Summary
Denne systematiske protokollen beskriver en ny dyremodell av posttraumatisk epilepsi etter repeterende mild traumatisk hjerneskade. Den første delen detaljer skritt for traumatisk hjerneskade induksjon ved hjelp av en modifisert vekt fall modell. Den andre delen gir instruksjoner om kirurgisk tilnærming for en- og flerkanals elektroencefalografiske datainnsamlingssystemer.
Abstract
Traumatisk hjerneskade (TBI) er en ledende årsak til ervervet epilepsi. TBI kan resultere i en fokal eller diffus hjerneskade. Fokal skade er et resultat av direkte mekaniske krefter, noen ganger penetrerer gjennom kraniet, og skaper en direkte lesjon i hjernevevet. Disse er synlige under hjerneavbildning som områder med kontusjon, kutting og blødning. Fokale lesjoner induserer nevronal død og glial arrdannelse og er tilstede hos 20%−25% av alle mennesker som pådrar seg en TBI. Men i de fleste TBI tilfeller, skade er forårsaket av akselerasjon-retardasjon krefter og påfølgende vev klipping, noe som resulterer i ikke-fokal, diffus skade. En underpopulasjon av TBI-pasienter fortsetter å utvikle posttraumatisk epilepsi (PTE) etter en ventetid på måneder eller år. For tiden er det umulig å forutsi hvilke pasienter som vil utvikle PTE, og anfall hos PTE-pasienter er utfordrende å kontrollere, noe som krever videre forskning. Inntil nylig var feltet begrenset til bare to dyre-/gnagermodeller med validerte spontane posttraumatiske anfall, som begge presenterer med store fokale lesjoner med massivt vevstap i cortex og noen ganger subkortikale strukturer. I motsetning til disse tilnærmingene ble det fastslått at diffus tbi indusert ved hjelp av en modifisert vektdråpemodell er tilstrekkelig til å initiere utvikling av spontane konvulsive og ikke-konvulsive anfall, selv i fravær av fokale lesjoner eller vevstap. I likhet med menneskelige pasienter med ervervet posttraumatisk epilepsi, presenterer denne modellen med en ventetid etter skade før anfall utbruddet. I denne protokollen vil samfunnet bli utstyrt med en ny modell av posttraumatisk epilepsi, som beskriver hvordan man induserer diffus ikke-lesjonelt TBI etterfulgt av kontinuerlig langsiktig video-elektroencefalografisk dyreovervåking i løpet av flere måneder. Denne protokollen vil detalj dyr håndtering, vekt fall prosedyre, elektrode plassering for to oppkjøpssystemer, og hyppige utfordringer oppstått under hvert av trinnene i kirurgi, postoperativ overvåking, og datainnsamling.
Introduction
Hvert år påvirker TBI anslagsvis 60 millioner mennesker over hele verden. Berørte individer har høyere risiko for å utvikle epilepsi, noe som kan manifestere år etter den første skaden. Selv om alvorlige TBIer er forbundet med en høyere risiko for epilepsi, øker selv mild TBI en persons sjanse til å utvikle epilepsi1,2,3,4. Alle TBO-er kan klassifiseres som fokal, diffuse eller en kombinasjon av begge. Diffus hjerneskade, tilstede i mange om ikke alle TBIer, er et resultat av hjernevev av forskjellige tettheter som skjærer mot hverandre på grunn av akselerasjonsretardasjon og rotasjonskrefter. Per definisjon oppstår diffus skade bare isolert i mild /hjernerystelse, ikke-gjennomtrengende hjerneskade, der ingen hjerneskader er synlige på beregnede tomografiskanninger5.
Det er for tiden to kritiske problemer i behandling av pasienter som har, eller er i fare for, å utvikle posttraumatisk epilepsi (PTE). Den første er at når PTE har manifestert, anfall er resistente mot tilgjengelige antiepileptiske legemidler (AEDs)6. For det andre er AEDer like ineffektive for å forhindre epileptogenese, og det finnes ingen effektive alternative terapeutiske tilnærminger. For å løse dette underskuddet og finne bedre terapeutiske mål og kandidater til behandling, vil det være nødvendig å utforske nye cellulære og molekylære mekanismer ved roten av PTE6.
En av de fremtredende trekk ved posttraumatisk epilepsi er den latente perioden mellom den første traumatiske hendelsen og utbruddet av spontane, uprovoserte, tilbakevendende anfall. Hendelsene som oppstår i dette tidsmessige vinduet er et naturlig fokus for forskere, fordi dette tidsvinduet kan tillate behandling og forebygging av PTE helt. Dyremodeller brukes oftest til denne forskningen fordi de tilbyr flere forskjellige fordeler, ikke minst av dem er at kontinuerlig overvåking av menneskelige pasienter vil være både upraktisk og kostbart over slike potensielt lange tidsspenn. I tillegg kan cellulære og molekylære mekanismer ved roten av epileptogenesis bare utforskes i dyremodeller.
Dyremodeller med spontane posttraumatiske anfall og epilepsi foretrekkes fremfor modeller der anfall induseres etter TBI med mindre fysiologisk relevante midler, for eksempel ved chemoconvulsants eller elektrisk stimulering akutt, kronisk eller ved opptenning. Spontane posttraumatiske anfallsmodeller tester hvordan TBI endrer det sunne hjernenettverket som fører til epileptogenese. Studier som bruker ekstra stimulering etter TBI vurderer hvordan eksponering for TBI reduserer anfallsterskelen og påvirker mottakelighet for anfall. Fordelene med dyremodeller med anfall indusert kjemisk eller med elektrisk stimulering er i testing av de spesifikke mekanismene for refractoriness til AEDer og effekten av eksisterende og nye AEDer. Likevel kan graden av relevans og oversettelse av disse dataene til mennesker væretvetydige 7 på grunn av følgende: 1) anfallsmekanismer kan være forskjellig fra de som induseres av TBI alene; 2) ikke alle disse modellene fører til spontane anfall7; 3) lesjoner skapt av konvulsiv tupp middel selv, med kanylen som kreves for levering, eller ved å stimulere elektrodeplassering i dybdestrukturer (f.eks. hippocampus eller amygdala) kan allerede forårsake økt anfallsfølsomhet og til og med hippocampal epileptiformfeltpotensialer7. Videre produserer noen konvulsive midler (dvs. kainic syre) direkte hippocampal lesjoner og sklerose, som ikke er typisk etter diffus TBI.
Inntil nylig, bare to dyr modeller av posttraumatisk epilepsi eksisterte: kontrollert kortikal innvirkning (CCI, fokal) eller væske perkusjon skade (FPI, fokal og diffus)8. Begge modellene resulterer i store fokale lesjoner sammen med vevstap, blødning og gliose hos gnagere8. Disse modellene etterligner posttraumatisk epilepsi indusert av store fokale lesjoner. En fersk studie viste at gjentatt (3x) diffus TBI er tilstrekkelig for utvikling av spontane anfall og epilepsi hos mus selv i fravær av fokale lesjoner9, og legger til en tredje gnager PTE-modell med bekreftede spontane tilbakevendende anfall. Denne nye modellen etterligner cellulære og molekylære endringer indusert av diffuse TBI, som bedre representerer den menneskelige befolkningen med milde, hjernerystelser. I denne modellen, latent perioden på tre uker eller mer før anfall utbruddet og fremveksten av sent, spontane, tilbakevendende anfall gjør det mulig å undersøke de grunnleggende årsakene til posttraumatisk epileptogenesis, teste effekten av forebyggende tilnærminger og nye terapeutiske kandidater etter anfall utbruddet, og har potensial for utvikling av biomarkører av posttraumatisk epileptogenesis fordi omtrent halvparten av dyrene utvikler posttraumatisk epilepsi.
Valget av dyremodell for studiet av posttraumatisk epilepsi avhenger av det vitenskapelige spørsmålet, typen hjerneskade undersøkt, og hvilke verktøy som skal brukes til å bestemme de underliggende cellulære og molekylære mekanismene. Til syvende og sist må enhver modell av posttraumatisk epilepsi demonstrere både fremveksten av spontane anfall etter TBI og en innledende ventetid i en undergruppe av TBI-dyr, fordi ikke alle pasienter som pådrar seg en TBI, fortsetter å utvikle epilepsi. For å gjøre dette brukes elektroencefalografi (EEG) med samtidig videooppkjøp i denne protokollen. Det er avgjørende å forstå de tekniske aspektene bak datainnsamlingsmaskinvare og tilnærminger for nøyaktig datatolkning. De kritiske maskinvareaspektene inkluderer typen opptakssystem, type elektroder (skrue eller ledningsledning) og materiale de er laget av, synkronisert videoanskaffelse (som en del av EEG-systemet eller tredjeparten), og egenskapene til datasystemet. Det er viktig å sette de riktige oppkjøpsparametrene i alle typer systemer avhengig av studiemål, EEG-hendelser av interesse, videre analysemetode og bærekraft av datalagring. Til slutt må metoden for elektrodekonfigurasjon (montasje) vurderes, da hver har fordeler og ulemper og vil påvirke datatolkningen.
