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Developmental Biology

एक अर्द्ध उच्च-थ्रूपुट इमेजिंग विधि और डेटा विज़ुअलाइज़ेशन टूलकिट का विश्लेषण करने के लिए C. elegans भ्रूणीय विकास

Published: October 29, 2019 doi: 10.3791/60362
Automatic Translation
1,2,3, 1,2, 1,2, 1,4,5, 1,6, 1,7, 1,2, 1,2, 1,2
1Ludwig Institute for Cancer Research, San Diego, 2Department of Cellular and Molecular Medicine, University of California, San Diego, 3Recursion Pharmaceuticals, 4Biomedical Sciences Graduate Program, University of California, San Diego, 5Cell Biology Section, National Institute of Dental and Craniofacial Research, National Institutes of Health, 6Department of Biology, San Diego State University, 7Developmental and Stem Cell Biology Graduate Program, University of California, San Francisco

Summary

यह काम एक अर्द्ध उच्च throughput प्रोटोकॉल है कि एक साथ 3 डी समय चूक 80-100 C. elegans भ्रूण में एक ही रात भर चलाने में भ्रूण की इमेजिंग की अनुमति देता है का वर्णन करता है. साथ ही, छवि संसाधन और दृश्यावलोकन उपकरण डेटा विश्लेषण को कारगर बनाने के लिए शामिल किए गए हैं। कस्टम रिपोर्टर उपभेदों के साथ इन तरीकों का संयोजन भ्रूणजनन की विस्तृत निगरानी में सक्षम बनाता है।

Abstract

सी elegans भ्रूण विकास के दौरान सेल भाग्य विनिर्देश और morphogenetic घटनाओं के व्यवस्थित विश्लेषण के लिए प्रमुख प्रणाली है. एक चुनौती यह है कि भ्रूणजनन गतिशील रूप से लगभग 13 ज की अवधि में प्रकट होता है; इस आधे दिन के समय के पैमाने पर भ्रूण है कि छवि की जा सकती है की संख्या सीमित द्वारा प्रयोगों के दायरे को सीमित किया है. यहाँ, हम एक अर्द्ध उच्च throughput प्रोटोकॉल है कि एक साथ 3 डी समय चूक मध्यम समय संकल्प पर 80-100 भ्रूण में विकास के इमेजिंग के लिए अनुमति देता है का वर्णन, अप करने के लिए 14 विभिन्न स्थितियों से, एक ही रात में चलाने में. प्रोटोकॉल सीधा है और बिंदु पर जाकर क्षमता के साथ एक माइक्रोस्कोप के उपयोग के साथ किसी भी प्रयोगशाला द्वारा लागू किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल की उपयोगिता यह दो कस्टम निर्मित उपभेदों रोगाणु परत विनिर्देश और morphogenesis के प्रमुख पहलुओं कल्पना करने के लिए अनुकूलित फ्लोरोसेंट मार्करों व्यक्त करने के लिए उपयोग करके प्रदर्शन किया है. डेटा का विश्लेषण करने के लिए, एक कस्टम प्रोग्राम है कि फसलों अलग-अलग भ्रूण सभी चैनलों में देखने की एक व्यापक क्षेत्र से बाहर, z कदम, और timepoints और एक अलग झगड़ा ढेर में प्रत्येक भ्रूण के लिए दृश्यों बचाता है बनाया गया था. कार्यक्रम है, जो एक उपयोगकर्ता के अनुकूल चित्रमय यूजर इंटरफेस (GUI) भी शामिल है, visualization या स्वचालित विश्लेषण के लिए तैयार करने में अलग-अलग भ्रूण अलग अलग, पूर्व प्रसंस्करण, और समान रूप से उन्मुख द्वारा डेटा प्रसंस्करण को कारगर बनाता है। इसके अलावा आपूर्ति की एक ImageJ मैक्रो है कि एक बहु पैनल फ़ाइल है कि अधिकतम तीव्रता फ्लोरोसेंट प्रक्षेपण और प्रत्येक समय बिंदु पर प्रत्येक भ्रूण के लिए brightfield छवियों को प्रदर्शित करता है में अलग-अलग भ्रूण डेटा compiles है. प्रोटोकॉल और उपकरण यहाँ वर्णित उन्हें 40 पहले वर्णित विकासजीन के दस्तक के बाद भ्रूण विकास की विशेषता के लिए का उपयोग करके मान्य किया गया; इस विश्लेषण पहले एनोटेट विकासphenotypes कल्पना और नए लोगों से पता चला. सारांश में, यह काम एक अर्द्ध उच्च थ्रूपुट इमेजिंग विधि एक फसल कार्यक्रम और ImageJ दृश्य उपकरण के साथ युग्मित विवरण है कि, जब जानकारीपूर्ण फ्लोरोसेंट मार्करों व्यक्त उपभेदों के साथ संयुक्त, बहुत प्रयोगों का विश्लेषण करने के लिए accelerates भ्रूणीय विकास.

Introduction

सी एलिगेंस भ्रूण यंत्री कोशिका जीव विज्ञान के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल प्रणाली है और कोशिका भाग्य विनिर्देश और morphogenetic घटनाओं भ्रूण विकास ड्राइविंग के विश्लेषण1,2,3,4 ,5,6,7,8,9. तारीख करने के लिए, दोनों सेलुलर स्तर की घटनाओं और भ्रूण में सेल भाग्य विनिर्देश की विशेषता के बहुत अपेक्षाकृत उच्च लौकिक संकल्प एक पर एक समय इमेजिंग प्रयोगों का उपयोग कर प्राप्त किया गया है (यानी, अधिग्रहण हर 10-100 s) भ्रूण व्यक्त की फ्लोरोसेंट मार्करों. हालांकि अच्छी तरह से मिनट के दसियों करने के लिए सेकंड के आदेश पर घटनाओं के लिए अनुकूल है, इस दृष्टिकोण तकनीकी रूप से अब प्रक्रियाओं की विशेषता के लिए सीमित हो जाता है, दिन के लिए घंटे के आदेश पर. भ्रूण विकास पहले दरार से दीर्घीकरण के अंत तक के बारे में लेता है 10 ज. इस समय पैमाने पर, अर्द्ध उच्च throughput तरीकों कि एक साथ कम समय संकल्प इमेजिंग के लिए अनुमति होगी (यानी, भ्रूण के बड़े सहगण के 5-20 मिनट समय अंतराल पर अधिग्रहण), विभिन्न स्थितियों से, प्रयोगों की एक नई श्रृंखला खुल जाएगा; उदाहरण के लिए, व्यवस्थित बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग प्रयासों और आणविक क्षोभ के परिणामों की तुलना के लिए भ्रूण की पर्याप्त संख्या के विश्लेषण को सक्षम करने.

यहाँ, हम सी elegans भ्रूणजनन की निगरानी के लिए एक अर्द्ध उच्च throughput विधि का वर्णन है कि 80-100 भ्रूण में विकास के एक साथ 3 डी समय चूक इमेजिंग सक्षम बनाता है, अप करने के लिए 14 विभिन्न स्थितियों से, एक ही रात में चलाने के लिए. प्रोटोकॉल को लागू करने के लिए सीधा है और बिंदु पर जाकर क्षमताओं के साथ एक माइक्रोस्कोप के उपयोग के साथ किसी भी प्रयोगशाला द्वारा किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल के प्रमुख कदमचित्र 1में दिए गए हैं। संक्षेप में, भ्रूण ब्याज की फ्लोरोसेंट मार्करों व्यक्त करने और इमेजिंग के लिए एक 384 अच्छी तरह से प्लेट के कुओं के लिए युवा भ्रूण (2-8 सेल चरण) हस्तांतरण gravid वयस्कों से विच्छेदन कर रहे हैं. इस प्रारूप में, अपेक्षाकृत छोटे अच्छी तरह से आकार कीप एक संकीर्ण क्षेत्र में भ्रूण, जो समय चूक इमेजिंग के लिए कई भ्रूण युक्त क्षेत्रों की पहचान की सुविधा. भ्रूण के सहगण भर में मोटे तौर पर तुल्यकालिक विकास बनाए रखने के लिए, विच्छेदन ठंडा मीडिया में प्रदर्शन कर रहे हैं और थाली बर्फ पर आयोजित किया जाता है, जो घंटे भर विच्छेदन समय खिड़की के दौरान महत्वपूर्ण विकास को रोकता है. प्लेट माइक्रोस्कोप को स्थानांतरित कर दिया है और भ्रूण एक तापमान नियंत्रित कमरे में रात भर फिल्माया जाता है, 20 मिनट के समय अंतराल पर, एक 60x तेल विसर्जन 1.35 एनए लेंस का उपयोग कर, 2 $m चरणों में पूर्ण z सीमा इकट्ठा करने के लिए. पचास खेतों, प्रत्येक 1-5 भ्रूण के बीच युक्त, एक ही रात में चलाने में छवि रहे हैं. वांछित प्रयोग के आधार पर, समय रिज़ॉल्यूशन को बढ़ाया जा सकता है (उदाहरण के लिए, 5-10 मिनट के अंतराल पर इमेजिंग) आनुपातिक रूप से छविवाले फ़ील्ड की संख्या कम करके.

इस प्रोटोकॉल के साथ, यहां तक कि एक भी रात भर चलाने के डेटा का एक महत्वपूर्ण राशि उत्पन्न करता है (80-100 भ्रूण 50 से अधिक क्षेत्रों में फैले) और बड़े प्रयोगों जल्दी से डेटा विश्लेषण के संबंध में अप्रबंधनीय हो सकता है. इस डेटा के प्रसंस्करण, दृश्यऔर सुव्यवस्थित विश्लेषण को सुविधाजनक बनाने के लिए, भ्रूण को क्रॉप करने और ओरिएंट करने और प्री-प्रोसेसिंग चरण (वैकल्पिक) और एक ImageJ मैक्रो जो देखने को सरल बनाने के लिए डेटा को संकलित करने के लिए एक प्रोग्राम बनाया गया था। इन कार्यक्रमों के लिए पारंपरिक दृष्टिकोण का उपयोग कर एकत्र छवियों को संसाधित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, के रूप में वे इमेजिंग विधि से स्वतंत्र हैं, केवल एक ही brightfield विमान की आवश्यकता होती है. पहला कार्यक्रम एक 4D फ़ील्ड में लेता है जिसमें एकाधिक भ्रूण (GUI विकल्प या स्रोत कोड embryoCrop.py) या कई 4D फ़ील्ड होते हैं जिनमें कई भ्रूण (screenCrop.py), कसकर फसलें भ्रूण होती हैं और उन्हें पूर्वकाल-पोस्टर कॉन्फ़िगरेशन में उन्मुख करती हैं। ये प्रोग्राम उपयोगकर्ताओं को पृष्ठभूमि घटाव, प्रवाह सुधार, और क्षीणन सुधार करने का विकल्प भी देते हैं. परिणामस्वरूप फ़ाइलें समान रूप से पूर्व संसाधित कर रहे हैं, कसकर प्रत्येक भ्रूण है कि स्वचालित छवि विश्लेषण करने के लिए संशोधन कर रहे हैं के लिए झगड़ा ढेर. यह आसान प्रत्येक शर्त के लिए सभी भ्रूण को देखने के लिए बनाने के लिए, एक ImageJ मैक्रो (OpenandCombine-embsV2.iJm) लिखा गया था, जो एक भी झगड़ा ढेर में एक शर्त से सभी भ्रूण assembles और arrays brightfield छवियों और अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण रंग ( RGB) ओवरले, पक्ष द्वारा साइड, प्रत्येक भ्रूण के लिए. तरीकों को उनका उपयोग करके पुष्टि की गई थी जो रोगाणु-परत के प्रमुख पहलुओं की कल्पना करने के लिए अनुकूलित फ्लोरोसेंट मार्करों को व्यक्त करने वाले कस्टम-निर्मित उपभेदों की एक जोड़ी में 40 पहले से वर्णित विकास जीनों की दस्तक के बाद भ्रूण विकास की विशेषता है। विनिर्देश और रूपजनन10,11. साथ में, अर्द्ध उच्च थ्रूपुट भ्रूण इमेजिंग प्रोटोकॉल और छवि प्रसंस्करण उपकरण विकासात्मक प्रक्रियाओं को समझने के उद्देश्य से उच्च नमूना संख्या प्रयोगों और बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग प्रयासों को सक्षम करेंगे। इसके अलावा, इन उपभेदों भी भ्रूणजनन पर आणविक क्षोभ के प्रभाव की जांच के लिए एक कुशल साधन प्रदान करेगा.

