Summary
Este protocolo sistemático descreve um novo modelo animal de epilepsia pós-traumática após lesão cerebral traumática repetitiva. A primeira parte detalha etapas para indução traumática de lesão cerebral usando um modelo modificado de queda de peso. A segunda parte fornece instruções sobre a abordagem cirúrgica para sistemas de aquisição de dados eletroencefalográficos de um único e multicanal.
Abstract
Lesão cerebral traumática (TBI) é uma das principais causas de epilepsia adquirida. O TBI pode resultar em uma lesão cerebral focal ou difusa. A lesão focal é resultado de forças mecânicas diretas, às vezes penetrando pelo crânio, criando uma lesão direta no tecido cerebral. Estes são visíveis durante a imagem cerebral como áreas com contusão, laceração e hemorragia. Lesões focais induzem a morte neuronal e a formação de cicatrizes gliais e estão presentes em 20%-25% de todas as pessoas que incorrem em um TCE. No entanto, na maioria dos casos de TBI, a lesão é causada por forças de aceleração-desaceleração e posterior escofeteca de tecido, resultando em danos não focais e difusos. Uma subpopulação de pacientes com TBI continua a desenvolver epilepsia pós-traumática (EPT) após um período de latência de meses ou anos. Atualmente, é impossível prever quais pacientes desenvolverão PTE, e as convulsões em pacientes com PTE são desafiadoras de controlar, necessitando de mais pesquisas. Até recentemente, o campo se limitava a apenas dois modelos de animais/roedores com convulsões pós-traumáticas validadas, ambos apresentando grandes lesões focais com perda maciça de tecido no córtex e às vezes estruturas subcorticais. Ao contrário dessas abordagens, foi determinado que o TBI difuso induzido usando um modelo modificado de queda de peso é suficiente para iniciar o desenvolvimento de convulsões convulsivas espontâneas e não convulsivas, mesmo na ausência de lesões focais ou perda de tecido. Semelhante a pacientes humanos com epilepsia pós-traumática adquirida, este modelo apresenta um período de latência após lesão antes do início da convulsão. Neste protocolo, a comunidade receberá um novo modelo de epilepsia pós-traumática, detalhando como induzir TBI difuso não-lesão seguido de monitoramento contínuo de animais eletroencefalográficos de vídeo a longo prazo ao longo de vários meses. Este protocolo detalhará o manuseio de animais, o procedimento de queda de peso, a colocação de eletrodos para dois sistemas de aquisição e os desafios frequentes encontrados durante cada uma das etapas de cirurgia, monitoramento pós-operatório e aquisição de dados.
Introduction
Todos os anos, a TBI afeta cerca de 60 milhões de pessoas em todo o mundo. Indivíduos impactados têm maior risco de desenvolver epilepsia, o que pode se manifestar anos após a lesão inicial. Embora os TBIs graves estejam associados a um maior risco de epilepsia, mesmo o TBI leve aumenta a chance de um indivíduo desenvolver epilepsia1,2,3,4. Todos os TBIs podem ser classificados como focas, difusos ou uma combinação de ambos. A lesão cerebral difusa, presente em muitos, se não todos os TBIs, é resultado de tecidos cerebrais de diferentes densidades se escorando uns contra os outros devido à aceleração-desaceleração e forças rotacionais. Por definição, a lesão difusa só ocorre isoladamente em lesão cerebral leve/concussiva, na qual não há lesões cerebrais visíveis em tomografiacomputadorizadacomputadorizada 5.
Atualmente, há dois problemas críticos no manejo de pacientes que têm, ou estão em risco de desenvolver epilepsia pós-traumática (PTE). A primeira é que, uma vez manifestado pelo PTE, as apreensões são resistentes às drogas antiepilépticas disponíveis (AEDs)6. Em segundo lugar, os AEDs são igualmente ineficazes na prevenção da epilepileptogênese, e não há abordagens terapêuticas alternativas eficazes. Para enfrentar esse déficit e encontrar melhores metas terapêuticas e candidatos ao tratamento, será necessário explorar novos mecanismos celulares e moleculares na raiz do PTE6.
Uma das características proeminentes da epilepsia pós-traumática é o período latente entre o evento traumático inicial e o início de convulsões espontâneas, não provocadas e recorrentes. Os eventos que ocorrem dentro dessa janela temporal são um foco natural para os pesquisadores, pois desta vez a janela pode permitir o tratamento e a prevenção do PTE completamente. Os modelos animais são mais utilizados para esta pesquisa porque oferecem vários benefícios distintos, e não menos importante é que o monitoramento contínuo de pacientes humanos seria ao mesmo tempo impraticável e caro ao longo de tais períodos potencialmente longos de tempo. Além disso, mecanismos celulares e moleculares na raiz da epileptogênese só podem ser explorados em modelos animais.
Modelos animais com convulsões pós-traumáticas espontâneas e epilepsia são preferidos em modelos onde as convulsões são induzidas após o TBI por meios menos fisiologicamente relevantes, como por quimioconvulsivos ou estimulação elétrica agudamente, cronicamente ou por acender. Modelos espontâneos de convulsão pós-traumática testam como o TBI modifica a rede cerebral saudável que leva à epilofegênese. Estudos utilizando estimulação adicional após o TBI avaliar como a exposição ao TBI reduz o limiar de convulsão e afeta a suscetibilidade às convulsões. As vantagens dos modelos animais com convulsões induzidas quimicamente ou com estimulação elétrica estão em testar os mecanismos específicos de refratividade aos AEDs e a eficácia dos AEDs existentes e novos. No entanto, o grau de relevância e tradução desses dados para humanos pode ser ambíguo7 devido ao seguinte: 1) mecanismos de apreensão podem ser diferentes daqueles induzidos apenas pelo TBI; 2) nem todos esses modelos levam a convulsões espontâneas7; 3) lesões criadas pelo próprio agente convulsivo, com a cânula necessária para sua entrega, ou estimulando a colocação de eletrodos em estruturas de profundidade (por exemplo, o hipocampo ou amilgdala) já podem causar maior suscetibilidade de convulsões e até mesmo potenciais de campo epilépformehipo7. Além disso, alguns agentes convulsivos (ou seja, ácido kainic) produzem lesões hipocampais diretas e esclerose, o que não é típico após tbi difuso.
Até recentemente, existiam apenas dois modelos animais de epilepsia pós-traumática: impacto cortical controlado (CCI, focal) ou lesão de percussão fluida (FPI, focal e difusa)8. Ambos os modelos resultam em grandes lesões focais ao lado da perda de tecido, hemorragia e gliose em roedores8. Esses modelos imitam epilepsia pós-traumática induzida por grandes lesões focais. Um estudo recente demonstrou que o TBI difuso repetido (3x) é suficiente para o desenvolvimento de convulsões espontâneas e epilepsia em camundongos mesmo na ausência de lesões focais9,adicionando um terceiro modelo de PTE roedor com convulsões espontâneas confirmadas. Este novo modelo imita mudanças celulares e moleculares induzidas pelo TBI difuso, representando melhor a população humana com TBIs leves e concussivos. Nesse modelo, o período latente de três semanas ou mais antes do início da convulsão e o surgimento de convulsões tardias, espontâneas e recorrentes permite investigar as causas básicas da epileptogênese pós-traumática, testando a eficácia de abordagens preventivas e novos candidatos terapêuticos após o início da convulsão, e tem potencial para o desenvolvimento de biomarcadores de epileptogênese pós-traumática porque aproximadamente metade dos animais desenvolvem epilepsia pós-traumática.