Denne protokollen beskriver hvordan du bruker den modifiserte Marmarou vektfallmodell10,11 for å indusere diffus skade som resulterer i spontan, uprovosert, tilbakevendende anfall hos mus, beskriver kirurgiske tilnærminger for å skaffe seg en enkelt- og flerkanals kontinuerlig, og synkronisert video EEG ved hjelp av monopolar, bipolar eller blandet montasje.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreprosedyrer som er beskrevet i denne protokollen ble utført i samsvar med Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) av Virginia Tech og i samsvar med National Institutes of Health's 'Guide for care and use of Laboratory Animals' .
1. Protokoll for håndtering av dyr
MERK: Denne protokollen er ment å habituate dyr bestilt fra en leverandør til anlegget etter ankomst og for å kondisjonere dem til å bli håndtert av eksperimentereren. Dette forbedrer dyrs velvære ved å redusere stress og angst og forenkler visse prosedyrer som krever håndtering av dyr, inkludert å indusere TBI, postoperativ overvåking og koble dyret til oppkjøpssystemet.
- Når mange dyr mottas fra leverandøren, øremerker og tilfeldig tilordnedem til en eksperimentell gruppe (TBI) eller kontrollgruppe (sham kirurgi) mens du kombinerer dem i bur på 2-5 dyr. Hus TBI dyr separat fra sham dyr fordi sham mus av og til handle aggressivt mot mus som gjennomgikk TBI.
- Håndteringsdag 1 (24–48 timer etter øremerking): Klargjør et diagram for hogst av dyreørekoder, fødselsdato, behandlingsdatoer, dyrevekt på håndteringsdagene, varigheten av håndteringen og en del for kommentarer og observasjoner.
- Kopp forsiktig dyret med begge hender. Ikke grip dyret ved halen som det induserer forsvarsmekanismer og en stressrespons.
- Sjekk og registrer øreproppen på dyret.
- Plasser dyret i beholderen på vektskalaen og registrer vekten.
- Kopp forsiktig dyret med begge hender igjen og håndter det i 1 min, slik at det kan bevege seg og utforske i hendene. Utfør dette over en benk i prosedyrerommet og vær forsiktig med å ikke slippe dyret på gulvet.
- Etter 1 min håndtering, plasser dyret tilbake i buret.
- Gjenta trinn 1.3−1.7 for de andre dyrene i buret.
- Håndteringsdag 2 (neste dag): Gjenta trinn 1.2−1.5.
- Kopp forsiktig dyret med begge hender igjen og håndter det i 2 min, slik at det kan bevege seg og utforske i hendene. Utfør dette over en benk i prosedyrerommet og vær forsiktig med å ikke slippe dyret på gulvet.
- Etter 2 min håndtering, plasser dyret tilbake i buret.
- Gjenta trinn 1.10−1.11 for de andre dyrene i buret.
- Håndteringsdag 3 (neste dag): Gjenta trinn 1.2−1.5.
- Kopp forsiktig dyret med begge hender igjen og håndter det i 4 min, slik at det kan bevege seg og utforske i hendene. Utfør dette over en benk i prosedyrerommet og vær forsiktig med å ikke slippe dyret på gulvet.
- Etter 4 min håndtering, plasser dyret tilbake i buret.
- Gjenta trinn 1.14−1.15 for de andre dyrene i buret.
- Håndteringsdag 4 (kontrolldag, 1 uke fra håndteringsdag 1): Gjenta trinn 1.2−1.5.
- Kopp forsiktig dyret med begge hender igjen og håndter det i 4 min, slik at det kan bevege seg og utforske i hendene. Utfør dette over en benk i prosedyrerommet og vær forsiktig med å ikke slippe dyret på gulvet.
- Etter 4 min håndtering, plasser dyret tilbake i buret.
- Gjenta trinn 1.18-1.19 for de andre dyrene i buret.
MERK: Kontrollhåndteringsdagen tester oppbevaringen av den rolige virkemåten etter en tre dagers håndteringsprotokoll.
2. Vektfall prosedyre
- Plasser musen i et induksjonskammer. Sett strømmen av oksygen og vakuum både til 1 L/min og nivået på isoflurangass en 3%−5%. Bedøve musen i 5 min.
- Fjern musen fra induksjonskammeret og legg den på en skumpute. Test for fravær av et svar på en tå eller haleklype.
- Administrer et smertestillende middel (0,1 mg/kg buprenorfin) subkutant. Hvis EEG-operasjonen utføres samme dag, administrer buprenorfin subkutant i kombinasjon med ikke-steroide antiinflammatoriske karprofen (5 mg/kg).
- Administrer natriumlaktatoppløsningen (3 μL per gram av dyrets vekt) subkutant før eller etter siste påvirkning. Natriumlaktatoppløsningen kan blandes med smertestillende midler for rask administrasjon i en enkelt injeksjon.
MERK: Natriumlaktatoppløsningen inneholder en blanding av natriumklorid, kaliumklorid, kalsiumklorid og natriumlaktat i vann. Dette trinnet bidrar til å erstatte væsker og elektrolytter, hjelpe utvinning. - Plasser musens hode under vektdråperøret (Figur 1A) og plasser en flat rustfritt stålskive (1,3 cm diameter, 1 mm tykk og 880 mg vekt) i midten av hodet, mellom linjen i øynene og ørene.
MERK: Denne platen sprer virkningen over overflaten av skallen (Figur 1B). - Fjern pinnen i vektdråperøret for å frigjøre vektstangen på 100 g fra en høyde på 50 cm. For å indusere svindelskaden for kontrollmusene, fjern vektstangen fra røret for å forhindre utilsiktet frigjøring av pinnen og vektfallet.
MERK: Dyrets hode må plasseres flatt, slik at stangen faller fritt på hele overflaten av platen. - Plasser det bevisstløse dyret på ryggen for utvinning på en varmepute dekket med et sterilt polyfôret absorberende håndkle. Den retterefleksgjenopprettingstiden (dvs. tiden det tar musen til høyre seg fra ryggen) kan måles som en avlesning for tiden som brukes bevisstløs.
- Når dyret gjenvinner bevisstheten, legg det i et rent bur som har blitt varmet på en varmepute, med gjenopprettingsgel og noen fuktede chow stykker for å komme seg i 45 min. Pass på at det er tilstrekkelig søppel slik at buret ikke blir overopphetet. Overoppheting dyret kan vise seg like stor et hinder for utvinning som tillater musen å bli for kald.
- Etter 45 min gjentar du trinn 2.1-2.8 to ganger, og utelater trinn 2.3 (dvs. administrering av smertestillende midler og antiinflammatoriske legemidler).
- La dyrene komme seg i 1-2 timer hvis EEG elektrodeimplantasjonskirurgi utføres samme dag.
3. Kirurgisk feltforberedelse for implantasjon av EEG-elektroder
MERK: Autoklav kirurgiske verktøy og skruer før operasjonen. Rengjør kirurgiske hansker ved å sprøyte og gni med 70% etanol før og etter å ha rørt dyret, ikke-sterile materialer, og mellom håndtering av dyrene. Steriliser de kirurgiske verktøyene i 2-3 min i perlesterilisatoren (se Materialerstabell) mellom dyr. Bytt steril drapering før du plasserer et nytt dyr i stereotaktisk apparat. Kontroller at det kirurgiske feltet inneholder alle nødvendige komponenter for operasjonen (Figur 2). Fraværet av en invasiv kirurgisk prosedyre for å indusere TBI i denne modellen har flere fordeler: 1) implantasjon av elektrodene er fleksibel og kan utføres på samme dag som TBI eller etter en definert tidsperiode; 2) dyrets utvinning tid er raskere; 3) kraniet forblir intakt, noe som gir mer overflateareal og fleksibilitet for implantering elektroder.
- Bedøve musen i 3%−5% isoflurangass i et induksjonskammer i 5 min.
