Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

שיטת דימות למחצה של תפוקה גבוהה וערכת כלי הדמיה של נתונים כדי לנתח את הפיתוח העובריים של ס. אלאנס

Published: October 29, 2019 doi: 10.3791/60362
Automatic Translation
1,2,3, 1,2, 1,2, 1,4,5, 1,6, 1,7, 1,2, 1,2, 1,2
1Ludwig Institute for Cancer Research, San Diego, 2Department of Cellular and Molecular Medicine, University of California, San Diego, 3Recursion Pharmaceuticals, 4Biomedical Sciences Graduate Program, University of California, San Diego, 5Cell Biology Section, National Institute of Dental and Craniofacial Research, National Institutes of Health, 6Department of Biology, San Diego State University, 7Developmental and Stem Cell Biology Graduate Program, University of California, San Francisco

Summary

עבודה זו מתארת פרוטוקול של תפוקה חצי-גבוהה המאפשרת הדמיה בו של embryogenesis בזמן בו במהירות של 80-100 ס מ עוברים בריצה אחת ללילה. בנוסף, כלי עיבוד תמונה ופריטים חזותיים נכללים כדי לייעל את ניתוח הנתונים. השילוב של שיטות אלה עם זני כתבת מותאמים אישית מאפשר ניטור מפורט של embryogenesis.

Abstract

ג. אלגיה היא המערכת המובילה לניתוח שיטתי של מפרט הגורל התא ואירועים מורפולגנטיים במהלך התפתחות עובריים. אתגר אחד הוא שembryogenesis דינמי נפרש על פני תקופה של כ -13 שעות; זה חצי ציר זמן אורך היום יש להגביל את היקף הניסויים על ידי הגבלת מספר העוברים שניתן לדימות. כאן, אנו מתארים פרוטוקול חצי-גבוה-תפוקה המאפשרת הדמיה בזמן התלת-ממד הסימולטני של פיתוח ב-80-100 עוברים ברזולוציה מתונה, מתוך עד 14 מצבים שונים, בריצה אחת ללילה. הפרוטוקול הוא פשוט יכול להיות מיושם על ידי כל מעבדה עם גישה למיקרוסקופ עם היכולת לבקר הנקודה. השירות של פרוטוקול זה מוכח על ידי שימוש בו לתמונה שני זנים בנויים אישית ביטוי סמנים פלורסנט ממוטב להמחיש היבטים מרכזיים של שכבת נבט מפרט מורפולגנזה. כדי לנתח את הנתונים, תוכנית מותאמת אישית החותכת את העוברים הבודדים משדה רחב יותר של תצוגה בכל הערוצים, z-steps ונקודות זמן ושומרת את הרצפים עבור כל עובר לתוך מחסנית tiff נפרדת. התוכנית, הכוללת ממשק משתמש גרפי ידידותי למשתמש (GUI), מפשט עיבוד נתונים על ידי בידוד, טרום עיבוד, ו בצורה אחידה עוברים בודדים לקראת ויזואליזציה או ניתוח אוטומטי. שסופקו גם היא מאקרו ImageJ המבצע הידור של נתוני העובר בודדים לתוך קובץ מרובה חלוניות המציג הקרנה בעוצמה מירבית של הקרנת הקרינה ותמונות ברייטפילד לכל עובר בכל נקודה. הפרוטוקולים והכלים המתוארים במסמך זה אומתו באמצעות השימוש בהם לאפיון התפתחות עובריים בעקבות ה40 של הגנים ההתפתחותיים שתוארו לעיל; ניתוח זה דמיינו לעיל פנוטיפים התפתחותיים וחשף חדשים. לסיכום, עבודה זו מפרטת שיטת הדמיה למחצה של תפוקה גבוהה ביחד עם תוכנית חיתוך ו-ImageJ הכלי להדמיה, כאשר בשילוב עם זנים המבטא פלורסנט אינפורמטיבי סמנים, מאיצה מאוד ניסויים לנתח פיתוח עובריים.

Introduction

העובר C. אלגיה היא מערכת חשובה מודל עבור ביולוגיה של התא מכניסטי וניתוח של מפרט הגורל תא ואירועים גנטיים מורפוליום נהיגה פיתוח עובריים1,2,3,4 ,5,6,7,8,9. עד היום, רוב האפיון של האירועים ברמה התאית ואת מפרט הגורל התא בעובר הושג באמצעות ברזולוציה גבוהה יחסית הזמן ניסויים הדמיה (כלומר, רכישה כל 10-100 s) של עוברים ביטוי סמני פלורסנט. למרות שמתאים מאוד לאירועים בסדר שניות עד עשרות דקות, גישה זו הופכת להיות מגבילה מבחינה טכנית לאפיון תהליכים ארוכים יותר, בסדר שעות עד ימים. פיתוח עובריים מפני המחשוף הראשון עד סוף התארכות לוקח בערך 10 h. במהלך הזמן הזה, חצי-high-תפוקה שיטות שיאפשרו הדמיה בזמן הנמוך ביותר ברזולוציה נמוכה (כלומר, רכישה ב 5 – 20 מרווחי זמן) של כתרים גדולים יותר של עוברים, מתנאים שונים, יפתח מגוון חדש של ניסויים; לדוגמה, הפעלת מאמצי הקרנה בקנה מידה גדול וניתוח מספר מספיק של עוברים להשוואות של השלכות הרטבאליות המולקולריות.

כאן, אנו מתארים שיטה למחצה התפוקה לניטור C. אלגיה embryogenesis המאפשרת הדמיה בו בזמן תלת-ממד של התפתחות ב 80-100 עוברים, מתוך עד 14 מצבים שונים, בריצה אחת לילה. הפרוטוקול הוא פשוט ליישם והוא יכול להתבצע על ידי כל מעבדה עם גישה למיקרוסקופ עם יכולות ביקור הנקודה. השלבים העיקריים בפרוטוקול זה מתוארים באיור 1. בקצרה, עוברים גזור מבוגרים gravid המבטא סמנים פלורסנט של עניין והעברת עוברי צעירים (2 – 8 הבמה התא) כדי בארות של 384-צלחת לוח עבור הדמיה. בתבנית זו, בגודל הטוב יחסית funnels עוברים לתוך אזור צר, אשר מקלה על זיהוי של שדות המכילים עוברים מרובים עבור הדמיה בזמן מפקיעה. כדי לשמור על התפתחות סינכרונית באופן כלשהו על פני הקבוצה של העוברים, הניתוח מבוצע בתקשורת מקורר והצלחת מוחזקת על הקרח, אשר מונע התפתחות משמעותית במהלך שעת הניתוח במשך שעה. הצלחת מועברת המיקרוסקופ והעוברים מצולמים בחדר מבוקר טמפרטורה, ב 20 דקות מרווחי זמן, באמצעות שמן 60x טבילה 1.35 NA עדשה, כדי לאסוף את המלא z-טווח ב 2 יקרומטר שלבים. 50 שדות, כל אחד המכיל בין 1-5 עוברים, הם התמונה במהלך אחד לילה הפעלה. בהתאם לניסוי הרצוי, ניתן להגדיל את רזולוציית הזמן (לדוגמה, הדמיה ב-5-10 דקות) על-ידי הפחתת המספר של שדות הדמיה באופן פרופורציונלי.

עם פרוטוקול זה, אפילו הפעלת לילה אחת מייצרת כמות משמעותית של נתונים (80-100 עוברים הפרושים מעל 50 שדות) וניסויים גדולים יותר יכולים להיות במהירות ביחס לניתוח נתונים. כדי להקל על עיבוד, הדמיה חזותית וייעול הניתוח של נתונים אלה, נבנתה תוכנית לחיתוך והכנה של עוברים ולביצוע שלבי עיבוד מקדים (אופציונלי) ומאקרו ImageJ המבצע הידור של הנתונים כדי לפשט את הצפייה. ניתן להשתמש בתוכניות אלה כדי לעבד תמונות שנאספו באמצעות גישות קונבנציונליות, מאחר שהן אינן תלויות בשיטת הדימות, ודורשות רק מטוס ביביואלי יחיד. התוכנית הראשונה מקבלת בשדה 4D המכיל עוברים מרובים (אפשרות GUI או קוד מקור embryoCrop.py) או שדות 4D מרובים המכילים עוברים מרובים (screenCrop.py), גידולים הדוקים העוברים וכיוון אותם בתצורה האחורי הקדמי. תוכניות אלה גם נותנות למשתמשים אפשרות לבצע חיסור רקע, תיקון סחיפה ותיקון החליש. הקבצים המתקבלים הם אחיד מעובד מראש, חיתוך היטב בערימות tiff עבור כל עובר הamendable לניתוח תמונה אוטומטית. כדי להפוך את זה לפשוט יותר להציג את כל העוברים עבור כל תנאי, מאקרו ImageJ (OpenandCombine_embsV2. ijm) נכתב, אשר מרכיב את כל העוברים מתנאי נתון לתוך מחסנית אחת tiff ומערכים ברייטפרופילד תמונות וצבע הקרנה מקסימלית העוצמה ( RGB) כיסויי שכבות, זה לצד זה, לכל עובר. השיטות היו מאומת על ידי שימוש בהם כדי לאפיין את הפיתוח העובריים לאחר הדפיקה של 40 בעבר-תיאר גנים התפתחותיים בזוג זנים בנוי אישית המבטא סמנים פלורסנט ממוטב להמחיש היבטים מרכזיים של הנבט-שכבה מפרט ומורפוגנזה10,11. יחד עם זאת, העברת התפוקה למחצה וכלים לעיבוד התמונה מאפשרים ניסויים במספר גבוה יותר ומאמצי הקרנה בקנה מידה גדול המיועדים להבנת תהליכים התפתחותיים. בנוסף, זנים אלה יספק גם אמצעי יעיל לבדיקת ההשפעות של רטבאליות מולקולרית על embryogenesis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1 . הכנת העוברים עבור הדמיה למחצה של תפוקה גבוהה

