Een semi-High-throughput imaging methode en data visualisatie Toolkit om C. elegans embryonale ontwikkeling te analyseren

Summary

Dit werk beschrijft een semi-High-throughput protocol dat gelijktijdige 3D time-lapse beeldvorming van embryogenese in 80 – 100 C. elegans embryo's in een enkele nachtelijke run toestaat. Daarnaast worden tools voorbeeld verwerking en visualisatie meegeleverd om de gegevensanalyse te stroomlijnen. De combinatie van deze methoden met aangepaste reporter stammen maakt gedetailleerde controle van embryogenese.

Abstract

C. elegans is het belangrijkste systeem voor de systematische analyse van de specificatie van het lot van cellen en morfogenetische gebeurtenissen tijdens de embryonale ontwikkeling. Een uitdaging is dat embryogenese dynamisch zich ontvouwt over een periode van ongeveer 13 uur; deze tijdschaal van een halve dag heeft de reikwijdte van experimenten beperkt door het aantal embryo's dat kan worden gefotografeerd te beperken. Hier beschrijven we een semi-High-throughput-protocol dat de gelijktijdige 3D-time-lapse-beeldvorming van ontwikkeling mogelijk maakt in 80 – 100 embryo's bij matige tijdresolutie, van maximaal 14 verschillende omstandigheden, in een enkele nachtelijke run. Het protocol is eenvoudig en kan worden geïmplementeerd door elk laboratorium met toegang tot een microscoop met punt bezoek capaciteit. Het nut van dit protocol wordt aangetoond door het te gebruiken om beeld twee op maat gebouwde stammen uitdrukken fluorescerende markers geoptimaliseerd voor het visualiseren van belangrijke aspecten van de kiem-laag specificatie en morfogenese. Om de gegevens te analyseren, is een aangepast programma dat individuele embryo's uit een breder gezichtsveld in alle kanalen, z-stappen en tijdpunten snijdt en de sequenties voor elk embryo opslaat in een aparte TIFF-stapel gebouwd. Het programma, dat een gebruiksvriendelijke grafische gebruikersinterface (GUI) bevat, stroomlijnt de gegevensverwerking door afzonderlijke embryo's te isoleren, vooraf te verwerken en uniform te oriënteren in voorbereiding op visualisatie of geautomatiseerde analyse. Ook meegeleverd is een ImageJ-macro die individuele embryo gegevens compileert in een bestand met meerdere panelen dat de maximale intensiteit fluorescentie projectie en brightfield-afbeeldingen voor elk embryo op elk tijdstip weergeeft. De protocollen en hulpmiddelen die hierin worden beschreven, werden gevalideerd door ze te gebruiken om embryonale ontwikkeling te karakteriseren na een knock-down van 40 eerder beschreven ontwikkelings genen; deze analyse visualiseerde eerder geannoleerde ontwikkelings fenotypes en onthulde nieuwe. Kortom, dit werk Details een semi-hoge doorvoer imaging methode in combinatie met een bijsnijden programma en ImageJ visualisatietool die, in combinatie met stammen uitdrukken informatieve fluorescerende markers, sterk versnelt experimenten te analyseren embryonale ontwikkeling.

Introduction

De C. elegans embryo is een belangrijk modelsysteem voor mechanistische celbiologie en analyse van de specificatie van het lot van cellen en morfogenetische gebeurtenissen die embryonale ontwikkeling stimuleren^{1,2,3,4 ,5,6,7,8,9}. Tot op heden is veel van de karakterisering van zowel gebeurtenissen op cellulair niveau als de specificatie van het lot van cellen in het embryo bereikt met behulp van relatief hoge temporele resolutie One-at-a-time Imaging experimenten (d.w.z. acquisitie elke 10 – 100 s) van embryo's die fluorescerende markers. Hoewel zeer geschikt voor gebeurtenissen op de orde van seconden tot tientallen minuten, wordt deze aanpak technisch beperkt voor de karakterisering van langere processen, op de volgorde van uren tot dagen. Embryonale ontwikkeling van het eerste decolleté tot het einde van de rek duurt ongeveer 10 uur. Op deze tijdschaal, semi-hoge doorvoer methoden die ervoor zorgen dat gelijktijdige lagere tijdresolutie Imaging (d.w.z. acquisitie met 5 – 20 min tijdsintervallen) van grotere cohorten van embryo's, van verschillende omstandigheden, zou een nieuwe reeks experimenten openen; bijvoorbeeld het mogelijk maken van systematische grootschalige screening-inspanningen en de analyse van voldoende aantallen embryo's voor vergelijkingen van de gevolgen van moleculaire verstoringen.

Hier beschrijven we een semi-High-throughput-methode voor het bewaken van C. elegans embryogenese die gelijktijdige 3D-timelapse-beeldvorming van de ontwikkeling mogelijk maakt in 80 – 100 embryo's, van maximaal 14 verschillende omstandigheden, in een enkele nachtelijke run. Het protocol is eenvoudig te implementeren en kan worden uitgevoerd door elk laboratorium met toegang tot een microscoop met punt bezoek mogelijkheden. De belangrijkste stappen in dit protocol zijn uiteengezet in Figuur 1. In het kort, embryo's worden ontleed van zwangere volwassenen uitdrukken van fluorescerende markers van belang en overdracht van jonge embryo's (2 – 8 cel stage) naar putten van een 384-put voorbeeld vorming. In dit formaat, de relatief kleine goed grootte trechters embryo's in een smal gebied, die de identificatie van velden met meerdere embryo's voor time-lapse beeldvorming vergemakkelijkt. Om ruwweg synchrone ontwikkeling in de cohort van embryo's te handhaven, worden dissecties uitgevoerd in gekoelde media en wordt de plaat op ijs gehouden, waardoor significante ontwikkeling tijdens het urenlange dissectie tijdvenster wordt voorkomen. De plaat wordt overgebracht naar de Microscoop en de embryo's worden gefilmd in een kamer met temperatuurregeling, 's nachts, op 20 min tijdsintervallen, met een 60x olie onderdompeling 1,35 NA lens, om het volledige z-bereik in stappen van 2 μm te verzamelen. 50 velden, elk met een tussen 1 – 5 embryo's, worden in één enkele nacht run afgebeeld. Afhankelijk van het gewenste experiment kan de tijdresolutie worden verhoogd (bijvoorbeeld Imaging met intervallen van 5 tot 10 minuten) door het aantal afbeeldingsvelden proportioneel te verlagen.

Met dit protocol genereert zelfs één overnight run een aanzienlijke hoeveelheid gegevens (80 – 100 embryo's verspreid over 50 velden) en grotere experimenten kunnen snel onbeheersbaar worden met betrekking tot data-analyse. Om de verwerking, visualisatie en stroomlijn analyse van deze gegevens te vergemakkelijken, werd een programma gebouwd om embryo's uit te snijden en te oriënteren en pre-processing stappen uit te voeren (optioneel), en een ImageJ-macro die de gegevens compileert om de weergave te vereenvoudigen. Deze Programma's kunnen worden gebruikt om beelden te verwerken die zijn verzameld met conventionele benaderingen, omdat ze onafhankelijk zijn van de beeldvormings methode, waarbij slechts één brightfield-vlak vereist is. Het eerste programma neemt een 4D-veld met meerdere embryo's (GUI-optie of broncode embryoCrop.py) of meerdere 4D-velden met meerdere embryo's (screenCrop.py), snijdt embryo's goed en oriënteert ze in een anterieure-posterieure configuratie. Deze Programma's geven gebruikers ook de mogelijkheid om achtergrond aftrekken, drift correctie en demping correctie uit te voeren. De resulterende bestanden zijn uniform voorbewerkte, strak bijgesneden TIFF-stapels voor elk embryo dat kan worden geamendeerbaar voor geautomatiseerde beeldanalyse. Om het eenvoudiger te maken om alle embryo's voor elke aandoening te bekijken, is een ImageJ-macro (OpenandCombine_embsV2. IJM) geschreven, die alle embryo's van een bepaalde voorwaarde samenstelt tot één TIFF-stack en matrices van brightfield-afbeeldingen en projectie kleur voor maximale intensiteit ( RGB)-overlays, naast elkaar, voor elk embryo. De methoden werden gevalideerd door ze te gebruiken om embryonale ontwikkeling te karakteriseren na een knock-down van 40 eerder beschreven ontwikkelings genen in een paar op maat gebouwde stammen die fluorescerende markers uitdrukken die geoptimaliseerd zijn om belangrijke aspecten van kiem-laag te visualiseren specificatie en morfogenese^10,11. Samen zullen de semi-hoge doorvoer embryo Imaging protocol en beeldverwerkings hulpmiddelen hogere sample-getalexperimenten en grootschalige screening-inspanningen mogelijk maken die gericht zijn op het begrijpen van ontwikkelingsprocessen. Daarnaast zullen deze stammen ook een efficiënt middel zijn om de effecten van moleculaire verstoringen op embryogenese te onderzoeken.