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Protocol

1. सेमी-हाई-थ्रूपुट इमेजिंग के लिए सी एलिगन भ्रूण तैयार करना

नोट: प्रोटोकॉल के इस भाग का लक्ष्य अर्ध-सिंक्रनाइज़्ड (2 से 8-सेल चरण) सी एलिगन भ्रूण की जनसंख्या को लोड करना है, जो इमेजिंग के लिए कांच-नीचे 384-वेल प्लेट में उपयुक्त मार्कर उपभेदों (चित्र 2)से अलग किया गया है। अन्य प्लेट प्रारूपों भी काम कर सकता है, लेकिन 384 अच्छी तरह से प्लेटें पसंद कर रहे हैं क्योंकि छोटे अच्छी तरह से आकार एक अपेक्षाकृत छोटे क्षेत्र है, जो समय चूक इमेजिंग के लिए कई भ्रूण युक्त क्षेत्रों की पहचान की सुविधा के लिए भ्रूण के प्रसार constrains. मोटे तौर पर भ्रूण सिंक्रनाइज़ सुनिश्चित करता है कि विकास का पूरा कोर्स एक क्षेत्र में भ्रूण के प्रत्येक के लिए कब्जा कर लिया है.

  1. 0.1 मिलीग्राम/एमएल का 5-10 एमएल टेट्रामिसोल हाइड्रोक्लोराइड (टीएमएचसी) एनेस्थेटिक बर्फ ठंड M9 माध्यम में भंग (0.45 M Na2HPO4$ 7H 2 O, 0.11 M KH2PO4, 0.04 M NaCl, 0.09 M NH4Cl) के दौरान उपयोग करने के लिए तैयार करें विच्छेदन और इमेजिंग. इस मीडिया में यह सुनिश्चित करने के लिए एक संवेदनाहारी शामिल है कि चलती लार्वा पहले के विकास चरणों में भ्रूण की इमेजिंग को बाधित न करे।
    नोट: यदि मानक agarose पैड बढ़ते तरीकों का उपयोग कर प्राप्त डेटा का विश्लेषण करने के लिए फसल और दृश्यावलोकन उपकरणों का उपयोग कर, नीचे अनुभाग 3 के लिए आगे बढ़ें।
  2. एक गिलास नीचे 384-अच्छी प्लेट के अलग-अलग कुओं में तैयार समाधान के 70 डिग्री सेल्सियस प्रत्येक स्थिति के लिए एक अच्छी तरह से के साथ; किनारे प्रभाव को रोकने के लिए थाली के बाहरी दो पंक्तियों से बचें।
    नोट: चिपकने वाला पीसीआर प्लेट पन्नी का उपयोग करके आस-पास के कुओं को मुखौटा करने के लिए उपयोगी है (चित्र 1Dमें उदाहरण देखें ) यह भविष्य के प्रयोगों के लिए आसन्न कुओं को संरक्षित करता है और विच्छेदन सूक्ष्मदर्शी के तहत उपयुक्त कुओं का पता लगाना आसान बनाता है। एक बार जब समाधान का उपयोग किया जाता है, तब प्लेट को और शेष घोल को पूरी तरह बर्फ पर रखें।
  3. अवसाद स्लाइड से भ्रूण को स्थानांतरित करने के लिए मुंह के पिपेट उत्पन्न करें (जहां ग्रेविड हेमाफ्रोडाइट्स को काट दिया जाता है) कुओं में। एक लौ पर केशिका पिपेट (25 डिग्री सेल्सियस कैलिपेट) खींचो और एक ठीक पतला अंत उत्पन्न करने के लिए तोड़ (चित्र 1डी). क्रॉस-संदूषण को रोकने के लिए प्रति शर्त एक पाइपेट की आवश्यकता है; उपयोग के बाद पाइप्ट को छोड़ दें।
  4. प्रत्येक स्थिति के लिए एक अवसाद स्लाइड पर aliction बर्फ ठंड TMHC समाधान के 150 डिग्री एल में एक विच्छेदन दायरे के तहत $ 10 gravid वयस्कों के हस्तांतरण करने के लिए ठीक tweezers का प्रयोग करें। चने और स्कैल्पल का उपयोग करके, कीड़े को काटकर भ्रूणों को छोड़ नाश करें।
  5. एक खींचा केशिका पाइप को एस्पिरेटर अनुलग्नक में लोड करें जिसमें पिपेट्स शामिल हैं, और मुंह पाइपेट को तैयार प्लेट के एक व्यक्ति कुएं में 2 से 8-सेल-चरण भ्रूणों को स्थानांतरित करने के लिए (चित्र 1D)। देर से चरण भ्रूण और विच्छेदन मलबे को स्थानांतरित करने से बचें। विच्छेदन क्षेत्र के तहत जांच करें और यदि भ्रूणों का समुच्चय मौजूद है, तो मुंह में पाइप अप और नीचे या फैलाने के लिए पाइप टिप के साथ भ्रूण के झुरमुटों को टैप करें।
    नोट: पार संदूषण को रोकने के लिए, साफ विच्छेदन उपकरण और शर्तों के बीच चलती है, जबकि एक ताजा मुँह पाइप का उपयोग करें। विच्छेदन के बीच बर्फ पर प्लेट स्टोर.
  6. एक बार सभी स्थितियों से कीड़े विच्छेदन किया गया है और भ्रूण उनके उचित अच्छी तरह से में रखा, भ्रूण व्यवस्थित करने के लिए 600 x ग्राम पर 1 मिनट के लिए 384 अच्छी तरह से प्लेट स्पिन.
  7. किसी भी अवशेष को हटाने के लिए एक इथेनॉल से लथपथ पोंछे के साथ प्लेट के नीचे साफ करें और प्लेट को तापमान-नियंत्रित वातावरण में प्लेट होल्डर से सुसज्जित एक कॉनफोकल माइक्रोस्कोप पर रखें।
    नोट: प्रयोगशाला सेटअप का उपयोग कर इस विधि विस्तार का पालन करें जो चरणों का पालन करें; कृपया प्रयोगात्मक आवश्यकताओं और उपकरणों के अनुरूप अधिग्रहण शर्तों को संशोधित करें। यहाँ, एक confocal स्कैनर बॉक्स एक microlens-एन्हांस्ड दोहरी Nipkow कताई डिस्क, एक 512 x 512 EM-CCD कैमरा, एक उच्च परिशुद्धता ऑटो XY-स्टेज (निर्धारित संकल्प 0.1 $m) और motorized z-अक्ष नियंत्रण (नामित संकल्प 0.1 $m) के साथ सुसज्जित किया जाता है. इस प्रणाली को 16 डिग्री सेल्सियस के कमरे में रखा जाता है, जो रात भर इमेजिंग के दौरान 21 से 23 डिग्री सेल्सियस के बीच माइक्रोस्कोप तापमान बनाए रखता है।
  8. उपयुक्त भ्रूण के साथ क्षेत्रों की पहचान करने के लिए, एक 10x 0.4 एनए उद्देश्य और उपयुक्त इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रत्येक अच्छी तरह से एक पूर्व स्कैन प्रदर्शन करते हैं। सबसे इष्टतम क्षेत्रों में एक से अधिक प्रारंभिक चरण भ्रूण होगा जो एक ही फोकल तल में अन्य भ्रूणों के रूप में है और आदर्श रूप से आसन्न भ्रूणों के बीच कम से कम संपर्क होगा। उपयुक्त क्षेत्रों की स्थिति को चिह्नित करें।
  9. इमेजिंग फ़ील्ड का चयन करने के लिए, 60x उद्देश्य पर स्विच करें और भ्रूण को उचित रूप से अनुभाग करने के लिए प्रत्येक बिंदु पर फोकल विमान को समायोजित करें। 1ण्4 प्रति कुएँ की छवियाँ हैं, 14 कुओं में कुल 50 क्षेत्रों के लिए, और प्रत्येक क्षेत्र में एक से पांच भ्रूण ों के बीच हो सकते हैं। कुल मिलाकर, 4 से 15 भ्रूण उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए प्रत्येक शर्त से चयन ित कर रहे हैं.
    नोट: इस कदम पर एक महत्वपूर्ण चर पर्याप्त तेल का उपयोग है; उद्देश्य पर तेल जगह, प्रत्येक अच्छी तरह से अंक पर जाकर कुओं के सभी की सतह के आसपास तेल का प्रसार और फिर क्षेत्रों के चयन से पहले उद्देश्य के लिए तेल की एक अतिरिक्त बूंद लागू होते हैं.
  10. छवि चयनित क्षेत्रों का उपयोग कर एक 60x 1.35 एनए उद्देश्य 10 h के लिए हर 20 मिनट 2 डिग्री अंतराल पर 18 z वर्गों प्राप्त करने के लिए। रोगाणु परत और morphogenesis रिपोर्टर उपभेदों का उपयोग कर इमेजिंग शर्तों इस प्रकार हैं: ब्राइटफील्ड, 90% शक्ति, 25 एमएस, 20% लाभ; 488 एनएम, 100% बिजली, 200 एमएस, 60% लाभ; 568 एनएम, 45% बिजली, 150 एमएस, 60% लाभ.
  11. इमेजिंग के बाद पूरा हो गया है, एक कम आवर्धन (10x 0.4 एनए उद्देश्य) पूरे अच्छी तरह से ब्राइटफील्ड स्कैन $ 20-24 एच रात भर इमेजिंग की शुरुआत के बाद प्रदर्शन करके भ्रूण घातकता का आकलन।