הערה: המטרה של חלק זה של הפרוטוקול היא לטעון אוכלוסיה של מסונכרן למחצה (2 עד 8-תא הבמה) C. אלגיה עוברים, גזור זני סמן מתאים (איור 2), לתוך התחתון זכוכית 384-צלחת להדמיה. תבניות אחרות צלחת גם לעבוד, אבל 384 לוחות היטב הם העדיפו בגלל הגודל הטוב קטן מגביל את התפשטות העוברים לאזור קטן יחסית, אשר מקלה על זיהוי של שדות המכילים עוברים מרובים עבור הדמיה בזמן. בערך סנכרון העוברים מבטיח שתהליך ההתפתחות המלא ייתפס עבור כל אחד מהעוברים בשדה.

  1. הכינו 5 – 10 מ ל של 0.1 מ"ג/mL פתרון של tetramisole הידרוכלוריד (TMHC) הרדמה מומס קרח קר M9 בינונית (0.45 M Na2hpo4∙ 7h2O, 0.11 m KH2PO4, 0.04 m הנאל, 0.09 m NH4Cl) להשתמש במהלך ניתוח והדמיה. מדיה זו כוללת חומר הרדמה כדי להבטיח שהזזת הזחל המקווקו לא משבש את ההדמיה של עוברים בשלבים התפתחותיים מוקדמים יותר.
    הערה: אם נעשה שימוש בכלי החיתוך וההדמיה לניתוח נתונים שנרכשו באמצעות שיטות הרכבה סטנדרטיות של כרית, דלג קדימה לסעיף 3 להלן.
  2. Aliquot 70 μL של הפתרון המוכן לתוך בארות בודדות של התחתון זכוכית 384-באר עם אחד טוב עבור כל תנאי; למנוע את שתי השורות החיצוניות של הצלחת כדי למנוע תופעות קצה.
    הערה: זה שימושי להסוות את הבארות שמסביב באמצעות דבק רדיד PCR לוחית (ראה דוגמה באיור 1ד) זה שומר על בארות סמוכות לניסויים עתידיים ומקל על איתור בארות מתאימות תחת מיקרוסקופ הניתוח. לאחר הפתרון הוא מצוטט, לשמור את הצלחת ואת הפתרון הנותר על הקרח במהלך הניתוח.
  3. צור בעלי חיים להעברת העוברים מתוך שקופית הדיכאון (שם הרמאת gravid הדיכוטים הם גזור) לבארות. משוך בעלי חיים קפילר (25 μL מכויל מכוילים) מעל להבה והפסקה כדי ליצור סוף דק ומחודדות (איור 1ד). Pipet אחד נדרש בכל מצב כדי למנוע זיהום צולב; להיפטר pipet לאחר השימוש.
  4. השתמש בפינצטה עדין כדי להעביר ~ 10 gravid מבוגרים מתחת לטווח הניתוח לתוך 150 μL של הקרח קר TMHC פתרון מצוטט אל שקופית דיכאון עבור כל תנאי. באמצעות מלקחיים ואזמל, מנתחים את התולעים כדי לשחרר את העוברים.
  5. לטעון את הקפילר משכו לתוך ההחזקה המצורפת כלול עם pipet, ואת הפה מלטף להעביר את כל 2 כדי 8-cell בשלב העוברים לתוך הבאר האישית של הצלחת מוכן (איור 1ד). להימנע מהעברת עוברי שלב מאוחר ופסולת חיתוך. לבחון תחת טווח הניתוח ואם אגרגטים של העוברים נמצאים, הפה מלטף למעלה ולמטה או ברז גושים של עוברים עם טיפ pipet להתפזר.
    הערה: כדי למנוע מזהמים, לנקות ציוד הניתוח ולהשתמש בחיית מחמד בפה טרי תוך כדי תנועה בין התנאים. . לאחסן את הלוחית על הקרח בין הניתוח
  6. פעם תולעים מכל התנאים היו גזור העוברים ממוקמים היטב המתאים שלהם, לסובב את הצלחת 384-באר עבור 1 דקות ב 600 x g כדי ליישב את העוברים.
  7. לנגב את החלק התחתון של הצלחת עם מחיקה האתנול ספוג להסיר כל שאריות ולמקם את הצלחת על מיקרוסקופ קונפוקלית וקד מצויד עם מחזיק צלחת בסביבה מבוקרת טמפרטורה.
    הערה: השלבים הבאים מפרטים את השיטה באמצעות הגדרת המעבדה; נא לשנות את תנאי הרכישה כדי להתאים את הצרכים הניסיוניים וציוד. כאן, תיבת סורק קונפוקלית וקד מצויד מיקרועדשה משופרת כפול nipkow מסתובב דיסק, a 512 x 512 EM-CCD מצלמה, דיוק גבוהה auto-XY-שלב (החלטה מיועדת 0.1 μm) ו מוטורי z-ציר בקרה (החלטה ייעודי 0.1 μm) משמש. מערכת זו נשמרת בחדר של 16 ° c, השומרת על טמפרטורת המיקרוסקופ בין 21 ל -23 ° c במהלך הדמיה של לילה.
  8. כדי לזהות שדות עם עוברים מתאימים, בצע סריקה מראש של כל טוב באמצעות מטרה 10x 0.4 NA ותוכנת דימות מתאימה. השדות האופטימליים ביותר יכילו יותר מעובר שלב מוקדם אחד הנמצא באותו מישור מוקד כמו עוברים אחרים ובאופן אידיאלי יהיה קשר מינימלי בין עוברים סמוכים. סמן עמדות של אזורים מתאימים.
  9. כדי לבחור שדות דימות, עבור למטרת ה-60x וכוונן את המישור המוקד בכל נקודה ביקור בסעיף הראוי לעוברים. 1 – 4 שדות לכל טוב הם התמונה, עבור סך של 50 שדות על פני 14 בארות, וכל שדה יכול להכיל בין אחד לחמישה עוברים. בסך הכל, 4 עד 15 עוברים נבחרים מכל תנאי לדימות ברזולוציה גבוהה.
    הערה: משתנה מפתח בשלב זה הוא השימוש בשמן מספיק; מניחים שמן על המטרה, נקודות ביקור בכל באר כדי לפזר את השמן סביב פני השטח של כל הבארות ולאחר מכן להחיל טיפה נוספת של שמן למטרה לפני מבחר של שדות.
  10. התמונה השדות שנבחרו באמצעות מטרה 60x 1.35 NA לרכוש 18 z מקטעים ב 2 יקרומטר מרווחי כל 20 דקות עבור 10 h. תנאי הדימות באמצעות שכבת הנבט ומורפולגנזה זנים כתבת הם כדלקמן: ברייטפילד, 90% כוח, 25 ms, 20% רווח; 488 ננומטר, 100% כוח, 200 ms, 60% רווח; 568 ננומטר, 45% כוח, 150 ms, 60% להרוויח.
  11. לאחר הדמיה הושלמה, להעריך את החיים העובריים על ידי ביצוע הגדלה נמוכה (10x 0.4 NA מטרה) כל טוב לסרוק את השדה ~ 20 – 24 h בעקבות התחלת הדמיה לילה.

2. הבקיע לטבליות עובריים

  1. שימוש בשדות הסרוקים שלאחר ההפעלה 10x, הערכת הטבוליות עובריים ופגמים בזחל על ידי ספירת תולעים מקווקו ועוברים בלתי מקווקו עבור כל באר.
  2. הניקוד הבלתי מקווקו כקטלני. לא לכלול נעצר אחד עד ארבעה תאים בשלב מספירת התיאליות, מאז העוברים בגזור צעירים לפעמים להיכשל היווצרות קליפת ביצה (אם מיוזה II עדיין לא הושלמה) וליקויים חדירות יכול להוביל סיבוכים אוסמוטי במהלך שני הראשונים חטיבות.
  3. ציון תולעים מקווקו או מקווקו באופן חלקי עם מורפולוגיה הגוף או פגמים התנהגותיים, כגון הדומפי או משותק, כמו ' זחל נורמלי '.

3. חיתוך אוטומטי (איור 3א)

הערה: התוכנה שוכנת בשני מיקומים: (1) Zenodo מארח גירסה ידידותית למשתמש של התוכנה12 שאינה דורשת מומחיות בתכנות. (2) Github מכיל את קוד המקור עבור התוכנה שלנו embryoCropUI.py ו screenCrop.py13, אשר דורשים מיומנות עם פיתון. הוראות מפורטות להורדת ותפעול הן הגירסאות של התוכנית ניתן למצוא להלן.