Protocol

1. voorbereiding van C. elegans embryo's voorbeeld vorming met semi-hoge doorvoer

Opmerking: Het doel van dit deel van het protocol is het laden van een populatie van semi-gesynchroniseerde (2 tot 8-cel stage) C. elegans embryo's, ontleed uit geschikte marker stammen (Figuur 2), in een glazen bodem 384-well plate voor Imaging. Andere plaat formaten kunnen ook werken, maar de 384 well Plates hebben de voorkeur omdat de kleine put de verspreiding van embryo's beperkt tot een relatief klein gebied, wat de identificatie van velden met meerdere embryo's voor timelapse-beeldvorming vergemakkelijkt. Een ruwweg synchroniseren van de embryo's zorgt ervoor dat het volledige verloop van de ontwikkeling wordt opgevangen voor elk van de embryo's in een veld.

1. Bereid 5 – 10 mL van 0,1 mg/mL oplossing van tetramisole hydrochloride (TMHC) anestheticum opgelost in Ice Cold M9 medium (0,45 M na₂HPO₄∙ 7h₂O, 0,11 m KH₂PO₄, 0,04 M NaCl, 0,09 m NH₄cl) te gebruiken tijdens dissectie en imaging. Deze media omvatten een verdoving om ervoor te zorgen dat bewegend gearceerde larve de beeldvorming van embryo's in eerdere ontwikkelingsstadia niet verstoren.
   Opmerking: Als u de gereedschappen voor uitsnijden en visualisatie gebruikt om gegevens te analyseren die zijn verkregen met behulp van standaard agarose pad-bevestigingsmethoden, gaat u verder met sectie 3 hieronder.
2. Aliquot 70 μL van de bereide oplossing in afzonderlijke putjes van een glazen bodem 384-putplaat met één goed voor elke toestand; Vermijd de buitenste twee rijen van de plaat om randeffecten te voorkomen.
   Opmerking: Het is handig om omringende putten te maskeren met behulp van zelfklevende PCR-plaat folie (zie voorbeeld in Figuur 1D) dit behoudt aangrenzende putten voor toekomstige experimenten en maakt het gemakkelijker om geschikte putten te lokaliseren onder de dissectie Microscoop. Houd de plaat en de resterende oplossing op het ijs als de oplossing eenmaal is opgegeven.
3. Het genereren van mond pipets voor het overbrengen van embryo's uit de depressie dia (waar de zwangere hermaphrodites worden ontleed) naar de putten. Trek capillaire pipets (25 μL gekalibreerde pipets) over een vlam en breek om een fijn taps toelopende uiteinde te genereren (Figuur 1D). Er is één pipet per aandoening nodig om kruisbesmetting te voorkomen; Gooi het pipet na gebruik weg.
4. Gebruik fijne pincet voor het overbrengen van ~ 10 zwangere volwassenen onder een dissectie-bereik in 150 μL van de ijskoude tmhc-oplossing die voor elke aandoening op een depressie dia wordt vermeld. Met behulp van de pincet en een scalpel, ontleden de wormen om de embryo's vrij te geven.
5. Plaats een getrokken capillaire pipet in de aspirator-bijlage bij de pipets en de mond pipet om alle 2 tot 8-celfase embryo's over te brengen naar een individueel goed van de bereide plaat (Figuur 1D). Vermijd het overdragen van embryo's in de late fase en dissectie puin. Onderzoek onder een dissectie bereik en als er verzamelingen van embryo's aanwezig zijn, pipetteer dan op en neer of tik op klonten embryo's met pipetpunt om te dispergeren.
   Opmerking: Om kruisbesmetting te voorkomen, reinig de dissectie apparatuur en gebruik een verse mond pipet tijdens het verplaatsen tussen de omstandigheden. Bewaar plaat op ijs tussen dissecties.
6. Zodra de wormen uit alle omstandigheden zijn ontleed en embryo's in hun passende put zijn geplaatst, draai de 384-put plaat gedurende 1 minuut bij 600 x g om de embryo's te vereffenen.
7. Veeg de onderkant van de plaat af met een door ethanol gedrenkt doekje om eventuele resten te verwijderen en plaats de plaat op een confocale Microscoop die is uitgerust met een plaathouder in een temperatuurgestuurde omgeving.
   Opmerking: De stappen die deze methode in detail volgen met behulp van de Lab-installatie; Wijzig de acquisitie voorwaarden om aan de experimentele behoeften en apparatuur te voldoen. Hier wordt een confocale scanner Box uitgerust met een microlens-Enhanced Dual Nipkow Spinning disk, een 512 x 512 EM-CCD camera, een hoge precisie auto-XY-stage (aangewezen resolutie 0,1 μm) en gemotoriseerde z-axis Control (aangewezen resolutie 0,1 μm). Dit systeem wordt bewaard in een kamer van 16 °C, die de Microscoop temperatuur tussen 21 en 23 °C handhaaft tijdens nachtelijke beeldvorming.
8. Om velden met geschikte embryo's te identificeren, voert u elke put een pre-scan uit met een 10x 0,4 NA objectief en geschikte beeldvormings software. De meest optimale velden zullen meer dan één embryo in de vroege fase bevatten, dat zich in hetzelfde brandvlak bevindt als andere embryo's en idealiter een minimaal contact tussen de aangrenzende embryo's zal hebben. Markeer posities van geschikte gebieden.
9. Om Imaging velden te selecteren, schakelt u over naar de 60x-doelstelling en past u het brandvlak bij elk punt bezoek aan op de juiste sectie van de embryo's. 1 – 4 velden per put worden afgebeeld, voor een totaal van 50 velden in 14 Wells, en elk veld kan bevatten tussen één en vijf embryo's. In totaal worden 4 tot 15 embryo's geselecteerd uit elke voorwaarde voorbeeld vorming met hoge resolutie.
   Opmerking: Een belangrijke variabele bij deze stap is het gebruik van voldoende olie; plaats olie op het doel, bezoek punten in elk putje om de olie rond het oppervlak van alle putjes te verspreiden en breng vervolgens een extra druppel olie aan op de doelstelling voorafgaand aan de selectie van velden.
10. Beeld de geselecteerde velden met behulp van een 60x 1,35 NA doelstelling om 18 z secties te verwerven bij 2 μm intervallen elke 20 min voor 10 h. De beeldvormende condities met behulp van de kiemen-laag en morfogenesis reporter stammen zijn als volgt: brightfield, 90% vermogen, 25 MS, 20% Gain; 488 nm, 100% vermogen, 200 MS, 60% winst; 568 nm, 45% vermogen, 150 MS, 60% Gain.
11. Nadat de beeldvorming is voltooid, evalueer dan de embryonale letaliteit door een lage vergroting (10x 0,4 NA objectief) hele put brightfield-scan ~ 20 – 24 h na het begin van de nachtelijke beeldvorming.

