Ett semi-högt dataflöde Imaging metod och data visualisering Toolkit för att analysera C. elegans embryonal utveckling

Summary

Detta arbete beskriver ett semi-högt dataflöde protokoll som tillåter samtidig 3D Time-lapse Imaging av embryogenes i 80-100 C. elegans embryon i en enda över natten springa. Dessutom ingår verktyg för bildbehandling och visualisering för att effektivisera dataanalysen. Kombinationen av dessa metoder med anpassade reporter stammar möjliggör detaljerad övervakning av embryogenes.

Abstract

C. elegans är det främsta systemet för systematisk analys av cellöde specifikation och morfogenetiska händelser under embryonal utveckling. En utmaning är att embryogenes dynamiskt utspelar sig under en period av ca 13 h; Denna halvdag långa tidsskalan har begränsat omfattningen av experiment genom att begränsa antalet embryon som kan avbildas. Här beskriver vi en semi-högt dataflöde protokoll som möjliggör samtidig 3D tidsförlopp avbildning av utvecklingen i 80 – 100 embryon vid måttlig tid upplösning, från upp till 14 olika förhållanden, i en enda övernattning. Protokollet är enkelt och kan implementeras av alla laboratorier med tillgång till ett Mikroskop med punkt besöks kapacitet. Nyttan av detta protokoll visas genom att använda den för att bilden två specialbyggda stammar uttrycker fluorescerande markörer optimerad för att visualisera viktiga aspekter av bakterie-skikt specifikation och morfogenes. För att analysera data, ett anpassat program som Beskär enskilda embryon ur ett bredare synfält i alla kanaler, z-steg, och tidpunkter och sparar sekvenser för varje embryo i en separat TIFF-stacken byggdes. Programmet, som innehåller ett användarvänligt grafiskt användargränssnitt (GUI), effektiviserar databehandling genom att isolera, förbehandling, och enhetligt orientera enskilda embryon som förberedelse för visualisering eller automatiserad analys. Levereras också är en ImageJ makro som sammanställer enskilda embryo data till en multi-panel fil som visar maximal intensitet fluorescens projektion och brightfield bilder för varje embryo vid varje tidpunkt. De protokoll och verktyg som beskrivs häri validerades genom att använda dem för att karakterisera embryonal utveckling efter knock-down av 40 tidigare beskrivna utvecklingsgener; denna analys visualiseras tidigare kommenterade utvecklingsmässiga fenotyper och avslöjade nya. Sammanfattnings, detta arbete Detaljer en semi-högt dataflöde Imaging metod tillsammans med ett beskärnings program och ImageJ visualiseringsverktyg som, när de kombineras med stammar som uttrycker informativa fluorescerande markörer, kraftigt accelererar experiment för att analysera embryonal utveckling.

Introduction

C. elegans embryot är ett viktigt modellsystem för mekanistisk cellbiologi och analys av cell öde specifikation och morfogenetiska händelser drivande embryonal utveckling^{1,2,3,4 ,5,6,7,8,9}. Hittills har mycket av karakteriseringen av både cellulära-nivå händelser och cell öde specifikation i embryot uppnåtts med hjälp av relativt hög temporala upplösning en-vid-en-tid bildbehandling experiment (dvs., förvärv varje 10-100 s) av embryon som uttrycker fluorescerande markörer. Även om det lämpar sig väl för händelser i storleksordningen sekunder till tiotals minuter, blir denna metod tekniskt begränsande för karakterisering av längre processer, på order av timmar till dagar. Embryonal utveckling från första klyvning till slutet av förlängningen tar ca 10 h. Vid denna tidsskala, semi-högt genomflöde metoder som skulle möjliggöra samtidig lägre tidsupplösning bildbehandling (dvs., förvärv på 5 – 20 min tidsintervall) av större kohorter av embryon, från olika förhållanden, skulle öppna upp en ny rad experiment; till exempel möjliggöra systematiska storskaliga screening insatser och analys av tillräckligt antal embryon för jämförelser av konsekvenserna av molekylära störningar.

Här beskriver vi en semi-högt genomflöde metod för övervakning C. elegans embryogenes som möjliggör samtidig 3D tidsförlopp avbildning av utvecklingen i 80 – 100 embryon, från upp till 14 olika förhållanden, i en enda övernattning. Protokollet är enkelt att genomföra och kan utföras av alla laboratorier med tillgång till ett Mikroskop med punkt besökande kapacitet. De viktigaste stegen i detta protokoll beskrivs i figur 1. I korthet, embryon dissekeras från dräktiga vuxna uttrycker fluorescerande markörer av intresse och överföra unga embryon (2-8 cell Stadium) till brunnar i en 384-brunn plattan för avbildning. I detta format, den relativt små väl storlek trattar embryon i ett smalt område, vilket underlättar identifieringen av fält som innehåller flera embryon för Time-lapse Imaging. För att bibehålla en ungefär synkron utveckling över kohorten av embryon, är dissektioner utförs i kylda medier och plattan hålls på is, vilket förhindrar betydande utveckling under den timlånga dissektion tidsfönster. Plattan överförs till Mikroskop och embryon är filmade i ett temperaturkontrollerat rum över natten, på 20 min tidsintervall, med hjälp av en 60x oljeimmersion 1,35 NA lins, att samla in hela z-Range i 2 μm steg. 50 fält, som var och en innehåller mellan 1 – 5 embryon, avbildas i en enda övernattning. Beroende på önskat experiment kan tidsupplösningen ökas (t. ex. bildtagning med 5 – 10 minuters mellanrum) genom att proportionellt minska antalet avbildade fält.