A escolha do modelo animal para o estudo da epilepsia pós-traumática depende da questão científica, do tipo de lesão cerebral investigada e de quais ferramentas serão usadas para determinar os mecanismos celulares e moleculares subjacentes. Em última análise, qualquer modelo de epilepsia pós-traumática deve demonstrar tanto o surgimento de convulsões espontâneas após o TBI quanto um período inicial de latência em um subconjunto de animais TBI, porque nem todos os pacientes que incorrem em um TBI passam a desenvolver epilepsia. Para isso, a eletroencefalografia (EEG) com aquisição simultânea de vídeo é utilizada neste protocolo. Entender os aspectos técnicos por trás do hardware e abordagens de aquisição de dados é fundamental para uma interpretação precisa dos dados. Os aspectos críticos do hardware incluem o tipo de sistema de gravação, tipo de eletrodos (parafuso ou suporte de arame) e material de que são feitos, aquisição sincronizada de vídeo sincronizado (como parte do sistema EEG ou terceiros) e propriedades do sistema de computador. É imprescindível definir os parâmetros de aquisição adequados em qualquer tipo de sistema, dependendo da meta de estudo, eventos de interesse eEG, método de análise adicional e sustentabilidade do armazenamento de dados. Por fim, o método de configuração de eletrodos (montagem) deve ser considerado, pois cada um tem vantagens e desvantagens e afetará a interpretação dos dados.
Este protocolo detalha como usar o modelo de queda de peso marmarou modificado10,11 para induzir lesões difusas resultando em convulsões espontâneas, não provocadas e recorrentes em camundongos, descreve abordagens cirúrgicas para adquirir um EEG de vídeo contínuo e multicanal único e sincronizado usando a montagem monopolar, bipolar ou mista.
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Protocol
Todos os procedimentos em animais descritos neste protocolo foram realizados de acordo com o Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Virginia Tech e em conformidade com o 'Guia para o Cuidado e Uso de Animais De Laboratório' dos Institutos Nacionais de Saúde. .
1. Protocolo de manuseio de animais
NOTA: Este protocolo destina-se a habituar animais encomendados de um fornecedor para a instalação após a chegada e condicioná-los a serem manuseados pelo experimentador. Isso melhora o bem-estar animal reduzindo o estresse e a ansiedade e simplifica certos procedimentos que requerem o manuseio de animais, incluindo induzir o TCE, o monitoramento pós-operatório e conectar o animal ao sistema de aquisição.
- Quando muitos animais são recebidos do vendedor, a orelha e os atribuem aleatoriamente a um grupo experimental (TBI) ou grupo de controle (cirurgia falsa) enquanto os combinam em gaiolas de 2-5 animais. Casa tbi animais separadamente de animais falsos porque ratos falsos ocasionalmente agem agressivamente em relação a ratos que foram submetidos a TBI.
- Manuseio do dia 1 (24-48 h após a marcação de ouvido): Prepare um gráfico para registrar etiquetas de ouvido animal, data de nascimento, datas de manuseio, peso animal nos dias de manuseio, duração do manuseio e uma seção para comentários e observações.
- Bata suavemente o animal usando as duas mãos. Não agarre o animal pela cauda, pois ele induz mecanismos de defesa e uma resposta ao estresse.
- Verifique e grave a etiqueta de ouvido do animal.
- Coloque o animal no recipiente na balança de peso e grave o peso.
- Bata suavemente o animal com as duas mãos novamente e manuseie-o por 1 min, permitindo que ele se mova e explore dentro das mãos. Faça isso em cima de um banco na sala de procedimentos e tenha cuidado para não deixar o animal cair no chão.
- Depois de 1 min de manuseio, coloque o animal de volta em sua gaiola.
- Repita os passos 1.3-1,7 para os outros animais na gaiola.
- Manuseio dia 2 (no dia seguinte): Repita as etapas 1.2-1.5.
- Bata suavemente o animal com as duas mãos novamente e manuseie-o por 2 minutos, permitindo que ele se mova e explore dentro das mãos. Faça isso em cima de um banco na sala de procedimentos e tenha cuidado para não deixar o animal cair no chão.
- Depois de 2 min de manuseio, coloque o animal de volta em sua gaiola.
- Repita os passos 1.10-1.11 para os outros animais na gaiola.
- Manuseio dia 3 (no dia seguinte): Repita as etapas 1.2-1.5.
- Bata suavemente o animal com as duas mãos novamente e manuseie-o por 4 minutos, permitindo que ele se mova e explore dentro das mãos. Faça isso em cima de um banco na sala de procedimentos e tenha cuidado para não deixar o animal cair no chão.
- Depois de 4 min de manuseio, coloque o animal de volta em sua gaiola.
- Repita os passos 1.14-1,15 para os outros animais na gaiola.
- Manuseio dia 4 (dia de controle, 1 semana a partir do dia 1): Repita as etapas 1.2-1.5.
- Bata suavemente o animal com as duas mãos novamente e manuseie-o por 4 minutos, permitindo que ele se mova e explore dentro das mãos. Faça isso em cima de um banco na sala de procedimentos e tenha cuidado para não deixar o animal cair no chão.
- Depois de 4 min manuseando, coloque o animal de volta em sua gaiola.
- Repita os passos 1.18-1.1.19 para os outros animais na gaiola.
NOTA: O dia de manuseio de controle testa a retenção do comportamento calmo após um protocolo de manuseio de três dias.
2. Procedimento de queda de peso
- Coloque o rato em uma câmara de indução. Defina o fluxo de oxigênio e vácuo tanto para 1 L/min quanto ao nível de gás isoflurano para 3%-5%. Anestesiar o rato por 5 min.
- Retire o mouse da câmara de indução e coloque-o em uma almofada de espuma. Teste para a ausência de uma resposta a uma pitada de dedo ou cauda.
- Administrar um analgésico (0,1 mg/kg buprenorfina) subcutânea. Se a cirurgia do EEG for realizada no mesmo dia, administre a subcutânea de buprenorfina em combinação com o carprofeno anti-inflamatório não esteroide (5 mg/kg).
- Adminisão a solução de lactato de sódio (3 μL por grama do peso do animal) subcutâneamente antes ou depois do último impacto. A solução de lactato de sódio pode ser misturada com os analgésicos para administração rápida em uma única injeção.
NOTA: A solução de lactato de sódio contém uma mistura de cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio e lactato de sódio na água. Esta etapa ajuda a substituir fluidos e eletrólitos, auxiliando na recuperação. - Posicione a cabeça do mouse o tubo de queda de peso (Figura 1A) e coloque um disco de aço inoxidável plano (1,3 cm de diâmetro, 1 mm de espessura e 880 mg de peso) no centro da cabeça, entre a linha dos olhos e orelhas.
NOTA: Este disco difunde o impacto através da superfície do crânio (Figura 1B). - Retire o pino no tubo de queda de peso para soltar a haste de peso de 100 g de uma altura de 50 cm. Para induzir a lesão falsa para os camundongos de controle, remova a haste de peso do tubo para evitar a liberação acidental do pino e queda de peso.
NOTA: A cabeça do animal deve ser posicionada plana, de modo que a haste cai livremente em toda a superfície do disco. - Coloque o animal inconsciente nas costas para recuperação em uma almofada de aquecimento coberta com uma toalha absorvente polilined estéril. O tempo de recuperação do reflexo de direita (ou seja, o tempo que leva o mouse para se corrigir de suas costas) pode ser medido como uma leitura para o tempo gasto inconsciente.
- Quando o animal recuperar a consciência, coloque-o em uma gaiola limpa que foi aquecida em uma almofada de aquecimento, com gel de recuperação e algumas peças de comida umedecida para se recuperar por 45 minutos. Certifique-se de que há lixo suficiente para que a gaiola não fique superaquecida. Superaquecer o animal pode ser um grande obstáculo para a recuperação como permitir que o rato fique muito frio.
- Após 45 min, repita as etapas 2.1-2,8 duas vezes, omitindo a etapa 2.3 (ou seja, administração de analgésicos e anti-inflamatórios).
- Permita que os animais se recuperem por 1-2 h se a cirurgia de implantação de eletrodos EEG for realizada no mesmo dia.