2. भ्रूण घातकता स्कोरिंग

  1. पोस्ट रन 10x स्कैन क्षेत्रों का उपयोग करना, प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए रची कीड़े और unhatched भ्रूण गिनती द्वारा भ्रूण घातकता और लार्वा दोष का आकलन.
  2. भ्रूण घातक के रूप में unhatched भ्रूण स्कोर. गिरफ्तार एक से चार कोशिका चरण भ्रूण घातक गिनती से बाहर निकलें, के बाद से युवा विच्छेदन भ्रूण कभी कभी eggshell गठन को पूरा करने में विफल (यदि meiosis द्वितीय अभी तक पूरा नहीं हुआ है) और पारगम्यता दोष पहले दो के दौरान परासरणी जटिलताओं के लिए नेतृत्व कर सकते हैं प्रभागों.
  3. शरीर की आकृति विज्ञान या व्यवहार दोषों के साथ आंशिक रूप से पैदा हुए या पूरी तरह से से पैदा हुए कीड़े स्कोर करें, जैसे डम्पी या लकवाग्रस्त, 'असामान्य लार्वा' के रूप में।

3. स्वचालित फसल (चित्र 3ए)

नोट: सॉफ्टवेयर दो स्थानों में रखे है: (1) ज़ेनोडो किसी भी प्रोग्रामिंग विशेषज्ञता की आवश्यकता नहीं है कि सॉफ्टवेयर12 के एक उपयोगकर्ता के अनुकूल संस्करण घरों. (2) Github हमारे embryoCropUI.py और screenCrop.py सॉफ्टवेयर13के लिए स्रोत कोड होता है, जो पायथन के साथ प्रवीणता की आवश्यकता होती है. डाउनलोड करने और कार्यक्रम के दोनों संस्करणों के संचालन के लिए विस्तृत निर्देश नीचे पाया जा सकता है.

  1. स्वचालित फसल भ्रूणCropUI निष्पादन योग्य संस्करण (उपयोगकर्ता के अनुकूल संस्करण) का उपयोग कर
    1. भ्रूणCropUI कार्यक्रम का उपयोग करने के लिए, पहले ज़ीनोडो से कार्यक्रम डाउनलोड (https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w)12.
      1. MacOS या प्रोग्राम के Windows स्वरूप संस्करण डाउनलोड करें (ध्यान दें कि MacOS संस्करण MacOS X10.11 या उच्चतर की आवश्यकता है)।
      2. परीक्षण और भ्रूणCropUI प्रोग्राम का उपयोग करने के लिए कदम से कदम अनुदेश प्रदान करता है जो निर्देश फ़ाइल (GUI[Instructions]zenodo]repoV2.docx)डाउनलोड करें।
      3. प्रोग्राम ठीक से मंच पर कार्य कर रहा है, तो परीक्षण करने के लिए test-files.zip डाउनलोड करें (निर्देश देखें).
    2. एक बार डाउनलोड, खोलना और भ्रूणCropUI निष्पादन योग्य खोजने के लिए नेविगेट करें (...]भ्रूणCropUI[WINDOWS]embryoCropUI]embryoCropUI.exe) या (...]भ्रूणCropUI[MacOS]embryoCropUI]embryoCropUI.exe) डबल क्लिक करें शुरू करने के लिए (या चुना 'के साथ खुला' टर्मिनल) और भ्रूणCropUI निष्पादन योग्य चलाते हैं.
    3. जीयूआई निष्पादन योग्य फसलों एक समय में देखने के एक 4D क्षेत्र. ऊपरी बाएँ हाथ के कोने में, फसल (मल्टी-tiff) के लिए विशिष्ट क्षेत्र लोड करने के लिए खुले बटन का चयन करें। यदि एक झगड़ा श्रृंखला फसल, कई आयामों के साथ (यानी, z, समय, चैनल), फ़ोल्डर के भीतर श्रृंखला में केवल पहली छवि लोड (एक टिफ श्रृंखला प्रति फ़ोल्डर).
    4. एक बार छवियों को लोड किया गया है, निम्नलिखित जानकारी निर्दिष्ट करें: z- स्लाइस की संख्या, (जेड), समय अंक की संख्या (टी), चैनलों की संख्या (सी), चैनल है कि डीआईसी या brightfield से मेल खाती है (पहली $1, दूसरा $2, आदि).
    5. छवियों पर चलाने के लिए अतिरिक्त प्रसंस्करण का चयन करें। कार्यक्रम बहाव सुधार, पृष्ठभूमि घटाव, और क्षीणन सुधार प्रदान करता है.
    6. GUI प्रॉम्प्ट में संसाधन प्रयासों का मार्गदर्शन करने के लिए पृष्ठभूमि घटाव और क्षीणन सुधार के लिए पैरामीटर्स निर्दिष्ट करें. पृष्ठभूमि घटाना के लिए, सार्थक संकेत के आकार को प्रतिबिंबित करने के लिए सबसे बड़ा सुविधा आकार परिभाषित करें; इस सुविधा का आकार पृष्ठभूमि के रूप में नहीं माना जाना चाहिए और एक विषम संख्या मान होना चाहिए। क्षीणता सुधार के लिए 0-1 से कोई मान इनपुट करें। क्षीणन सुधार मान मूल तीव्रता के प्रतिशत को दर्शाता है जो छवि वाले ऑब्जेक्ट की सबसे दूर गहराई पर रहता है.
      नोट: पृष्ठभूमि घटाव और क्षीणन सुधार एक साथ चलाया जाना चाहिए।
    7. छवि संग्रह क्रम (यानी, चैनल-z-समय (czt), या z-चैनल-समय (zct)) निर्दिष्ट करें।
    8. उपयोग किए जा रहे कैमरे के आधार पर छवियों के लिए माइक्रोन प्रति पिक्सेल निर्दिष्ट करें.
      नोट: पिक्सेल आकार ठीक से परिभाषित नहीं है, तो खराब छवि फसल हो जाएगा।
    9. नीचे बाएँ कोने पर चलाएँ का चयन करें. "फसल" लेबल वाला एक नया सबफ़ोल्डर उसी पथ में uncropped फ़ोल्डर के रूप में बनाया जाएगा; क्रॉप किए गए संस्करण इस स्थान पर सहेजे जाएँगे. फ़ाइल आकार के आधार पर, क्रॉपिंग सेकंड के भीतर मिनट के लिए पूरा करना चाहिए.
  2. screenCrop.py का उपयोग करस्वचालित फसल (बैच संस्करण ऊपर वर्णित भ्रूणCrop GUI के लिए वैकल्पिक;केवल अजगर प्रेमी उपयोगकर्ताओं)10,13
    1. screenCrop.py का उपयोग करने के लिए, बड़े डेटा सेट की क्रॉपिंग के लिए Python सॉफ़्टवेयर संस्करण बैच स्वरूप में क्लोन करता है या Github (github.com/renatkh/embryo_crop.git)से स्रोत कोड डाउनलोड करता है.
    2. एक उचित वर्चुअल परिवेश को कॉन्फ़िगर करने के लिए निर्देशों को पढ़ें और वर्णित फ़ाइल नामकरण सिस्टम का पालन करें; जिनमें से दोनों Github भंडार में README फ़ाइल में विस्तृत हैं: https://github.com/renatkh/embryo_crop/blob/master/README.md.
    3. एक बार पर्यावरण चर और नामकरण सम्मेलनों ठीक से स्थापित किया गया है, parameters.py खुला और पसंद के एक संपादक में screenCrop.py.
    4. स्रोत कोड को छुए बिना समायोज्य पैरामीटर संशोधित करने के लिए, parameters.py फ़ाइल संपादित करें.
      नोट: यह भी सीधे screenCrop.py के शीर्षक के भीतर पैरामीटर बदलने के लिए संभव है.
      1. यदि parameters.py कॉन्फ़िगरेशन फ़ाइल का उपयोग कर रहा है, तो use-configure सेटिंग को सही करने के लिए परिवर्तित करें। यदि screenCrop.py के भीतर सीधे संपादन का उपयोग कर रहे हैं, तो false पर use-configure सेटिंग छोड़ दें।
      2. parameters.py फ़ाइल के भीतर निम्न जानकारी का पता लगाएँ और इच्छित इमेजिंग पैरामीटर और फ़ाइल संरचना के अनुरूप संशोधन करें:
        1. loadFolder (पंक्ति 9): जिस पर फ़ाइलें संग्रहीत की जाती हैं ड्राइव करने के लिए बदलें (उदा., $:/, D://, आदि)
        2. दिनांक (पंक्ति 7): इमेजिंग सत्र के लिए फ़ाइलों वाले फ़ोल्डर में परिवर्तित करें. इसे CSV ट्रैकिंग फ़ाइल में "प्रयोग फ़ोल्डर नाम" के रूप में संदर्भित किया जाता है (निर्देश देखें).
        3. trackingFile (पंक्ति 11): CSV फ़ाइल में प्रयोग जानकारी संग्रहीत की जाती है, जिस पथ में बदलें.
        4. z (पंक्ति 13): z विमानों की संख्या के रूप में सेट करें।
        5. nT (line14): timepoints की संख्या के रूप में सेट करें।
        6. nWells (पंक्ति 19): इस्तेमाल कुओं की संख्या के रूप में सेट करें.
        7. pointVisits (पंक्ति 20): बिंदु यात्राओं की अधिकतम संख्या के रूप में सेट करें (ठीक है).
        8. पंक्ति 10 में वर्तमान में 'CV1000/' द्वारा कब्जा कर लिया स्थान और इनपुट बाहरी फ़ोल्डर फ़ाइल पथ में उपयोग किया जाता है। समस्याओं से बचने के लिए, निम्न कन्वेंशन का उपयोग करें: 'XXXXXXX/
        9. पंक्ति 12 में, फसली डेटा के लिए पक्ष अनुपात डेटा के भंडारण के लिए एक मान्य फ़ाइल पथ इनपुट करें.
        10. 15, 16, 17, और 18 इनपुट True/False में कि क्या छवियाँ निम्न संसाधन के माध्यम से जाएँ:
          1. इनपुट सच है या रेखा 15 पर बहाव सुधार के लिए गलत है।
          2. इनपुट सही या गलत पृष्ठभूमि के लिए रेखा 16 पर घटाना। सुविधा का आकार अनुभवजन्य रूप से विभिन्न मार्कर उपभेदों और पिक्सेल आकार के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए। यहाँ विन्यास में, सुविधा का आकार Germ-Layer तनाव के लिए 41 और Morphogenesis तनाव के लिए 201 के रूप में परिभाषित किया गया था. पृष्ठभूमि घटाना क्षीणन सुधार के साथ संयोजन के रूप में किया जाना चाहिए.
          3. इनपुट सही है या रेखा 17 पर क्षीणन सुधार के लिए गलत है।
          4. इनपुट सच है या रेखा 18 पर पूर्वकाल पीछे रोटेशन के लिए गलत है.
    5. एक बार सभी परिवर्तन किए गए हैं, फसल शुरू कर सकते हैं. ऐसा करने के लिए, screenCrop.py पर स्विच करें और उपकरण पट्टी में Play चिह्न का चयन करें, ड्रॉप-डाउन मेनू में इस रूप में चलाएँ का चयन करें
    6. के रूप में फसल एक बड़े डेटासेट के लिए पूरा करने के लिए कई घंटे लग सकते हैं (50 बिंदु का दौरा 18 z कदम, 3 चैनल, 31 timepoints), कंसोल विंडो में फसल की प्रगति को ट्रैक. एक बार फसल पूरा हो गया है, एक छोटी सी खिड़की को बचाने से पहले फसली छवियों के पूर्वावलोकन दिखाई देगा. प्रत्येक छवि के लिए 3 विकल्प हैं:
      1. सहेजें: छवि को बचाने के लिए अंतरिक्ष बार प्रेस अगर छवि ब्याज का कोई क्षेत्रों के साथ ठीक से फसली है काट दिया जा रहा है.
      2. एक्स: प्रेस एक्स अगर छवि ब्याज कटौती के क्षेत्रों में प्रतीत होता है; छवि यह अन्य छवियों से अलग करने के लिए नाम के सामने एक एक्स के साथ सहेजा जाएगा.
      3. हटाएँ:छवि ठीक से फसली नहीं है या भ्रूण संतोषजनक नहीं है, तो फसली छवि को नष्ट करने के लिए डी दबाएँ।
        नोट: छवियों (प्रोग्राम की पंक्ति 9 में परिभाषित) लोड फ़ोल्डर में "क्रॉप्ड" नाम के एक सबफ़ोल्डर के लिए सहेजा जाएगा।