- Overfør musen fra induksjonskammeret til stereotaktisk apparat og plasser den på en steril drapering på en varmepute med isoflurangass og vakuumrør koblet til nesekjeglen.
- Opprettholde kroppstemperaturen ved 37 °C i løpet av operasjonen. Plasser temperatursensoren slik at den kommer i kontakt med musens bryst- eller bukvegg.
- Fest dyrets hode på plass ved hjelp av ørestengene.
- Opprettholde anestesi på 1,5%−3,5% isofluran eeller på ~ 60 åndedrag / min i det kirurgiske planet (uten respons på tå eller hale klype).
- Påfør en øyesalve på dyrets øyne for å holde dem smurt gjennom operasjonen.
- Administrer en blanding av smertestillende midler (0,1 mg/kg buprenorfin) og det ikke-steroide antiinflammatoriske stoffet (5 mg/kg karprofen) i en enkelt injeksjon subkutant med mindre TBI ble utført tidligere på dagen, i så fall fikk dyret allerede smertestillende midler og antiinflammatoriske midler.
MERK: Buprenorfin skal administreres igjen dersom tiden mellom den første TBI- og EEG-plasseringsoperasjonen overstiger 8 timer eller hvis dyret viser tegn på smerte 8 timer etter første administrering, men det bør gis uten tilsetning av carprofen. - Administrer natriumlaktatoppløsning (3 μL per gram av dyrets vekt) subkutant for å erstatte væsker og elektrolytter i dyret.
MERK: Hvis operasjonen utføres umiddelbart etter TBI, må dette trinnet tidsberegnes riktig. Natriumlaktatoppløsning en annen gang, mens dyret gjennomgår prosedyrene og én gang etter operasjonen, 2 timer fra forrige injeksjon. - Fjern håret fra hodebunnen ved hjelp av en hårfjerningskrem.
- Før snittet, desinfisere huden i hodebunnen med povidon-jod kirurgisk antiseptisk løsning og 70% etanol i vekslende vattpinner med sterile gasbind pads i en sirkulær bevegelse 3x (20 s per løsning hver gang).
- Bruk en skalpell, lag et rostral-caudal snitt i hodebunnen midtlinjen fra like over øynene til baksiden av hodet. Denne metoden for hodebunnsåpning foretrekkes fremfor å kutte hodebunnen av, da hudklaffer kan forsegles over eller rundt EEG-hetten som gir mer stabilitet.
MERK: Når du forbereder skallen for implantasjon av 3-EEG-hodemonteringen, er det nødvendig å kutte hodebunnen av, da størrelsen på hodefestet ikke tillater lukking av hudklaffene over hodemonteringen. - Utvid snittområdet ved å bruke små hemostater på de åpnede hudgrensene. Hvis blødning oppstår etter snittet, rengjør med en steril bomullsgasbind eller vattpinne.
- Fjern periosteumet forsiktig (dvs. den tynne membranen over kraniebenet) med et skalpellblad. Hvis blødning oppstår i løpet av dette trinnet, trykk på blødningsstedet med en steril bomullspinne til den stopper.
- Bruk sterile bomullspinner til å rengjøre kraniet med hydrogenperoksid, men unngå å berøre bløtvev rundt det eksponerte kranielområdet. Gjenta dette trinnet til kraniet rengjøres fra bløtvev og har et hvitt utseende.
- Tørk kraniet med en steril gasbind eller bomullspinne.
MERK: Trinn 3.12−3.15 er viktige for riktig fiksering av elektrodene og tannsementen. Bløtvev, ikke-cauterized blødning, og rusk kan forårsake infeksjon, ustabil headmount fiksering, forvrengt eller fraværende signal, og tap av implantatet innen flere dager eller uker etter operasjonen.
4. Elektrodeplassering
- Implanter enkelt EEG(1EEG) kanalhodemontering.
MERK: Forkortelser i stereotaktiske koordinater representerer romlige relasjoner og angir avstanden i millimeter av målet fra bregmaen i en gitt orientering på dyrets hode: fremre bakre (AP) og medial-lateral (ML). Dorsal-ventral gjelder ikke i denne protokollen fordi alle elektroder er plassert i epiduralrommet i stedet for i en bestemt struktur i hjernen (Figur 3). Vin+ er en aktiv elektrode og Vin- er dens referanseelektrode.- Bruk en høyhastighets drill med en stålbit (0,5 mm, rund, 1/4 tommer) på ~ 5000−6000 runder per min (rpm) for å lage seks burr hull (tre for stabilitetsskruer og tre for elektroder) ved hjelp av de medfølgende stereotaktiske koordinatene12. For de to de to de to de to skruene: AP = +1,5 mm, ML = ±1,5 mm; for den ene bakre skruen: AP = -5,2 mm, ML = -1,5 mm; for bakkeelektroden: AP = -5,2 mm, ML = +1,5 mm; for opptakselektrodene: AP = -2,3 mm, ML = ±2,7 mm, med Vin+ til høyre og Vin- til venstre.
- Legg til tre skruer for økt stabilitet i hodetrinnet. Ved hjelp av en skrutrekker dreier skruene 1–1,5 x hver for å festes stabilt i kraniet.
MERK: Å plassere skruene dypere vil skade hjernen. - Sett 1EEG-hodemonteringen inn i en stereotaktisk holderarm og plasser hodefestet slik at de tre elektrodene er plassert langs kranialmidtlinjen. I denne konfigurasjonen er bakkeelektroden og den respektive åpningen på toppen av hodefjellet på baksiden, Vin+ elektroden i midten og Vin-elektroden foran. Et merke kan gjøres på hodefestet med en permanent markør.
- Bøy hver elektrode 90° slik at enden av hver ledning er bøyd nedover og er plassert over det tilsvarende burrhullet. Deretter måler du ut 1 mm lengde på den delen av ledningen som nå er vinkelrett på burrhullet og trimmer overflødig av (Figur 3). Dette vil sikre epidural plassering av elektrodene. Elektrodene skal knapt berøre dura mater overflaten.
- Senk hodemonteringen og juster alle tre elektrodene slik at de samsvarer med det respektive burrhullet. For epiduralopptak må elektrodene plasseres over eller knapt berøre dura mater.
- Forbered tannsement til påføring ved å blande en 1/2 skje pulver med flere dråper oppløsningsvæske. Bruk en blandeslikkepott og rør til den endelige blandingen er kitt-lignende, klebrig, men formbar, og stiv nok til å bli riktig kondensert når den plasseres på dyrets kranium.
- Påfør tannsementblanding som dekker alle skruer og elektroder og vent ~3−5 min til den skal stivne. Pass på at du ikke dekker plastpidestallen med tannsement, fordi det vil gjøre det umulig å koble dyret til pendleren med en tjore.
- Slipp hemostatene som holder hudklaffene og lukk snittet ved å koble hudklaffene rundt plastpidestallen. Påfør flere dråper vevlim (se Tabell av materialer)for å forsegle hudklaffene.
- Påfør klorhexidin antiseptisk til området rundt implantatet for å unngå infeksjon. Hvis dyret er under anestesi i mer enn 2 timer etter forrige injeksjon av natriumlaktatoppløsning, gitt under TBI-induksjonen, administrer en annen injeksjon subkutant. For å opprettholde riktig hydrering av dyret, gjenta injeksjonen hver 2 timer som dyret tilbringer under anestesi.
- Etter operasjonen, gi en endelig injeksjon av natriumlaktatoppløsning 2 t etter forrige injeksjon. Hvis operasjonen er mindre enn 2 timer lang, administrer den endelige gjenopprettingsdosen av natriumlaktatoppløsningen 2 t fra første injeksjon.
- Fjern dyret fra stereotaktisk apparat og måle dyrets vekt etter EEG kirurgi som en referanse for fremtidig overvåking. På grunn av implantatet vil dyrets vekt være større enn før operasjonen.
- Legg dyret i et rent bur på en varm varmepute for utvinning.
- Implanter de to EEG- og én EMG-kanaler (2EEG/1EMG).
- Bruk bregma som et landemerke for plassering av hodemonteringen. Påfør en liten mengde vevlim (se Materialtabell)på undersiden av 2EEG/1EMG-hodemonteringen, unngå de fire skruehullene og plasser 2EEG/1EMG-hodefestet på overflaten av kraniet.