  1. חיתוך אוטומטי באמצעות גירסת הפעלה embryoCropUI (גירסה ידידותית למשתמש)
    1. כדי להשתמש בתוכנית embryoCropUI, הורד תחילה את התוכנית מ-Zenodo (https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w)12.
      1. הורד את ה-MacOS או גירסת התבנית של Windows של התוכנית (שים לב כי הגירסה MacOS דורש MacOS X 10.11 או גבוה יותר).
      2. הורד את קובץ ההוראות (GUI_Instructions_zenodo_repoV2. docx), אשר מספק צעד אחר צעד הוראה לבדיקה ושימוש בתוכנית embryoCropUI.
      3. הורד את test_files. zip כדי לבדוק אם התוכנית פועלת כראוי על הפלטפורמה (ראה הוראות).
    2. לאחר הורדת, לפתוח ולנווט כדי למצוא את ההפעלה embryoCropUI (... \embryoCropUI\_WINDOWS\embryoCropUI\embryoCropUI.exe) או (... \embryoCropUI\_MacOS\embryoCropUI\embryoCropUI.exe). לחץ פעמיים כדי להשיק (או בחר ' לפתוח עם ' מסוף) ולהפעיל את embryoCropUI ההפעלה.
    3. ההפעלה GUI לגידולים שדה אחד 4D של תצוגה בכל פעם. בפינה השמאלית העליונה, בחר בלחצן פתח כדי לטעון את השדה הספציפי לחיתוך (ריבוי tiff). אם חיתוך סדרת tiff, עם ממדים מרובים (כלומר z, זמן, ערוץ), טען רק את התמונה הראשונה בסידרה בתוך התיקיה (סדרת tiff אחת לכל תיקיה).
    4. לאחר טעינת תמונות, ציין את הפרטים הבאים: מספר הפרוסות z, (Z), מספר נקודות הזמן (T), מספר הערוצים (C), הערוץ המתאים ל-DIC או ברייטפילד (ראשון = 1, שני = 2, וכו ').
    5. בחרו עיבוד נוסף להפעלה בתמונות. התוכנית מציעה תיקון להיסחף, הרקע חיסור, תיקון החליש.
    6. ציין פרמטרים עבור ' חיסור רקע ' ו'תיקון החליש ' כדי להדריך את המאמצים לעיבוד בשורת הפקודה GUI. באפשרות ' הפחת רקע ', הגדירו את גודל התכונה הגדול ביותר שישקף את גודל האות בעל המשמעות; אין להתייחס לגודל תכונה זה כרקע ועליו להיות ערך מספר אי-זוגי. קלט ערך מ-0-1 עבור תיקון החליש. הערך ' תיקון החליש ' משקף את אחוז העוצמה המקורית הנותרת בעומק המרוחק של האובייקט הנמצא בתמונה.
      הערה: יש להפעיל יחד את ' חיסור רקע ' ו'תיקון החליש '.
    7. ציין את סדר אוסף התמונות (כלומר, ערוץ-z-time (czt) או z-time-channel (zct)).
    8. ציינו את המלנים לכל פיקסל בתמונות בהתבסס על השימוש במצלמה.
      הערה: חיתוך תמונה ירודה יתרחש אם גודל הפיקסל אינו מוגדר כראוי.
    9. בחר באפשרות הפעלה בפינה השמאלית התחתונה. תיקיית משנה חדשה הנקראת "חיתוך" תיווצר באותו נתיב של התיקיה שלא נחתכה; גירסאות שנחתכו יישמרו במיקום זה. בהתאם לגודל הקובץ, החיתוך אמור להיות מושלם תוך שניות לדקות.
  2. חיתוך אוטומטי באמצעות screenCrop.py (גרסת אצווה חלופה embryoCrop GUI המתואר לעיל;פיתון מתמצא למשתמשים בלבד)10,13
    1. כדי להשתמש screenCrop.py, גירסת התוכנה פייתון לחיתוך של ערכות נתונים גדולים יותר בפורמט אצווה, לשכפל או להוריד את קוד המקור מ Github (github.com/renatkh/embryo_crop.git).
    2. קרא את ההוראות לקביעת תצורה של סביבה וירטואלית נאותה ובצע את מערכת מתן השמות לקבצים המתוארת; שניהם מפורטים בקובץ README במאגר Github: https://github.com/renatkh/embryo_crop/blob/master/README.md.
    3. לאחר משתנים סביבתיים ומוסכמות למתן שמות הוקמו כראוי, לפתוח parameters.py ו screenCrop.py בעורך הבחירה.
    4. כדי לשנות פרמטרים הניתנים לשינוי מבלי לגעת בקוד המקור, ערוך את קובץ parameters.py .
      הערה: ניתן גם לשנות באופן ישיר פרמטרים בתוך הכותרת של screenCrop.py.
      1. אם נעשה שימוש בקובץ התצורה parameters.py, שנה את ההגדרה use_configure ל-True. אם אתה משתמש בעריכה ישירה בתוך screenCrop.py, השאר את ההגדרה use_configure ב-False.
      2. אתר את המידע הבא בתוך קובץ parameters.py וביצוע שינויים בהתאם לפרמטרי ההדמיה הרצויים ולמבנה הקבצים:
        1. loadFolder (קו 9): שינוי לכונן שבו מאוחסנים הקבצים (לדוגמה, Z:/, D://, וכו ')
        2. date (שורה 7): שנה לתיקיה המכילה קבצים עבור הפעלת ההדמיה. פעולה זו נקראת ' הניסוי שם תיקיה ' בקובץ המעקב בתבנית CSV (ראה הוראות).
        3. trackingFile (קו 11): שינוי בנתיב לקובץ ה-CSV שבו מאוחסן פרטי הניסוי.
        4. z (קו 13): קבע כמספר מטוסי z.
        5. nT (line14): קבע כמספר נקודות הזמן.
        6. nWells (קו 19): להגדיר כמספר הבארות המשמשות.
        7. ביקורים בנקודות (קו 20): קבע כמספר מירבי של ביקורים בנקודה (לכל היותר).
        8. בשורה 10 מצא את המיקום הכבוש כרגע על-ידי ' CV1000/' ולהזין את התיקיה החיצונית המשמשת בנתיב הקובץ. כדי להימנע מבעיות, השתמש במוסכמה הבאה: ' XXXXXXX/'.
        9. בשורה 12, הזן נתיב קובץ חוקי לאחסון נתוני יחס גובה-רוחב עבור נתונים שנחתכו.
        10. בשורות 15, 16, 17 ו-18 קלט True/False אם התמונות עוברות את העיבוד הבא:
          1. קלט True או False עבור תיקון הסחף בקו 15.
          2. קלט True או False עבור רקע חסר בקו 16. גודל תכונה חייב להיות מקובע בצורה מדעית עבור זנים סמן שונים וגדלים פיקסל. בתצורה כאן, גודל התכונה הוגדרה כ 41 עבור זן נבט שכבה ו 201 עבור זן מורפוגנזה. יש לבצע הפחתה ברקע בשילוב עם תיקון החליש.
          3. קלט True או False עבור תיקון הנחתה בשורה 17.
          4. קלט True או False עבור סיבוב אחורי קדמי בקו 18.
    5. לאחר שכל השינויים נעשו, חיתוך יכול להתחיל. לשם כך, עבור אל screenCrop.py ובחר את סמל ההפעלה בסרגל הכלים, בתפריט הנפתח בחר באפשרות הפעל כ> פייתון run.
    6. כמו חיתוך יכול להימשך מספר שעות כדי להשלים ערכת נתונים גדולה (50 נקודות ביקורים 18 z שלבים, 3 ערוצים, 31 timepoints), מעקב אחר התקדמות חיתוך בחלון המסוף. לאחר חיתוך הושלמה, חלון קטן יציג תצוגה מקדימה של התמונות שנחתכו לפני שמירה. עבור כל תמונה ישנן 3 אפשרויות:
      1. שמור: לחץ על מקש הרווח כדי לשמור את התמונה אם התמונה נחתכת כראוי עם אזורים לא מעניינים להיות מנותקים.
      2. כונן X: הקש X אם נראה שהתמונה מופיעה באזורים מעניינים; התמונה תישמר עם X לפני השם כדי להפריד אותו מהתמונות האחרות.
      3. Delete: לחץ על D כדי למחוק את התמונה החתוכה אם התמונה אינה חתוכה כהלכה או שהעובר אינו משביע רצון.
        הערה: התמונות יישמרו בתיקיית ממשנה בשם "חתוכה" בתיקיה Load (מוגדרת בשורה 9 של התוכנית).