3. Preparação de campo cirúrgico para implantação de eletrodos EEG
NOTA: Autoclave as ferramentas cirúrgicas e parafusos antes da cirurgia. Limpe as luvas cirúrgicas pulverizando e esfregando com 70% de etanol antes e depois de tocar o animal, materiais não estéreis e entre o manuseio dos animais. Esterilizar as ferramentas cirúrgicas de 2 a 3 min no esterilizador de bicos (ver Tabela de Materiais) entre os animais. Troque a cortina estéril antes de colocar um novo animal no aparelho estereotático. Certifique-se de que o campo cirúrgico contenha todos os componentes necessários para a cirurgia (Figura 2). A ausência de um procedimento cirúrgico invasivo para induzir o TBI neste modelo tem várias vantagens: 1) a implantação dos eletrodos é flexível e pode ser realizada no mesmo dia do TBI ou após um período definido de tempo; 2) o tempo de recuperação do animal é mais rápido; 3) o crânio permanece intacto, permitindo mais área superficial e flexibilidade para implantar eletrodos.
- Anestesiar o rato em 3%-5% de gás isoflurano em uma câmara de indução por 5 min.
- Transfira o mouse da câmara de indução para o aparelho estereotático e coloque-o em uma cortina estéril em uma almofada de aquecimento com gás isoflurano e tubos de vácuo conectados ao cone do nariz.
- Mantenha a temperatura corporal em 37 °C ao longo da cirurgia. Coloque o sensor de temperatura para que faça contato com o peito ou a parede abdominal do mouse.
- Conserte a cabeça do animal no lugar usando as barras de ouvido.
- Mantenha a anestesia em 1,5%-3,5% isoflurane ou a ~60 respirações/min no plano cirúrgico (sem resposta ao dedo do dodo ou na pitada de cauda).
- Aplique uma pomada ocular aos olhos do animal para mantê-los lubrificados durante toda a cirurgia.
- Administrar uma mistura de analgésicos (0,1 mg/kg buprenorfina) e a droga anti-inflamatória não esteroide (5 mg/kg carprofeno) em uma única injeção subcutânea, a menos que o TBI tenha sido realizado mais cedo durante o dia, nesse caso o animal já recebeu analgésicos e anti-inflamatórios.
NOTA: Buprenorfina deve ser administrada novamente se o tempo entre a primeira cirurgia de colocação tbi e EEG exceder 8h ou se o animal apresenta sinais de dor 8h após a primeira administração, mas deve ser dado sem a adição de carprofeno. - Administrar a solução de lactato de sódio (3 μL por grama do peso do animal) subcutâneamente para substituir fluidos e eletrólitos no animal.
NOTA: Se a cirurgia for realizada imediatamente após o TCE, esta etapa tem que ser cronometrada corretamente. A solução de lactato de sódio deve ser administrada a cada 2h enquanto o animal passa pelos procedimentos e uma vez após a cirurgia, a 2h da injeção anterior. - Retire o cabelo do couro cabeludo usando um creme de depilação.
- Antes de fazer a incisão, desinfete a pele do couro cabeludo com solução antisséptica cirúrgica povido-iodo e 70% de etanol em cotonetes alternados com almofadas de gaze estéreis em um movimento circular 3x (20 s por solução cada vez).
- Usando um bisturi, faça uma incisão rostral-caudal no couro cabeludo da linha central do couro cabeludo de logo acima dos olhos para a parte de trás da cabeça. Este método de abertura do couro cabeludo é preferido ao cortar o couro cabeludo, já que os retalhos de pele podem ser selados sobre ou ao redor da tampa EEG proporcionando mais estabilidade.
NOTA: Ao preparar o crânio para implantação do headmount 3-EEG, é necessário cortar o couro cabeludo, pois o tamanho do suporte de cabeça não permitirá o fechamento dos retalhos da pele sobre o suporte da cabeça. - Expanda a área de incisão aplicando pequenos hemostatos nas fronteiras de pele abertas. Se ocorrer algum sangramento após a incisão, limpe com uma gaze de algodão estéril ou cotonete.
- Remova suavemente o periosteum (ou seja, a fina membrana sobre o osso craniano) com uma lâmina bisturi. Se ocorrer algum sangramento durante esta etapa, pressione o local sangrando com um cotonete de algodão estéril até parar.
- Use cotonetes de algodão estéreis para limpar o crânio com peróxido de hidrogênio, mas evite tocar o tecido mole ao redor da área craniana exposta. Repita este passo até que o crânio seja limpo de qualquer tecido mole e tenha uma aparência esbranquiçada.
- Seque o crânio com uma gaze estéril ou cotonete de algodão.
NOTA: As etapas 3.12-3.15 são importantes para a fixação adequada dos eletrodos e cimento dentário. Qualquer tecido mole, sangramento não cauterizado e detritos podem causar infecção, fixação instável do headmount, sinal distorcido ou ausente e perda do implante dentro de vários dias ou semanas após a cirurgia.
4. Colocação de eletrodo
- Implante o único headmount do canal EEG (1EEG).
NOTA: Abreviaturas nas coordenadas estereotáticas representam relações espaciais e especificam a distância em milímetros do alvo do bregma em uma determinada orientação na cabeça do animal: anterior-posterior (AP) e medial-lateral (ML). A dorsal-ventral não é aplicável neste protocolo porque todos os eletrodos são colocados no espaço peridural em vez de em uma determinada estrutura dentro do cérebro (Figura 3). Vin+ é um eletrodo ativo e Vin- é seu eletrodo de referência.- Use uma broca de alta velocidade com um bit de aço (0,5 mm, redondo, 1/4 in.) em ~5.000-6.000 rodadas por min (rpm) para criar seis furos de rebarba (três para parafusos de estabilidade e três para eletrodos) usando as coordenadas estereotáticas fornecidas12. Para os dois parafusos anteriores: AP = +1,5 mm, ML = ±1,5 mm; para o parafuso um posterior: AP = -5,2 mm, ML = -1,5 mm; para o eletrodo moído: AP = -5,2 mm, ML = +1,5 mm; para os eletrodos de gravação: AP = -2,3 mm, ML = ±2,7 mm, com Vin+ à direita e Vin- à esquerda.
- Adicione três parafusos para maior estabilidade do estágio da cabeça. Usando uma chave de fenda, gire parafusos 1-1,5 x cada para serem fixados no crânio.
NOTA: Colocar os parafusos mais fundo danificará o cérebro. - Insira o headmount 1EEG em um braço de suporte estereotático e posicione o suporte de cabeça para que os três eletrodos estejam localizados ao longo da linha média craniana. Nesta configuração, o eletrodo moído e sua respectiva abertura em cima do headmount estão na parte de trás, o eletrodo Vin+ no meio, e o vin-eletrodo na frente. Uma marca pode ser feita no headmount com um marcador permanente.
- Dobre cada eletrodo de 90° para que a extremidade de cada fio seja dobrada para baixo e esteja posicionada acima do orifício de rebarba correspondente. Em seguida, meça 1 mm de comprimento da porção do fio que agora é perpendicular ao orifício da rebarba e corte o excesso(Figura 3). Isso garantirá a colocação peridural dos eletrodos. Os eletrodos mal devem tocar na superfície dura mater.
- Abaixe o suporte da cabeça e ajuste os três eletrodos para combinar com o respectivo buraco de rebarba. Para gravação peridural, os eletrodos devem ser colocados acima ou mal tocar na dura mater.
- Prepare cimento dentário para aplicação misturando uma colher de 1/2 de pó com várias gotas de solvente. Use uma espátula de mistura e mexa até que a mistura final seja parecida, brega, mas maleável, e rígida o suficiente para ser devidamente condensada quando colocada no crânio do animal.
- Aplique mistura de cimento dentário cobrindo todos os parafusos e eletrodos e espere ~3-5 min para que ele se solidifique. Certifique-se de não cobrir o pedestal plástico com cimento dentário, pois será impossível conectar o animal ao deslocamento com uma corda.
- Solte os aquecedores segurando os retalhos da pele e feche a incisão conectando os retalhos da pele ao redor do pedestal de plástico. Aplique várias gotas de adesivo tecidual (ver Tabela de Materiais) para selar os retalhos da pele.