4. दृश्य (चित्र 4)

नोट: OpenandCombine-embsV2.iJm10,12 एक ImageJ मैक्रो है कि एक विशिष्ट तनाव और हालत के लिए सभी छवियों से झगड़ा फ़ाइल देखने के लिए एक आसान निर्माण होगा. FIJI/ImageJ14की स्थापना,15 की आवश्यकता है. यह मैक्रो हमारी फ़ाइल संरचना के अनुसार चलता है; यह अन्य फ़ाइल संरचनाओं के साथ काम करने के लिए संशोधित करने की आवश्यकता होगी। उचित फ़ाइल संरचना और महत्वपूर्ण विचारों का विस्तृत विवरण के लिए एक गाइड जीयूई के अंत में पाया जा सकता है[Instructions]zenodo-repoV2.docx फ़ाइल पर ज़ेनोडो भंडार. कृपया इन निर्देशों के माध्यम से पूरी तरह से इमेजिंग से पहले पढ़ें ठीक से नाम और संरचना फ़ाइलों को इस मैक्रो के साथ सबसे अच्छा इंटरफेस करने के लिए. संदर्भ के लिए, हमारी फ़ाइल स्थान संरचना इस तरह दिखाई देरही है:
[:[cropped]Target]तनाव[Emb][Target]Emb]15 अंक अद्वितीय पहचानकर्ता [W]#F]T]#_Z]#_C].tif
i.e. [: [cropped]EMBD0001]GLS[Emb1]EMBD0001[Emb1]20140327T135219]W02F1[T01]01]C1.tif

  1. डाउनलोड करें OpenandCombine$embsV2 और GUI[Instructions]zenodo]repoV2.docx से ज़ीनोडो (https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w)
  2. निम्न जानकारी तैयार करें:
    -स्थान जहां छवि फ़ोल्डर्स (फसल के बाद) जमा हो जाती है।
    -छवि फ़ोल्डर नाम (ओं) संसाधित किया जा करने के लिए विशिष्ट स्थिति (ओं) के लिए (यानी, EMBD0002)। यह उपरोक्त उदाहरण में "लक्ष्य" के रूप में संदर्भित किया जाता है
    -A 15 अंक अल्फ़ा-न्यूमेरिक अद्वितीय पहचानकर्ता जो किसी दिए गए रात भर के प्रयोग के लिए विशिष्ट है-इस पहचानकर्ता डेटा अधिग्रहण फ़ोल्डर का नाम है (यानी, 20140402T140154) और अद्वितीय पहचानकर्ता अलग-अलग tiff फ़ाइल नाम में एम्बेडेड है (EMBD002[Emb1] 20140402T140154[W06F2]T01[01]C1) उस दिन पर छवि वाले प्रत्येक भ्रूण के लिए। मैक्रो एक ही तारीख पर प्राप्त भ्रूण के लिए जाँच करने के लिए इस पहचानकर्ता का उपयोग करता है और दोहराया शर्तों को इकट्ठा कर सकते हैं, अलग दिनांक के साथ, अलग ImageJ फ़ाइलों में.
  3. ImageJ खोलें, और खींचें-और-ड्रॉप मैक्रो फ़ाइल, OpenandCombine-embsV2.izm,ImageJ पट्टी करने के लिए, या सीधे मैक्रो खोलें।
  4. एक बार मैक्रो खुला है, लाइनों 3 और 4 का पता लगाएं. (अनुभाग 4.2) में एकत्रित जानकारी निम्न चरणों के अनुसार इनपुट करें:
    1. पंक्ति 3 (RNAL) में, संसाधित किए जाने वाले छवियों के लिए लक्ष्य नाम इनपुट करें. इनपुट प्रत्येक लक्ष्य में निम्न संरचना newArray("XXXXXXXX/"); कोटेशन शामिल हैं. एक बार में कई शर्तों को चलाने के लिए, एक अल्पविराम के साथ अलग और कोष्ठक के भीतर सभी लक्ष्य नाम रखने के लिए (यानी, newArray("EMBD0000/","EMBD0001/","EMBD0002/" ).
    2. पंक्ति 4 (दिनांक) में, इनपुट 15 अंक ों alpha-numeric अद्वितीय पहचानकर्ता कोटेशन में, उदाहरण के लिए newArray("20140402T140154").
  5. मैक्रो विंडो के निचले बाएँ पर चलाएँ दबाएँ. एक विंडो दिखाई देगी, जो फसली छवि फ़ोल्डर (4.4.1 में निर्दिष्ट) वाले बाहरी फ़ोल्डर में नेविगेट करने के लिए एक संकेत लॉन्च करेगी।
  6. एक बार चयनित, एक और खिड़की दिखाई देगा, जो इमेजिंग पैरामीटर के विनिर्देश की अनुमति देगा.
    1. चैनलों की संख्या, $ स्लाइस की संख्या, संकलित छवियों लेबलिंग में उपयोग किए गए पाठ के लिए फ़ॉन्ट आकार, और प्रत्येक चैनल के लिए रंग दर्ज करें.
    2. सभी चैनलों में ऑटो विषम की जाँच करें।
  7. सभी पैरामीटर निर्दिष्ट हो जाने के बाद, विंडो के निचले भाग पर ठीक क्लिक करें. समग्र फ़ाइल को इकट्ठा करने के लिए शुरू हो जाएगा; यह कई मिनट लग जाएगा, प्रति शर्त, पूरा करने के लिए.
  8. एक बार पूरा, यदि वांछित खुला छोड़ दिया जाता है कि फ़ाइलों की समीक्षा करें. उन्हें सहेजे बिना बंद किया जा सकता है, क्योंकि मैक्रो ने फ़ाइलों को पहले से ही नए बनाए गए फ़ोल्डर में सहेजा है जिसका नाम निम्न तरीके से है: बाहरी फ़ोल्डर नाम (अनुभाग 4.5 के संकेत में निर्दिष्ट) + "-फिजी-प्रक्रिया-प्रसंस्कृत-आउटपुट" (यानी, [:]: croped-fiजी-processed-output[EMBD0002]GLS]20140402T140154.tif)।

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Representative Results

सी एलिगॉन्स भ्रूणीय विकास पर आण्विक क्षोभ के प्रभाव की विशेषता में एक महत्वपूर्ण चुनौती यह है कि भ्रूणों के लिए 20 डिग्री16पर दीर्घीकरण के अंत तक प्रगति करने में लगभग 10 घंटा लगते हैं . एक अर्द्ध उच्च throughput विधि जिसमें भ्रूण के बड़े सहगण एक साथ छवि किया जा सकता है इस समय पैमाने पर घटनाओं के लिए उपयोगी है क्योंकि यह प्रत्येक शर्त के लिए एक पर्याप्त पहनावा आकार के साथ समानांतर में कई स्थितियों के इमेजिंग अनुमति देता है सक्षम करने के लिए मात्रात्मक विश्लेषण (चित्र 1ए)

अर्ध-उच्च थ्रूपुट इमेजिंग विधि और बहु-मार्कर उपभेदों
यहाँ वर्णित अर्द्ध-उच्च-थ्रूपुट इमेजिंग विधि (चित्र 1Bमें रेखांकित), एक 384-वेल ग्लास बॉटम प्लेट कार्यरत है; बहु अच्छी तरह से प्रारूप अप करने के लिए अनुमति देता है 14 शर्तों समानांतर में arrayed और कुओं के छोटे आकार खोज क्षेत्र constrains, उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए भ्रूण युक्त क्षेत्रों की पहचान को सरल बनाने. यहाँ, एक confocal स्कैनर बॉक्स का इस्तेमाल किया गया था, एक microlens बढ़ाया दोहरी Nipkow कताई डिस्क, एक 512 x 512 EM-CCD कैमरा, एक उच्च परिशुद्धता ऑटो XY-स्टेज (नामित संकल्प 0.1 $m) और motorized z-अक्ष नियंत्रण (नामित संकल्प 0.1 $m) के साथ सुसज्जित. हालांकि, प्रोटोकॉल सटीक बिंदु का दौरा क्षमताओं और एक बहु अच्छी तरह से थाली को समायोजित कर सकते हैं कि एक मंच अनुकूलक के साथ किसी भी confocal माइक्रोस्कोप के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. इस विधि को विकसित करने में एक महत्वपूर्ण चुनौती एक ही विकासात्मक चरण में भ्रूण की एक प्लेट उत्पन्न करने के लिए एक साधन तैयार कर रहा था ताकि विकास की संपूर्णता प्रत्येक क्षेत्र में भ्रूण के सभी के लिए कब्जा कर लिया जा सकता है. यह एक चुनौती है क्योंकि इमेजिंग प्लेट पर पहले व्यवस्थित भ्रूण विकसित होते रहेंगे, जबकि बाद में नमूनों को विभाजित किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप कुओं में मचान की ढाल होती है। इस मुद्दे को दरकिनार करने के लिए, प्रारंभिक चरण भ्रूण (2-8 सेल चरण) का चयन किया जाता है और विच्छेदन मीडिया और इमेजिंग प्लेट को बर्फ पर रखें; यह भ्रूण उत्पत्ति को तब तक नहीं करता जब तक कि भ्रूणीय व्यवहार्यता10को कोई प्रभाव न हो तब तक सभी शर्तें पूरी नहीं हो जातीं . समय है कि भ्रूण 1 घंटे के लिए बर्फ पर बैठते हैं सीमित करने के लिए, दो शोधकर्ताओं के विच्छेदन एक साथ प्रदर्शन, जो के बारे में 50 मिनट में 14 विभिन्न स्थितियों के सेट अप के लिए अनुमति देता है. विच्छेदन के बाद, प्लेट भ्रूण और कुओं उच्च आवर्धन इमेजिंग के लिए उपयुक्त भ्रूण के समूहों के साथ खेतों का पता लगाने के लिए कम आवर्धन पर पूर्व स्कैन कर रहे हैं तलछट के लिए 1 मिनट के लिए 600 x ग्राम पर काता है; बिंदु यात्रा स्थानों को चिह्नित कर रहे हैं. भ्रूण एक तापमान नियंत्रित कमरे में रात भर एक 60x तेल विसर्जन 1.35 एनए लेंस का उपयोग कर फिल्माया जाता है. नमूने एक 4 अच्छी तरह से 4 अच्छी तरह से क्षेत्र में कॉन्फ़िगर कर रहे हैं ताकि एक प्रयोग में प्रयोग किया जाता है कि थाली की सतह क्षेत्र एक 22 x 22 मिमी2 मानक coverslip, जो एक 60x तेल उद्देश्य के उपयोग के लिए अनुमति देता है के बराबर है. इमेजिंग की शुरुआत से पहले इस क्षेत्र में तेल के समान प्रसार सफल दीर्घकालिक छवि अधिग्रहण के लिए महत्वपूर्ण है. विकासशील भ्रूण संवेदनाहारी युक्त एक समाधान में छवि रहे हैं; यह सुनिश्चित करता है कि जब अच्छी तरह से हैच के भीतर बड़े भ्रूण, उनके आंदोलन आसन्न युवा भ्रूण है कि छवि की जा रही है की स्थिति को बाधित नहीं करता है. अंडकोश की अभेद्य प्रकृति के कारण, संवेदनाहारी अंडे से निकलने से पहले आंदोलन को प्रभावित नहीं करता है। इन शर्तों के तहत, 3 डी समय चूक डेटा एक रात भर प्रयोग में 80-100 भ्रूण की कुल के लिए 3 चैनलों में एकत्र किया जाता है (नीचे और अधिक चर्चा की).