4. הדמיה (איור 4)

הערה: OpenandCombine_embsV2. ijm10,12 הוא מאקרו imagej אשר לבנות קל להציג קובץ tiff מכל התמונות עבור זן מסוים ומצב. התקנה של פיג'י/imagej14,15 נדרש. מאקרו זה פועל בהתאם למבנה הקבצים שלנו; יהיה צורך לשנותה כדי לעבוד עם מבני קבצים אחרים. מדריך למבנה הקובץ הנכון ותיאור מפורט של שיקולים חשובים ניתן למצוא בסוף GUI_Instructions_zenodo_repoV2. docx הקובץ על מאגר zenodo. נא לקרוא באמצעות הוראות אלה לחלוטין לפני הדמיה לשם כהלכה וקבצי מבנה לממשק הטוב ביותר עם מאקרו זה. לעיון, מבנה מיקום הקובץ שלנו נראה כך:
Z:\cropped\Target\Strain\Emb \Target_Emb _ 15 מזהה ייחודי לספרות _ W #F _15 #_Z #_C. tif
i.e. Z:\cropped\EMBD0001\GLS\Emb1\EMBD0001_Emb1_20140327T135219_W02F1_T01_Z01_C1.tif

  1. הורד OpenandCombine_embsV2 ו GUI_Instructions_zenodo_repoV2. Docx מתוך zenodo (https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w).
  2. הכינו את המידע הבא:
    -המיקום שבו תיקיות התמונה מאוחסנות (לאחר חיתוך).
    -שם תיקיית התמונה (ים) עבור התנאים הספציפיים שיש לעבד (כלומר, EMBD0002). הדבר נקרא "יעד" בדוגמה שלעיל
    -מזהה ייחודי alpha-נומרי של 15 ספרות שהוא ספציפי לניסוי מסוים בן לילה-מזהה זה הוא שם תיקיית הרכישה של הנתונים (כלומר, 20140402T140154) והמזהה הייחודי מוטבע בשם קובץ ה-tiff הבודד (EMBD0002_Emb1_ 20140402T140154_ W06_1) עבור כל עובר התמונה באותו יום. המאקרו משתמש במזהה זה כדי לבדוק אם עוברים שנרכשו באותו תאריך ויכולים להרכיב תנאים חוזרים, עם תאריכים נפרדים, לקבצי ImageJ נפרדים.
  3. פתח את ImageJ, וגרור ושחרר את קובץ המאקרו, OpenandCombine_embsV2. ijm, לסרגל imagej, או פתח את המאקרו ישירות.
  4. לאחר פתיחת המאקרו, אתר את שורות 3 ו-4. הכנס את המידע שנאסף (סעיף 4.2) בהתאם לצעדים הבאים:
    1. בשורה 3 (RNAL), הזן את שם היעד עבור התמונות שיעובדו. קלט כל מטרה במבנה הבא newArray ("XXXXX/"); כוללות ציטוטים. כדי להפעיל תנאים מרובים בו, הפרד באמצעות פסיק ושמור את כל שמות היעד בתוך הסוגריים (כלומר, Newarray ("EMBD0000/", "EMBD0001/", "EMBD0002/").
    2. בשורה 4 (תאריך), קלט את המזהה הייחודי alpha-נומרי של 15 ספרות בהצעות מידע, לדוגמה Newarray ("20140402t140154").
  5. לחץ על הפעלה בקצה השמאלי התחתון של חלון המאקרו. יופיע חלון, שיפעיל בקשה לניווט אל התיקיה החיצונית המכילה את תיקיות התמונה שנחתכו (שצוינו ב4.4.1).
  6. לאחר שנבחר, יופיע חלון אחר, שיאפשר ציון של פרמטרי דימות.
    1. הזן את מספר הערוצים, את מספר פרוסות ה-Z, את גודל הגופן עבור הטקסט המשמש לתיוג התמונות שעברו קומפילציה, והצבע עבור כל אחד מהערוצים.
    2. בדוק/כיבוי אוטומטי מנוגדים בכל הערוצים.
  7. לאחר שצוינו כל הפרמטרים, לחץ על אישור בתחתית החלון. הקובץ המורכב יתחיל להרכיב; זה ייקח מספר דקות, בכל תנאי, כדי להשלים.
  8. לאחר שהושלם, סקור את הקבצים שנותרו פתוחים במידת הצורך. ניתן לסגור אותן ללא שמירה, מאחר שהמאקרו שומר כבר את הקבצים בתיקיה חדשה שנוצרה, הקרויה באופן הבא: שם התיקיה החיצונית (מצוין בבקשה לסעיף 4.5) + "-פיג'י-מעובד-פלט" (כלומר, Z:\ cropped-fiji-processed-output\EMBD0002_GLS_20140402T140154.tif).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

אתגר משמעותי באפיון ההשפעה של רטבאליות מולקולרית על ההתפתחות העובריים של ה -"אלגיה " היא שלוקח כ-10 שעות להתקדם מהמחשוף הראשון ועד לסוף התארכות ב -20 °16. שיטה בעלת תפוקה מלאה למחצה שבה יכולות להיות הדמיה של קבוצות גדולות של עוברים בו, שימושיות לאירועים בקנה מידה זה, משום שהיא מאפשרת הדמיה של תנאים מרובים במקביל לגודל הרכב מספיק עבור כל תנאי כדי לאפשר אנליזהכמותית(איור 1א).

שיטת הדמיה של תפוקה גבוהה למחצה וזנים רב-מרקר
שיטת הדימות למחצה של תפוקה גבוהה שתוארה כאן (מתוארת באיור 1B), מעסיקה לוח מ384 באיכות תחתונה מזכוכית. הפורמט multi-היטב מאפשר עד 14 תנאים להיות מסודר במקביל בגודל קטן של הבארות מגביל את אזור החיפוש, פישוט הזיהוי של שדות המכילים עוברים עבור דימות ברזולוציה גבוהה. כאן, תיבת סורק קונפוקלית וקד שימש, מצויד מיקרועדשה משופרת כפול nipkow מסתובב, a 512 x 512 EM-CCD מצלמה, דיוק גבוהה auto-XY-שלב (החלטה מיועדת 0.1 μm) ו מוטורי z-בקרת ציר (החלטה מיועדת 0.1 μm). עם זאת, הפרוטוקול יכול להיות מותאם עבור כל מיקרוסקופ קונפוקלית וקד עם יכולות דיוק ביקור הנקודה ומתאם שלב שיכול להכיל צלחת מרובת היטב. אתגר משמעותי בפיתוח שיטה זו היה להמציא אמצעים ליצירת צלחת של עוברים באותו שלב התפתחותי, כך שניתן יהיה ללכוד את כל העוברים בכל תחום. זהו אתגר, כי העוברים הנערכים על צלחת ההדמיה הראשונים ימשיכו להתפתח בעוד דגימות מאוחר יותר הם גזור, וכתוצאה מכך הדרגתי של ההיערכות על פני הבארות. כדי לעקוף בעיה זו, עוברים שלב מוקדם (2-8 בשלב התאים) נבחרים ולשמור על מדיית החיתוך ולוחית ההדמיה על הקרח; זה דוכנים embryogenesis עבור העוברים בגזור עד כל התנאים הסודר ללא היכולת להשפיע באופן משמעותי על הכדאיות העובריים10. כדי להגביל את הזמן שבו העוברים יושבים על הקרח עד שעה אחת, שני החוקרים לבצע את הניתוח בו זמנית, אשר מאפשר הגדרת 14 מצבים שונים כ 50 דקות. לאחר הניתוח, הצלחת הוא סובב ב 600 x g עבור 1 דקות כדי משקעים העוברים ובארות נסרקים מראש בהגדלה נמוכה כדי לאתר שדות עם קבוצות של עוברים מתאימים להדמיה בהגדלה גבוהה; נקודות ביקור מיקומים מסומנים. עוברים מצולמים בחדר טמפרטורה מבוקרת לילה באמצעות שמן 60x טבילה 1.35 NA העדשה. הדגימות מוגדרות 4 גם על ידי 4 אזור טוב, כך שטח המשטח של הצלחת המשמש בניסוי הוא דומה ל 22 x 22 מ"מ שמיכות סטנדרטי2 , אשר מאפשר להשתמש במטרה שמן 60x. התפשטות אחידה של נפט באזור זה לפני תחילת ההדמיה הוא קריטי עבור רכישת תמונה מוצלחת לטווח ארוך. העוברים המתפתחים הם התמונה בפתרון המכיל הרדמה; הדבר מבטיח כי כאשר העוברים הבוגרים בתוך הפתח הבאר, התנועה שלהם אינה משבש את מיקומם של עוברים צעירים סמוכים הנמצאים בתמונה. ההרדמה אינה משפיעה על התנועה לפני הבקיעה, בשל טבעה הבלתי חדיר של קליפת היצה. בתנאים אלה, 3D נתוני מעבר הזמן נאספים ב 3-ערוצים עבור סך של 80-100 עוברים בניסוי יחיד לילה (דנו יותר להלן).