- Aplique cloroxidina antisséptica na área ao redor do implante para evitar infecções. Se o animal estiver anestesia por mais de 2h após a injeção anterior de solução de lactato de sódio, dada durante a indução do TCE, ametre outra injeção subcutâneamente. Para manter a hidratação adequada do animal, repita a injeção a cada 2h que o animal passa anestesia.
- Após a cirurgia, dê uma injeção final de solução de lactato de sódio 2h após a injeção anterior. Se a cirurgia tiver menos de 2h de duração, administre a dose final de recuperação da solução de lactato de sódio 2 h da primeira injeção.
- Remova o animal do aparelho estereotático e meça o peso do animal após a cirurgia do EEG como referência para o monitoramento futuro. Devido ao implante, o peso do animal será maior do que antes da cirurgia.
- Coloque o animal em uma gaiola limpa em uma almofada de aquecimento quente para recuperação.
- Implante os dois canais EEG e um EMG (2EEG/1EMG).
- Use o bregma como um marco para colocação do headmount. Aplique uma pequena quantidade de adesivo tecidual (ver Tabela de Materiais) no lado inferior do headmount 2EEG/1EMG, evitando os quatro orifícios de parafuso e coloque o suporte de cabeça 2EEG/1EMG na superfície do crânio.
NOTA: Não há coordenadas específicas para colocação deste headmount. O suporte de cabeça tem 8 mm de comprimento e 5 mm de largura, que cobre a maior parte da superfície craniana. Posicionar o suporte de cabeça com sua borda dianteira 3,0 mm anterior ao bregma é ótimo e proporciona boa qualidade de sinal. A colocação manual rápida é necessária antes da queda das curas adesivos do tecido. Permita aproximadamente 5 min para a cola de tecido curar completamente. - Use uma agulha estéril de 23 G para criar buracos piloto para os parafusos através das quatro aberturas no headmount. Para isso, empurre suavemente a agulha e gire lentamente até que a ponta da agulha penetre no crânio sem danificar o cérebro. Remova qualquer sangramento dos buracos do piloto usando um cotonete de algodão estéril.
- Insira o 0.10 em parafusos nos orifícios do piloto e gire-os até que cada um esteja fixado no crânio. Isso pode ser até metade do comprimento do parafuso, mas não o comprimento total, pois isso danificaria a dura mater e o córtex. Se o suporte de cabeça estiver posicionado para que haja uma lacuna entre a superfície do crânio e a extremidade traseira do suporte da cabeça use dois 0,12 em parafusos na parte posterior.
- Faça pequena abertura nas laterais da bolsa de dois componentes (silver-epóxi) de embalagem dupla. Pegue uma espátula dupla e use cada lado para colher uma pequena e igual quantidade de cada componente da bolsa e misturá-los. Use apenas uma pequena quantidade suficiente para uma única cirurgia, pois a mistura se solidifica dentro de 20 minutos. Selar as laterais da bolsa para evitar a secagem.
NOTA: O epóxi prateado permite o contato elétrico adequado entre o parafuso e o suporte da cabeça e aumenta a estabilidade dos parafusos. - Aplique uma pequena quantidade dessa mistura entre cabeça de fenda e orifício de parafuso, em seguida, aperte cada parafuso até que sua cabeça repode sobre a base do implante. Certifique-se de que nenhum epóxi prateado está fazendo contato entre os dois parafusos porque cada parafuso serve como um eletrodo individual e, para garantir um sinal preciso, ele não deve fazer contato com o outro parafuso.
- Se a mistura de epóxi prateado foi extraviada, há uma janela de poucas segundas vezes para colher cuidadosamente o excesso para separar a conexão. Dobre cuidadosamente ambas as pistas EMG da borda posterior do headmount para seguir o contorno da cabeça e pescoço do animal, e depois inseri-los nos músculos nuchal.
- Prepare cimento dentário para aplicação misturando uma colher de 1/2 de pó com várias gotas de solvente. Use uma espátula de mistura e mexa até que a mistura final seja parecida, brega, mas maleável, e rígida o suficiente para ser devidamente condensada quando colocada no crânio do animal.
- Aplique a mistura de cimento dentário cobrindo todo o suporte da cabeça, evitando cobrir os orifícios de seis pinos, pois isso tornará impossível conectar o pré-amplificador. Espere ~3-5 min para que o cimento se solidifique. Certifique-se de que a pele não está selada para o headmount com cimento dentário.
- Solte os aquecedores segurando os retalhos da pele e feche a incisão conectando os retalhos da pele ao redor do pedestal de plástico. Aplique várias gotas de adesivo tecidual para selar os retalhos da pele.
NOTA: Se a incisão da pele for feita mais tempo para permitir o endireitamento dos fios EMG, a pele pode ser selada com adesivo tecidual ou suturado. Selar a pele com adesivo tecidual geralmente é suficiente. No entanto, se durante a abertura de monitoramento pós-operatório da incisão for observada, as suturas são recomendadas em vez disso. - Aplique cloroxidina antisséptica na área ao redor do implante para evitar infecções. Administrar a solução de lactato de sódio (3 μL por grama do peso do animal) subcutâneamente para substituir fluidos e eletrólitos se o animal estiver anestesia por mais de 2h após a injeção anterior.
- Remova o animal do aparelho estereotático e meça o peso do animal após a cirurgia do EEG como referência para o monitoramento futuro. Devido ao implante, o peso do animal será maior do que antes da cirurgia.
- Coloque o animal em uma gaiola limpa em uma almofada de aquecimento quente, com gel de recuperação e algumas peças de chow umedecidas para recuperação.
- Use o bregma como um marco para colocação do headmount. Aplique uma pequena quantidade de adesivo tecidual (ver Tabela de Materiais) no lado inferior do headmount 2EEG/1EMG, evitando os quatro orifícios de parafuso e coloque o suporte de cabeça 2EEG/1EMG na superfície do crânio.
- Implante um headmount de três canais EEG (3EEG).
- Use broca de alta velocidade com um bit de aço (0,5 mm, redondo, 1/4) a ~5.000-6.000 rpm para criar seis furos de rebarba (três para parafusos de estabilidade e três para eletrodos) usando as coordenadas estereotáticas fornecidas12. Para referência moída e comum para EEG1 e EEG2: AP = 5,2 mm, ML = ±1,5 mm; para EEG1 e EEG2: AP = -3,0 mm, ML = ±3,0 mm; para EEG3 independente: AP =-1,4 mm, ML = ±1,5 mm.
- Coloque os seis eletrodos de parafuso nos buracos de rebarba.
NOTA: Colocar os parafusos mais fundo criará danos significativos ao cérebro. Eletrodos de parafuso proporcionam melhor estabilidade do suporte de cabeça. - Prepare cimento dentário para aplicação misturando uma colher de 1/2 de pó com várias gotas de solvente. Use uma espátula de mistura e mexa até que a mistura final seja parecida, brega, mas maleável, e rígida o suficiente para ser devidamente condensada quando colocada no crânio do animal.
- Aplique a mistura de cimento dentário cobrindo toda a superfície exposta do crânio e cada eletrodo de parafuso. Certifique-se de que a pele não está selada para o headmount com cimento dentário. Espere ~1-2 min para que o cimento se solidifique levemente. Não há necessidade de esperar até a solidificação total antes de seguir para o próximo passo.
- Ligue o ferro de solda para aquecê-lo. Coloque o suporte de cabeça 3EEG em um braço de suporte estereotático.
NOTA: Posicione o suporte de cabeça para que as seis posições de chumbo de arame correspondam à posição dos cabos do fio de cada eletrodo de parafuso. - Abaixe a cabeça para que sua parte ventral repoque em cima do cimento dentário.
- Torça o fio de cada chumbo de cada um dos eletrodos do parafuso com o suporte de arame correspondente do suporte da cabeça.
NOTA: Torcer os cabos de fio errados tornará a interpretação dos dados complicada ou impossível. - Corte cuidadosamente o excesso de fio usando tesouras. Solde cada par de arame torcido para condução adequada do sinal.