2. embryonale letaliteit scoren

1. Gebruik de na-run 10x gescande velden, evalueer embryonale letaliteit en larvale defecten door het tellen van gearceerde wormen en niet-uitgekomen embryo's voor elke put.
2. Scoor ongehatste embryo's als embryonaal dodelijk. Uitsluiten van aangehouden één-op-vier-celfase embryo's van letaliteitstelling, aangezien jonge ontleed embryo's soms niet in de eierschaal vorming (als meiose II nog niet compleet is) en permeabiliteit defecten kunnen leiden tot osmotische complicaties tijdens de eerste twee Divisies.
3. Partituur gedeeltelijk uitgekomen of volledig gearceerde wormen met lichaams morfologie of gedrags gebreken, zoals Dumpy of verlamd, als ' abnormale larve '.

3. geautomatiseerd bijsnijden (Figuur 3A)

Opmerking: De software is ondergebracht op twee locaties: (1) Zenodo herbergt een gebruiksvriendelijke versie van de software¹² die geen programmeerkennis vereist. (2) github bevat de broncode voor onze embryoCropUI.py en screenCrop.py software¹³, die vaardigheid met python vereisen. Gedetailleerde instructies voor het downloaden en het bedienen van beide versies van het programma u hieronder vinden.

1. Geautomatiseerd bijsnijden met behulp van de uitvoerbare versie van embryoCropUI (gebruiksvriendelijke versie)
   1. Om het embryoCropUI programma te gebruiken, downloadt u eerst het programma van Zenodo (https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w)¹².
      1. Download de MacOS-of Windows-versie van het programma (Houd er rekening mee dat MacOS X 10.11 of hoger vereist is voor de MacOS-versie).
      2. Download het instructiebestand (GUI_Instructions_zenodo_repoV2. docx), dat stapsgewijze instructies biedt voor het testen en gebruiken van het embryoCropUI-programma.
      3. Download de test_files. zip om te testen of het programma goed functioneert op het platform (zie instructies).
   2. Eenmaal gedownload, unzip en navigeer naar de embryoCropUI uitvoerbaar (... \Embryocropui\_windows\embryocropui\embryocropui.exe) of (... \Embryocropui\_macos\embryocropui\embryocropui.exe). Dubbelklik om te starten (of kies ' openen met '-Terminal) en voer het uitvoerbare bestand van de embryoCropUI uit.
   3. De GUI executable gewassen één 4D gezichtsveld op een moment. Selecteer in de linkerbovenhoek de knop openen om het specifieke veld te laden om te bijsnijden (multi-TIFF). Als u een TIFF-serie bijsnijd met meerdere dimensies (d.w.z. z, time, Channel), laadt u alleen de eerste afbeelding in de reeks in de map (één TIFF-serie per map).
   4. Nadat de afbeeldingen zijn geladen, geeft u de volgende informatie op: aantal z-slices, (Z), aantal tijdpunten (T), aantal kanalen (C), het kanaal dat overeenkomt met DIC of brightfield (eerste = 1, tweede = 2, enz.).
   5. Selecteer extra verwerking om uit te voeren op de afbeeldingen. Het programma biedt drift correctie, achtergrond aftrek, en demping correctie.
   6. Geef parameters op voor achtergrond aftrek en demping correctie om de verwerkings inspanningen in de GUI-prompt te begeleiden. Definieer voor achtergrond aftrekken de grootste functie grootte om de grootte van een betekenisvol signaal weer te geven; deze functie grootte moet niet worden beschouwd als achtergrond en moet een oneven getal waarde zijn. Voer een waarde van 0-1 voor demping correctie. De waarde van de dempings correctie weerspiegelt het percentage van de oorspronkelijke intensiteit dat blijft op de verste diepte van het object dat wordt afgebeeld.
      Opmerking: Achtergrond aftrekken en demping correctie moeten samen worden uitgevoerd.
   7. Geef de volgorde van de installatiekopie verzameling op (d.w.z. Channel-z-time (czt) of z-Channel-time (zct)).
   8. Specificeer de micron per pixel voor de afbeeldingen op basis van de camera die wordt gebruikt.
      Opmerking: Er wordt een slechte afbeelding bijgesneden als de pixelgrootte niet correct is gedefinieerd.
   9. Selecteer uitvoeren in de linkerbenedenhoek. In hetzelfde pad als de niet-bijgesneden map wordt een nieuwe submap met het label bijsnijden gemaakt. bijgesneden versies worden opgeslagen op deze locatie. Afhankelijk van de bestandsgrootte, moet bijsnijden binnen enkele seconden tot minuten worden voltooid.
2. Geautomatiseerd bijsnijden met behulp van screenCrop.py (batch versie alternatief voor embryoCrop GUI hierboven beschreven;Alleen python-savvy-gebruikers)^10,13
   1. Voor het gebruik van screenCrop.py, de python-softwareversie voor het bijsnijden van grotere gegevenssets in een batch-indeling, kloon of download de broncode van github (github.com/renatkh/embryo_crop.git).
   2. Lees de instructies voor het configureren van een juiste virtuele omgeving en volg het bestands naamgevingssysteem dat wordt beschreven; beide zijn gedetailleerd in het Leesmij -bestand in de GitHub-repository: https://github.com/renatkh/embryo_crop/BLOB/Master/README.MD.
   3. Zodra omgevingsvariabelen en naamgevingsconventies goed zijn vastgesteld, opent u parameters.py en screenCrop.py in een editor naar keuze.
   4. Als u instelbare parameters wilt wijzigen zonder de broncode aan te raken, bewerkt u het bestand parameters.py .
      Opmerking: het is ook mogelijk om de parameters direct te wijzigen in de header van screenCrop.py.
      1. Als u het parameters.py-configuratiebestand gebruikt, wijzigt u de instelling use_configure in True. Als u direct bewerken binnen screenCrop.py, laat u de use_configure instelling op false.
      2. Zoek de volgende informatie in het bestand parameters.py en breng wijzigingen aan in de gewenste imaging parameters en bestandsstructuur:
         1. loadFolder (lijn 9): Ga naar het station waarop de bestanden zijn opgeslagen (bijv. Z:/, D://, enz.)
         2. datum (regel 7): Ga naar de map met bestanden voor de Imaging-sessie. Dit wordt ' naam van de experiment-map ' genoemd in het CSV-traceringsbestand (zie instructies).
         3. trackingFile (regel 11): Ga naar het pad naar het CSV-bestand waarin de informatie over het experiment is opgeslagen.
         4. z (lijn 13): instellen als het aantal z-vlakken.
         5. nT (line14): instellen als het aantal tijdspunten.
         6. nWells (lijn 19): instellen als het aantal gebruikte putten.
         7. Pointbezoeken (lijn 20): instellen als het maximum aantal punt bezoeken (per put).
         8. In regel 10 Zoek de locatie die momenteel bezet is door ' CV1000/' en voer de buitenste map in die wordt gebruikt in het bestandspad. Om problemen te voorkomen, gebruikt u de volgende Conventie: ' XXXXXXX/'.
         9. Voer in regel 12 een geldig bestandspad in voor het opslaan van gegevens over de hoogte-breedte verhouding voor bijgesneden gegevens.
         10. In de regels 15, 16, 17 en 18 invoer waar/onwaar voor of de afbeeldingen gaan door de volgende verwerking:
             1. Voer True of False in voor drift correctie op regel 15.
             2. Invoer waar of ONWAAR voor achtergrond aftrekken op regel 16. De grootte van de functie moet empirisch worden bepaald voor verschillende markerings stammen en pixel groottes. In de configuratie hier, de grootte van de functie werd gedefinieerd als 41 voor de kiem-Layer stam en 201 voor de morfogenese stam. Achtergrond aftrekken moet worden gedaan in combinatie met demping correctie.
             3. Invoer waar of ONWAAR voor demping correctie op regel 17.
             4. Invoer waar of ONWAAR voor de anterieure posterieure rotatie op lijn 18.
   5. Als alle wijzigingen zijn doorgevoerd, kan het bijsnijden beginnen. Ga hiervoor naar screenCrop.py en selecteer het pictogram afspelen in de werkbalk, selecteer uitvoeren als > python runin het vervolgkeuzemenu.
   6. Als bijsnijden kan enkele uren in beslag nemen voor een grote gegevensset (50 punt bezoeken 18 z stappen, 3 kanalen, 31 tijdpunten), bijhouden van de voortgang van bijsnijden in het consolevenster. Zodra het bijsnijden is voltooid, zal een klein venster voorvertoningen van de bijgesneden afbeeldingen weergeven voordat het wordt opgeslagen. Voor elke afbeelding zijn er 3 opties:
      1. Opslaan: Druk op de SPATIEBALK om de afbeelding op te slaan als de afbeelding goed wordt bijgesneden zonder dat er interessegebieden worden afgesneden.
      2. X: Druk op X als het beeld interessegebieden lijkt te hebben afgesneden; de afbeelding wordt opgeslagen met een X voor de naam om deze van de andere afbeeldingen te scheiden.
      3. Verwijderen: druk op D om de bijgesneden afbeelding te verwijderen als de afbeelding niet goed wordt bijgesneden of als het embryo niet bevredigend is.
         Opmerking: de afbeeldingen worden opgeslagen in een submap met de naam "bijgesneden" in de map laden (gedefinieerd in regel 9 van het programma).