ג. אלגיה התפתחות עובריים מתרחשת בשני שלבים. ראשון, 10 סיבובים של חלוקת התא מצמידים למפרט הגורל התא ליצור את שלוש שכבות הנבט (עור, מזועור, ואנדועור) על פני 6 שעות תקופה17. ב 7 h הבאות, אירועים מורפולגנטיות לנהוג היווצרות רקמות הבדיל8,16. כדי ללכוד את שני ההיבטים הללו של פיתוח, בנינו זוג זנים מותאמים אישית, שכבת נבט ומורפוגנזה זנים10 (איור 2א), והשתמשו בפרוטוקול חצי-גבוה תפוקה לעוברים התמונה משני הזנים. זן שכבת נבט מבטא את החלבונים הפלואורסצנטי מקודד גנטית כי לסמן גרעינים בתוך העור, מזועור ומלא עור באדום, צהוב, וירוק. זן זה מכיל שלושה הכתבת טרנסגנים: (1) טרנסגנים המבטא פא-4:: gfp המסמן גרעינים במעי והלוע (דלקת עור ירוק)10,18,19, (2) טרנסגנטית המבטאת פיוז'ן mCherry-histone באפידרמיס ו-~ 1/3 של נוירונים (העור האדום; איור 2א), ו-(3) טרנסגנים המבטא בו זמנית את מצ ו-gfp-מתויגים האבנים בשריר קיר הגוף (מזועור צהוב). למתח מורפוגנזה יש שני טרנסגנים המבטאים: (1) סמן ירוק האפיתל הצומת (DLG-1:: GFP) באפידרמיס, ו (2) מסמן הפלזמה mCherry מתויג, ב ~ 1/3 של נוירונים (Pcnd-1 מקדם; איור 2א). כדי לשפר את האפקטיביות של RNAi, שני זנים היו גם מתוכננים להכיל זוג של מוטציות RNAi-סנסיטיזציה (nre-1 (hd20) לין-15b (hd126)20. אלה נבנו עם המטרה של ביצוע מסך מבוסס RNAi בקנה מידה גדול של הגנים ~ 2,000 הנדרש לפיתוח עובריים. עם זאת, זה זוג זנים יהוו גם פלטפורמה סטנדרטית שימושי באופן כללי להערכת פגמים התפתחותיים מוטציות, ועל ניתוחים מפורטים יותר של התפקידים של חלבונים שונים בפיתוח.

עבור איסוף נתונים בתבנית זו של תפוקה למחצה גבוהה, עם זנים אלה, ירוק, אדום ובהיר-סדרת z-series (18 x 2 יקרומטר2 מרווחי זמן) נאספים, כל ~ 20 דקות, לתקופה של 10 h ב 16 ° c בטמפרטורה מבוקרת החדר; זה שומר על המיקרוסקופ בין 21-23 ° c במהלך הריצה. 20 דקות מרווח זמן מאפשר לנו תמונה 50 שדות של עוברים (נקודות ביקורים) לכל ניסוי. משתמשים יכולים להתאים את הרכישות למרווחי זמן קצרים יותר עם פחות ביקורים בנקודות, או מרווחי זמן ארוכים יותר עם ביקורים בנקודות יותר כדי להתאים את היעדים הניסיוניים שלהם. עבור זנים אלה, נקודות הזמן ההתפתחותיות מוקדם אינם מ, משום שהרקמה הספציפית של הכתבים הנוהגים לסמן את ההבעה לא מתחילה להתבטא עד לתחילת הביטוי. בשלב מוקדם זה, בארות נסרקו בהגדלה נמוכה (10x) ושדות נבחרים עבור דימות הגדלה גבוהה. מומלץ לבחור שדות המכילים יותר מעובר בשלב מוקדם אחד, אך הימנעות משדות שבהם עוברים חופפים באופן חלקי, צפופים מדי, או מצויים בקצה הקיצוני של הבאר. לאחר לילה 60x הדמיה, הגדלה נמוכה (10x) סריקת היטב שלמות מבוצעת כדי לקבוע אם העוברים בצוהר עם מראה רגיל (WT), צוהר עם חריגות גלוי (זחל נורמלי), או שהם קטלניים עובריים עבור כל תנאי מוערך ( איור 1ב). שלב זה משמש כחלופה קלה להקמת צלחות במקביל להערכת המצב החיצוני לאורך אוכלוסיה גדולה יותר; הבאר כולו 10x פוסט-סריקה מספק נתונים מעובריים מתחלקים על 50-80 עוברים לכל מצב. שימוש באמצעי זה כדי להשוות את הנתונים העובריים של האוכלוסיה עבור פקדים בין הרצפים הוא שליטה שימושית המבטיחה עקביות ביחס לבריאות הזנים והתנאים הסביבתיים ושלבי העיבוד. כאשר התמונה משולבת, שני זנים העיתונאי מותאם אישית לספק קריאות אינפורמטיבי עבור האירועים ההתפתחותיים ביותר, כולל מפרט הגורל התא, intercalation, מארז עוריות, התארכות, ונוירוגנזה (נציג תמונות שליטה מוצגים באיור 2B, גם לראות וואנג et al.10).

עיבוד נתונים: חיתוך וכיוון אוטומטי של העובר
בעזרת פרוטוקול הדימות שלנו, כל שדה הדמיה ברזולוציה גבוהה מכיל בין 1 ל -5 עוברים; עוברים אלה מכוונים באופן אקראי ומוצבים לעתים קרובות בסמוך זה לזה. נתונים שנאספו באמצעות טכניקות הרכבה קונבנציונאלי העובר סובל מאותם אתגרים. כדי להכין את הנתונים לצורך הדמיה וניתוח מאוחרים יותר, יש צורך בטיפול מניפולציה משמעותי בידיים כדי לחתוך ולכוון את רצפי העובר, כמו גם לעבד אותם מראש כדי להפחית את הרקע, לתקן את הסחף ולפצות על החליש אות עם עומק. כדי לייעל את התהליך, נבנתה תוכנית חיתוך העובר מותאמת אישית הבודדת ומכוונת כל עובר מהשדה הרחב ביותר (איור 1ג, איור 3). תוכנית זו נארזה כידידותי למשתמש, תוכנית עצמאי עם ממשק משתמש גרפי (GUI, תואם נתונים מפלטפורמות הדמיה ביותר) כי יכול לקחת רצף הזמן התלת-ממד של שדה של עוברים, ולעבד אותו בסדרה tiff בודדים עבור כל עובר בשדה (איור 3ב', זמין ב https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w)10,12. קוד מקור פיתון עבור GUI (embryoCropUI.py), וגרסת אצווה של תוכנית זו (screenCrop.py) זמינים גם עבור משתמשים מנוסים פיתון על github (https://github.com/renatkh/embryo_crop.git)10,13. הפונקציונליות המרכזית של תוכנית זו היא לאתר, לחתוך ולכוון את העובר לאורך הציר האחורי הקדמי. במקביל, ניתן לבצע חיסור רקע, תיקון החליש ותיקון סחיפה בערכת הנתונים באמצעות הגדרות אופציונליות הניתנות לכוונון.

בקצרה, תוכנת החיתוך האוטומטית מזהה את העוברים הבודדים במסיכה בינארית שמתקבלת מהתמונות של השדה הבהיר ומשארים באופן רציף את העוברים מכל הערוצים ומכוון את התמונות לאורך הציר האחורי הקדמי (איור 3 B, המתואר לראשונה ב וואנג et al.10). לפני חיתוך, התוכנה מתקנת עבור הסחף, מפחית את הרקע ומבצעת תיקון החליש עומק בכל ערוץ הזריחה (אופציונלי). כדי להשיג את המסיכה הבינארית, התוכנה מחילה את הורכב באמצעות זיהוי קצוות21 לתמונות השדה הבהיר, מבצעת הקרנת עוצמה מרבית של שלושת המטוסים המרכזיים ומילויים בחורים קטנים. האלגוריתם מזהה עוברים בודדים על ידי התאמת האליפסה קאסיני לקטע של המסיכה הבינארית מתאר (ראה איור 3B, 3c). לאחר יישור האליפסה לאורך הציר הראשי שלה, התוכנה מודד את עוצמת הקרינה האדומה בכל חצי של העובר המבודד ומסובב את העובר כזה עוצמה אדומה מכוונת לכיוון שמאל, אשר מציב את העובר הקדמי בצד שמאל עבור שני ה זנים העיתונאי המשמשים בעבודה זו (איור 3ד). הטסת תוכנה זו חשפה כי רוב העוברים נחתכו ביעילות כפי שציפינו. בעיות דימות משניות, כגון העובר סחיפה, הפסד זמני מטוס מוקד (בשל בועות בשמן), או שדות צפופים של עוברים לא הפריע בדרך כלל חיתוך מוצלח. עם זאת, עבור שדות בהם היו גושים גדולים של עוברים (חופפים במקצת z), עוברים שהיו מוטה באופן משמעותי בתוך מישור הדמיה (ב Z), הפסד ארוך טווח מטוס, או עוברים שהיו באופן חלקי, חיתוך מוצלח לא תמיד היה ושגת. ניתן לעקוף בקלות בעיות אלה על-ידי בחירת שדה טובה יותר במהלך שלב רכישת הנתונים. באופן כללי, נתוני עיבוד מקדים הנאספים באמצעות שיטה זו של תפוקה למחצה או שימוש בשיטות הרכבה קונבנציונליות הוא צעד ראשון שימושי לצורך המחשה וניתוח של ערכות נתונים עובריים.