MERK: Det finnes ingen spesifikke koordinater for plassering av denne hodemonteringen. Hodemonteringen er 8 mm lang og 5 mm bred, som dekker det meste av kranieoverflaten. Posisjonering av hodebraketten med forsiden 3,0 mm fremre til bregmaen er optimal og gir god signalkvalitet. Rask manuell plassering er nødvendig før dråpe vevlimkurer. La ca 5 min for vev lim å kurere helt. - Bruk en steril 23 G nål for å lage pilothull for skruene gjennom de fire åpningene i hodefestet. For å oppnå dette, skyv forsiktig nålen og roter sakte til nålenstt trenger inn i skallen uten å skade hjernen. Fjern blødninger fra pilothullene ved hjelp av en steril bomullspinne.
- Sett inn 0,10 i skruer i pilothullene og roter dem til hver er festet i skallen. Dette kan være opptil halvparten av skruelengden, men ikke hele lengden, da dette ville skade dura mater og cortex. Hvis hodemonteringen er plassert slik at det er et gap mellom skallen og den bakre enden av hodemonteringsenheten, bruk to 0,12 i skruer i den bakre delen.
- Gjør liten åpning på sidene av to-komponent epoxy (sølv-epoxy) twin-pack posen. Ta en dobbeltsidig slikkepott og bruk hver side til å øse en liten og lik mengde av hver komponent fra posen og bland dem sammen. Bruk bare en liten mengde tilstrekkelig for en enkelt operasjon, fordi blandingen stivner innen 20 min. Forsegle sidene av posen for å hindre tørking.
MERK: Sølv-epoxy gir mulighet for riktig elektrisk kontakt mellom skruen og hodefestet og forbedrer stabiliteten til skruene. - Påfør en liten mengde av denne blandingen mellom skruhode og skruehull, og stram deretter hver skrue til hodet hviler på bunnen av implantatet. Pass på at ingen sølv-epoxy kommer i kontakt mellom de to skruene fordi hver skrue fungerer som en individuell elektrode, og for å sikre et nøyaktig signal, bør den ikke komme i kontakt med den andre skruen.
- Hvis sølv-epoxy blandingen ble feilplassert, er det noen andre tidsvindu for å forsiktig øse ut overflødig for å skille tilkoblingen. Bøy forsiktig begge EMG-ledningene fra den bakre kanten av hodemonteren for å følge konturen av dyrets hode og nakke, og sett dem deretter inn i nuchal musklene.
- Forbered tannsement til påføring ved å blande en 1/2 skje pulver med flere dråper oppløsningsvæske. Bruk en blandeslikkepott og rør til den endelige blandingen er kitt-lignende, klebrig, men formbar, og stiv nok til å bli riktig kondensert når den plasseres på dyrets kranium.
- Påfør tannsementblanding som dekker hele hodefestet samtidig som du unngår å dekke de seks festehullene, da dette vil gjøre det umulig å koble til forforsterkeren. Vent ~3-5 min for at sementen skal stivne. Pass på at huden ikke er forseglet til hodemontering en tannsement.
- Slipp hemostatene som holder hudklaffene og lukk snittet ved å koble hudklaffene rundt plastpidestallen. Påfør flere dråper vevlim for å forsegle hudklaffene.
MERK: Hvis hudsnittet ble gjort lenger for å tillate retting av EMG-ledningene, kan huden forsegles med vevlim eller sutureres. Tetting av huden med vevlim er vanligvis tilstrekkelig. Men hvis under postoperativ overvåking av snittet observeres, anbefales suturer i stedet. - Påfør klorhexidin antiseptisk til området rundt implantatet for å unngå infeksjon. Administrer natriumlaktatoppløsning (3 μL per gram av dyrets vekt) subkutant for å erstatte væsker og elektrolytter hvis dyret er under anestesi i mer enn 2 timer etter forrige injeksjon.
- Fjern dyret fra stereotaktisk apparat og måle dyrets vekt etter EEG kirurgi som en referanse for fremtidig overvåking. På grunn av implantatet vil dyrets vekt være større enn før operasjonen.
- Legg dyret i et rent bur på en varm varmepute, med restitusjonsgel og noen fuktede chow stykker for utvinning.
- Bruk bregma som et landemerke for plassering av hodemonteringen. Påfør en liten mengde vevlim (se Materialtabell)på undersiden av 2EEG/1EMG-hodemonteringen, unngå de fire skruehullene og plasser 2EEG/1EMG-hodefestet på overflaten av kraniet.
- Implanter en tre EEG-kanaler (3EEG) hodemontering.
- Bruk høyhastighetsbor med en stålbit (0,5 mm, rund, 1/4) på ~ 5000−6000 rpm for å lage seks burr hull (tre for stabilitetsskruer og tre for elektroder) ved hjelp av de medfølgende stereotaktiske koordinatene12. For jord- og fellesreferanse for EEG1 og EEG2: AP = 5,2 mm, ML = ±1,5 mm; for EEG1 og EEG2: AP = -3,0 mm, ML = ±3,0 mm; uavhengig EEG3: AP =-1,4 mm, ML = ±1,5 mm.
- Plasser de seks skrueelektrodene i burrhullene.
MERK: Å plassere skruene dypere vil skape betydelig skade på hjernen. Skrueelektroder gir bedre stabilitet i hodefestet. - Forbered tannsement til påføring ved å blande en 1/2 skje pulver med flere dråper oppløsningsvæske. Bruk en blandeslikkepott og rør til den endelige blandingen er kitt-lignende, klebrig, men formbar, og stiv nok til å bli riktig kondensert når den plasseres på dyrets kranium.
- Påfør tannsementblanding som dekker hele den eksponerte overflaten av kraniet og hver skrueelektrode. Pass på at huden ikke er forseglet til hodemonteringen med tannsement. Vent ~1-2 min for at sementen skal stivne mildt. Det er ikke nødvendig å vente til full størkning før du går videre til neste trinn.
- Slå på loddejernet for å varme det opp. Plasser 3EEG-hodemonteringen i en stereotaktisk holderarm.
MERK: Plasser hodemonteringen slik at de seks trådledningsposisjonene samsvarer med posisjonen til ledningsledningene til hver skrueelektrode. - Senk hodemonteringen slik at ventrale delen hviler på toppen av tannsementen.
- Vri ledningen på hver ledning fra hver av skrueelektrodene med den tilsvarende ledningsledningen på hodefestet.
MERK: Å vri feil ledningsledninger vil gjøre datatolkning komplisert eller umulig. - Trim overflødig ledning forsiktig av med saks. Lodde hver vridd par wire for riktig signal ledning.
MERK: Hvert par ledninger må ta kontakt med et annet par, ellers vil signalkvalitet og datatolkning bli kompromittert. - Bøy hvert loddede par ledningsledninger rundt hodefestet, unngå kontakt mellom hvert par.
MERK: Hvis ledningene ikke trimmes kort nok, kan det være vanskelig å bøye dem rundt hodefestet uten å berøre en annen ledning. I dette tilfellet, bøy ett par først, dekk det med dental sement blanding, vent ~ 1-2 min for å stivne, deretter fortsette med neste par på samme måte. - Fullfør dekker alle ledningen med tannsement slik at bare den svarte delen av headmount utsatt.
MERK: Vær forsiktig så du ikke påfører tannsementpulver eller blanding på toppen av den eksponerte delen av hodefestet, da rusk eller sement i hullene vil blokkere kontakten og vil føre til enten signalfravær eller støy. - Slipp hemostatene som holder hudklaffene. Påfør klorhexidin antiseptisk til området rundt implantatet for å unngå infeksjon.
- Administrer natriumlaktatoppløsning (3 μL per gram av dyrets vekt) subkutant for å erstatte væsker og elektrolytter hvis dyret har vært under anestesi i mer enn 2 timer etter forrige injeksjon.
- Fjern dyret fra stereotaktisk apparat og måle dyrets vekt etter EEG kirurgi som en referanse for fremtidig overvåking. På grunn av implantatet vil dyrets vekt være større enn før operasjonen.
- Legg dyret i et rent bur på en varm varmepute, med restitusjonsgel og noen fuktede chow stykker for utvinning.
MERK: Hydrogenperoksid bidrar til å fjerne det gjenværende bløtvevet fra kraniet.
5. Koble dyr til oppkjøpssystemet
- Kopp dyret med begge hender for å fjerne det fra oppkjøpet buret og overføre den til et rent område med en flat overflate, som en Animal Transfer Station (ATS).
- Ta forsiktig musen ved huden på ryggen. Ikke ta dyret ved halen, da dette forårsaker nød.