4. visualisatie (Figuur 4)

Opmerking: OpenandCombine_embsV2. IJM^10,12 is een imagej-macro die een eenvoudig te bekijken TIFF-bestand van alle afbeeldingen voor een specifieke stam en conditie zal construeren. Installatie van Fiji/imagej^14,15 is vereist. Deze macro wordt uitgevoerd volgens onze bestandsstructuur; het zal moeten worden aangepast om te werken met andere bestandsstructuren. Een handleiding voor de juiste bestandsstructuur en gedetailleerde beschrijving van belangrijke overwegingen vindt u aan het einde van het bestand GUI_Instructions_zenodo_repoV2. docx op de zenodo-repository. Lees deze instructies volledig door voordat u Imaging naar behoren naam en structuur bestanden naar de interface het beste met deze macro. Ter referentie, onze bestandslocatie structuur ziet er als volgt uit:
Z:\cropped\Target\Strain\Emb # \Target_Emb # _15 Digit unieke id _W # #F # _T # #_Z # #_C #. TIF
dat wil zeggen Z:\cropped\EMBD0001\GLS\Emb1\EMBD0001_Emb1_20140327T135219_W02F1_T01_Z01_C1.tif

1. Download OpenandCombine_embsV2 en GUI_Instructions_zenodo_repoV2. docx van zenodo (https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w).
2. Bereid de volgende informatie voor:
   -De locatie waar de afbeeldingsmappen worden opgeslagen (na bijsnijden).
   -De naam (namen) van de afbeeldingsmap voor de specifieke voorwaarde (n) die moet worden verwerkt (d.w.z. EMBD0002). Dit wordt ' target ' genoemd in het bovenstaande voorbeeld
   -Een 15-cijferige alfanumerieke unieke id die specifiek is voor een bepaald overnight-experiment-deze id is de naam van de map voor gegevens acquisitie (d.w.z. 20140402T140154) en de unieke id is ingebed in de afzonderlijke TIFF-bestandsnaam (EMBD0002_Emb1_ 20140402T140154_W06F2_T01_Z01_C1) voor elk embryo dat op die dag is afgebeeld. De macro gebruikt deze id om te controleren op embryo's die op dezelfde datum zijn verworven en kan herhaalde voorwaarden, met afzonderlijke datums, in afzonderlijke ImageJ-bestanden assembleren.
3. Open ImageJ en sleep het macro bestand OpenandCombine_embsV2. IJMnaar de imagej-balk of open de macro rechtstreeks.
4. Nadat de macro is geopend, zoekt u de regels 3 en 4. Voer de gegevens die zijn verzameld in (punt 4,2) in volgens de volgende stappen:
   1. Voer in regel 3 (RNAL) de doelnaam in voor de afbeeldingen die moeten worden verwerkt. Invoer van elk doel in de volgende structuur newArray ("XXXXXXXX/"); offertes opnemen. Als u meerdere voorwaarden tegelijk wilt uitvoeren, scheidt u deze met een komma en houdt u alle doelnamen binnen de haakjes (d.w.z. Newarray ("EMBD0000/", "EMBD0001/", "EMBD0002/").
   2. Voer in regel 4 (datum) de 15-cijferige alfanumerieke unieke id in offertes in, bijvoorbeeld Newarray ("20140402t140154").
5. Druk op uitvoeren linksonder in het macrovenster. Er verschijnt een venster waarin wordt gevraagd naar de buitenste map met de bijgesneden afbeeldingsmappen (opgegeven in 4.4.1) te navigeren.
6. Als deze optie is geselecteerd, wordt er een ander venster weergegeven waarin de imaging parameters kunnen worden gespecificeerd.
   1. Voer het aantal kanalen in, het aantal Z-segmenten, de tekengrootte voor de tekst die wordt gebruikt bij het labelen van de gecompileerde afbeeldingen en de kleur voor elk van de kanalen.
   2. In-en uitschakel auto in alle kanalen.
7. Zodra alle parameters zijn opgegeven, klikt u op OK onder in het venster. Het samengestelde bestand zal beginnen te monteren; Dit duurt enkele minuten, per conditie, om te voltooien.
8. Als u klaar bent, controleert u de bestanden die desgewenst open blijven. Ze kunnen worden gesloten zonder op te slaan, als de macro heeft al de bestanden opgeslagen in een nieuw gecreëerde map met de naam op de volgende manier: naam van de buitenste map (opgegeven in de prompt van sectie 4,5) + "-Fiji-verwerkte-uitvoer" (dat wil zeggen, Z:\ cropped-fiji-processed-output\EMBD0002_GLS_20140402T140154.tif).

Representative Results

Een belangrijke uitdaging bij het karakteriseren van het effect van moleculaire perturbaties op C. elegans embryonale ontwikkeling is dat het ongeveer 10 uur duurt voordat embryo's van het eerste decolleté tot het einde van de rek op 20 °¹⁶worden uitgevoerd. Een semi-High-throughput methode waarbij grote cohorten van embryo's tegelijkertijd kunnen worden afgebeeld, is handig voor gebeurtenissen op deze tijdschaal, omdat het beeldvorming van meerdere voorwaarden parallel met een voldoende ensemble grootte voor elke voorwaarde mogelijk maakt om kwantitatieve analyse (Figuur 1A).