ואלידציה של איסוף תמונה ושיטות עיבוד נתונים: התפתחות הפיתוח העצמי לאחר הנקישה על 40 גנים שתוארו בעבר
כדי לאמת את זה למחצה התפוקה הגבוהה אוסף תמונה שיטה משטר חיתוך מותאם אישית, מסך RNAi קטן בוצע זנים מותאמים אישית, בבימויו של 40 גנים עם פונקציות שתוארו בעבר במפרט הגורל תא ו מורפולגנזה ( המתואר על ידי וואנג, אוצ'ואה, ח'ולמלין ועמיתיו10,11). כדי לעשות זאת, dsRNA הופק נגד כל יעד, מוזרק L4 בעלי חיים מכל זן, חיכה 20-24 h, ולאחר מכן גזור העוברים והתמונה באמצעות הפרוטוקול המתואר לעיל (עבור קבוצת נתונים מלאה10,11). השגת פנוטיפים התפתחותיים על ידי RNAi דורש עיכוב הן ביטוי גנים אימהי וזיפטיים. גנים התפתחותיים יכולים להתבטא maternally, עם מוצרי החלבון שנוצר נטען לתוך העוברים, או ביטוי הזיסטי בעובר, או, במקרים רבים, הן10,22,23. הזמן שבין ההזרקה לצילום העובר הוא המשתנה הקריטי כדי למקד ביעילות את הmaternally וביטא בצורה הזיטית אוכלוסיות; עיתוי קובע הן את כמות dsRNA מוזרק כי הוא נטען לתוך העובר כדי למנוע ביטוי זיפטי24 ואת היקף המחסור בחלבון אימהי. לאחר הזרקת dsRNA, mRNA אימהי המתאים להגן המיועד מקבל מושפל ולא להתאושש במרווח זמן רלוונטי. מחסור החלבון הקיים מחייב ייצור העובר, אשר פולט את חלבון אימהי מרקמות germline על ידי טעינת אותו לתוך יוצרים עוברים. 20-24 h ב 20 ° c הוא זמן הדגירה הקצר ביותר המאפשר דלדול אימהי עקבית; דלדול אימהי מקבל יותר טוב בזמן מאוחר יותר (כלומר, 36-42 h לאחר ההזרקה). כמות dsRNA מוזרק כי הוא נטען לתוך העובר מכתיב כמה יעיל למניעת ביטוי הגנים הזיפטיים יהיה. כמות של פסגות שנטענו RNA על 5-10 h לאחר ההזרקה, כאשר עוברים עם חומר מוזרק מופרות לראשונה, פוחתת לאחר מכן. בניסיון שלנו, 24 שעות לאחר ההזרקה היא נקודת זמן אופטימלית, שבה מחסור בחלבון אימהי ועיכוב של ביטוי הגנים הזיפטיים הם יעילים. ניתוח של פנוטיפים בזנים כתבת מותאם אישית המשמשים בעבודה זו, על פני הקבוצה של הגנים מבחן 40, הראה כי הפרוטוקול המשולב שלנו הניב ברורים, החתימה מאוד מאוד החתימות לאורך ספקטרום רחב של גנים המעורבים גורל התאים מפרט ומורפולגנזה (ראה וואנג et al.10); ערכת הנתונים המלאה זמינה11). כדוגמה לנתונים אלה, תמונות סטילס של ארבעה עוברים שונים עבור שליטה , פא-4 (RNAi), pal-1 (rnai)ו -mex-3 (rnai ) בתוך מאמץ העיתונאי של שכבת הנבט מוצגים באיור 4א. לדיון מקיף יותר של פנוטיפים שנצפו במסך 40 RNAi, לראות וואנג et al.10

ImageJ מאקרו: קומפילציה והדמיה של כל הנתונים עבור תנאי נתון
ויזואליזציה של מספר רב של עוברים מערימות בודדים tiff יכול להיות מייגע זמן רב לעבוד דרך. מהמאמץ הראשוני, > 400 עוברים בודדים הוצאו באמצעות תוכנית חיתוך אוטומטי מותאם אישית המתואר לעיל. כדי להאיץ את ניתוח המעבר הראשון, בנינו מאקרו ImageJ, היוצר מערך של כל העוברים הניתנים לדימות עבור תנאי RNAi נתון ברקע מסוים (איור 4ב). עבור כל עובר במערך, תמונת ברייטפילד ותמונת הקרנה בעוצמה מרבית מוצגים זה לצד זה, עבור כל נקודת זמן, כדי ליצור קובץ סרט ללא הפרדות צבע. בעוד שמאקרו זה נכתב כדי לתפקד עם מבנה הקובץ שלנו, ניתן לערוך אותו כדי להתאים למבנה הקבצים של המשתמש. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, עם זאת, על המשתמשים לעקוב אחר המוסכמות למתן שמות ומבנה קבצים שנקבעו בפרוטוקול (ראה קבצי README או Github, לפרטים נוספים עבור מוסכמות של שמות יישומים של פיתון ו-ImageJ). כדי להציג את כל ה-ImageJ נתונים מעובדים ולקבל ניתוח מעמיק יותר של פנוטיפים שנצפו עבור מבחן 40-גנטית להגדיר, עיין בנתונים הנמסרים במסד הנתונים של Dryad10,11. תבנית ההדמיה החזותית של ImageJ מאפשרת הערכה מהירה של הפנוטיפ הכולל והחדירה שלו, ומקלה על הדגל של בעיות איכות נתונים, כגון נוכחות של פסולת או הפסד של מטוס מוקד. בסך הכל, השילוב של שיטת רכישת הנתונים למחצה בתפוקה גבוהה, תוכנית חיתוך ו-ImageJ הכלי להדמיה, בשילוב עם זנים עיתונאי מותאם אישית, מאוד מקל על מאמצים בקנה מידה גדול יותר ללמוד התפתחות עובריים.

Figure 1
איור 1. סקירה של שיטת דימות בעלת תוכן גבוה, שגרת עיבוד נתונים וכלים חיוניים. (א) השוואה בין התכונות של השיטה הסטנדרטית המבוססת על מקלדת, לצורך העברת מספר העוברים אל הגישה הרב-מרובת-התפוקה הגבוהה המתוארת כאן. (ב) מבט כולל על שיטת למחצה תפוקה גבוהה לניטור התפתחות עובריים. עיין בטקסט לקבלת פרטים. (ג) סקירה של כלי עיבוד הנתונים וההדמיה, שניתן להשתמש בהם בנתונים שנרכשו באמצעות הליך הרכבה רגיל מבוסס-pad או התקנה מבוססת-על-ידי התפוקה הגבוהה למחצה, המתוארת להלן. ניתן לעבד בודדת 3 ערוצים רצף העובר משדה אחד (משמאל) או מספר שלושה ערוצים, שדות 4-ממדיים של נתוני העובר (מימין) יכולים להיות מעובדים באמצעות תוכנית החיתוך המותאמת אישית, התואמת לנתונים הנלכדים ברוב פלטפורמות ההדמיה. הגירסה של ממשק המשתמש הגרפי (GUI) של התוכנית היא ידידותית למשתמש ואינה דורשת מומחיות בתכנות. היישום screenCrop.py דורש מומחיות פיתון, אבל זה הוסיף יכולות-כלומר זה יכול לחתוך בפורמט אצווה. הפלט של צעד זה הוא נחתך בחוזקה, אחורי אחוריים מונחה העובר החוצה tiff. כדי להמחיש את כל הנתונים מתנאי אחד, מאקרו מסוג ImageJ נבנה באמצעות הידור, ערימות tiff מסובבות כדי להציג תמונת ברייטפילד והקרנת עוצמה מרבית עבור כל עובר בכל נקודת זמן. (D) הפאנל מציג כלים חיוניים הדרושים לניתוח והתקנה של תבנית הדמיה חצי-גבוהה תפוקה. חלק ממרכיבי הדמות משוחזרים בהיתר מ-וואנג et al.10. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
. איור 2 זנים מותאמים אישית שנוצרו עבור הדמיה התוכן הגבוה של C. אלגיה embryogenesis. (א) תרשימים להמחיש את הטרנסגנים המשמשים לבניית שכבת נבט (למעלה) ו מורפולגנזה (למטה) זנים. (ב) לוחות הקרנה מקסימלית בעוצמה להציג את הזמן ההתפתחותי-קורס מורפולגנזה (למעלה) ואת שכבת נבט (למטה) זנים. תצוגה מוצגמת מוצגת, כפי שמוצג בתרשים (משמאל). הזמן הוא יחסית לשלב הפסיק (t = 0), שניתן לזהותו בקלות בשני הזנים. סרגל בקנה מידה = 10 μm. איור שוחזר באישור וואנג et al.10. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3. תוכנית חיתוך מותאמת אישית מבודדת ומכוונת עוברים בודדים משדות הדמיה. (א) סכמטי ממחיש את התכונות של תוכנית חיתוך העובר המותאם אישית ומדגיש את שתי האפשרויות עבור גישה לתוכנית זו: ממשק GUI ידידותי למשתמש, אשר דורש לא מומחיות תכנות זמין על zenodo (משמאל) ו הגרסה חיתוך אצווה של התוכנית, אשר דורש ניסיון פיתון זמין Github (מימין). (ב) הגרפיקה מסכמת את אלגוריתם החיתוך האוטומטי — מסיכה בינארית נוצרת מתמונות שדות של 8 סיביות ועוברים בודדים מזוהים, נחתכים ומכוונים לאורך הציר האחורי הקדמי. סרגל בקנה מידה הוא 10 μm. (C) שרטוט פירוט ההליך המשמש לאיטראציה לזהות עוברים במסיכה הבינארית. (ד) סכימטי ממחיש את השיטה המשמשת לעוברים מורידים לאורך הציר האחורי הקדמי. פאנלים B-D לשכפל עם אישור וואנג et al.10. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4. ImageJ מאקרו מותאם אישית מאפשר ויזואליזציה של הקרנת נתונים של RNAi על-ידי יצירת קבצים מורכבים עבור כל תנאי. (א) עוברים שלושה למשל התנאים rnai מן 40-מבחן גנים להגדיר (לראותוואנגet al. 10,11 עבור dataset מלאה) מוצגים (מימין) להדגיש את הפנוטיפים ברורים לחתימה המתקבלים עבור כל מצב והשגות של הפנוטיפים בתוך כל תנאי. פאנל הותאם באישור וואנג et al.10. (B) מדגים כיצד המאקרו imagej המותאם אישית (OpenandCombine_embsV2. ijm) מפרט עוברים מתנאי rnai נתון לקובץ imagej משולב המערכים את השדה הבראלי ואת התחזיות האינטנסיביות המרביות עבור כל עובר בכל נקודת זמן. למרות שדוגמה אחת בלבד מודגשת, מאקרו זה יכול לקמפל את הנתונים עבור תנאים רבים של RNAi בו. מאקרו של ImageJ זמין בזניקה12. סרגל בקנה מידה = 10 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