- Identifiser åpningen i EEG-hodemonteringen som tilsvarer bakkeelektroden og match den respektive stiften på tetheren for riktig tilkobling.
MERK: Omvendt tilkobling av tjore fra pendleren til dyrets hodemontering vil resultere i en annen lesning fra elektrodene og potensielt forvrengte bølgeformer. - Returner dyret til oppkjøpsburet og koble den andre enden av tjore (EEG System 1) eller forforsterkeren (EEG System 2) til pendleren.
MERK: Når du kobler forforsterkeren (EEG System 2) til tjore fra pendleren, matcher du de hvite merkene på endene av begge tethers. Omvendt tilkobling vil resultere i permanent skade på forsterkeren og krever reparasjoner av produsenten, som er dyre. - Roter forsiktig tjoresomforbinder dyret til pendleren for å sikre at mekanismen fungerer som den skal og dyret kan bevege seg fritt.
6. Innstillinger for EEG-datainnsamling
- Angi EEG System 1-anskaffelsesparametere.
- Sett samplingsfrekvens til 500 Hz; få 5000; modus Norm 35 Hz; LPN av. Sett høypassfilteret til 0,5 Hz.
MERK: 100 Hz (lav pass) er innebygd og krever ikke manuell inngang.
- Sett samplingsfrekvens til 500 Hz; få 5000; modus Norm 35 Hz; LPN av. Sett høypassfilteret til 0,5 Hz.
- Angi EEG System 2-anskaffelsesparametere.
- Sett samplingsfrekvens til 600 Hz; preamp gevinst 100; 1 (EEG1,2). Sett lavpassfilteret til 100 Hz.
MERK: 1 Hz (høy pass) er innebygd og krever ikke manuell inngang.
- Sett samplingsfrekvens til 600 Hz; preamp gevinst 100; 1 (EEG1,2). Sett lavpassfilteret til 100 Hz.
7. Innstillinger for innsamling av videodata
- Angi anskaffelsesparametere for EEG System 1.
MERK: Et tredjeparts videoinnhentingssystem er nødvendig for å få samtidige videodata.- Angi bildefrekvens mellom 15 (minimum anbefalt) og 30 (maksimalt tilgjengelig) for riktig videokvalitet. Sett oppløsningen til 640 x 640 piksler. Sett komprimeringstype til H.264H.
- Angi anskaffelsesparametere for EEG System 2.
MERK: Dette EEG-systemet tilbyr et videosystem og programvare som synkroniserer video- og EEG-data sammen i en enkelt fil for opptil fire dyr (se Materialtabell).- Angi bildefrekvens mellom 15 (minimum anbefalt) og 30 (maksimalt tilgjengelig) for riktig videokvalitet. Sett oppløsningen til 640 x 480 piksler. Angi komprimeringstypen til WebM-filformatet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen som er skissert her beskriver metoden for induksjon av en diffus skade isolert (f.eks. i fravær en fokal lesjon) ved hjelp av en musemodell av repeterende diffus TBI (Figur 1). Figur 1A viser vektfallenheten og komponentene ( figur1A, a1−a5) som brukes til induksjon av TBI i denne modellen og avgjørende trinn under prosedyren (Figur 1B, b1−b5).
Kjennetegn på denne modellen inkluderer mangel på en fokal lesjon til hjernen som følge av TBI, bevissthetstap, høy overlevelse, fremveksten av sen anfallsutbrudd (> 1 uke av TBI), og spontan, uprovosert, tilbakevendende anfall i en undergruppe av TBI-mus etter en ventetid på minst tre uker etter TBI.
Denne protokollen viser detaljerte prosedyrer for å sette opp et rent kirurgisk felt (figur 2),gir en trinnvis tilnærming til implantering av forskjellige elektrodearrayer (figur 3), og inneholder en detaljert veiledning om bruk av to forskjellige EEG-anskaffelsessystemer (se Materialtabellen)for å oppdage anfall (figur 4 og figur 5) i denne modellen. Spektralkraften til et typisk anfall indikerer høyeste tetthet i frekvensområdet på 10 til 40 Hz med en topp på 15 Hz (figur 4). De fleste anfallene hos mus er kramper, med en gjennomsnittlig varighet på 12–15 s. Bare en liten brøkdel av anfaller er ikke-konvulsive. En grundig sammenligning av fordelene og ulempene ved å bruke begge systemet er beskrevet i Diskusjon-delen. Videre viser denne protokollen tidslinjene for anfall sinns hos dyr etter repeterende vektfall TBI, som viser anfallklynger hos noen dyr (Figur 6) som understreker viktigheten av å skaffe kontinuerlige i stedet for periodiske opptak, da dette vil sikre en nøyaktig stratifisering av dyr som utvikler spontane anfall etter TBI fra de som ikke gjør det. Viktigere, denne protokollen diskuterer også fordelene og ulempene ved gnagermodeller av PTE og deres evne til å representere en bestemt populasjon av mennesker etter TBI.
Figur 1: Musemodellen for repeterende diffus TBI. (A) Vektslippenhet. -Jeg har ikke noe å si. Vekt dråpe rør. - Jeg har ikkenoeå si. En vektstang på 100 g. - Jeg har ikke noe åsi. Pin holder stangen. -Jeg har ikke noe å si. Streng for å heve stangen opp hvis du endrer høyden eller fjerner stangen fra vektdråperøret. (a5). Skum pute for å plassere dyret under vekten slipp rør. (B) Vektfall prosedyre. - Jeg har ikke noe åsi. Platen i rustfritt stål er plassert i midten av hodet mellom linjen av øynene og ørene. - Jeg har ikke noe å si. Etter visuell bekreftelse på at dyrets hode er i flat posisjon og skumputen flyttes, plassere dyrets hode under vekten slipp rør. -Jeg har ikke noe å si. Slipp av pin holder vektstangen, treffer midten av rustfritt stål plate. -Jeg har ikke noe å si. Musen er plassert på et sterilt håndkle umiddelbart etter virkningen og tap av bevissthet vurderes ved å måle tiden det tar for dyret å gjenopprette og rett seg selv. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Kirurgisk feltforberedelse og EEG elektrodeplasseringsordning. Autokluserte verktøy og nødvendige materialer for kirurgi og elektrodeimplantasjon fremstilles før de bepasser dyret for å sikre tilgjengeligheten av alle nødvendige deler. Dette er en steril sone, og det er viktig å ikke forurense denne sonen med ikke-sterile materialer. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Stereotaktiske landemerker og skjematisk representasjon av elektrodeplassering ved hjelp av EEG System 1 og 2. Topppanelet viser metodene for å implantere de tre forskjellige hodemonteringene som er beskrevet i denne protokollen. (A) Enkelt EEG kanal, bipolar montasje. (B) To EEG-kanaler med felles referanse, bipolar montasje og en EMG-kanal. (C) Tre EEG-kanaler, ved hjelp av monopolar (kanal 1−2) og bipolar (kanal 3) montasje. Det nederste panelet viser hodemonteringer og skruer implantert som i det øverste panelet. De tre typene skruer som brukes i denne protokollen til to formål: som stabilitetsskruer (EEG System 1) eller både stabilitet og som elektrode (EEG System 2). Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Spontant anfall ervervet ved hjelp av EEG System 1. Topppanelet viser et spontant anfall i en mus 23 dager etter gjentatt vektfall TBI ved hjelp av data som er anskaffet ved hjelp av 1EEG-hodemontering. (A) Pre-ictal (pre-anfall) aktivitet. (B) Ictal (anfall) aktivitet. (C) Post-ictal (post-anfall) depresjon. Bunnpanel: Strømspektrumtetthet beregnes ved hjelp av egendefinert skript og programvare (se Materialtabell). Gjennomsnittlig effekt = gjennomsnittlig effekt av kraftspekteret i epoken (enheter: V2/Hz). Median frekvens = frekvens der 50 % av den totale effekten i epoken nås (enheter: Hz). Gjennomsnittlig frekvens = frekvens der den gjennomsnittlige effekten i epoken nås (enheter: Hz). Spektral kant = frekvens under hvilken en brukerspesifisert prosentandel av den totale kraften i epoken er nådd (enheter: Hz). Peak frequency = frekvens der maksimal effekt oppstår under epoken. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Spontane anfall ervervet ved hjelp av EEG System 2. (A) Spontant ikke-krampeanfall (elektrografisk) i en mus 65 dager etter gjentatt vektfall TBI. Data som er anskaffet ved hjelp av 2EEG/1EMG-hodemontering. (B) Spontankrampeanfall i en mus 97 dager etter vektfall TBI. Data som er anskaffet ved hjelp av 3EEG-hodemontering. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Tidslinje for anfallsforekomst hos mus etter gjentatt vektfall TBI. Det tidligste anfallet ble observert tre uker etter skade. Noen dyr utvikler klynger av anfall i løpet av samme dag etterfulgt av flere uker uten anfall. Dyr ble registrert opptil fire måneder etter TBI. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I motsetning til CCI- og FPI-modeller som induserer enten fokus eller kombinasjon av fokal og diffus skade, gjør modellen av repeterende diffus TBI beskrevet i denne protokollen mulighet for induksjon av diffus skade i fravær av fokal hjerneskade og krever ikke hodebunn eller kraniale åpninger og tilhørende betennelse. En ekstra fordel med fraværet av kraniektomy i denne modellen er at det gjør det mulig å ikke bare implantere elektrodene for kronisk kontinuerlig EEG-opptak, men også etableringen av et tynnet kranielt vindu for kronisk in vivo 2-fotonavbildning av dyrene før, umiddelbart etter, og gjentatte ganger i dager, uker og til og med måneder etter TBI som beskrevet i Shandra og Robel 201913.