NOTA: Cada par de fios deve fazer contato com outro par, caso contrário, a qualidade do sinal e a interpretação dos dados serão comprometidas. - Dobre cada par de fios soldados ao redor do suporte da cabeça, evitando o contato entre cada par.
NOTA: Se os fios não forem aparados curtos o suficiente, pode ser difícil dobrá-los ao redor da cabeça sem tocar em outro fio. Neste caso, dobre um par primeiro, cubra-o com mistura de cimento dentário, espere ~1-2 min para solidificar, em seguida, prossiga com o próximo par da mesma forma. - Finalize cobrindo todo o fio com cimento dentário deixando apenas a porção preta do suporte de cabeça exposto.
NOTA: Tenha cuidado para não aplicar qualquer pó de cimento dentário ou mistura na parte superior da parte exposta do headmount, pois qualquer detrito ou cimento nos orifícios bloqueará o contato e levará a ausência de sinal ou ruído. - Solte os aquecedores segurando os retalhos da pele. Aplique cloroxidina antisséptica na área ao redor do implante para evitar infecções.
- Administrar a solução de lactato de sódio (3 μL por grama do peso do animal) subcutâneamente para substituir fluidos e eletrólitos se o animal estiver anestesia por mais de 2h após a injeção anterior.
- Remova o animal do aparelho estereotático e meça o peso do animal após a cirurgia do EEG como referência para o monitoramento futuro. Devido ao implante, o peso do animal será maior do que antes da cirurgia.
- Coloque o animal em uma gaiola limpa em uma almofada de aquecimento quente, com gel de recuperação e algumas peças de chow umedecidas para recuperação.
NOTA: O peróxido de hidrogênio auxilia na remoção do tecido mole restante do crânio.
5. Conectando animais ao sistema de aquisição
- Cupoo o animal com as duas mãos para removê-lo da gaiola de aquisição e transferi-lo para uma área limpa com superfície plana, como uma Estação de Transferência de Animais (ATS).
- Pegue suavemente o rato pela pele de suas costas. Não agarre o animal pela cauda, pois isso causa angústia.
- Identifique a abertura no headmount Do EEG correspondente ao eletrodo do solo e combine o respectivo pino da corda para conexão adequada.
NOTA: A conexão reversa da corda do deslocamento ao headmount animal resultará em uma leitura diferente dos eletrodos e formas de onda potencialmente distorcidas. - Devolva o animal à gaiola de aquisição e conecte a outra extremidade da corda (Sistema EEG 1) ou pré-amplificador (Sistema EEG 2) ao commuta.
NOTA: Ao conectar o pré-amplificador (Sistema EEG 2) à corda do deslocamento, combine as marcas brancas nas extremidades de ambas as amarras. A conexão reversa resultará em danos permanentes do amplificador e requer reparos do fabricante, que são caros. - Gire suavemente a corda que liga o animal ao deslocamento para garantir que o mecanismo funcione corretamente e o animal possa se mover livremente.
6. Configurações de aquisição de dados da EEG
- Defina os parâmetros de aquisição do EEG System 1.
- Definir a taxa de amostragem para 500 Hz; ganhar 5.000; modo Norma 35 Hz; LPN desligado. Defina o filtro de passe alto a 0,5 Hz.
NOTA: 100 Hz (passe baixo) é embutido e não requer entrada manual.
- Definir a taxa de amostragem para 500 Hz; ganhar 5.000; modo Norma 35 Hz; LPN desligado. Defina o filtro de passe alto a 0,5 Hz.
- Defina os parâmetros de aquisição do EEG System 2.
- Definir a taxa de amostragem para 600 Hz; pré-amp ganhar 100; ganho 1 (EEG1,2). Defina o filtro de passe baixo a 100 Hz.
NOTA: 1 Hz (passe alto) é embutido e não requer entrada manual.
- Definir a taxa de amostragem para 600 Hz; pré-amp ganhar 100; ganho 1 (EEG1,2). Defina o filtro de passe baixo a 100 Hz.
7. Configurações de aquisição de dados de vídeo
- Defina parâmetros de aquisição para o Sistema EEG 1.
NOTA: Um sistema de aquisição de vídeo de terceiros é necessário para obter dados de vídeo simultâneos.- Definir a taxa de quadros entre 15 (mínimo recomendado) e 30 (máximo disponível) para a qualidade de vídeo adequada. Defina a resolução para 640 x 640 pixels. Definir o tipo de compressão em H.264H.
- Defina parâmetros de aquisição para o Sistema EEG 2.
NOTA: Este sistema EEG oferece um sistema de vídeo e um software que sincronizam os dados de vídeo e EEG juntos em um único arquivo para até quatro animais (ver Tabela de Materiais).- Definir a taxa de quadros entre 15 (mínimo recomendado) e 30 (máximo disponível) para a qualidade de vídeo adequada. Defina a resolução para 640 x 480 pixels. Defina o tipo de compressão ao formato de arquivo WebM.
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Representative Results
O protocolo aqui descrito descreve o método de indução de uma lesão difusa isoladamente (por exemplo, na ausência de uma lesão focal) utilizando um modelo de camundongo de TBI difuso repetitivo (Figura 1). A Figura 1A retrata o dispositivo de queda de peso e seus componentes (Figura 1A, a1-a5) usadopara indução de TBI neste modelo e passos cruciais durante o procedimento (Figura 1B, b1-b5).
Características deste modelo incluem a falta de uma lesão focal no cérebro como resultado do TBI, perda de consciência, alta taxa de sobrevivência, o surgimento do início tardio da convulsão (>1 semana do TBI), e convulsões espontâneas, não provocadas, recorrentes em um subconjunto de Ratos TBI após um período de latência de pelo menos três semanas após tbi.
Este protocolo demonstra procedimentos detalhados para a criação de um campo cirúrgico limpo (Figura 2), fornece uma abordagem passo a passo para implantar diferentes matrizes de eletrodos (Figura 3), e inclui um guia detalhado sobre o uso de dois sistemas diferentes de aquisição de EEG (ver a Tabela de Materiais) para detectar convulsões(Figura 4 e Figura 5) neste modelo. O poder espectral de uma convulsão típica indica maior densidade na faixa de frequência de 10 a 40 Hz com um pico de 15 Hz (Figura 4). A maioria das convulsões em camundongos são convulsivas, com duração média de 12-15 s. Apenas uma pequena fração de convulsões não é convulsiva. Uma comparação completa das vantagens e desvantagens do uso de qualquer sistema é detalhada na seção Discussão. Além disso, este protocolo demonstra os cronogramas para o início da convulsão em animais após a queda repetitiva de peso TBI, mostrando a apreensão agrupando em alguns animais (Figura 6) que enfatiza a importância de adquirir gravações contínuas e não intermitentes, pois isso garantirá uma estratificação precisa de animais que desenvolvem convulsões espontâneas após o TBI daqueles que não o fazem. É importante ressaltar que esse protocolo também discute as vantagens e desvantagens dos modelos de roedores do PTE e sua capacidade de representar uma população específica de seres humanos após o TBI.