עבודה זו מתארת חבילה של כלים ושיטות שפותחו כדי לאפשר מאמצים גדולים יותר לפרופיל הפונקציה של גנים בהתפתחות עובריים בג. שיטת התפוקה הגבוהה שלנו למחצה מאפשרת הדמיה של זמן תלת-ממד של התפתחות עובריים ברזולוציה של 20 דקות עבור 80 – 100 עוברים בניסוי אחד. בעוד פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לשימוש עם זן סמן הרצוי (s), עבודה זו ממחישה את הפוטנציאל של השיטה באמצעות שני זנים מותאמים אישית שפותחו כדי לפקח על אירועים במהלך embryogenesis: (1) מאמץ שכבת הנבט, שבו מסוימים הרקמה היזמים לכונן את הביטוי של האבנים פלורסנט כדי לסמן את האנדועור, מזועור ו הגרעין אאקטודרם, ו (2) זן כתב מורפולגנזה, אשר משתמשת באפידרמיס היזמים עצביים כדי לכונן את הביטוי של סמנים פלורסנט בתא צמתים קרום הפלזמה. על ידי הדמיה של שני זנים, את ההשלכות של רטבאליות מולקולרית על מפרט הגורל התא ואירועים מורפולגנטיות ניתן ללכוד עם פרט מדהים. כדי לטפל באתגרים שהוצגו על-ידי כמות הנתונים שנוצרה על-ידי שיטה זו, פותחו כלים מותאמים אישית לצורך ייעול עיבוד נתונים והדמיה. הכלי הראשון לגידולים עוברים בודדים מתוך שדה של העוברים ברצף פקיעה בזמן תלת-ממד, תוך שהיא גם מסתובבת את העוברים לכיוון רגיל האחורי הקדמי וביצוע חיסור הרקע, תיקון הסחף, ותיקון החליש. תוכנית זו נארזה כמו GUI ידידותי למשתמש (https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w) ואת קוד המקור וגרסת אצווה מתקדמת יותר של התוכנית עבור משתמשים מנוסים פיתון (github.com/renatkh/embryo_crop.git) מסופק10,12,13. לבסוף, כדי להמחיש את הנתונים המעובדים בתבנית משמעותית, המציאו מאקרו ImageJ; דבר זה מאפשר למשתמש להמחיש את כל העוברים ממצב RNAi נתון בסרט רב-ממדי, המציג שדה ברייטגרפי והקרנת עוצמה מרבית עבור כל עובר בכל נקודת זמן. יחד, הזנים, הפרוטוקול וכלי עיבוד הנתונים, מאמצים לחקור את embryogenesis בקנה מידה גדול יותר של מאמץ אפשרי.

למרות ששיטת הרכישה החצי-גבוהה המתוארת כאן מחייבת תשומת לב למספר פרטים קריטיים, הנדונים להלן. ראשית, המשתמשים חייבים לקבל גישה למיקרוסקופ קונפוקלית וקד עם מדויק נקודת הביקור קיבולת שניתן לבוש עם מחזיק צלחת מרובת היטב. השיקול הקריטי ביותר לפרוטוקול זה הוא המיקרוסקופ להישמר בחדר בקרת טמפרטורה. בעוד שליקרוסקופים רבים יש את היכולת לחמם, רובם לא יכולים להתקרר באופן אמין, ולכן הטמפרטורה הסביבתית צריכה להיות מותאמת כדי לשמור על הטמפרטורה הידידותית הקבועה של הג . כדי להשיג זאת, חדר ההדמיה מתקיים ב -16 ° c. שטח המדגם של המכשיר מתחמם עד 21-23 ° צ' במהלך ההדמיה. תנודות בטמפרטורת החדר יכולות להשפיע על העיתוי ההתפתחותי ולשנות בעדינות את דיוק המישור המוקד במהלך הביקור בנקודה ויש להימנע ככל האפשר. שימו לב כי הפעלת בטמפרטורות מעל 23 ° צ' עלולה לגרום לזינוק ניכר במצבי השליטה העובריים לתנאי שליטה ואינו מומלץ. עוד שיקול מפתח הוא בחירת העובר ופיזור במהלך הניתוח. יש לנקוט כדי להימנע מהעברת עוברים מבוגרים לבארות ההדמיה, שכן, בעלי חיים מאינקובטור נוטים לעוברים מחוץ לנוף; השכיחות של זה הוא הפחת על ידי הכללת הרדמה בתקשורת. הפיזור של עוברים, כדי למנוע גושים גדולים של עוברים, הוא גם משתנה קריטי. הפסיעה נוטה להתרחש כאשר עוברים מועברים לבארות בעלי חיים בעלי החיים הנמשכים דק מדי, או כאשר העוברים אינם מפוזרים במידה מספקת במהלך הניתוח. שיקול נוסף הוא הבחירה נקודה וכוונון מטוס מוקד לוקח זמן. הצלחת אינה מוחזקת בקרח במהלך תהליך זה, כך שעוברים מתחילים להתפתח באופן מיידי. עבור זנים סמן מותאם אישית המשמשים במחקר זה, יש על 90 דקות החלון לאחר הצלחת מוסר קרח כדי לבצע סריקת צלחת ובחירת נקודת לפני סמנים מתחילים להתבטא. זה מספיק זמן להגדיר על המכשיר שלנו עם זנים אלה, אבל אחרים מיקרוסקופים וזנים עשויים להציע אתגרים בזמן נוסף שידרוש פתרון בעיות. לבסוף, השיטה שאנו מתארים מעסיקה מטרת שמן 60x כדי לאסוף z-ערימות של 50 שדות ב 20 דקות במרווחי זמן. כפי שאנו מדגישים, ניתן להגדיל את הרזולוציה הטמפורלית על-ידי הפחתת מספר השדות הניתנים לדימות. לדוגמה, 10 שדות ניתנים לדימות ברזולוציית זמן של 4 דקות. חלופה נוספת להגברת הרזולוציה הטמפורלית היא שימוש בהגדלה נמוכה יותר, מטרת מפתח מספרית גבוהה; במקרה זה, השדה הגדול של התצוגה מאפשר דימות של מספר גדול של עוברים ברזולוציה גבוהה יותר עם הפחתה מתונה רק ברזולוציה מרחבית.

כדי לאפשר עיבוד והדמיה של נתונים בקנה מידה גדול יותר, בנינו כלים מותאמים אישית והפכו אותם לזמינים באופן חופשי. הכלי הכי שימושי ביותר הוא GUI חיתוך מותאם אישית, אשר דורש לא מומחיות תכנות לפעול. GUI ניתן להשתמש כדי לקצץ העוברים המזרח בכל שלבי הפיתוח והוא תואם את כל הסמנים, מה שהופך אותו שימושי לא רק עבור ביולוגים התפתחותיים, אלא גם עבור חוקרים לומדים תהליכים בעובר המוקדם. בגלל הפלט של GUI הוא נחתך בדיוק, מונחה, קנה מידה, מתוקן נתונים, הנתונים יכולים להיות בקלות מנהרה לתוך צינור ניתוח אוטומטי, מה שהופך את הכלי הזה שימושי ניתוח של העבר והנתונים העתידיים; אם נעשה שימוש בזנים מתאימים, ניתן להשתמש בקבצי נתונים שיתקבלו כקלט עבור משטרי ניתוח אוטומטיים קיימים, כגון כלים embryogenesis יישור25. כדי להשתמש בתוכנית, חשוב שהמשתמשים יהיו מודעים לכך שאלגוריתם החיתוך מחייב שימוש בשדה בהיר או בתמונה DIC שייאספו עבור כל שלב ונקודת זמן. בנוסף, משתמשים צריכים לציין כי אלגוריתם הכיוון הקדמי האחורי מובנה בהתבסס על התפלגות האות האדום בכתב הנבט שכבת ומורפולגנזה דו ח זנים, המוצג בעבודה זו. כך, דיוק של התמצאות AP בזנים סמן אחרים יהיה צורך להעריך על בסיס מקרה אחר מקרה. GUI נבדק עם נתונים שנאספו על שלושה פלטפורמות הדמיה קונפוקלית וקד שונים והוא תואם על פני הלוח עבור ערימות מרובת tiff וסדרת tiff. בנוסף לגרסה ידידותית למשתמש, קוד המקור עבור GUI וגירסת אצווה של תוכנית זו גם הפך זמין, עם האזהרה כי ניסיון בתיכנות נדרש, ואת מבנים הקובץ ומוסכמות למתן שמות יהיה צורך לעקוב. לבסוף, מאקרו עיבוד ImageJ נבנה כדי לקחת ערימות של תמונות raw עבור כל העוברים, בכל תנאי RNAi, ולקמפל מערך אינפורמטיבי כדי להראות את כל העוברים עבור תנאי זה ברייטפילד והקרנת העוצמה המקסימלית של הקרינה בכל נקודת זמן. כלי זה יכול להיות מותאם למפרטים של המשתמש והוא מאקרו שימושי כדי להפוך את חיפושי נתונים ובקרת איכות הערכה פשוטה יותר.