Uavhengig av hvilken dyremodell som er valgt, er datainnsamlingstilnærmingen vedtatt et avgjørende element i enhver vellykket og omfattende studie. I gnagermodeller av posttraumatisk epilepsi er frekvensen av anfall lav14, mellom 0,3−0,4 anfall per dag9,15og latent perioden før det første anfallet kan vare alt fra dager eller uker til og med måneder etter den første TBI-prosedyren. Til slutt, i motsetning til ikke-traumatiske modeller, som har en generelt høyere forekomst av anfall over en kortere periode, i gjennomsnitt vil bare 9% -50% av dyrene med TBI ha spontane anfall over en periode på opptil seks måneder8,16. Dette tyder på at meningsfulle studier krever kontinuerlig langsiktig video-EEG-opptak.
Det overordnede målet for hver dyremodell av TBI er å reprodusere så nært som mulig de forskjellige formene for TBI som finnes hos menneskelige pasienter, for å bedre undersøke de cellulære og molekylære mekanismene som ligger til grunn for PTE. Teknikker i denne protokollen vil bidra til å lette oppdagelsen av terapeutiske mål, testing av effekt og toleranse for nye forebyggende og terapeutiske kandidater, og utvikling av pålitelige biomarkører eller prediktorer av epilepsi etter Tbi.
Potensielle utfordringer under vektfallprosedyren
Fordi hodet ikke er festet i en stereotaktisk ramme, må det tas ekstra forsiktighet for å sikre en flat posisjon på hodet og metallplaten. Hvis den vektede stangen treffer metallplaten eller hodet i en vinkel, eller hvis vekten glir av til siden av musehodet, vil skadebiomekanikk variere, noe som muligens resulterer i en mildere eller ingen skade. Tidligere ble metallplaten limt til skallen for å minimere variasjon. Imidlertid, fjerning av metallplaten og lim fra museskallen etter vektfall, selv om utført med forsiktighet, indusert skade på meningene, noe som resulterer i vaskulær skade og påfølgende skade på hjernevevet selv i sham dyr. Videre krever snittet helbredelse, potensielt involverer en perifer immunrespons, noe som kan føre til variasjon. Av disse grunnene ble det valgt å utelate liming av metallplaten til skallen. Dyr kan dø med gjentatt (dvs. 3x i denne protokollen) skade. Mus med kroppsvekt under 25 g tåler kanskje ikke gjentatte støt. Mens enkeltskader nesten aldri resulterer i dødelighet, dør opptil 7 % av C57BL/6-dyrene etter gjentatte virkninger9. Motoriske underskudd kan observeres hos noen dyr. Disse underskuddene manifesterer seg som hindlimb parese eller gangart abnormiteter. Dette er vanligvis en prognostisk faktor for dårlig utvinning, og det anbefales at dyret ofres. Tegn på smerte eller nød inkluderer vekttap, dårlig pleie, dehydrering, økt angst, lav eller fraværende utforskende aktivitet (hydrogel / gjenoppretting, chow og / eller nestlet forblir uberørt). Rescue analgesi (0,1 mg/kg buprenorfin) kan administreres subkutant hver 8 timer i tre dager fra TBI for å lindre smerten og forhindre at dyret når det humane endepunktet. Subkutan natriumlaktatoppløsning (3 μL per gram av dyrets vekt) kan administreres to ganger om dagen for hydrering. Dyr vanligvis gjenopprette innen tre dager etter TBI. Bruk av en fem trinns kroppstilstandscore (BCS) for dyreovervåking etter eksperimentelle prosedyrer anbefales. Stadiene inkluderer (1) Emaciated (skjelettstrukturer er ekstremt fremtredende, ryggvirvler ekstremt segmentert); (2) Underkondisjonert (segmentering av vertebral kolonne er tydelig, dorsal bekken bein er lett håndgripelig); (3) Godt kondisjonert (ryggvirvler og ryggbekken er ikke fremtredende håndgripelig med lite trykk); (4) Overkondisjonert (ryggraden er en kontinuerlig kolonne, ryggvirvler håndgripelig bare med fast trykk); (5) Overvektig (musen er glatt og klumpete, bein struktur forsvinner under kjøtt og subkutant fett). Det humane endepunktet nås når BCS er 1-2, 20% eller mer vekttap i en voksen mus sammenlignet med sin pre-TBI vekt, symptomer på smerte eller nød lindres ikke av smertestillende midler, tegn på selvlemlestelse, symptomer på dehydrering, hypotermi, tilstedeværelse av nevrologiske underskudd (unormal gangart eller motorparese). Flere mulige utfall av rusbehandling bør tas i betraktning. Buprenorfin injisert subkutant når den første toppen av sin smertestillende effekt ved 10 min etter injeksjon17. Den første effekten oppstår sekunder etter at buprenorfin administreres, noe som tyder på at den første målingen av rettingstiden neppe påvirkes. Dette kan imidlertid ikke fullstendig utelukkes som en variabel. Derfor anbefales eksperimenterere å utøve sin egen dømmekraft. Hvis vektfallprosedyren etterfølges av stereotaktisk kirurgi og carprofen administreres, er det viktig å merke seg at carprofen er et antiinflammatorisk middel som kan påvirke anfallsforekomsten, og dermed anbefales eksperimenterere å vurdere bruken nøye.
Potensielle utfordringer under operasjonen
Risikoen for forurensning eller infeksjon vil bli senket ved bruk av 70% etanol, men det vil ikke resultere i sterile forhold. Alternativt kan sterile kirurgiske hansker brukes. Stereotaktisk apparat er imidlertid ikke i seg selv sterilt, så enhver manuell manipulasjon vil resultere i tap av hanskenes sterile tilstand. Derfor er sprøyting med 70% etanol nødvendig etter kontakt med usterilt materiale under operasjonen. Boring gjennom kraniet inn i hjernen skaper skade på hjernevevet og kan forårsake rikelig blødning. Å lage burr hullene krever ekstrem forsiktighet. Fest håndboret i stereotaktisk arm og gradvis senke den foretrekkes fremfor boring av hullene mens du holder boret manuelt. Elektroder og fikseringsskruer kan synke dypere enn planlagt, skade dura mater (subdural plassering) eller cortex (kortikal plassering). Dette kan forårsake rikelig blødning og en fokal lesjon. Eksperimentereren må unngå overoppheting av dyret under operasjonen. Hvis temperatursensoren ikke er riktig festet, vil den ikke opprettholde den nødvendige 37 °C-temperaturen, noe som forårsaker overoppheting, brannskader og noen ganger dyrets død som et resultat. Dyrets øyne blir tørre, irriterte eller skadet under operasjonen hvis det ikke smøres så snart dyret er plassert i stereotaktisk apparat.