C. एलिगन भ्रूणीय विकास दो चरणों में होता है। सबसे पहले, सेल डिवीजन के 10 राउंड सेल भाग्य विनिर्देश के साथ मिलकर एक 6 घंटे की अवधि17से अधिक तीन रोगाणु परतों (एक्टोडर्म, मध्यजनऔर एंडोडर्म) उत्पन्न करते हैं। निम्नलिखित 7 ज में, morphogenetic घटनाओं विभेदित ऊतकों के गठन ड्राइव8,16. विकास के इन दो पहलुओं पर कब्जा करने के लिए, हमने कस्टम उपभेदों की एक जोड़ी का निर्माण किया, जर्म लेयर और मॉर्पोजेनेसिस10 (चित्र 2ए)का निर्माण किया, और दोनों उपभेदों से भ्रूण की छवि के लिए अर्द्ध उच्च-थ्रूपुट प्रोटोकॉल का उपयोग किया। जर्म परत तनाव ट्रांसजीन-एनकोडेड फ्लोरोसेंट प्रोटीन को व्यक्त करता है जो केंद्रको एक्टोडर्म, मेसोडर्म और एंडोडर्म में लाल, पीले और हरे रंग में चिह्नित करता है। इस तनाव में तीन रिपोर्टर ट्रांसजीन होते हैं: (1) PHA-4:GFP को व्यक्त करने वाला एक ट्रांसजीन जो आंत और ग्रसनी (ग्रीन एंडोडर्म)10,18,19, (2) एक ट्रांसजीन को व्यक्त करता है एपिडरमिस में और न्यूरॉन्स (लाल बहिर्चर्म) के $1/3 में mCherry-हिस्टोन संलयन; चित्र ाााःा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा Morphogenesis तनाव दो transgenes है कि व्यक्त: (1) एक हरे उपकला जंक्शन मार्कर (DLG-1::GFP) बाह्य त्वचा में, और (2) एक mCherry-टैग प्लाज्मा झिल्ली मार्कर, में $1/3 न्यूरॉन्स के $1 (Pcnd-1 प्रमोटर; चित्र 2ए) . RNAi की प्रभावशीलता को बढ़ाने के लिए, दोनों उपभेदों भी RNAi-संवेदनशीलता उत्परिवर्तनों की एक जोड़ी को शामिल करने के लिए इंजीनियर थे(nre-1(hd20) लिन-15b (hd126)20. ये भ्रूण विकास के लिए आवश्यक 2,000 जीन के एक बड़े पैमाने पर RNAi आधारित स्क्रीन प्रदर्शन के लक्ष्य के साथ निर्माण किया गया. हालांकि, उपभेदों की इस जोड़ी को भी उत्परिवर्ती में विकासात्मक दोषों का आकलन करने के लिए एक मोटे तौर पर उपयोगी मानकीकृत मंच का गठन होगा, और विकास में विभिन्न प्रोटीन की भूमिकाओं के अधिक विस्तृत विश्लेषण के लिए.

इस अर्द्ध उच्च थ्रूपुट प्रारूप में डेटा संग्रह के लिए, इन उपभेदों के साथ, हरे, लाल और उज्ज्वल क्षेत्र z-श्रृंखला (18 x 2 डिग्री 2अंतराल) एकत्र कर रहे हैं, हर $ 20 मिनट, एक 16 डिग्री सेल्सियस तापमान नियंत्रित कमरे में 10 एच की अवधि के लिए; यह रन के दौरान 21-23 डिग्री सेल्सियस के बीच माइक्रोस्कोप बनाए रखता है। 20 मिनट के समय अंतराल हमें प्रति प्रयोग भ्रूण (बिंदु का दौरा) के 50 क्षेत्रों छवि के लिए अनुमति देता है. उपयोगकर्ता अपने प्रयोगात्मक उद्देश्यों के अनुरूप अधिक बिंदु विज़िट के साथ कम पॉइंट विज़िट या लंबे अंतराल के साथ कम अंतराल पर अधिग्रहण अनुकूलित कर सकते हैं. इन उपभेदों के लिए, प्रारंभिक विकास timepoints क्योंकि ऊतक विशिष्ट पत्रकारों मार्कर अभिव्यक्ति ड्राइविंग के लिए मध्य से देर gastrulation तक व्यक्त करने के लिए शुरू नहीं कर रहे हैं छवि नहीं कर रहे हैं. इस प्रारंभिक चरण के दौरान, कुओं कम आवर्धन (10x) पर स्कैन किया गया और क्षेत्रों उच्च आवर्धन इमेजिंग के लिए चुना जाता है. एक से अधिक प्रारंभिक चरण भ्रूण युक्त क्षेत्रों का चयन की सिफारिश की है, लेकिन क्षेत्रों से बचने जहां भ्रूण आंशिक रूप से ओवरलैप कर रहे हैं, अत्यधिक भीड़, या अच्छी तरह से के चरम किनारे पर पाए जाते हैं. रात भर 60x इमेजिंग के बाद, एक कम आवर्धन (10x) पूरी अच्छी तरह से स्कैन निर्धारित करने के लिए किया जाता है कि क्या भ्रूण सामान्य उपस्थिति के साथ हैच (WT), दृश्य असामान्यताओं के साथ हैच (लार्वल असामान्य), या प्रत्येक शर्त का आकलन के लिए भ्रूण घातक हैं ( चित्र 1B) . यह चरण एक बड़ी आबादी में घातकता का आकलन करने के लिए समानांतर में प्लेटें स्थापित करने के लिए एक आसान विकल्प के रूप में कार्य करता है; पूरी अच्छी तरह से 10x पोस्ट स्कैन प्रति हालत 50-80 भ्रूण पर भ्रूण घातक डेटा प्रदान करता है. रन के बीच नियंत्रण के लिए जनसंख्या भ्रूण घातकता डेटा की तुलना करने के लिए इस उपाय का उपयोग करना एक उपयोगी नियंत्रण है कि उपभेदों और पर्यावरण की स्थिति और प्रसंस्करण के कदम के स्वास्थ्य के संबंध में स्थिरता सुनिश्चित करता है. जब संयोजन में छवि, दो कस्टम रिपोर्टर उपभेदों सेल भाग्य विनिर्देश, पृष्ठीय intercalation, epidermal संलग्नक, बढ़ाव, और neurogenesis (प्रतिनिधि) सहित सबसे प्रमुख विकास की घटनाओं के लिए जानकारीपूर्ण readouts प्रदान करते हैं नियंत्रण छवियों चित्र 2ठमें दिखाए जाते हैं, यह भी वांग एट अल10देखें।

डेटा प्रसंस्करण: स्वचालित भ्रूण फसल और अभिविन्यास
हमारे इमेजिंग प्रोटोकॉल के साथ, प्रत्येक उच्च संकल्प इमेजिंग क्षेत्र 1 और 5 भ्रूण के बीच होता है; ये भ्रूण बेतरतीब ढंग से उन्मुख होते हैं और अक्सर एक दूसरे के निकट तुरंत तैनात होते हैं। पारंपरिक भ्रूण बढ़ते तकनीकों का उपयोग कर एकत्र डेटा एक ही चुनौतियों से ग्रस्त है. बाद के दृश्य और विश्लेषण के लिए डेटा तैयार करने के लिए, काफी हाथ पर हेरफेर फसल और भ्रूण दृश्यों उन्मुख करने के लिए आवश्यक है, साथ ही पूर्व प्रक्रिया करने के लिए उन्हें पृष्ठभूमि घटाना, बहाव के लिए सही है, और संकेत क्षीणन के लिए क्षतिपूर्ति गहराई के साथ. इस प्रक्रिया को कारगर बनाने के लिए, एक कस्टम भ्रूण फसल कार्यक्रम बनाया गया था जो प्रत्येक भ्रूण को व्यापक क्षेत्र से अलग और उन्मुख करता है(चित्र 1C, चित्र 3)। इस कार्यक्रम के एक उपयोगकर्ता के अनुकूल के रूप में पैक किया गया है, चित्रमय यूजर इंटरफेस के साथ खड़े अकेले कार्यक्रम (GUI, सबसे इमेजिंग प्लेटफार्मों से डेटा के साथ संगत) कि भ्रूण के एक क्षेत्र के एक 3 डी समय चूक अनुक्रम में ले जा सकते हैं, और यह अलग-अलग झगड़ा श्रृंखला में प्रक्रिया क्षेत्र में प्रत्येक भ्रूण के लिए (चित्र 3ठ , https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w पर उपलब्ध )10,12. GUI (embryoCropUI.py) के लिए Python स्रोत कोड, और इस प्रोग्राम (screenCrop.py) का एक बैच संस्करण GitHub (https://github.com/renatkh/embryo_crop.git)10,13पर अनुभवी Python उपयोगकर्ताओं के लिए भी उपलब्ध हैं. इस प्रोग्राम की मुख्य कार्यक्षमता पूर्ववर्ती-पश् च अक्ष के साथ भ्रूण का पता लगाना, फसल और उन्मुख करना है। इसके साथ ही, पृष्ठभूमि घटाव, क्षीणन सुधार, और बहाव सुधार वैकल्पिक समायोज्य सेटिंग्स का उपयोग कर डेटासेट पर किया जा सकता है।