יחד, שיטת הצילום למחצה בתפוקה גבוהה, יחד עם חיתוך העובר וכלים לעיבוד תמונה המתוארים להלן , יאפשרו ניתוח של התפתחות עובריים באמצעות מגוון מוטציות, רטבאליות, ומסמן זנים. במעבדה שלנו, מסך בקנה מידה גדול העסקת שיטות אלה העוברים הסרט משני זנים מהונדסים אישית שתוארו כאן לאחר הנוק של ~ 2,000 גנים הדרושים לפיתוח, הוא כרגע בעיצומן. לבסוף, הנתונים מתוך מאמץ זה ישמש משאב נוסף כדי לשפר את המאמצים כדי להבין מפרט הגורל תא ואירועים מורפולגנטיות במהלך embryogenesis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לא

Acknowledgments

S.D.O. היה נתמך על ידי המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית בחסות אוניברסיטת קליפורניה בסן דייגו המחקר המוסדי ופיתוח הקריירה האקדמית פרס (NIH/IRACDA K12 GM068524). Ad ו K.O. תמכו על ידי המכון לודוויג לחקר הסרטן, אשר גם סיפק להם מימון מחקר המשמש לתמיכה זו עבודה. אנו אסירי תודה לאנדרו צ'ישולם על עצתו בשלבים המוקדמים של הפרויקט הזה, רונלד ביגס לתרומות לפרויקט זה לאחר שלב פיתוח השיטה הראשונית, ודייב ג'נקינס ואנדי Shiau לתמיכה וגישה לגילוי המולקולה הקטנה מערכת הדמיה של התוכן הגבוה של הקבוצה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aspirator Tube Assembly Drummond Scientific 2-000-000
Calibrated Pipette (25 mL) Drummond Scientific 2-000-025
Cell Voyager Software Yokogawa Electric Corp Included with CV1000
Conical Tube (15 mL) USA Scientific 1475-0501
CV1000 Microscope Yokogawa Electric Corp CV1000
Depression slide (3-well) Erie Scientific 1520-006
Dissection Microscope Nikon SMZ-645
Eppendorf Centrifuge 5810R Eppendorf 5811 07336
ImageJ/FIJI Open Source https://imagej.net/Fiji
M9 Buffer Lab Prepared https://openwetware.org/wiki/M9_salts
Microcentrifuge Tube (1.5 mL) USA Scientific 1615-5500
Microseal F-foil Seal Bio-Rad MSF1001
NGM Plates Lab Prepared http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html#d0e214
Scalpel #15 Bard Parker REF 371615
Sensoplate Plus, 384 Well, F-bottom, Glass Bottom Greiner Bio-One 781855
Tetramisole Hydrochloride Sigma Aldirch T1512-10G
Tweezers, Dumont #3 Electron Microscopy Sciences 0109-3-PO
U-PlanApo objective (10× 0.4 NA) Olympus 1-U2B823
U-PlanApo objective (60× 1.35 NA) Olympus 1-U2B832

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Armenti, S. T., Nance, J. Adherens junctions in C. elegans embryonic morphogenesis. Sub-Cellular Biochemistry. 60, 279-299 (2012).
  2. Chisholm, A. D., Hsiao, T. I. The Caenorhabditis elegans epidermis as a model skin. I: development, patterning, and growth. Wiley Interdisciplinary Reviews Developmental Biology. 1 (6), 861-878 (2012).
  3. Jackson, B. M., Eisenmann, D. M. beta-catenin-dependent Wnt signaling in C. elegans: teaching an old dog a new trick. Cold Spring Harbor Perspectives In Biology. 4 (8), 007948 (2012).
  4. Lamkin, E. R., Heiman, M. G. Coordinated morphogenesis of neurons and glia. Current Opinion in Neurobiology. 47, 58-64 (2017).
  5. Loveless, T., Hardin, J. Cadherin complexity: recent insights into cadherin superfamily function in C. elegans. Current Opinion in Cell Biology. 24 (5), 695-701 (2012).
  6. Priess, J. R. Notch signaling in the C. elegans embryo. WormBook. , 1-16 (2005).
  7. Spickard, E. A., Joshi, P. M., Rothman, J. H. The multipotency-to-commitment transition in Caenorhabditis elegans-implications for reprogramming from cells to organs. FEBS Letters. 592 (6), 838-851 (2018).
  8. Vuong-Brender, T. T., Yang, X., Labouesse, M. C. elegans Embryonic Morphogenesis. Current Topics in Developmental Biology. 116, 597-616 (2016).
  9. Wang, J. T., Seydoux, G. Germ cell specification. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 17-39 (2013).
  10. Wang, S., et al. A high-content imaging approach to profile C. elegans embryonic development. Development. 146 (7), (2019).
  11. Wang, S., Ochoa, S., Khaliullin, R. N., Gerson-Gurwitz, A., Hendel, J. M., Zhao, Z., Biggs, R., Chisholm, A. D., Desai, A., Oegema, K., Green, R. A. Dryad Digital Repository. , (2019).
  12. Wang, S., Ochoa, S., Khaliullin, R., Gerson-Gurwitz, A., Hendel, J., Zhao, Z., Biggs, R., Chisholm, A., Desai, A., Oegema, K., Green, R. A. Zenodo. , (2018).
  13. Khaliullin, R. N. Software to crop C. elegans embryos from multi-channel microscopy images. , Available from: https://github.com/renatkh/embryo_crop (2018).
  14. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  15. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  16. Chisholm, A. D., Hardin, J. Epidermal morphogenesis. WormBook. , 1-22 (2005).
  17. Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 100 (1), 64-119 (1983).
  18. Fakhouri, T. H., Stevenson, J., Chisholm, A. D., Mango, S. E. Dynamic chromatin organization during foregut development mediated by the organ selector gene PHA-4/FoxA. PLoS Genetics. 6 (8), (2010).
  19. Zhong, M., et al. Genome-wide identification of binding sites defines distinct functions for Caenorhabditis elegans PHA-4/FOXA in development and environmental response. PLoS Genetics. 6 (2), 1000848 (2010).
  20. Schmitz, C., Kinge, P., Hutter, H. Axon guidance genes identified in a large-scale RNAi screen using the RNAi-hypersensitive Caenorhabditis elegans strain nre-1(hd20) lin-15b(hd126). Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 104 (3), 834-839 (2007).
  21. Canny, J. A computational approach to edge detection. IEEE transactions on pattern analysis and machine intelligence. 8 (6), 679-698 (1986).
  22. Levin, M., Hashimshony, T., Wagner, F., Yanai, I. Developmental milestones punctuate gene expression in the Caenorhabditis embryo. Developmental Cell. 22 (5), 1101-1108 (2012).
  23. Packer, J. S., et al. A lineage-resolved molecular atlas of C. elegans embryogenesis at single cell resolution. BioRxiv. , (2019).
  24. Oegema, K., Hyman, A. A. Cell division. WormBook. , 1-40 (2006).
  25. Insley, P., Shaham, S. Automated C. elegans embryo alignments reveal brain neuropil position invariance despite lax cell body placement. PLoS One. 13 (3), 0194861 (2018).

Tags

ביולוגיה התפתחותית סוגיה 152 C. אלגיה עובר הדמיה בעלת תוכן גבוה embryogenesis עיבוד תמונה ויזואליזציה של נתונים פיתוח פיתוח עובריים חצי-תפוקה גבוהה
שיטת דימות למחצה של תפוקה גבוהה וערכת כלי הדמיה של נתונים כדי לנתח את הפיתוח העובריים <em>של ס. אלאנס</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Khaliullin, R. N., Hendel, J. M.,… More

Khaliullin, R. N., Hendel, J. M., Gerson-Gurwitz, A., Wang, S., Ochoa, S. D., Zhao, Z., Desai, A., Oegema, K., Green, R. A. A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development. J. Vis. Exp. (152), e60362, doi:10.3791/60362 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter