficile d’évaluer son comportement. Dans ces cas, l’acquisition d’un signal d’électromyographie (EMG) en plus de l’EEG et de la vidéo peut résoudre le défi en fournissant des informations sur l’activité musculaire lors de crises comportementales plus douces (avec de faibles composants moteurs) ou pour confirmer l’absence de mouvement des animaux lors d’absences de pointe et de faible onde sur l’EEG. Les défis potentiels avec le canal EMG sont similaires aux défis avec les canaux EEG, tels que la contamination par le bruit, le placement incorrect des électrodes, ou les électrodes se détacher (ou perdre le contact de surface) au cours de la période prolongée de l’enregistrement. L’utilisation de la vidéo avec l’analyse de l’EEG a deux objectifs : confirmer qu’un événement EEG n’est pas un artefact causé par le mouvement de l’animal (comportement exploratoire, boire, mâcher, gratter, étirer, se toiletter, ou respirer rapidement/travaillé) et faire la différence entre les crises convulsives et non convulsives. L’utilisation d’une échelle Racine modifiée pour caractériser les crises convulsives ou non convulsives est recommandée. Les étapes incluent (0) saisie électrographique pure sans n’importe quelle manifestation motrice identifiable ; (1) Automatismes orofacial et hochement de tête; (2) Secousse clonique de membre du pays; (3) Clonus bilatéral de membre antérieur; (4) Clonus et élevage de membres antérieurs; (5) Clonus de membre du ponde avec l’élevage et la chute. Chaque canal vidéo doit clairement montrer toute la surface avec l’animal dans la cage, une étiquette avec un numéro d’identification des animaux, pointe de bouteille d’eau, nourriture, et gel régime / récupération. Pour assurer l’acquisition vidéo pendant les heures sombres, utilisez une source de nuit infrarouge. (Certaines caméras ont des dispositifs intégrés ou peuvent nécessiter des pièces supplémentaires. Voir la Table des Matériaux). Ajuster le cadre par deuxième taux et la résolution de l’image. Le taux d’image et la résolution plus élevés se présentent au prix d’une plus grande taille de fichier. Les principaux inconvénients de l’acquisition de la vidéo au cours d’expériences chroniques continues prolongées comprennent la nécessité de stocker de très grandes quantités de données et les difficultés techniques liées au traitement des fichiers volumineux. La compétence de l’expérimentateur à interpréter efficacement les données comportementales avec l’EEG doit également être prise en considération.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à révéler.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par R01 NS105807/NS/NINDS NIH HHS/United States et CURE sur la base d’une subvention CURE reçue de l’Armée des États-Unis Medical Research and Materiel Command, Department of Defense (DoD), par le biais du Psychological Health and Traumatic Brain Injury Research Program dans le cadre du Prix No. W81XWH-15-2-0069. Ivan Zuidhoek est très apprécié pour la relecture du manuscrit.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.10" screw Pinnacle Technology Inc., KS, USA 8209 0.10 inch long stainless steel
0.10" screw Pinnacle Technology Inc., KS, USA 8403 0.10 inch long with pre-soldered wire lead
0.12" screw Pinnacle Technology Inc., KS, USA 8212 0.12 inch long stainless steel
1EEG headmount Invitro1 (subsidiary of Plastics One), VA, USA MS333/8-A/SPC 3 individually Teflon-insulated platinum iridium wire electrodes (twisted or untwisted, 0.005 inch diameter) extending below threaded plastic pedestal
2EEG/1EMG headmount Pinnacle Technology Inc., KS, USA 8201 2EEG/1EMG channels
3% hydrogen peroxide Pharmacy
3EEG headmount Pinnacle Technology Inc., KS, USA 8235-SM-C custom 6-Pin Connector for 3EEG channels
Buprenorphine Par Pharmaceuticals, Cos. Inc., Spring Valley, NY, USA 060969
Buprenorphine Par Pharmaceuticals, Cos. Inc., Spring Valley, NY, USA 060969
C57BL/6 mice Harlan/Envigo Laboratories Inc male, 12-16 weeks old
C57BL/6 mice The Jackson Laboratory male, 12-16 weeks old
Carprofen Zoetis Services LLC, Parsippany, NJ, USA 026357 NOTE: this drug is added during weight drop only if stereotactic electrode implantation will be performed on the same day
Chlorhexidine antiseptic Pharmacy
Dental cement and solvent kit Stoelting Co., USA 51459
Drill Foredom HP4-917
Drill bit Meisinger USA, LLC, USA HM1-005-HP 0.5 mm, Round, 1/4, Steel
Dry sterilizer Cellpoint Scientific, USA Germinator 500
EEG System 1 Biopac Systems, CA, USA
EEG System 2 Pinnacle Technology Inc., KS, USA
Ethanol ≥70% VWR, USA 71001-652 KOPTEC USP, Biotechnology Grade (140 Proof)
Eye ointment Pro Labs Ltd, USA Puralube Vet Ointment Sterile Ocular Lubricant available in general online stores and pharmacies
Fluriso liquid for inhalation anesthesia MWI Veterinary Supply Co., USA 502017
Hair removal product Church & Dwight Co., Inc., USA Nair cream
Isoflurane MWI Veterinary Supply Co., USA 502017
Povidone-iodine surgical solution Purdue Products, USA 004677 Betadine
Rimadyl/Carprofen Zoetis Services LLC, Parsippany, NJ, USA 026357
Solder Harware store
Soldering iron Weller, USA WP35 ST7 tip, 0.8mm
Stainless steel disc Custom made
Sterile cotton swabs
Sterile gauze pads Fisher Scientific, USA 22362178
Sterile poly-lined absorbent towels pads Cardinal Health, USA 3520
Tissue adhesive 3M Animal Care Products, USA 1469SB

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References

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Comportement Numéro 156 TBI épilepsie convulsions astrogliosis EEG TBI doux commotion cérébrale TBI diffuse épilepsie post-traumatique
Induire l’épilepsie post-traumatique dans un modèle de souris de lésions cérébrales traumatiques diffuses répétitives
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Shandra, O., Robel, S. Inducing Post-Traumatic Epilepsy in a Mouse Model of Repetitive Diffuse Traumatic Brain Injury. J. Vis. Exp. (156), e60360, doi:10.3791/60360 (2020).

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