Semi-hoge doorvoer imaging methode en multi-marker stammen
De hier beschreven semi-High-throughput beeldvormings methode (beschreven in Figuur 1B) maakt gebruik van een 384-goed glazen bodemplaat; het multi-well formaat maakt het mogelijk om tot 14 voorwaarden parallel te worden opgesteld en de geringe omvang van de putten beperkt het zoekgebied, waardoor de identificatie van velden met embryo's voorbeeld vorming met hoge resolutie wordt vereenvoudigd. Hier werd een confocale scanner Box gebruikt, uitgerust met een microlens-verbeterde Dual Nipkow Spinning disk, een 512 x 512 EM-CCD camera, een hoge precisie auto-XY-stage (aangewezen resolutie 0,1 μm) en gemotoriseerde z-axis Control (aangewezen resolutie 0,1 μm). Het protocol kan echter worden aangepast voor elke confocale Microscoop met precisiepunt-bezoek mogelijkheden en een stage adapter die geschikt is voor een multi-well plaat. Een belangrijke uitdaging bij de ontwikkeling van deze methode was het bedenken van een manier om een plaat van embryo's te genereren in dezelfde ontwikkelingsfase, zodat de gehele ontwikkeling voor alle embryo's op elk gebied kan worden vastgelegd. Dit is een uitdaging omdat de embryo's die op de beeld plaat zijn geënt, zich eerst zullen blijven ontwikkelen, terwijl latere monsters worden ontleed, wat resulteert in een helling van de enscenering over de putjes. Om dit probleem te omzeilen, worden vroege fase embryo's (2-8 Cell stage) geselecteerd en houden de dissectie media en imaging Plate op ijs; Deze stalletjes embryogenese voor de ontleed embryo's totdat alle omstandigheden zijn voorzien zonder een significante invloed op de embryonale levensvatbaarheid¹⁰. Om de tijd dat de embryo's op het ijs zitten te beperken tot 1 uur, voeren twee onderzoekers de dissecties tegelijkertijd uit, waardoor de set-up van 14 verschillende omstandigheden in ongeveer 50 minuten mogelijk is. Na dissectie wordt de plaat gedurende 1 minuut op 600 x g gesponnen om de embryo's te sediment en putten worden vooraf gescand bij een lage vergroting om velden te lokaliseren met groepen geschikte embryo's voorbeeld vorming met een hoge vergrotingsfactor; punt bezoek locaties zijn gemarkeerd. Embryo's worden 's nachts gefilmd in een kamer met temperatuurregeling en een 60x olie-immersie 1,35 NA-lens. De monsters zijn geconfigureerd in een 4 put door 4 well regio, zodat het oppervlak van de plaat die wordt gebruikt in een experiment is vergelijkbaar met een 22 x 22 mm² standaard coverslip, die het mogelijk maakt voor het gebruik van een 60x olie doelstelling. Uniforme verspreiding van olie in deze regio voorafgaand aan de start van Imaging is van cruciaal belang voor succesvolle lange termijn beeld verwerving. De zich ontwikkelende embryo's worden afgebeeld in een oplossing die verdoving bevat; Dit zorgt ervoor dat wanneer de oudere embryo's in de put uitkomen, hun beweging de positie van aangrenzende jongere embryo's die worden afgebeeld niet verstoort. Door de ondoordringbare aard van de eierschaal heeft het anestheticum geen invloed op de beweging voorafgaand aan het uitkomen. In deze omstandigheden worden 3D-timelapse-gegevens verzameld in 3-kanalen voor een totaal van 80-100 embryo's in één overnight-experiment (hieronder meer besproken).

C. elegans embryonale ontwikkeling vindt plaats in twee fasen. Ten eerste genereren 10 ronden celdeling in combinatie met de specificatie van het lot van cellen de drie kiem lagen (Ectoderm, mesoderm en endoderm) over een periode van 6 uur¹⁷. In de volgende 7 uur, morfogenetische gebeurtenissen rijden de vorming van gedifferentieerde weefsels^8,16. Om deze twee aspecten van ontwikkeling vast te leggen, bouwden we een paar aangepaste stammen, de kiem laag en morfogenese stammen¹⁰ (Figuur 2a), en gebruikten ze het semi-hoge doorvoer protocol om embryo's van beide stammen te beelden. De kiem laag stam drukt transgene gecodeerde fluorescerende eiwitten die kernen markeren in de Ectoderm, mesoderm en endoderm in rood, geel en groen. Deze stam bevat drie reporter transgenes: (1) een transgen dat Pha-4:: GFP aangeeft dat kernen in de darm en keelholte (groene endoderm)^10,18,19, (2) een transgen uitdrukt die een mCherry-histone fusie in de epidermis en in ~ 1/3 van neuronen (rode Ectoderm; Figuur 2a), en (3) een transgen dat tegelijkertijd mcherry en GFP-Tagged histonen in de Body Wall muscle (gele mesoderm) uitdrukt. De morfogenese stam heeft twee transgenen die uitdrukken: (1) een groene epitheliale Junction marker (DLG-1:: GFP) in de epidermis, en (2) een mCherry-Tagged plasma membraan marker, in ~ 1/3 van neuronen (PCND-1 promotor; Figuur 2A). Om de effectiviteit van RNAi te verbeteren, werden beide stammen ook ontworpen om een paar RNAi-sensibiliserende mutaties (NRE-1 (HD20) Lin-15b (hd126)²⁰te bevatten. Deze werden gebouwd met als doel het uitvoeren van een grootschalig RNAi-gebaseerd scherm van de ~ 2.000 genen die nodig zijn voor embryonale ontwikkeling. Dit paar stammen zal echter ook een breed bruikbaar gestandaardiseerd platform vormen voor het beoordelen van ontwikkelings fouten bij mutanten, en voor gedetailleerdere analyses van de rollen van verschillende eiwitten in ontwikkeling.

Voor het verzamelen van gegevens in deze semi-hoge doorvoer indeling, met deze stammen, worden groen, rood en helder-veld z-serie (18 x 2 μm² intervallen) verzameld, elke ~ 20 min, voor een periode van 10 uur in een 16 °c temperatuurgestuurde kamer; Dit handhaaft de Microscoop tussen 21-23 °C tijdens de run. Het tijdsinterval van 20 minuten stelt ons in staat om 50 velden van embryo's (punt bezoeken) per experiment te afbeelen. Gebruikers kunnen acquisities afstemmen op kortere intervallen met minder punt bezoeken, of langere intervallen met meer punt bezoeken om het beste bij hun experimentele doelstellingen te passen. Voor deze stammen, de vroege ontwikkelingstijd punten worden niet afgebeeld, omdat de weefsel specifieke verslaggevers rijden marker uitdrukking niet beginnen te drukken tot middellange tot late gastrulatie. Tijdens deze vroege fase werden putten gescand bij een lage vergroting (10x) en werden velden geselecteerd voor een hoge vergrotingsweergave. Het is raadzaam velden te selecteren die meer dan één embryo met een vroege fase bevatten, maar vermijd velden waar embryo's deels overlapt zijn, of die zich aan de uiterste rand van de put bevinden. Na een nachtelijke 60x-beeldvorming wordt een hele goed scan van een lage vergroting (10x) uitgevoerd om te bepalen of embryo's met een normaal uiterlijk (WT) uitkomen, met zichtbare afwijkingen (larvale abnormaal) uitkomen of embryonaal dodelijk zijn voor elke beoordeelde aandoening ( Afbeelding 1B). Deze stap dient als een eenvoudig alternatief voor het instellen van platen parallel aan het beoordelen van letaliteit over een grotere populatie; de hele goed 10x na-Scan biedt embryonale letaliteit gegevens op 50-80 embryo's per aandoening. Het gebruik van deze maatregel om de populatie embryonale letaliteitsgegevens voor controles tussen runs te vergelijken, is een nuttige controle die zorgt voor consistentie met betrekking tot de gezondheid van de stammen en de milieuomstandigheden en de verwerkingsstappen. Bij een afbeelding in combinatie bieden de twee aangepaste reporter stammen informatieve uitlezingen voor de meeste belangrijke ontwikkelings gebeurtenissen, waaronder de specificatie van het lot van cellen, dorsale intercalatie, epidermale behuizing, rek en neurogenese (representatieve besturings beelden worden weergegeven in afbeelding 2B, zie ook Wang et al.¹⁰).

Gegevensverwerking: geautomatiseerd embryo bijsnijden en oriëntatie
Met ons Imaging protocol bevat elk beeldveld met hoge resolutie tussen 1 en 5 embryo's; Deze embryo's zijn willekeurig georiënteerd en worden vaak direct naast elkaar geplaatst. Gegevens die worden verzameld met conventionele embryo-montage technieken hebben dezelfde uitdagingen. Om de gegevens voor te bereiden voor een volgende visualisatie en analyse, is aanzienlijke hands-on manipulatie nodig om de embryo sequenties uit te snijden en te oriënteren, en om ze vooraf te verwerken om de achtergrond af te trekken, te corrigeren voor drift en de signaal demping te compenseren met diepte. Om dit proces te stroomlijnen werd een aangepaste embryo-teeltprogramma gebouwd dat elk embryo uit het bredere veld isoleert en oriënteert (Figuur 1C, Figuur 3). Dit programma is verpakt als een gebruiksvriendelijk, zelfstandig programma met grafische gebruikersinterface (GUI, compatibel met gegevens van de meeste Imaging platforms) die een 3D-time-lapse-sequentie van een veld van embryo's kunnen aannemen en verwerken in individuele TIFF-Series voor elk embryo in het veld (Figuur 3B, beschikbaar op https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w)^10,12. De python-broncode voor de GUI (embryoCropUI.py) en een batch versie van dit programma (screenCrop.py) zijn ook beschikbaar voor ervaren python-gebruikers op github (https://github.com/renatkh/embryo_crop.git)^10,13. De kernfunctionaliteit van dit programma is het vinden, bijsnijden en oriënteren van het embryo langs de anterieure-posterieure as. Tegelijkertijd kunnen op de gegevensset achtergrond aftrekken, demping correctie en drift correctie worden uitgevoerd met optionele instelbare instellingen.