संक्षेप में, स्वचालित फसल सॉफ्टवेयर पुनरावृत्तीय उज्ज्वल क्षेत्र छवियों से प्राप्त एक द्विआधारी मुखौटा में अलग-अलग भ्रूण का पता लगाता है और क्रमिक रूप से सभी चैनलों से भ्रूण फसलों और पूर्वकाल-पोस्टर अक्ष के साथ छवियों को उन्मुख करता है(चित्र 3) बी, पहले वांग एट अल10में वर्णित है. फसल से पहले, सॉफ्टवेयर बहाव के लिए सही है, पृष्ठभूमि subtracts और प्रत्येक फ्लोरोसेंट चैनल (वैकल्पिक) में गहराई क्षीणन सुधार करता है. द्विआधारी मुखौटा प्राप्त करने के लिए, सॉफ्टवेयर चमकदार क्षेत्र छवियों के लिए Canny बढ़त का पता लगाने21 लागू होता है, तीन केंद्रीय विमानों की अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण करता है और छोटे छेद में भरता है. एल्गोरिथ्म द्विआधारी मास्क बाह्यरेखा के एक भाग के लिए कैसिनी अंडाकार फिटिंग द्वारा अलग-अलग भ्रूण का पता लगाता है (चित्र 3ठ, 3Cदेखें)। अंडाकार को इसके मुख्य अक्ष के साथ संरेखित करने के बाद, सॉफ्टवेयर पृथक भ्रूण के प्रत्येक आधे हिस्से में लाल फ्लोरोसेंट तीव्रता को मापता है और भ्रूण को इस तरह घुमाता है कि लाल तीव्रता बाईं ओर उन्मुख होती है, जो भ्रूण को दोनों के लिए बाईं ओर पूर्वकाल डालता है इस कार्य में प्रयुक्त रिपोर्टर उपभेदों (चित्र 3डी) इस सॉफ्टवेयर के पायलट से पता चला कि ज्यादातर भ्रूण कुशलता से प्रत्याशित के रूप में फसली थे. मामूली इमेजिंग मुद्दों, जैसे भ्रूण बहाव, अस्थायी फोकल विमान हानि (तेल में बुलबुले के कारण), या भ्रूण की भीड़ क्षेत्रों आम तौर पर सफल फसल को बाधित नहीं किया. हालांकि, क्षेत्रों के लिए जहां भ्रूण के बड़े clumps थे (ज में कुछ हद तक overlapping), भ्रूण है कि काफी इमेजिंग विमान के भीतर झुका रहे थे (में$), लंबी अवधि के फोकल विमान हानि, या भ्रूण है कि आंशिक रूप से कटऑफ थे, सफल फसल हमेशा नहीं था हासिल. इन मुद्दों को आसानी से डेटा अधिग्रहण चरण के दौरान बेहतर क्षेत्र चयन द्वारा दरकिनार किया जा सकता है। कुल मिलाकर, पूर्व प्रसंस्करण डेटा इस अर्द्ध उच्च throughput विधि के साथ एकत्र या पारंपरिक बढ़ते तरीकों का उपयोग कर visualizing और भ्रूण डेटासेट का विश्लेषण करने के लिए एक उपयोगी पहला कदम है.

छवि संग्रह और डेटा प्रसंस्करण विधियों का सत्यापन: 40 पूर्व निर्धारित जीनों के नीचे दस्तक के बाद भ्रूण विकास कल्पना
इस अर्द्ध उच्च throughput छवि संग्रह विधि और कस्टम फसल शासन को मान्य करने के लिए, एक छोटे RNAi स्क्रीन कस्टम उपभेदों में प्रदर्शन किया गया था, सेल भाग्य विनिर्देश और morphogenesis में पहले से वर्णित कार्यों के साथ 40 जीन के खिलाफ निर्देशित ( वांग, Ochoa, Khaliullin और उनके सहयोगियों द्वारा वर्णित10,11). ऐसा करने के लिए, dsRNA प्रत्येक लक्ष्य के खिलाफ उत्पन्न किया गया था, प्रत्येक तनाव से L4 जानवरों इंजेक्शन, 20-24 घंटे इंतजार कर रहे थे, और फिर बाहर विच्छेदन और छवि भ्रूण ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग कर (पूर्ण डेटासेट के लिए10,11). आरएनएई द्वारा विकासात्मक फीनोटाइप्स प्राप्त करने के लिए मातृ और युग्मज जीन अभिव्यक्ति दोनों के निषेध की आवश्यकता होती है। विकासात्मक जीनों को मातृरूप से व्यक्त किया जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप प्रोटीन उत्पादों को भ्रूण में लोड किया जा सकता है , या भ्रूण में युग्मनज रूप से व्यक्त किया जा सकता है , या कई मामलों में10,22,23दोनों . इंजेक्शन और भ्रूण फिल्माने के बीच का समय मातृ और युग्मनज रूप से व्यक्त की गई आबादी को प्रभावी ढंग से लक्षित करने के लिए महत्वपूर्ण चर है; समय इंजेक्शन dsRNA की दोनों राशि है कि भ्रूण में भरी हुई है युग्मनज अभिव्यक्ति24 और मातृ प्रोटीन की कमी की हद को रोकने के लिए निर्धारित करता है. dsRNA इंजेक्शन के बाद, लक्षित जीन के लिए इसी मातृ MRNA निम्नीकृत हो जाता है और एक प्रासंगिक समय अंतराल में खत्म नहीं होता है. पहले से मौजूद प्रोटीन की कमी के लिए भ्रूण उत्पादन की आवश्यकता होती है, जो मातृ प्रोटीन को रोगाणुनलाइन ऊतकों से भ्रूण बनाने में लोड करके बाहर निकालता है। 20 डिग्री सेल्सियस पर 20-24 ज लगातार मातृ कमी की अनुमति देता है कि कम से कम ऊष्मायन समय है; मातृ अवक्षय बाद में समय बिंदु पर बेहतर हो जाता है (यानी, इंजेक्शन के बाद 36-42 एच)। भ्रूण में लोड किया गया है कि इंजेक्शन dsRNA की मात्रा तय कैसे प्रभावी युग्मनज जीन अभिव्यक्ति की रोकथाम हो जाएगा. इंजेक्शन के बाद लगभग 5-10 एच भरी हुई आरएनए की मात्रा, जब इंजेक्शन सामग्री वाले भ्रूण पहले निषेचित होते हैं, उसके बाद गिरावट आते हैं। हमारे अनुभव में, इंजेक्शन के बाद 24 एच एक इष्टतम समय बिंदु है, जिसमें मातृ प्रोटीन की कमी और युग्मनज जीन अभिव्यक्ति का निषेध दोनों प्रभावी हैं। इस काम में इस्तेमाल कस्टम रिपोर्टर उपभेदों में phenotypes के विश्लेषण, 40 परीक्षण जीन के सेट भर में, पता चला है कि हमारे संयुक्त प्रोटोकॉल सेल भाग्य में शामिल जीन की एक व्यापक स्पेक्ट्रम भर में अलग, अत्यधिक reprodduible हस्ताक्षर phenotypes मिले विनिर्देश और रूपजनन (वांग एट अल10देखें); पूरा डेटासेट उपलब्ध है11). इस डेटा का एक उदाहरण के रूप में, अभी भी नियंत्रण के लिए चार अलग भ्रूण की छवियों, pha-4 (RNAi), पाल-1 (RNAi), और रोगाणु परत रिपोर्टर तनाव में mex-3 (RNAi) चित्र 4एमें दिखाए गए हैं. 40-जीन RNAi स्क्रीन में मनाया phenotypes के एक अधिक व्यापक चर्चा के लिए, वांग एट अल10 देखें

ImageJ मैक्रो: संकलन और किसी दिए गए शर्त के लिए सभी डेटा का दृश्य
व्यक्तिगत झगड़ा ढेर से भ्रूण की बड़ी संख्या के दृश्य थकाऊ और समय के माध्यम से काम करने के लिए ले जा सकता है. हमारे प्रारंभिक प्रयास से, और 400 अलग-अलग भ्रूण कस्टम स्वचालित फसल कार्यक्रम के ऊपर वर्णित का उपयोग कर अलग-थलग कर दिया गया। प्रथम-पास विश्लेषण को गति देने के लिए, हमने एक ImageJ मैक्रो का निर्माण किया है, जो किसी दिए गए तनाव पृष्ठभूमि में आरएनएई स्थिति के लिए छवि वाले सभी भ्रूणों की एक सरणी उत्पन्न करता है (चित्र 4ठ)। सरणी में प्रत्येक भ्रूण के लिए, एक brightfield छवि और एक अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण छवि साथ-साथ प्रस्तुत कर रहे हैं, प्रत्येक समय बिंदु के लिए, एक समग्र फिल्म फ़ाइल उत्पन्न करने के लिए. जबकि इस मैक्रो हमारी फ़ाइल संरचना के साथ कार्य करने के लिए लिखा गया था, यह उपयोगकर्ता की फ़ाइल संरचना को समायोजित करने के लिए संपादित किया जा सकता है. सर्वोत्तम परिणामों के लिए, हालांकि, उपयोगकर्ताओं को प्रोटोकॉल में उल्ट किए गए नामकरण और फ़ाइल संरचना कन्वेंशनों का पालन करना चाहिए (Python और ImageJ अनुप्रयोग नामकरण कन्वेंशनके लिए अधिक विशिष्टके लिए ज़ेनोडो या Github README फ़ाइलें देखें). ImageJ संसाधित डेटा के सभी देखने के लिए और 40-जीन परीक्षण सेट के लिए मनाया phenotypes के अधिक में गहराई से विश्लेषण प्राप्त करने के लिए, कृपया Dryad डेटाबेस10,11में जमा डेटा देखें. इस ImageJ दृश्य प्रारूप समग्र phenotype और उसके penetrance के तेजी से मूल्यांकन सक्षम बनाता है, और यह आसान इस तरह के मलबे या फोकल विमान के नुकसान की उपस्थिति के रूप में डेटा गुणवत्ता के मुद्दों, झंडा करने के लिए बनाता है. कुल मिलाकर, अर्द्ध उच्च throughput डेटा अधिग्रहण विधि, फसल कार्यक्रम और ImageJ दृश्य उपकरण, कस्टम रिपोर्टर उपभेदों के साथ संयुक्त के संयोजन, बहुत भ्रूण विकास का अध्ययन करने के लिए बड़े पैमाने पर प्रयासों की सुविधा.