Postoperativ overvåking
Postoperativ overvåking begynner umiddelbart etter at prosedyren eller operasjonen avsluttes. Observer dyret til det våkner opp fra anestesi og se etter tilstedeværelse eller fravær av noen operasjonsrelaterte komplikasjoner, inkludert blødning eller parese. Hvis blødning observeres fra ufullstendig snittlukking, bedøvdyret, rengjør blødningsstedet med klorhexidin, utfør sårlukking som beskrevet ovenfor og returner dyret til gjenopprettingsburet. Omtrent 1–2 timer etter operasjonen skal dyret være helt våken fra anestesi, og bevege seg fritt i buret uten tegn på parese eller smerte. Dyret vil begynne å pleie seg selv, og derfor er det nødvendig å forsegle snittet for å hindre at dyret åpner det under grooming. Når dyret er gjenopprettet, overføre det til buret / kammeret som skal brukes til EEG datainnsamling. Dette vil tillate dyret å bli habituated til det nye miljøet. Dette er spesielt viktig for langsiktig opptak (måneder). Dyreburet må ha en gjenopprettingsgel (se Materialtabell),fuktet chow, en nestlet og en vannflaske. Dette vil tillate riktig utvinning og vil gi dyret tilgang til næringsstoffer og vann. Fortsett å overvåke dyret daglig. Vurderingen må omfatte (a) Visuell inspeksjon av dyrets oppførsel for tegn på smerte eller nød, inkludert vekttap, dårlig pleie, økt angst, lav eller fraværende utforskende aktivitet (hydrogel / gjenoppretting, chow og / eller nestlet forblir uberørt) og riktig helbredelse av snittområdet rundt EEG-implantatet; (b) Vurdering av BCS for tegn på dehydrering og underernæring; (c) Dyrets vekt. Administrer natriumlaktatoppløsning (3 μL per gram av dyrets vekt) subkutant hvis dyret viser tegn på dehydrering (se Materialtabell). Administrer buprenorfin (0,1 mg/kg) subkutant hvis dyret viser tegn på smerte eller nød. Hvis tegn på smerte vedvarer buprenorfin kan administreres hver 8 h. Overvåking må økes til to ganger om dagen hvis et dyr viser tegn på smerte og/eller nød. La dyret komme seg i minst tre dager etter EEG-operasjonen før de kobler til oppkjøpssystemet via en tjore. De humane endepunktkriteriene er de samme som i potensielle utfordringer under vektfallprosedyren ovenfor.
Fordeler og ulemper ved oppkjøpssystemer og hodemonteringer
Den største fordelen med EEG System 1 med en enkelt EEG kanal headmount er den relativt lave kostnaden for maskinvare, komponenter og service. Den enkle og enkle konfigurasjonen gjør det også mulig for brukere å tilpasse systemet til sine preferanser. Hver differensialforsterker gir en enkelt EEG-kanal, selv om flere differensialforsterkere kan kobles til hverandre, noe som øker antall kanaler for hvert dyr. I dette systemet ble en enkeltkanalkonfigurasjon per dyr brukt til å skaffe kroniske langsiktige EEG-opptak på 20 dyr samtidig. Posttraumatiske anfall er vanligvis generalisert, og med en bilateral bipolar montasje av elektrodene er det lett å oppdage denne typen epileptiformaktivitet. Ulempen med denne tilnærmingen er imidlertid at det er umulig å på en pålitelig måte oppdage brennhet, lateralisering eller forplantning av epileptiformaktivitet, da dette ville kreve flere kanaler. En annen potensiell utfordring kan være støyforurensning av enkeltkanalen over tid, noe som gjør den ute av stand til å skaffe nyttige data fra dyret. Dette kan overvinnes ved å kombinere to eller flere differensialforsterkere, noe som dobler antall kanaler per dyr. Til slutt er data hentet fra en enkelt kanal vanskeligere å skille mellom potensielle artefakter, og epileptiformaktivitet støttes best av videoopptak av dyrets oppførsel. Av denne grunn, alle opptakene kombinert synkronisert kontinuerlig videoovervåking med EEG oppkjøp. En begrensning av dette systemet og programvaren er at det ikke inkluderer videooppkjøpssystemet, og krever derfor et tilpasset tredjepartssystem for å anskaffe synkron video.
Den store fordelen med EEG System 2 med flerkanals hodemonteringer er den høye kvaliteten på signalet på grunn av forfilterisering av det oppkjøpte signalet av forforsterkeren (se Materialtabell) før den sendes gjennom pendleren til forsterkeren. Forsterkere i dette systemet tillater innsamling av data i tre kanaler i følgende konfigurasjoner: 2 EEG +1 EMG-kanaler eller tre EEG-kanaler (se Materialtabell). Dette gjør det mulig å oppdage ikke bare generalisert aktivitet, men også potensielt fokal epileptiform aktivitet. En annen stor fordel er at dette systemet ble designet spesielt for dyreforskning og dermed tilbyr et videoopptaksystem og programvare som er i stand til å synkronisere EEG og videokanaler for opptil fire dyr i en enkelt fil, noe som gjør analysen enklere og mer praktisk enn EEG-systemet 1. Dette systemet er enkelt å bruke for innsamling av data for anfall og søvnanalyse uten noen endringer i systemet annet enn hvilken type hodemontering som brukes. 2EEG/1EMG-hodemonteringen gjør det kun mulig å implantere elektrodene på faste steder, på grunn av størrelsen og konfigurasjonen av kretskortet. Skrueelektrodene med ledningsledninger i 3EEG-hodemonter gir fleksibilitet i implantering på ønsket sted med mulighet til å gjøre enten monopolar eller bipolar oppkjøp, avhengig av hvor referanseelektroden er plassert. Implantering av 3EEG-hodemonteringen krever imidlertid lodding, noe som legger til flere trinn i operasjonen og krever ekstra forsiktighet og presisjon. De sammenkoblede tethers og forforsterkerne ble spesielt designet for små gnagere som mus og umodne rotter, og er tynne, lavvektskabler som forårsaker lite trykk på dyrets hode. En ulempe med systemet er den relativt høye kostnaden for maskinvare, programvare, videolisens og komponenter (dvs. forforsterkere og hodemonteringer).
Betydning og kritiske trinn i EEG-datainnsamling
Pendleren har en roterende mekanisme, slik at tjore å rotere avhengig av retningen av dyr bevegelse. Hvis denne mekanismen mislykkes, vil dyrets bevegelse bli begrenset, noe som kan føre til fjerning av EEG-hetten. Gjentatt kirurgi for å plassere nye elektroder kan forsøkes. Dette kan imidlertid være utfordrende eller umulig hvis fjerning av den forrige EEG-hetten forårsaket skade på skallen og hjernen. Samplingsprosenten for EEG-datainnhenting må være minst 2–2,5 x den høyeste rentefrekvensen. Høyere samplingsfrekvenser resulterer i høyere oppløsning av dataene til prisen av en økning i filstørrelsen, noe som kan bli vanskelig å lagre og behandle når kontinuerlige opptak av flere dyr er anskaffet. Derfor er det nødvendig å optimalisere samplingsfrekvensen til et nivå som gjør det mulig å skaffe de nødvendige dataene uten tap av kvalitet samtidig som filstørrelsene minimeres.
Betydning og kritiske trinn i videodatainnsamling
Hos gnagere, som hos mennesker, kan PTE manifestere seg med bred variasjon i assosiert symptomatologi og elektrografisk korrelerer, noe som gjør det nødvendig å få en samtidig video under EEG-oppkjøpet for å tolke og klassifisere de observerte EEG-hendelsene på riktig måte. Tolkning av EEG-data i fravær av synkronisert video er spesielt utfordrende når en enkelt EEG-kanal brukes. I dette tilfellet kan det være vanskelig å avgjøre om EEG-bølgeformen er en artefakt, med mindre andre bevis (video) støtter klassifiseringen som et anfall. Bevegelsesartefakter kan virke lik det elektrografiske mønsteret av anfallet. Derfor er video med eller uten EMG-bekreftelse et krav. Mens videoopptak utføres under både lyse og mørke sykluser, kan videokvaliteten ikke alltid være tilfredsstillende og klar i de mørke timene. I tillegg, hvis dyret er vendt bort fra kameraet under ictal-lignende EEG-hendelsen, kan det være utfordrende å vurdere sin oppførsel. I slike tilfeller kan det å anskaffe et elektromyografisignal (EMG) i tillegg til EEG og video løse utfordringen ved å gi informasjon om muskelaktiviteten under mildere atferdsbeslag (med lave motorkomponenter) eller for å bekrefte mangelen på dyrebevegelse under fraværslignende pigg-og-sakte bølgeutslipp på EEG. De potensielle utfordringene med EMG-kanalen ligner utfordringene med EEG-kanalene, for eksempel støykontaminering, feil plassering av elektroder eller elektrodene blir løse (eller mister overflatekontakt) over den lange tiden av opptaket. Bruken av video sammen med EEG-analyse har to formål: å bekrefte at en EEG-hendelse ikke er en artefakt forårsaket av dyrets bevegelse (utforskende atferd, drikking, tygge, riper, strekking, pleie eller rask / anstrengt pust) og å skille mellom konvulsive og ikke-konvulsive anfall. Bruk av en modifisert racinskala for å karakterisere konvulsive eller ikke-konvulsive anfall anbefales. Stadiene inkluderer (0) Ren elektrografisk anfall uten identifiserbar motormanifestasjon; (1) Orofacial automatismer og hodet nikker; (2) Forbenkloniske jerk; (3) Bilateral forbenklonus; (4) Forbensklonus og oppdragelse; (5) Forbensklonus med opptogering og fall. Hver videokanal må tydelig vise hele overflaten med dyret i buret, en etikett med et dyr identifikasjonsnummer, vannflaske tips, mat, og kosthold / utvinning gel. For å sikre videoanskaffelse i de mørke timene, bruk en infrarød nattkilde. (Noen kameraer har innebygde enheter eller kan kreve flere deler. Se materialtabellen). Juster rammen per sekundhastighet og bildeoppløsning. Den høyere bildefrekvensen og oppløsningen kommer på bekostning av større filstørrelse. De viktigste ulempene ved å anskaffe video under langvarige kroniske kontinuerlige eksperimenter inkluderer behovet for å lagre svært store mengder data og de tekniske vanskelighetene som er involvert i behandlingen av de store filene. Ferdighetene til eksperimentereren til effektivt å tolke atferdsdataene sammen med EEG må også vurderes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av R01 NS105807/NS/NINDS NIH HHS/UNITED States and CURE basert på et stipend CURE mottatt fra United States Army Medical Research and Materiel Command, Department of Defense (DoD), gjennom Psychological Health and Traumatisk Brain Injury Research Program under Award No. W81XWH-15-2-0069. Ivan Zuidhoek er høyt verdsatt for korrekturlesing av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.10" screw | Pinnacle Technology Inc., KS, USA | 8209 | 0.10 inch long stainless steel |
| 0.10" screw | Pinnacle Technology Inc., KS, USA | 8403 | 0.10 inch long with pre-soldered wire lead |
| 0.12" screw | Pinnacle Technology Inc., KS, USA | 8212 | 0.12 inch long stainless steel |
| 1EEG headmount | Invitro1 (subsidiary of Plastics One), VA, USA | MS333/8-A/SPC | 3 individually Teflon-insulated platinum iridium wire electrodes (twisted or untwisted, 0.005 inch diameter) extending below threaded plastic pedestal |
| 2EEG/1EMG headmount | Pinnacle Technology Inc., KS, USA | 8201 | 2EEG/1EMG channels |
| 3% hydrogen peroxide | Pharmacy | ||
| 3EEG headmount | Pinnacle Technology Inc., KS, USA | 8235-SM-C | custom 6-Pin Connector for 3EEG channels |
| Buprenorphine | Par Pharmaceuticals, Cos. Inc., Spring Valley, NY, USA | 060969 | |
| Buprenorphine | Par Pharmaceuticals, Cos. Inc., Spring Valley, NY, USA | 060969 | |
| C57BL/6 mice | Harlan/Envigo Laboratories Inc | male, 12-16 weeks old | |
| C57BL/6 mice | The Jackson Laboratory | male, 12-16 weeks old | |
| Carprofen | Zoetis Services LLC, Parsippany, NJ, USA | 026357 | NOTE: this drug is added during weight drop only if stereotactic electrode implantation will be performed on the same day |
| Chlorhexidine antiseptic | Pharmacy | ||
| Dental cement and solvent kit | Stoelting Co., USA | 51459 | |
| Drill | Foredom | HP4-917 | |
| Drill bit | Meisinger USA, LLC, USA | HM1-005-HP | 0.5 mm, Round, 1/4, Steel |
| Dry sterilizer | Cellpoint Scientific, USA | Germinator 500 | |
| EEG System 1 | Biopac Systems, CA, USA | ||
| EEG System 2 | Pinnacle Technology Inc., KS, USA | ||
| Ethanol ≥70% | VWR, USA | 71001-652 | KOPTEC USP, Biotechnology Grade (140 Proof) |
| Eye ointment | Pro Labs Ltd, USA | Puralube Vet Ointment Sterile Ocular Lubricant available in general online stores and pharmacies | |
| Fluriso liquid for inhalation anesthesia | MWI Veterinary Supply Co., USA | 502017 | |
| Hair removal product | Church & Dwight Co., Inc., USA | Nair cream | |
| Isoflurane | MWI Veterinary Supply Co., USA | 502017 | |
| Povidone-iodine surgical solution | Purdue Products, USA | 004677 | Betadine |
| Rimadyl/Carprofen | Zoetis Services LLC, Parsippany, NJ, USA | 026357 | |
| Solder | Harware store | ||
| Soldering iron | Weller, USA | WP35 | ST7 tip, 0.8mm |
| Stainless steel disc | Custom made | ||
| Sterile cotton swabs | |||
| Sterile gauze pads | Fisher Scientific, USA | 22362178 | |
| Sterile poly-lined absorbent towels pads | Cardinal Health, USA | 3520 | |
| Tissue adhesive | 3M Animal Care Products, USA | 1469SB |
References
- Christensen, J., et al. Long-term risk of epilepsy after traumatic brain injury in children and young adults: a population-based cohort study. Lancet. 373 (9669), 1105-1110 (2009).
- Lowenstein, D. H. Epilepsy after head injury: an overview. Epilepsia. 50, Suppl 2 4-9 (2009).
- Ferguson, P. L., et al. A population-based study of risk of epilepsy after hospitalization for traumatic brain injury. Epilepsia. 51 (5), 891-898 (2010).
- Abou-Abbass, H., et al. Epidemiology and clinical characteristics of traumatic brain injury in Lebanon: A systematic review. Medicine (Baltimore). 95 (47), 5342 (2016).
- Management of Concussion/mTBI Working Group. VA/DoD Clinical Practice Guideline for Management of Concussion/Mild Traumatic Brain Injury. The Journal of Rehabilitation Research and Development. 46 (6), 1-68 (2009).
- Piccenna, L., Shears, G., O'Brien, T. J. Management of post-traumatic epilepsy: An evidence review over the last 5 years and future directions. Epilepsia Open. 2 (2), 123-144 (2017).
- Loscher, W., Brandt, C. Prevention or modification of epileptogenesis after brain insults: experimental approaches and translational research. Pharmacological Reviews. 62 (4), 668-700 (2010).
- Ostergard, T., Sweet, J., Kusyk, D., Herring, E., Miller, J. Animal models of post-traumatic epilepsy. Journal of Neuroscience Methods. 272, 50-55 (2016).
- Shandra, O., et al. Repetitive Diffuse Mild Traumatic Brain Injury Causes an Atypical Astrocyte Response and Spontaneous Recurrent Seizures. Journal of Neuroscience. 39 (10), 1944-1963 (2019).
- Foda, M. A., Marmarou, A. A new model of diffuse brain injury in rats. Part II: Morphological characterization. Journal of Neurosurgery. 80 (2), 301-313 (1994).
- Marmarou, A., et al. A new model of diffuse brain injury in rats. Part I: Pathophysiology and biomechanics. Journal of Neurosurgery. 80 (2), 291-300 (1994).
- Paxinos, G., Keith, B. J., Franklin, M. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Elsevier Science. (2007).
- Shandra, O., Robel, S. Imaging and Manipulating Astrocyte Function In Vivo in the Context of CNS Injury. Methods in Molecular Biology. 1938, 233-246 (2019).
- Pitkanen, A., Immonen, R. Epilepsy related to traumatic brain injury. Neurotherapeutics. 11 (2), 286-296 (2014).
- Kharatishvili, I., Nissinen, J. P., McIntosh, T. K., Pitkanen, A. A model of posttraumatic epilepsy induced by lateral fluid-percussion brain injury in rats. Neuroscience. 140 (2), 685-697 (2006).
- Pitkanen, A., Bolkvadze, T., Immonen, R. Anti-epileptogenesis in rodent post-traumatic epilepsy models. Neuroscience Letters. 497 (3), 163-171 (2011).
- Gades, N. M., Danneman, P. J., Wixson, S. K., Tolley, E. A. The magnitude and duration of the analgesic effect of morphine, butorphanol, and buprenorphine in rats and mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 39 (2), 8-13 (2000).