In het kort detecteert de geautomatiseerde bijsnijd software iteratief individuele embryo's in een binair masker dat is verkregen uit de heldere veld afbeeldingen en snijdt achtereenvolgens de embryo's van alle kanalen en oriënteert de beelden langs de voorste-posterieure as (Figuur 3 B, voor het eerst beschreven in Wang et al.¹⁰). Voorafgaand aan het bijsnijden corrigeert de software voor drift, trekt de achtergrond af en voert diepte-demping correctie uit in elk fluorescentie kanaal (optioneel). Om het binaire masker te verkrijgen, past de software Canny Edge Detection²¹ toe op de heldere veld afbeeldingen, voert de projectie van de maximale intensiteit van de drie centrale vlakken uit en vult kleine gaten in. Het algoritme detecteert individuele embryo's door een ovaal Cassini te monteren op een gedeelte van het binaire masker overzicht (Zie Figuur 3B, 3c). Na het uitlijnen van de ovaal langs de hoofdas, meet de software de intensiteit van de rode fluorescentie in elke helft van het geïsoleerde embryo en roteert het embryo zodanig dat de rode intensiteit naar links gericht is, waardoor het embryo voorste aan de linkerzijde wordt gezet voor beide Reporter stammen die in dit werk worden gebruikt (Figuur 3D). Het loodsen van deze software onthulde dat de meeste embryo's efficiënt werden bijgesneden zoals verwacht. Kleine beeldvormings problemen, zoals embryonale drift, tijdelijk verlies van brandvlak (als gevolg van luchtbellen in olie) of overvolle velden met embryo's verstoren doorgaans niet het uitsnijden. Voor velden met grote klonters embryo's (die enigszins in z overlappen), waren de embryo's die aanzienlijk werden gekanteld binnen het beeldvormings vlak (in Z), het verlies van het brandvlak op de lange termijn of embryo's die gedeeltelijk waren afgesloten, een succesvolle teelt niet altijd Bereikt. Deze problemen kunnen gemakkelijk worden omzeild door een betere veld selectie tijdens de data-acquisitie fase. Over het algemeen is het vooraf verwerken van gegevens die zijn verzameld met deze semi-High-throughput methode of het gebruik van conventionele montagemethoden een nuttige eerste stap voor het visualiseren en analyseren van embryonale gegevenssets.

Validering van beeld verzameling en gegevensverwerkings methoden: embryonale ontwikkeling visualiseren na knock-down van 40 eerder beschreven genen
Voor het valideren van deze semi-hoge doorvoer methode voor het verzamelen van afbeeldingen en aangepaste bijsnijden regime, een kleine RNAi scherm werd uitgevoerd in de aangepaste stammen, gericht tegen 40 genen met eerder beschreven functies in cel lot specificatie en morfogenese ( beschreven door Wang, Ochoa, Khaliullin en collega's^10,11). Om dit te doen, werd dsRNA gegenereerd tegen elk doelwit, geïnjecteerd L4 dieren van elke stam, wachtte 20-24 h, en vervolgens ontleed en geimageerde embryo's met behulp van het protocol hierboven beschreven (voor volledige dataset^10,11). Het bereiken van ontwikkelings fenotypes door RNAi vereist remming van zowel maternale als zygotische genexpressie. Ontwikkelings-genen kunnen maternaal uitgedrukt worden, waarbij de resulterende eiwitproducten in de embryo's worden geladen, of zygotisch uitgedrukt in het embryo, of in veel gevallen zowel^10,22,23. De tijd tussen injectie en embryo-opnames is de kritische variabele die effectief gericht is op maternaal en zygotisch uitgedrukt populaties; timing bepaalt zowel de hoeveelheid geïnjecteerd dsRNA die in het embryo wordt geladen om zygotische expressie²⁴ te voorkomen en de mate van maternale eiwit depletie. Na de injectie met dsRNA wordt de maternale mRNA die overeenkomt met het beoogde gen aangetast en wordt deze niet hersteld in een relevant tijdsinterval. Reeds bestaande eiwit depletie vereist embryoproductie, die het moederlijke eiwit uit kiembaan weefsels uitwerpt door het in de vorming van embryo's te laden. 20-24 h bij 20 °C is de kortste incubatietijd die een consistente maternale depletie toelaat; maternale uitputting wordt beter in latere tijdpunten (d.w.z. 36-42 h na injectie). De hoeveelheid geïnjecteerd dsRNA die in het embryo wordt geladen, dicleert hoe effectief de preventie van zygotische genexpressie zal zijn. De hoeveelheid geladen RNA pieken over 5-10 h na injectie, wanneer embryo's met ingespoten materiaal eerst worden bevruchte, daalt daarna. In onze ervaring is 24 h na injectie een optimaal tijdpunt, waarbij maternale eiwit depletie en remming van zygotische genexpressie beide effectief zijn. Analyse van fenotypes in de Custom reporter stammen gebruikt in dit werk, over de set van 40 test genen, toonde aan dat ons gecombineerde protocol leverde verschillende, zeer reproduceerbare kenmerkende fenotypes over een breed spectrum van genen die betrokken zijn bij het lot van cellen specificatie en morfogenese (Zie Wang et al.¹⁰); de volledige gegevensset is beschikbaar¹¹). Als voorbeeld van deze gegevens worden nog steeds afbeeldingen van vier verschillende embryo's voor controle, Pha-4 (RNAi), PAL-1 (RNAi)en MEX-3 (RNAi) in de kiem laag reporter stam weergegeven in Figuur 4A. Voor een uitgebreidere bespreking van de fenotypes die worden waargenomen in het 40-gen RNAi-scherm, zie Wang et al.¹⁰

ImageJ-macro: compilatie en visualisatie van alle gegevens voor een bepaalde voorwaarde
Visualisatie van grote aantallen embryo's uit individuele TIFF-stapels kan vervelend en tijdrovend zijn om door te werken. Vanaf onze eerste inspanning werden > 400 individuele embryo's geïsoleerd met behulp van het aangepaste geautomatiseerde bijsnijd programma zoals hierboven beschreven. Om de First-pass-analyse te versnellen, bouwden we een ImageJ-macro, die een array genereert van alle embryo's die worden afgebeeld voor een bepaalde RNAi-aandoening in een bepaalde strain-achtergrond (Figuur 4B). Voor elk embryo in de array worden een brightfield-afbeelding en een projectie afbeelding met maximale intensiteit naast elkaar weergegeven, voor elk tijdpunt, om een samengesteld filmbestand te genereren. Hoewel deze macro is geschreven om te functioneren met onze bestandsstructuur, kan deze worden bewerkt om tegemoet te komen aan de bestandsstructuur van de gebruiker. Voor de beste resultaten moeten gebruikers echter de naamgevings-en bestandsstructuur conventies volgen die in het protocol zijn uiteengezet (Zie de Leesmij-bestanden Zenodo of github voor meer informatie over de naamgevingsconventies voor python en ImageJ-toepassingen). Om alle verwerkte gegevens van ImageJ te bekijken en meer diepgaande analyse te krijgen van de fenotypes die zijn waargenomen voor de 40-gentestset, raadpleegt u de gegevens die zijn gedeponeerd in de dryad-database^10,11. Dit ImageJ-visualisatie formaat maakt een snelle evaluatie mogelijk van het algehele fenotype en de penetrantie ervan, en maakt het gemakkelijk om problemen met de gegevenskwaliteit te markeren, zoals de aanwezigheid van vuil of verlies van het brandvlak. Over het algemeen vergemakkelijkt de combinatie van de semi-hoge doorvoer methode voor gegevens acquisitie, het bijsnijd programma en het ImageJ-visualisatie hulpmiddel, gecombineerd met aangepaste reporter stammen, grote inspanningen om de embryonale ontwikkeling te bestuderen.

Figuur 1. Overzicht van de beeldvormings methode met hoge inhoud, de procedure voor gegevensverwerking en essentiële hulpmiddelen. A) eenvergelijking van de kenmerken van de standaard agarose pad-methode voor de montage van C. elegans embryo's op de semi-High-throughput multi-well Imaging benadering die hier wordt beschreven. B) overzicht van de semi-hoge doorvoer methode voor de monitoring van de embryonale ontwikkeling. Zie tekst voor meer informatie. (C) overzicht van de tools voor gegevensverwerking en visualisatie, die kunnen worden gebruikt op gegevens die zijn verkregen met behulp van een conventionele agarose pad-gebaseerde montage procedure of de semi-hoge doorvoer multi-well plate-gebaseerde methode die hierin wordt beschreven. Een enkele 3-kanaals timelapse embryo sequentie uit één veld (links) of meerdere 3-kanaals, 4-dimensionale velden van embryo gegevens (rechts) kunnen worden verwerkt met behulp van het aangepaste bijsnijd programma, dat compatibel is met gegevens die op de meeste beeldvormings platforms zijn vastgelegd. De grafische gebruikersinterface (GUI) versie van het programma is gebruiksvriendelijk en vereist geen programmeerkennis. De screenCrop.py applicatie vereist python expertise, maar het heeft toegevoegd mogelijkheden-namelijk dat het kan bijsnijden in batch formaat. De output van deze stap is strak bijgesneden, anterieure-posterieure embryo TIFF stapels. Om alle gegevens uit één voorwaarde te visualiseren, is een ImageJ-macro gebouwd die bijgesneden, geroteerde TIFF-stapels compileert om een brightfield-afbeelding en maximale intensiteit projectie voor elk embryo op elk tijdpunt weer te geven. (D) panel toont essentiële hulpmiddelen die nodig zijn voor dissectie en Setup van semi-hoge doorvoer Imaging Format. Sommige figuur componenten gereproduceerd met toestemming van Wang et al.¹⁰. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2. Aangepaste stammen gegenereerd voor High-content Imaging van C. elegans embryogenese. A) schema's illustreren de transgenen die worden gebruikt om de kiem laag (boven) en morfogenese (bodem) stammen te construeren. B) projectie panelen met maximale intensiteit tonen de ontwikkelingstijd in de morfogenese (boven) en de stammen van de kiem laag (bodem). Ventrale weergave wordt getoond, zoals geïllustreerd in de schema's (links). De tijd is relatief ten opzichte van de komma fase (t = 0), die gemakkelijk te herkennen is in beide stammen. Schaalbalk = 10 μm. afbeelding gereproduceerd met toestemming van Wang et al.¹⁰. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 3. Aangepast bijsnijd programma isoleert en oriënteert individuele embryo's uit Imaging velden. (A) Schematische voorstelling van de kenmerken van het aangepaste embryo-bijsnijd programma en de twee opties voor toegang tot dit programma: een gebruiksvriendelijke GUI-interface, die geen programmeerkennis vereist en beschikbaar is op zenodo (links) en een batch bijsnijden versie van het programma, die python-ervaring vereist en is beschikbaar op github (rechts). (B) afbeelding geeft een overzicht van het geautomatiseerde bijsnijd algoritme-een binair masker wordt gegenereerd uit 8-bits brightfield-afbeeldingen en individuele embryo's worden gedetecteerd, bijgesneden en georiënteerd langs de anterieure posterieure as. De schaalbalk is 10 μm.C) Schematische Details de procedure die wordt gebruikt om embryo's in het binaire masker iteratief te detecteren. D) Schematische voorstelling van de methode die wordt gebruikt voor het oriënteren van embryo's langs de anterieure posterieure as. Panelen B-D gereproduceerd met toestemming van Wang et al.¹⁰. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 4. Aangepaste ImageJ-macro maakt visualisatie van RNAi-screening gegevens mogelijk door samengestelde bestanden voor elke voorwaarde te genereren. A) embryo's voor drie voorbeelden van RNAi-condities uit de 40-gen-testset (Zie Wang et al.^10,11 voor volledige gegevensset) worden weergegeven (rechts) die de kenmerkende fenotypes die worden verkregen voor elke toestand en de reproduceerbaarheid van de fenotypes binnen elke toestand. Panel werd aangepast met toestemming van Wang et al.¹⁰. (B) illustreert hoe de aangepaste imagej-macro (OpenandCombine_embsV2. IJM) embryo's van een bepaalde RNAi-voorwaarde in een samengesteld imagej-bestand matrices die de projecties van brightfield en maximale intensiteit voor elk embryo op elk tijdpunt matrices. Hoewel slechts één voorbeeld is gemarkeerd, kan deze macro de gegevens voor veel RNAi-voorwaarden tegelijk compileren. ImageJ-macro is beschikbaar op Zenodo¹². Schaalbalk = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussion

Dit werk beschrijft een reeks instrumenten en methoden die zijn ontwikkeld om grotere inspanningen mogelijk te maken om de functie van genen in embryonale ontwikkeling in C. eleganste profile eren. Onze semi-High-throughput methode maakt het mogelijk om 3D-timelapse-beeldvorming van embryonale ontwikkeling met 20 minuten resolutie voor 80 – 100 embryo's in één experiment. Hoewel dit protocol kan worden aangepast voor gebruik met elke gewenste marker stam (en), demonstreert dit werk het potentieel van de methode met behulp van twee aangepaste stammen die zijn ontwikkeld om gebeurtenissen tijdens de embryogenese te monitoren: (1) een kiem-Layer reporter stam, waarin weefsel specifieke promoters stimuleren de expressie van fluorescerende histonen om de endoderm, mesoderm en Ectoderm-kernen te markeren, en (2) een morfogenese reporter stam, die epidermale en neuronale promotors gebruikt om de expressie van fluorescerende markers in celkruisingen te stimuleren en het plasma membraan. Door het beeld van de twee stammen, kunnen de gevolgen van moleculaire verstoringen op de specificatie van het lot van cellen en morfogenetische gebeurtenissen met opmerkelijke Details worden vastgelegd. Om de uitdagingen aan te pakken die worden voorgesteld door de hoeveelheid gegevens die door deze methode worden gegenereerd, zijn aangepaste hulpmiddelen ontwikkeld om de gegevensverwerking en visualisatie te stroomlijnen. Het eerste gereedschap gewassen individuele embryo's uit een veld van embryo's in 3D-timelapse-sequenties, terwijl ook de embryo's worden gedraaid naar een standaard anterieure-posterieure oriëntatie en het uitvoeren van achtergrond aftrekken, drift correctie, en demping correctie. Dit programma werd verpakt als een gebruiksvriendelijke GUI (https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w) en de broncode en een meer geavanceerde batchverwerking versie van het programma voor python savvy gebruikers (github.com/renatkh/embryo_crop.git) wordt geleverd^10,12,13. Tot slot, om deze verwerkte gegevens in een zinvolle indeling te visualiseren, werd een ImageJ-macro bedacht; Hierdoor kan de gebruiker alle embryo's van een bepaalde RNAi-aandoening visualiseren in een film met meerdere panelen, die op elk tijdpunt een projectie van brightfield en maximale intensiteit toont voor elk embryo. Samen, de stammen, protocol, en data processing tools, doen inspanningen om C. elegans embryogenese in grotere schaal een meer haalbare inspanning te bestuderen.