Figure 1
चित्र 1. उच्च सामग्री इमेजिंग विधि, डेटा संसाधन प्रक्रिया, और आवश्यक उपकरणों का अवलोकन. (क)यहाँ वर्णित अर्ध-उच्च-थ्रूपुट बहु-वेल इमेजिंग दृष्टिकोण में सी एलिगन भ्रूणों को माउंट करने के लिए मानक अगारोस पैड आधारित विधि की विशेषताओं की तुलना। (ख)भ्रूणीय विकास की निगरानी के लिए अर्ध-उच्च-थ्रूपुट विधि का अवलोकन। विवरण के लिए पाठ देखें. (ग)डेटा प्रोसेसिंग और दृश्यावलोकन उपकरणों का अवलोकन, जिनका उपयोग पारंपरिक अगारोस पैड-आधारित बढ़ते प्रक्रिया या अर्द्ध-उच्च-थ्रूपुट मल्टी-वेल प्लेट-आधारित विधि का उपयोग करके प्राप्त किए गए डेटा पर किया जा सकता है, जिसे यहां वर्णित किया गया है। एक क्षेत्र (बाएं) या एकाधिक 3 चैनल से एक एकल 3 चैनल समय चूक भ्रूण अनुक्रम, भ्रूण डेटा के 4 आयामी क्षेत्रों (दाएं) कस्टम फसल कार्यक्रम है, जो सबसे इमेजिंग प्लेटफार्मों पर कब्जा कर लिया डेटा के साथ संगत है का उपयोग कर संसाधित किया जा सकता है. प्रोग्राम का ग्राफ़िकल यूज़र इंटरफ़ेस (GUI) संस्करण उपयोगकर्ता के अनुकूल है और किसी भी प्रोग्रामिंग विशेषज्ञता की आवश्यकता नहीं है. screenCrop.py आवेदन पायथन विशेषज्ञता की आवश्यकता है, लेकिन यह क्षमताओं को जोड़ा गया है- अर्थात् कि यह बैच प्रारूप में फसल कर सकते हैं. इस कदम का उत्पादन कसकर फसली है, पूर्वकाल-पोस्टर उन्मुख भ्रूण tiff ढेर. एक ही शर्त से सभी डेटा कल्पना करने के लिए, एक ImageJ मैक्रो बनाया गया था कि प्रत्येक समय बिंदु पर प्रत्येक भ्रूण के लिए एक brightfield छवि और अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण दिखाने के लिए फसली, घुमाया झगड़ा ढेर compiles. (घ)पैनल अर्ध-उच्च-थ्रूपुट इमेजिंग प्रारूप के विच्छेदन और सेटअप के लिए आवश्यक आवश्यक उपकरणदिखा करता है। कुछ आकृति घटक वांग एट अल10से अनुमति के साथ पुनरुत्पादित हुए . कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2. सी एलिगेंस भ्रूणजनन के उच्च सामग्री इमेजिंग के लिए उत्पन्न कस्टम उपभेदों| (ए) स्केमेटिक्स जर्म लेयर (ऊपर) और मॉर्फोजेनेसिस (नीचे) उपभेदों के निर्माण के लिए उपयोग किए जाने वाले ट्रांसजीन्स को दर्शाते हैं। (बी)अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण पैनल Morphogenesis (ऊपर) और जर्म परत (नीचे) उपभेदों में विकासात्मक समय पाठ्यक्रम दिखाते हैं। वेंट्रल दृश्य दिखाया गया है, जैसा कि योजनाबद्ध (बाएं) में दिखाया गया है। समय अल्पविराम अवस्था (t ] 0) के सापेक्ष होता है, जो दोनों उपभेदों में आसानी से पहचाना जा सकता है। स्केल बार ] 10 डिग्री उ. वांग एट अल10से अनुमति के साथ पुनरुत्पादित चित्रा। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3. कस्टम फसल कार्यक्रम अलग और इमेजिंग क्षेत्रों से अलग-अलग भ्रूण उन्मुख। (A) Schematic कस्टम भ्रूण फसल कार्यक्रम की सुविधाओं को दिखाता है और इस कार्यक्रम तक पहुँचने के लिए दो विकल्पों पर प्रकाश डाला गया: एक उपयोगकर्ता के अनुकूल जीयूआई इंटरफ़ेस, जो कोई प्रोग्रामिंग विशेषज्ञता की आवश्यकता है और पर उपलब्ध है ज़ीनोडो (बाएं) और एक कार्यक्रम है, जो पायथन अनुभव की आवश्यकता है और Github (दाएं) पर उपलब्ध है की बैच फसल संस्करण. (बी)ग्राफिक स्वचालित फसल एल्गोरिथ्म को संक्षेप में प्रस्तुत करता है - एक द्विआधारी मुखौटा 8 बिट ब्राइटफील्ड छवियों से उत्पन्न होता है और अलग-अलग भ्रूणों का पता लगाया जाता है, उन्हें काट दिया जाता है, और पूर्वकाल-पश्च अक्ष के साथ उन्मुख किया जाता है। स्केल बार 10 डिग्री मी है।(सी) Schematics द्विआधारी मुखौटा में भ्रूण का पता लगाने के लिए पुनरावृत्ति के लिए इस्तेमाल किया प्रक्रिया विस्तार। (घ)बाह्य-पश्च अक्ष के साथ भ्रूणों को उन्मुख करने के लिए प्रयुक्त विधि का वर्णन करता है। पैनल बी-डी वांग एट अल10से अनुमति के साथ पुनरुत्पादित . कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4. कस्टम ImageJ मैक्रो प्रत्येक शर्त के लिए समग्र फ़ाइलें उत्पन्न करके RNAi स्क्रीनिंग डेटा के दृश्य को सक्षम बनाता है. (ए) 40-जीन परीक्षण सेट से तीन उदाहरण आरएनएआई शर्तों के लिए भ्रूण (वांग एट अल10देखें,11 पूर्ण डेटासेट के लिए) दिखाए जाते हैं (दाएं) जो प्रत्येक के लिए प्राप्त किए जाने वाले विशिष्ट हस्ताक्षर फीनोटाइप को हाइलाइट करते हैं हालत और प्रत्येक शर्त के भीतर phenotypes के reproducibility. पैनल वांग एट अल10से अनुमति के साथ अनुकूलित किया गया था. (बी) पैनल दिखाता है कि कैसे कस्टम ImageJ मैक्रो (OpenandCombine-embsV2.iZm) एक समग्र ImageJ फ़ाइल में एक दिया RNAi हालत से भ्रूण arrays कि प्रत्येक समय बिंदु पर प्रत्येक भ्रूण के लिए चमकीले क्षेत्र और अधिकतम तीव्रता अनुमानों arrays. केवल एक उदाहरण हाइलाइट किया गया है, जबकि यह मैक्रो एक ही बार में कई RNAi शर्तों के लिए डेटा संकलित कर सकते हैं। ImageJ मैक्रो ज़ेनोडो12पर उपलब्ध है। स्केल बार ] 10 डिग्री मी. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यह कार्य उन औजारों और विधियों के एक समूह का वर्णन करता है जो सी एलिगेंसमें भ्रूणीय विकास में जीनों के कार्य को परिपादित करने के लिए बड़े पैमाने पर प्रयासों को सक्षम करने के लिए विकसित किए गए थे . हमारे अर्द्ध उच्च throughput विधि एक ही प्रयोग में 80-100 भ्रूण के लिए 20 मिनट संकल्प पर भ्रूण विकास के 3 डी समय चूक इमेजिंग की अनुमति देता है. हालांकि इस प्रोटोकॉल किसी भी वांछित मार्कर तनाव (ओं) के साथ उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, यह काम भ्रूणजनन के दौरान घटनाओं की निगरानी के लिए विकसित दो कस्टम उपभेदों का उपयोग कर विधि की क्षमता को दर्शाता है: (1) एक रोगाणु परत रिपोर्टर तनाव, जिसमें ऊतक विशिष्ट प्रमोटरों एंडोडर, मध्याह्न और एक्टोडर्म न्यूक्लियस को चिह्नित करने के लिए फ्लोरोसेंट हिटोन की अभिव्यक्ति को ड्राइव करते हैं, और (2) एक रूपजनन रिपोर्टर तनाव, जो सेल-जंक्शन में फ्लोरोसेंट मार्करों की अभिव्यक्ति को ड्राइव करने के लिए एपिडर्मल और न्यूरोनल प्रमोटरों का उपयोग करता है और प्लाज्मा झिल्ली. दो उपभेदों इमेजिंग द्वारा, सेल भाग्य विनिर्देश और morphogenetic घटनाओं पर आणविक क्षोभ के परिणाम उल्लेखनीय विस्तार के साथ कब्जा किया जा सकता है. इस विधि द्वारा उत्पन्न डेटा की मात्रा द्वारा प्रस्तुत चुनौतियों का सामना करने के लिए, डेटा संसाधन और दृश्यकोव्यवस्थित करने के उद्देश्य से कस्टम उपकरण विकसित किए गए थे। पहला उपकरण 3 डी समय चूक दृश्यों में भ्रूण के एक क्षेत्र से बाहर व्यक्तिगत भ्रूण फसलों, जबकि भी एक मानक पूर्वकाल-पश्च अभिविन्यास और प्रदर्शन पृष्ठभूमि घटाव, बहाव सुधार, और क्षीणन सुधार करने के लिए भ्रूण घूर्णन. इस कार्यक्रम के एक उपयोगकर्ता के अनुकूल जीयूआई (https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w) के रूप में पैक किया गया था और स्रोत कोड और पायथन प्रेमी उपयोगकर्ताओं के लिए कार्यक्रम का एक और अधिक उन्नत batching संस्करण (github.com/renatkh/embryo_crop.git) प्रदान की जाती है10,12,13. अंत में, इस संसाधित डेटा को सार्थक स्वरूप में विज़ुअलाइज़ करने के लिए, एक ImageJ मैक्रो तैयार किया गया था; यह उपयोगकर्ता एक multipaneled फिल्म है, जो प्रत्येक समय बिंदु पर प्रत्येक भ्रूण के लिए एक brightfield और अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण से पता चलता है में एक दिया RNAi हालत से सभी भ्रूण कल्पना करने के लिए अनुमति देता है. साथ में, उपभेदों, प्रोटोकॉल, और डेटा प्रसंस्करण उपकरण, बड़े पैमाने पर एक और अधिक व्यावहारिक प्रयास में सी elegans भ्रूणजनन का अध्ययन करने के लिए प्रयास करते हैं।