Figura 1: O modelo de mouse do TBI difuso repetitivo. (A)Dispositivo de queda de peso. (a1) Tubo de queda de peso. (a2) Uma barra de peso de 100 g. (a3) Pino segurando a vara. (a4) String to raise the rod up if change the height ou removendo a haste do tubo de queda de peso. (a5). Almofada de espuma para colocar o animal o tubo de queda de peso. (B)Procedimento de queda de peso. (b1) O disco de aço inoxidável está posicionado no centro da cabeça entre a linha dos olhos e ouvidos. (b2 e b3) Após confirmação visual de que a cabeça do animal está na posição plana e a almofada de espuma é movida, colocando a cabeça do animal o tubo de queda de peso. (b4) Liberação de pino segurando a haste de peso, atingindo o centro do disco de aço inoxidável. (b5) O rato é colocado em uma toalha estéril imediatamente após o impacto e a perda de consciência ser avaliado medindo o tempo necessário para o animal se recuperar e se corrigir. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 2: Preparação de campo cirúrgico e esquema de colocação de eletrodos EEG. Ferramentas autocelavadas e materiais necessários para cirurgia e implantação de eletrodos são preparados antes de anestesiar o animal para garantir a disponibilidade de todas as peças necessárias. Esta é uma zona estéril e é imprescindível não contaminar essa zona com materiais não estéreis. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 3: Marcos estereotáticos e representação esquemática da colocação de eletrodos usando o Sistema EEG 1 e 2. O painel superior retrata os métodos de implantação dos três diferentes suportes de cabeça descritos neste protocolo. (A)canal EEG único, montagem bipolar. (B)Dois canais EEG com referência comum, montagem bipolar e um canal EMG. (C) Três canais EEG, utilizando a montagem monopolar (canal 1-2) e bipolar (canal 3). O painel inferior retrata os suportes de cabeça e parafusos implantados como no painel superior. Os três tipos de parafusos utilizados neste protocolo para dois fins: como parafusos de estabilidade (Sistema EEG 1) ou estabilidade e como eletrodo (Sistema EEG 2). Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 4: Apreensão espontânea adquirida utilizando o Sistema EEG 1. O painel superior retrata uma convulsão espontânea em um rato 23 dias após repetida queda de peso TBI usando dados adquiridos usando headmount 1EEG. (A)Atividade pré-gelo (pré-convulsão). (B)Atividade ictal (convulsão). (C)Depressão pós-gelo (pós-convulsão). Painel inferior: A densidade do espectro de energia é calculada usando script e software personalizados (ver Tabela de Materiais). Potência média = potência média do espectro de energia dentro da época (unidades: V2/Hz). Frequência mediana = frequência na qual 50% da potência total dentro da época é atingida (unidades: Hz). Frequência média = frequência na qual a potência média dentro da época é atingida (unidades: Hz). Borda espectral = frequência abaixo da qual é alcançada uma porcentagem especificada pelo usuário da potência total dentro da época (unidades: Hz). Frequência máxima = frequência na qual a potência máxima ocorre durante a época. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 5: Apreensões espontâneas adquiridas utilizando o Sistema EEG 2. (A)Convulsão espontânea não convulsiva (eletrográfica) em um camundongo 65 dias após repetida queda de peso TBI. Os dados adquiridos utilizando o headmount 2EEG/1EMG. (B)Convulsiva espontânea em um rato 97 dias após a queda de peso TBI. Dados adquiridos usando headmount 3EEG. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 6: Cronograma de incidência de convulsões em camundongos após repetida queda de peso TBI. A primeira convulsão foi observada três semanas após o ferimento. Alguns animais desenvolvem grupos de convulsões no mesmo dia seguidos por várias semanas sem convulsões. Os animais foram registrados até quatro meses após o TBI. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
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Discussion
Em contraste com os modelos CCI e FPI induzindo ou focal ou combinação de lesão focal e difusa, o modelo de TBI difuso repetitivo descrito neste protocolo permite a indução de lesão difusa na ausência de lesão cerebral focal e não requer aberturas de couro cabeludo ou craniana e a inflamação associada. Um benefício adicional da ausência de craniectomia neste modelo é que ele permite não só implantar os eletrodos para gravação crônica contínua de EEG, mas também a criação de uma janela craniana de crânio dilaalado para imagens crônicas de 2 fótons dos animais antes, imediatamente depois, e repetidamente por dias, semanas e até meses após tbi como descrito em Shandra e Robel 201913.
Independentemente de qual modelo animal é escolhido, a abordagem de aquisição de dados adotada é um elemento crucial de qualquer estudo bem-sucedido e abrangente. Nos modelos de roedores de epilepsia pós-traumática a frequência de convulsões é baixade 14, variando entre 0,3-0,4 convulsões por dia9,15, e o período latente antes da primeira convulsão pode durar em qualquer lugar de dias ou semanas até meses após o procedimento inicial do TBI. Por fim, ao contrário dos modelos não traumáticos, que têm uma incidência geralmente maior de convulsões em um período menor de tempo, em média apenas 9%-50% dos animais com TBI terão convulsões espontâneas durante um período de até seis meses8,16. Isso sugere que estudos significativos requerem gravação contínua de vídeo-EEG a longo prazo.
O objetivo geral de cada modelo animal de TBI é reproduzir o mais de perto possível as diferentes formas de TBI encontradas em pacientes humanos, a fim de investigar melhor os mecanismos celulares e moleculares subjacentes ao PTE. Técnicas neste protocolo ajudarão a facilitar a descoberta de metas terapêuticas, o teste da eficácia e tolerabilidade de novos candidatos preventivos e terapêuticos, e o desenvolvimento de biomarcadores ou preditores confiáveis da epilepsia seguindo Tce.
Desafios potenciais durante o procedimento de queda de peso
Como a cabeça não está fixada em um quadro estereotático, deve-se tomar cuidado extra para garantir uma posição plana da cabeça e da placa de metal. Se a haste ponderada atingir a placa de metal ou a cabeça em um ângulo ou se o peso escorregar para o lado da cabeça do rato, a biomecânica da lesão difere, possivelmente resultando em uma lesão mais amena ou sem ferimentos. No passado, a placa de metal estava colada ao crânio para minimizar a variabilidade. No entanto, a remoção da placa metálica e cola do crânio do rato após a queda de peso, mesmo que realizada com cuidado, induziram danos às meninges, resultando em danos vasculares e danos subsequentes ao tecido cerebral mesmo em animais falsos. Além disso, a incisão requer cura, potencialmente envolvendo uma resposta imune periférica, que pode introduzir variabilidade. Por essas razões foi escolhido para omitir a placa de metal no crânio. Animais podem morrer com lesão repetida (ou seja, 3x neste protocolo). Camundongos com peso corporal abaixo de 25 g podem não tolerar impactos repetidos. Embora as lesões únicas quase nunca resultem em mortalidade, até 7% dos animais C57BL/6 morrem após repetidos impactos9. Déficits motores podem ser observados em alguns animais. Esses déficits se manifestam como pares de membros traseiros ou anormalidades de marcha. Este é geralmente um fator prognóstico para a má recuperação e recomenda-se que o animal seja sacrificado. Os sinais de dor ou angústia incluem perda de peso, má preparação, desidratação, aumento da ansiedade, atividade exploratória baixa ou ausente (hidrogel/recuperação, chow e/ou nestlet permanecem intocados). A analgesia de resgate (0,1 mg/kg de buprenorfina) pode ser administrada subcutâneamente a cada 8h durante três dias a partir de Três dias do TCE para aliviar a dor e evitar que o animal atinja o ponto final humano. A solução subcutânea de lactato de sódio (3 μL por grama do peso do animal) pode ser administrada duas vezes por dia para hidratação. Os animais normalmente se recuperam três dias após o TCE. Recomenda-se o uso de um escore de condição corporal de cinco estágios (SBC) para monitoramento de animais após procedimentos experimentais. As etapas incluem (1) Emaciado (estruturas esqueléticas são extremamente proeminentes, vértebras extremamente segmentadas); (2) Subcondicionado (segmentação da coluna vertebral é evidente, os ossos pélvicos dorsais são prontamente palpáveis); (3) Bem condicionado (vértebras e pélvis dorsal não são palpáveis proeminentes com leve pressão); (4) Super-condicionado (coluna vertebral é uma coluna contínua, vértebras palpáveis apenas com pressão firme); (5) Obeso (rato é liso e volumoso, estrutura óssea desaparece carne e gordura subcutânea). O ponto final humano é alcançado quando o BCS é de 1-2, 20% ou mais perda de peso em um camundongo adulto em comparação com seu peso pré-TBI, sintomas de dor ou angústia não são aliviados por analgésicos, sinais de automutilação, sintomas de desidratação, hipotermia, presença de déficits neurológicos (marcha anormal ou parsóses motores). Vários resultados possíveis da administração de substâncias devem ser levados em consideração. Buprenorfina injetada subcutânea atinge subcutâneamente o primeiro pico de seu efeito analgésico a 10 min após a injeção17. O primeiro impacto ocorre segundos após a aplicação da buprenorfina, sugerindo que a primeira medição do tempo de acerto dificilmente será afetada. No entanto, isso não pode ser totalmente excluído como variável. Assim, os experimentadores são aconselhados a exercer seu próprio julgamento. Se o procedimento de queda de peso for seguido por cirurgia estereotática e carprofeno é administrado é importante notar que o carprofeno é um agente anti-inflamatório que pode afetar a incidência de convulsões, portanto, os experimentadores são aconselhados a considerar seu uso cuidadosamente.
Potenciais desafios durante a cirurgia
O risco de contaminação ou infecção será reduzido com o uso de 70% de etanol, mas não resultará em condições estéreis. Alternativamente, luvas cirúrgicas estéreis podem ser usadas. No entanto, o aparelho estereotático não é estéreo em si, então qualquer manipulação manual resultará na perda da condição estéril das luvas. Assim, a pulverização com 70% de etanol é necessária após o contato com qualquer material não estéril durante a cirurgia. Perfurar o crânio no cérebro cria danos no tecido cerebral e pode causar sangramento profuso. Criar os buracos de rebarba requer extremo cuidado. Fixar a broca manual no braço estereotático e aremendo gradualmente é preferida sobre a perfuração dos furos enquanto segura a broca manualmente. Eletrodos e parafusos de fixação podem afundar mais fundo do que o planejado, ferindo a dura mater (colocação subdural) ou o córtex (colocação cortical). Isso pode causar sangramento profuso e uma lesão focal. O experimentador deve evitar o superaquecimento do animal durante a cirurgia. Se o sensor de temperatura não for corrigido corretamente, ele não manterá a temperatura necessária de 37 °C, causando superaquecimento, queimaduras e, às vezes, a morte do animal como resultado. Os olhos do animal ficam secos, irritados ou danificados durante a cirurgia se não lubrificados assim que o animal é colocado no aparelho estereotático.
Monitoramento pós-operatório
O monitoramento pós-operatório começa imediatamente após o término do procedimento ou cirurgia. Observe o animal até que ele acorde da anestesia e procure a presença ou ausência de quaisquer complicações relacionadas à cirurgia, incluindo sangramento ou parose. Se o sangramento for observado a partir do fechamento incompleto de incisão, anestesiar o animal, limpar o local do sangramento com cloroxidina, realizar o fechamento da ferida conforme descrito acima e devolver o animal à gaiola de recuperação. Aproximadamente 1-2h após a cirurgia, o animal deve estar totalmente acordado da anestesia, movendo-se livremente na gaiola sem sinais de paris ou dor. O animal começará a se preparar sozinho, razão pela qual selar a incisão é necessário para evitar que o animal o abram durante o preparo. Uma vez recuperado o animal, transfira-o para a gaiola/câmara que será usada para aquisição de dados da EEG. Isso permitirá que o animal se habituará ao novo ambiente. Isso é especialmente importante para a gravação de longo prazo (meses). A gaiola animal deve ter um gel de recuperação (ver Tabela de Materiais),um endociado, um ninho e uma garrafa de água. Isso permitirá a recuperação adequada e dará ao animal acesso a nutrientes e água. Continue monitorando o animal diariamente. A avaliação deve incluir (a) A inspeção visual do comportamento do animal para sinais de dor ou angústia, incluindo perda de peso, má aliciamento, aumento da ansiedade, atividade exploratória baixa ou ausente (hidrogel/recuperação, chow e/ou nestlet permanecem intocadas) e a cura adequada da área de incisão em torno do implante EEG; b Avaliação do BCS para sinais de desidratação e desnutrição; c Peso do animal. Administrar a solução de lactato de sódio (3 μL por grama do peso do animal) subcutâneamente se o animal apresentar sinais de desidratação (ver Tabela de Materiais). Administrar buprenorfina (0,1 mg/kg) subcutâneamente se o animal mostrar sinais de dor ou angústia. Se os sinais de dor persistirem, a buprenorfina pode ser administrada a cada 8h. O monitoramento deve ser aumentado para duas vezes por dia se um animal estiver mostrando sinais de dor e/ou angústia. Permita que o animal se recupere por pelo menos três dias após a cirurgia do EEG antes de se conectar ao sistema de aquisição através de uma corda. Os critérios de ponto final humanos são os mesmos dos desafios potenciais durante o procedimento de queda de peso acima.
Vantagens e desvantagens dos sistemas de aquisição e de headmounts
A principal vantagem do Sistema EEG 1 com um único headmount do canal EEG é o custo relativamente baixo do hardware, componentes e serviço. A configuração simples e simples também permite que os usuários personalizem o sistema às suas preferências. Cada amplificador diferencial fornece um único canal EEG, embora vários amplificadores diferenciais possam ser conectados entre si, aumentando o número de canais para cada animal. Neste sistema, uma configuração de canal único por animal foi usada para adquirir gravações crônicas de EEG a longo prazo de 20 animais simultaneamente. Convulsões pós-traumáticas são tipicamente generalizadas, e com uma montagem bipolar bilateral dos eletrodos é fácil detectar esse tipo de atividade epilptiforme. A desvantagem dessa abordagem, no entanto, é que é impossível detectar de forma confiável a focalidade, a lateralização ou a propagação da atividade epilptiforme, pois isso exigiria vários canais. Outro desafio em potencial pode ser a contaminação sonora do canal único ao longo do tempo, tornando-o incapaz de adquirir dados úteis do animal. Isso pode ser superado combinando dois ou mais amplificadores diferenciais, que dobra o número de canais por animal. Por fim, os dados adquiridos de um único canal são mais difíceis de distinguir de artefatos potenciais, e a atividade epilptiforme é melhor suportada por gravações de vídeo do comportamento do animal. Por essa razão, todas as gravações combinaram monitoramento contínuo de vídeo sincronizado com aquisição da EEG. Uma limitação deste sistema e seu software é que ele não inclui o sistema de aquisição de vídeo e, portanto, requer um sistema personalizado de terceiros para adquirir vídeo síncrono.
A maior vantagem do Sistema EEG 2 com headmounts multicanais é a alta qualidade do sinal devido à sua pré-filtragem do sinal adquirido pelo pré-amplificador (ver Tabela de Materiais) antes de ser passado através do deslocamento para o amplificador. Os amplificadores deste sistema permitem a aquisição de dados em três canais nas seguintes configurações: 2 canais EEG+1 EMG ou três canais EEG (ver Tabela de Materiais). Isso permite a detecção não só da atividade generalizada, mas também, potencialmente, da atividade epilépforme focal. Outra grande vantagem é que este sistema foi projetado especificamente para pesquisa animal e, portanto, oferece um sistema de gravação de vídeo e um software capaz de sincronizar o EEG e canais de vídeo para até quatro animais em um único arquivo, o que torna a análise mais fácil e conveniente do que o sistema EEG 1. Este sistema é fácil de usar para aquisição de dados para análise de convulsões e sono sem quaisquer modificações no sistema que não seja o tipo de headmount utilizado. O headmount 2EEG/1EMG permite implantar os eletrodos apenas em locais fixos, devido ao tamanho e configuração da placa de circuito. Os eletrodos de parafuso com cabos de arame em headmounts 3EEG permitem flexibilidade no implante no local desejado com a possibilidade de fazer a aquisição monopolar ou bipolar, dependendo de onde o eletrodo de referência é colocado. No entanto, a implantação do headmount 3EEG requer solda, o que adiciona mais passos à cirurgia e requer mais cautela e precisão. As amarras de conexão e pré-amplificadores foram especificamente projetadas para pequenos roedores como ratos e ratos imaturos, e são cabos finos e de baixo peso que causam pouca pressão na cabeça do animal. Uma desvantagem do sistema é o custo relativamente alto do hardware, software, licença de vídeo e componentes (ou seja, pré-amplificadores e headmounts).