Hoewel het eenvoudig te implementeren over het algemeen, de semi-High-throughput acquisitie methode hier beschreven vereist aandacht voor een paar kritische Details, die hieronder worden besproken. Ten eerste moeten gebruikers toegang hebben tot een confocale Microscoop met een precisiepunt-bezoek capaciteit die kan worden uitgerust met een multi-well plaathouder. De meest kritische overweging voor dit protocol is dat de Microscoop in een temperatuurgestuurde ruimte wordt gehouden. Hoewel veel microscopen de capaciteit hebben om te verwarmen, kunnen de meeste niet betrouwbaar afkoelen, dus de omgevingstemperatuur moet worden aangepast om een constante C. elegans vriendelijke temperatuur te behouden. Om dit te bereiken, wordt de Imaging room gehouden op 16 °C. Het monstergebied van het instrument verhit tot 21-23 °C tijdens beeldvorming. Schommelingen in kamertemperatuur kunnen de ontwikkelings timing beïnvloeden en de nauwkeurigheid van het focale vlak tijdens punt bezoek subtiel veranderen en moeten zo veel mogelijk worden vermeden. Merk op dat het draaien bij temperaturen boven 23 °C kan resulteren in een aanzienlijke Piek in embryonale letaliteit voor controle omstandigheden en niet aan te raden is. Een andere belangrijke overweging is de selectie en spreiding van embryo's tijdens dissectie. Er moet voor worden gezorgd dat oudere embryo's niet in de beeldvormings putten worden overgebracht, aangezien bij het uitbroeden de neiging bestaat om de aangrenzende embryo's uit het zicht te vegen; de incidentie hiervan wordt verminderd door het opnemen van verdoving in de media. De dispersie van embryo's, om grote klonters van embryo's te voorkomen, is ook een kritische variabele. Clumping treedt meestal op wanneer embryo's worden overgebracht naar de putten in capillaire pipets die te dun zijn uitgetekend, of wanneer embryo's niet voldoende gedispergeerd zijn tijdens dissectie. Een andere overweging is dat punt selectie en focal plane tuning tijd kost. De plaat wordt tijdens dit proces niet op ijs gehouden, zodat de embryo's zich onmiddellijk beginnen te ontwikkelen. Voor de aangepaste marker stammen gebruikt in deze studie, er is ongeveer een 90 min venster nadat de plaat is verwijderd van ijs te bereiken plaat scanning en punt selectie voordat markeringen beginnen te worden uitgedrukt. Dit is voldoende tijd om met deze stammen op ons instrument te zetten, maar andere microscopen en stammen kunnen extra tijd uitdagingen bieden waarvoor het oplossen van problemen nodig is. Ten slotte maakt de methode die we beschrijven een 60x-olie doelstelling om z-stapels van 50-velden te verzamelen met een tijdsinterval van 20 minuten. Zoals we benadrukken, kan de tijdelijke resolutie worden verhoogd door het aantal velden dat wordt afgebeeld te verminderen. 10 velden kunnen bijvoorbeeld worden afgebeeld op 4 min. tijdresolutie. Een tweede alternatief voor het verhogen van de temporele resolutie is het gebruik van een lagere vergroting, hoge numerieke diafragma doelstelling; in dit geval maakt het grotere gezichtsveld het mogelijk om een groot aantal embryo's bij een hogere resolutie te bekijken met een gematigde reductie van de ruimtelijke resolutie.

Om gegevensverwerking en visualisatie op grotere schaal mogelijk te maken, hebben we aangepaste tools gebouwd en ze vrij beschikbaar gemaakt. De meest algemeen bruikbare tool is de aangepaste bijsnijden GUI, waarvoor geen programmeerkennis nodig is om te werken. De GUI kan worden gebruikt om embryo's uit te snijden en te oriënteren in alle stadia van ontwikkeling en is compatibel met alle markers, waardoor het niet alleen nuttig is voor ontwikkelings biologen, maar ook voor onderzoekers die processen in het vroege embryo bestuderen. Omdat de uitvoer van de GUI nauwkeurig is bijgesneden, georiënteerd, geschaald, drift-gecorrigeerde gegevens, kunnen de gegevens gemakkelijk worden gefunneleerd in een geautomatiseerde analyse pijplijn, waardoor deze tool nuttig is voor analyse van vroegere en toekomstige gegevens; Als er geschikte stammen worden gebruikt, kunnen resulterende gegevensbestanden worden gebruikt als invoer voor bestaande geautomatiseerde analyse regimes, zoals embryogenese Alignment tools²⁵. Om het programma te gebruiken, is het belangrijk dat gebruikers zich ervan bewust zijn dat het bijsnijd algoritme een brightfield-of DIC-afbeelding vereist die voor elke stap en elk tijdpunt moet worden verzameld. Bovendien moeten gebruikers er rekening mee dat de anterieure-posterieure oriëntatie algoritme is gestructureerd op basis van de verdeling van het rode signaal in de kiem-Layer reporter en morfogenesis rapport stammen, getoond in dit werk. Zo zal de nauwkeurigheid van de AP-oriëntatie in andere markerings stammen per geval moeten worden geëvalueerd. De GUI is getest met gegevens die zijn verzameld op drie verschillende confocale beeldvormings platformen en is compatibel over de hele linie voor multi-TIFF stacks en TIFF Series. Naast de gebruiksvriendelijke versie, is ook de broncode voor de GUI en een batch versie van dit programma beschikbaar gesteld, met het voorbehoud dat programmeerervaring vereist is, en moeten bestandsstructuren en naamgevingsconventies worden gevolgd. Ten slotte werd een ImageJ-verwerkings macro gebouwd om RAW-beeld stapels te maken voor alle embryo's, in elke RNAi-voorwaarde, en een informatieve array samen te stellen om alle embryo's voor die aandoening te tonen in de projectie van de maximale intensiteit van brightfield en fluorescentie op elk moment. Deze tool kan worden aangepast aan de specificaties van de gebruiker en is een handige macro om gegevensverkenning en kwaliteitscontrole te vereenvoudigen.

Samen met de film methode semi-High-throughput samen met de embryo-en beeldverwerkings hulpmiddelen die hierin worden beschreven, zal de analyse van C. elegans embryonale ontwikkeling met behulp van verschillende mutanten, perturbaties en marker stammen worden vergemakkelijkt. In ons eigen laboratorium is momenteel een grootschalig scherm met deze methoden om embryo's te filmen van de twee op maat gemaakte soorten die hier worden beschreven nadat ~ 2.000 genen nodig zijn voor ontwikkeling. Ten slotte zullen de gegevens van deze inspanning dienen als een andere bron om de inspanningen te verbeteren om de specificatie van het lot van cellen en morfogenetische gebeurtenissen tijdens de embryogenese te begrijpen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aspirator Tube Assembly	Drummond Scientific	2-000-000
Calibrated Pipette (25 mL)	Drummond Scientific	2-000-025
Cell Voyager Software	Yokogawa Electric Corp	Included with CV1000
Conical Tube (15 mL)	USA Scientific	1475-0501
CV1000 Microscope	Yokogawa Electric Corp	CV1000
Depression slide (3-well)	Erie Scientific	1520-006
Dissection Microscope	Nikon	SMZ-645
Eppendorf Centrifuge 5810R	Eppendorf	5811 07336
ImageJ/FIJI	Open Source	https://imagej.net/Fiji
M9 Buffer	Lab Prepared	https://openwetware.org/wiki/M9_salts
Microcentrifuge Tube (1.5 mL)	USA Scientific	1615-5500
Microseal F-foil Seal	Bio-Rad	MSF1001
NGM Plates	Lab Prepared	http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html#d0e214
Scalpel #15	Bard Parker	REF 371615
Sensoplate Plus, 384 Well, F-bottom, Glass Bottom	Greiner Bio-One	781855
Tetramisole Hydrochloride	Sigma Aldirch	T1512-10G
Tweezers, Dumont #3	Electron Microscopy Sciences	0109-3-PO
U-PlanApo objective (10× 0.4 NA)	Olympus	1-U2B823
U-PlanApo objective (60× 1.35 NA)	Olympus	1-U2B832