जबकि पूरे पर लागू करने के लिए सीधा, अर्द्ध उच्च throughput अधिग्रहण विधि यहाँ वर्णित कुछ महत्वपूर्ण विवरण है, जो नीचे चर्चा कर रहे हैं पर ध्यान देने की आवश्यकता है. सबसे पहले, उपयोगकर्ताओं को सटीक बिंदु यात्रा क्षमता है कि एक बहु अच्छी तरह से प्लेट धारक के साथ outfitted किया जा सकता है के साथ एक confocal माइक्रोस्कोप के लिए उपयोग होना चाहिए. इस प्रोटोकॉल के लिए सबसे महत्वपूर्ण विचार यह है कि माइक्रोस्कोप एक तापमान नियंत्रित कमरे में बनाए रखा जाना है. जबकि कई माइक्रोस्कोप गर्मी करने की क्षमता है, सबसे मज़बूती से शांत नहीं कर सकते, इस प्रकार पर्यावरण के तापमान के लिए एक निरंतर सी elegans अनुकूल तापमान बनाए रखने के लिए अनुकूलित किया जाना है. इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए, इमेजिंग रूम 16 डिग्री सेल्सियस पर आयोजित किया जाता है। उपकरण का नमूना क्षेत्र इमेजिंग के दौरान 21-23 डिग्री सेल्सियस तक तपता है। कमरे के तापमान में उतार-चढ़ाव विकास के समय को प्रभावित कर सकते हैं और आसानी से बिंदु पर जाकर के दौरान फोकल विमान सटीकता को बदल सकते हैं और जितना संभव हो उतना बचा जाना चाहिए। ध्यान दें कि 23 डिग्री सेल्सियस से ऊपर के तापमान पर चलने से नियंत्रण स्थितियों के लिए भ्रूण घातकता में काफी स्पाइक हो सकता है और यह उचित नहीं है। एक अन्य महत्वपूर्ण विचार विच्छेदन के दौरान भ्रूण चयन और फैलाव है. पुराने भ्रूणों को इमेजिंग कुओं में स्थानांतरित करने से बचने के लिए सावधानी बरती जानी चाहिए, क्योंकि पशुओं को पैदा करने पर वे बगल के भ्रूणों को देखने से बाहर निकल जाते हैं; इस की घटना मीडिया में संवेदनाहारी के शामिल किए जाने से कम है. भ्रूण के फैलाव, भ्रूण के बड़े clumps से बचने के लिए, भी एक महत्वपूर्ण चर है. क्लंपिंग तब होती है जब भ्रूण को केशिका पिपेट में कुओं में स्थानांतरित किया जाता है जो बहुत पतली रूप से बाहर निकाले जाते हैं, या जब विच्छेदन के दौरान भ्रूण पर्याप्त रूप से तितर-बितर नहीं होते हैं। एक और विचार यह है कि बिंदु चयन और फोकल विमान ट्यूनिंग समय लगता है. इस प्रक्रिया के दौरान प्लेट बर्फ पर नहीं रखी जाती है, इसलिए भ्रूण तुरंत विकसित होने लगते हैं। कस्टम मार्कर इस अध्ययन में इस्तेमाल उपभेदों के लिए, वहाँ के बारे में एक 90 मिनट खिड़की के बाद प्लेट बर्फ से हटा दिया जाता है प्लेट स्कैनिंग और बिंदु चयन पूरा करने से पहले मार्करों व्यक्त किया जा करने के लिए शुरू होता है. यह इन उपभेदों के साथ हमारे साधन पर स्थापित करने के लिए पर्याप्त समय है, लेकिन अन्य माइक्रोस्कोप और उपभेदों अतिरिक्त समय चुनौतियों है कि समस्या निवारण की आवश्यकता होगी की पेशकश कर सकते हैं. अंत में, जिस विधि का वर्णन हम करते हैं, वह 20 मिनट के अंतराल पर 50 क्षेत्रों के z-स्टैक एकत्र करने के लिए 60x तेल उद्देश्य को रोजगार देता है। जैसा कि हम प्रकाश डाला, लौकिक संकल्प छवि खेतों की संख्या कम करके बढ़ाया जा सकता है. उदाहरण के लिए, 10 फ़ील्ड 4 मिनट के समय रिज़ॉल्यूशन पर छविबद्ध किया जा सकता है। अस्थायी संकल्प बढ़ाने के लिए एक दूसरा विकल्प एक कम आवर्धन, उच्च संख्यात्मक एपर्चर उद्देश्य का उपयोग करने के लिए है; इस मामले में, देखने के बड़े क्षेत्र स्थानिक संकल्प में केवल एक मध्यम कमी के साथ उच्च समय संकल्प पर भ्रूण की एक बड़ी संख्या के इमेजिंग की अनुमति देता है.

डेटा संसाधन और दृश्यावलोकन को बड़े पैमाने पर सक्षम करने के लिए, हमने कस्टम उपकरण बनाए और उन्हें स्वतंत्र रूप से उपलब्ध कराया. सबसे व्यापक रूप से उपयोगी उपकरण कस्टम फसल जीयूआई है, जो संचालित करने के लिए कोई प्रोग्रामिंग विशेषज्ञता की आवश्यकता है. जीयूआई बाहर फसल और विकास के सभी चरणों में भ्रूण उन्मुख करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और सभी मार्करों के साथ संगत है, यह न केवल विकासात्मक जीवविज्ञानियों के लिए उपयोगी बनाने, लेकिन यह भी जल्दी भ्रूण में प्रक्रियाओं का अध्ययन शोधकर्ताओं के लिए. क्योंकि जीयूआई का आउटपुट ठीक फसली है, उन्मुख, स्केल, बहाव-सुधार ित डेटा, डेटा आसानी से एक स्वचालित विश्लेषण पाइपलाइन में कीप किया जा सकता है, जिससे यह उपकरण अतीत और भविष्य के डेटा के विश्लेषण के लिए उपयोगी हो सकता है; यदि उपयुक्त उपभेदों का उपयोग किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप डेटा फ़ाइलों को मौजूदा स्वचालित विश्लेषण व्यवस्थाओं के लिए इनपुट के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, जैसे भ्रूणजनन संरेखण उपकरण25. कार्यक्रम का उपयोग करने के लिए, यह उपयोगकर्ताओं के लिए महत्वपूर्ण है कि फसल एल्गोरिथ्म प्रत्येक कदम और timepoint के लिए एकत्र किया जा करने के लिए एक brightfield या DIC छवि की आवश्यकता है अवगत होना करने के लिए. इसके अलावा, उपयोगकर्ताओं को ध्यान देना चाहिए कि पूर्वकाल-पश्च अभिविन्यास एल्गोरिथ्म रोगाणु परत रिपोर्टर और morphogenesis रिपोर्ट उपभेदों में लाल संकेत के वितरण के आधार पर संरचित है, इस काम में दिखाया गया है. इस प्रकार, अन्य मार्कर उपभेदों में एपी अभिविन्यास की सटीकता के लिए एक मामला द्वारा मामले के आधार पर मूल्यांकन किया जाना चाहिए. जीयूआई तीन अलग confocal इमेजिंग प्लेटफार्मों पर एकत्र डेटा के साथ परीक्षण किया गया है और बहु tiff ढेर और झगड़ा श्रृंखला के लिए बोर्ड भर में संगत है. उपयोगकर्ता के अनुकूल संस्करण के अलावा, जीयूआई के लिए स्रोत कोड और इस कार्यक्रम के एक बैच संस्करण भी उपलब्ध कराया गया है, चेतावनी है कि प्रोग्रामिंग अनुभव की आवश्यकता है के साथ, और फ़ाइल संरचनाओं और नामकरण सम्मेलनों का पालन करने की आवश्यकता होगी. अंत में, एक ImageJ प्रसंस्करण मैक्रो सभी भ्रूण के लिए कच्चे छवि ढेर लेने के लिए बनाया गया था, प्रत्येक RNAi हालत में, और एक जानकारीपूर्ण सरणी संकलन के लिए ब्राइटफील्ड और फ्लोरोसेंट अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण में उस हालत के लिए सभी भ्रूण दिखाने के लिए प्रत्येक समय बिंदु पर. यह उपकरण उपयोगकर्ता के विनिर्देशों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है और डेटा अन्वेषण और गुणवत्ता नियंत्रण मूल्यांकन सरल बनाने के लिए एक उपयोगी मैक्रो है।

साथ में, भ्रूण फसल और छवि प्रसंस्करण उपकरण यहाँ वर्णित के साथ अर्द्ध उच्च throughput फिल्माने विधि सी elegans भ्रूण विकास के विश्लेषण की सुविधा होगी म्यूटेंट, क्षोभ, और मार्कर उपभेदों की एक किस्म का उपयोग कर. हमारी अपनी प्रयोगशाला में, एक बड़े पैमाने पर स्क्रीन दो कस्टम इंजीनियर उपभेदों से फिल्म भ्रूण के लिए इन तरीकों को रोजगार के विकास के लिए आवश्यक 2,000 $ जीन के knockdown के बाद यहाँ वर्णित है, वर्तमान में चल रहा है. अंत में, इस प्रयास से डेटा भ्रूणजनन के दौरान सेल भाग्य विनिर्देश और morphogenetic घटनाओं को समझने के प्रयासों को बढ़ाने के लिए एक और संसाधन के रूप में काम करेगा.

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Disclosures

कोई नहीं

Acknowledgments

S.D.O. कैलिफोर्निया सैन डिएगो संस्थागत अनुसंधान और शैक्षणिक कैरियर विकास पुरस्कार के राष्ट्रीय सामान्य चिकित्सा विज्ञान के संस्थान द्वारा प्रायोजित विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया था (NIH/IRACDA K12 GM068524). ए.डी. और के.ओ. कैंसर अनुसंधान के लिए लुडविग संस्थान द्वारा समर्थित थे, जो भी उन्हें इस काम का समर्थन करने के लिए इस्तेमाल अनुसंधान धन के साथ प्रदान की. हम इस परियोजना के प्रारंभिक चरणों में उनकी सलाह के लिए एंड्रयू Chisholm के आभारी हैं, रोनाल्ड Biggs प्रारंभिक विधि विकास चरण के बाद इस परियोजना के लिए योगदान के लिए, और डेव Jenkins और एंडी Shiau समर्थन और छोटे अणु डिस्कवरी के लिए उपयोग के लिए समूह के उच्च सामग्री इमेजिंग प्रणाली.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aspirator Tube Assembly Drummond Scientific 2-000-000
Calibrated Pipette (25 mL) Drummond Scientific 2-000-025
Cell Voyager Software Yokogawa Electric Corp Included with CV1000
Conical Tube (15 mL) USA Scientific 1475-0501
CV1000 Microscope Yokogawa Electric Corp CV1000
Depression slide (3-well) Erie Scientific 1520-006
Dissection Microscope Nikon SMZ-645
Eppendorf Centrifuge 5810R Eppendorf 5811 07336
ImageJ/FIJI Open Source https://imagej.net/Fiji
M9 Buffer Lab Prepared https://openwetware.org/wiki/M9_salts
Microcentrifuge Tube (1.5 mL) USA Scientific 1615-5500
Microseal F-foil Seal Bio-Rad MSF1001
NGM Plates Lab Prepared http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html#d0e214
Scalpel #15 Bard Parker REF 371615
Sensoplate Plus, 384 Well, F-bottom, Glass Bottom Greiner Bio-One 781855
Tetramisole Hydrochloride Sigma Aldirch T1512-10G
Tweezers, Dumont #3 Electron Microscopy Sciences 0109-3-PO
U-PlanApo objective (10× 0.4 NA) Olympus 1-U2B823
U-PlanApo objective (60× 1.35 NA) Olympus 1-U2B832

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References

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विकासात्मक जीव विज्ञान अंक 152 सी elegans,भ्रूण उच्च सामग्री इमेजिंग भ्रूणजनन छवि प्रसंस्करण डेटा दृश्य विकास भ्रूण विकास अर्द्ध उच्च throughput
एक अर्द्ध उच्च-थ्रूपुट इमेजिंग विधि और डेटा विज़ुअलाइज़ेशन टूलकिट का विश्लेषण करने के लिए <em>C. elegans</em> भ्रूणीय विकास
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