Passos importantes e importantes na aquisição de dados do EEG
O deslocamento tem um mecanismo rotativo, permitindo que a corda gire dependendo da direção do movimento animal. Se esse mecanismo falhar, o movimento do animal será restrito, o que pode resultar na remoção da tampa EEG. Cirurgia repetida para colocar novos eletrodos pode ser tentada. No entanto, isso pode ser desafiador ou impossível se a remoção da tampa EEG anterior causou danos ao crânio e ao cérebro. A taxa de amostragem para aquisição de dados do EEG deve ser de pelo menos 2-2,5 x a maior frequência de juros. Taxas de amostragem mais altas resultam em maior resolução dos dados ao preço de um aumento no tamanho do arquivo, o que pode se tornar difícil de armazenar e processar quando gravações contínuas de vários animais são adquiridas. Assim, é necessário otimizar a taxa de amostragem a um nível que permita obter os dados necessários sem perda de qualidade, minimizando os tamanhos dos arquivos.
Significado e passos críticos na aquisição de dados de vídeo
Em roedores, como em humanos, o PTE pode se manifestar com ampla variabilidade em sintomatologia associada e correlações eletrográficas, tornando necessário obter um vídeo simultâneo durante a aquisição do EEG, a fim de interpretar e classificar adequadamente os eventos eEG observados. A interpretação dos dados do EEG na ausência de vídeo sincronizado é particularmente desafiadora quando um único canal EEG é usado. Neste caso, pode ser difícil determinar se a forma de onda EEG é um artefato, a menos que outras evidências (vídeo) apoiem a classificação como uma convulsão. Artefatos de movimento podem parecer semelhantes ao padrão eletrográfico da convulsão. Portanto, vídeo com ou sem confirmação EMG é um requisito. Embora a gravação de vídeo seja realizada durante ciclos claros e escuros, a qualidade do vídeo pode nem sempre ser satisfatória e clara durante as horas escuras. Além disso, se o animal for afastado da câmera durante o evento Ictal-like EEG, pode ser desafiador avaliar seu comportamento. Nesses casos, a aquisição de um sinal de eletromiografia (EMG) além do EEG e do vídeo pode resolver o desafio fornecendo informações sobre a atividade muscular durante convulsões comportamentais mais brandas (com componentes motores baixos) ou para confirmar a falta de movimento animal durante descargas de pico e ondas lentas no EEG. Os potenciais desafios com o canal EMG são semelhantes aos desafios com os canais EEG, como contaminação por ruído, colocação incorreta de eletrodos ou os eletrodos que se soltam (ou perdendo contato superficial) durante o tempo prolongado da gravação. O uso de vídeo em conjunto com a análise do EEG tem dois propósitos: confirmar que um evento do EEG não é um artefato causado pelo movimento do animal (comportamento exploratório, bebida, mastigação, arranhão, alongamento, limpeza ou respiração rápida/laboral) e diferenciar entre convulsões convulsivas e convulsivas. Recomenda-se o uso de uma escala de Racine modificada para caracterizar convulsões convulsivas ou não convulsivas. As etapas incluem (0) Apreensão eletrográfica pura sem qualquer manifestação motora identificável; (1) Automatismos orofaciais e acenando para a cabeça; (2) Empurrão clonic forelimb; (3) Clonus bilateral de membros dianteiros; (4) Clonus de forelimb e criação; (5) Clonus forelimb com criação e queda. Cada canal de vídeo deve mostrar claramente toda a superfície com o animal na gaiola, um rótulo com número de identificação animal, ponta de garrafa de água, comida e gel de dieta/recuperação. Para garantir a aquisição de vídeo durante as horas escuras, use uma fonte noturna infravermelha. (Algumas câmeras possuem dispositivos embutidos ou podem exigir peças adicionais. Veja a Tabela de Materiais). Ajuste o quadro por segunda taxa e resolução de imagem. A taxa de quadros mais alta e a resolução vêm ao custo de maior tamanho de arquivo. As principais desvantagens da aquisição de vídeo durante experimentos contínuos crônicos prolongados incluem a necessidade de armazenar grandes quantidades de dados e as dificuldades técnicas envolvidas no processamento dos arquivos grandes. A proficiência do experimentador para interpretar efetivamente os dados comportamentais em conjunto com o EEG também deve ser considerada.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo R01 NS105807/NS/NINDS NIH HHS/Estados Unidos e CURE com base em uma cura concedida recebida do Comando de Pesquisa Médica do Exército dos Estados Unidos e do Comando Materiel, Departamento de Defesa (DoD), através do Programa de Pesquisa em Saúde Psicológica e Lesão Cerebral Traumática o Prêmio Nº. W81XWH-15-2-0069. Ivan Zuidhoek é muito apreciado por revisar o manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.10" screw | Pinnacle Technology Inc., KS, USA | 8209 | 0.10 inch long stainless steel |
| 0.10" screw | Pinnacle Technology Inc., KS, USA | 8403 | 0.10 inch long with pre-soldered wire lead |
| 0.12" screw | Pinnacle Technology Inc., KS, USA | 8212 | 0.12 inch long stainless steel |
| 1EEG headmount | Invitro1 (subsidiary of Plastics One), VA, USA | MS333/8-A/SPC | 3 individually Teflon-insulated platinum iridium wire electrodes (twisted or untwisted, 0.005 inch diameter) extending below threaded plastic pedestal |
| 2EEG/1EMG headmount | Pinnacle Technology Inc., KS, USA | 8201 | 2EEG/1EMG channels |
| 3% hydrogen peroxide | Pharmacy | ||
| 3EEG headmount | Pinnacle Technology Inc., KS, USA | 8235-SM-C | custom 6-Pin Connector for 3EEG channels |
| Buprenorphine | Par Pharmaceuticals, Cos. Inc., Spring Valley, NY, USA | 060969 | |
| Buprenorphine | Par Pharmaceuticals, Cos. Inc., Spring Valley, NY, USA | 060969 | |
| C57BL/6 mice | Harlan/Envigo Laboratories Inc | male, 12-16 weeks old | |
| C57BL/6 mice | The Jackson Laboratory | male, 12-16 weeks old | |
| Carprofen | Zoetis Services LLC, Parsippany, NJ, USA | 026357 | NOTE: this drug is added during weight drop only if stereotactic electrode implantation will be performed on the same day |
| Chlorhexidine antiseptic | Pharmacy | ||
| Dental cement and solvent kit | Stoelting Co., USA | 51459 | |
| Drill | Foredom | HP4-917 | |
| Drill bit | Meisinger USA, LLC, USA | HM1-005-HP | 0.5 mm, Round, 1/4, Steel |
| Dry sterilizer | Cellpoint Scientific, USA | Germinator 500 | |
| EEG System 1 | Biopac Systems, CA, USA | ||
| EEG System 2 | Pinnacle Technology Inc., KS, USA | ||
| Ethanol ≥70% | VWR, USA | 71001-652 | KOPTEC USP, Biotechnology Grade (140 Proof) |
| Eye ointment | Pro Labs Ltd, USA | Puralube Vet Ointment Sterile Ocular Lubricant available in general online stores and pharmacies | |
| Fluriso liquid for inhalation anesthesia | MWI Veterinary Supply Co., USA | 502017 | |
| Hair removal product | Church & Dwight Co., Inc., USA | Nair cream | |
| Isoflurane | MWI Veterinary Supply Co., USA | 502017 | |
| Povidone-iodine surgical solution | Purdue Products, USA | 004677 | Betadine |
| Rimadyl/Carprofen | Zoetis Services LLC, Parsippany, NJ, USA | 026357 | |
| Solder | Harware store | ||
| Soldering iron | Weller, USA | WP35 | ST7 tip, 0.8mm |
| Stainless steel disc | Custom made | ||
| Sterile cotton swabs | |||
| Sterile gauze pads | Fisher Scientific, USA | 22362178 | |
| Sterile poly-lined absorbent towels pads | Cardinal Health, USA | 3520 | |
| Tissue adhesive | 3M Animal Care Products, USA | 1469SB |
References
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