Med detta protokoll, även en enda över natten kör genererar en betydande mängd data (80-100 embryon utspridda över 50 fält) och större experiment kan snabbt bli ohanterliga med avseende på dataanalys. För att underlätta bearbetning, visualisering och effektivisera analys av dessa data, ett program byggdes för att beskära ut och orientera embryon och utföra Pre-processing steg (tillval), och en ImageJ makro som sammanställer data för att förenkla visning. Dessa program kan användas för att bearbeta bilder som samlats in med konventionella metoder, eftersom de är oberoende av avbildnings metoden, vilket kräver endast ett enda brightfield-plan. Det första programmet tar i en 4D fält som innehåller flera embryon (GUI alternativ eller källkod embryoCrop.py) eller flera 4D fält som innehåller flera embryon (screenCrop.py), tätt grödor embryon och orienterar dem i en anterior-posterior konfiguration. Dessa program ger också användarna möjlighet att utföra bakgrunds subtraktion, avdrift korrigering, och dämpning korrigering. De resulterande filerna är enhetligt förbehandlade, tätt beskurna TIFF stackar för varje embryo som är tillägg till automatiserad bildanalys. För att göra det enklare att se alla embryon för varje villkor, en ImageJ Macro (OpenandCombine_embsV2. IJM) skrevs, som monterar alla embryon från ett givet tillstånd till en enda TIFF-stack och matriser brightfield bilder och maximal intensitet projektion färg ( RGB) överlagringar, sida vid sida, för varje embryo. Metoderna validerades genom att använda dem för att karakterisera embryonal utveckling efter knock-down av 40 tidigare beskrivna utvecklingsgener i ett par specialbyggda stammar uttrycker fluorescerande markörer optimerad för att visualisera viktiga aspekter av köns skiktet specifikation och morfogenes^10,11. Tillsammans kommer semi-High genomströmning embryo Imaging Protocol och verktyg bildbehandling möjliggör högre prov antal experiment och storskaliga screening insatser för att förstå utvecklingsprocesser. Dessutom, dessa stammar kommer också att ge ett effektivt sätt att undersöka effekterna av molekylära störningar på embryogenes.

Protocol

1. förbereda C. elegans embryon för semi-högt dataflöde Imaging

Anmärkning: Målet med denna del av protokollet är att läsa in en population av semi-synkroniserade (2 till 8-cellsledet) C. elegans embryon, dissekeras från lämpliga markör stammar (figur 2), i en glasbotten 384-brunn plattan för avbildning. Andra plåtformat kan också fungera, men 384 väl plattorna är att föredra eftersom den lilla storleken begränsar spridningen av embryon till ett relativt litet område, vilket underlättar identifieringen av fält som innehåller flera embryon för tidsförlopp Imaging. Grovt synkronisera embryona säkerställer att hela utvecklingsförloppet fångas för varje embryon i ett fält.

1. Förbered 5 – 10 mL 0,1 mg/mL lösning av tetramisole hydroklorid (TMHC) bedövningsmedel upplöst i Ice Cold M9 medium (0,45 M na₂HPO₄∙ 7h₂O, 0,11 m KH₂PO₄, 0,04 M NaCl, 0,09 m NH₄cl) att använda under dissektion och avbildning. Denna media innehåller ett bedövningsmedel för att säkerställa att rörliga kläckta larv inte stör avbildning av embryon vid tidigare utvecklingsstadier.
   Anmärkning: Om du använder beskärnings-och visualiseringsverktygen för att analysera data som erhållits med standard monteringsmetoder för againblock, gå vidare till avsnitt 3 nedan.
2. Aliquot 70 μL av den beredda lösningen i enskilda brunnar i en glasbotten 384-brunn tallrik med en brunn för varje villkor; Undvik de yttre två raderna av plattan för att förhindra kanteffekter.
   Anmärkning: Det är lämpligt att maskera omgivande brunnar med hjälp av adhesiv PCR-plattfolie (se exempel i figur 1D) Detta bevarar intilliggande brunnar för framtida experiment och gör det lättare att lokalisera lämpliga brunnar under dissekeringsmikroskopet. När lösningen är aliciterad, hålla plattan och resterande lösning på is hela dissektion.
3. Generera munnen glaspipetter för överföring av embryon från depression Slide (där dräktiga hermafroditer dissekeras) till brunnarna. Dra kapillärpipets (25 μl kalibrerade glaspipetter) över en flamma och Bryt för att generera en fin avsmalnande ände (figur 1D). Ett Pipettera behövs per tillstånd för att förhindra korskontaminering; Kassera Pipettera efter användning.
4. Använd fin pincett för att överföra ~ 10 dräktiga vuxna under en dissektion omfattning i 150 μL av iskall TMHC lösning aliciteras på en depression Slide för varje tillstånd. Använda pincetten och en skalpell, dissekera maskar att frigöra embryon.
5. Ladda en drog kapillär Pipettera i rökrörs tillbehöret ingår i Pipets, och munnen Pipettera att överföra alla 2 till 8-cell-stadiet embryon till en individuell brunn av den beredda plattan (figur 1D). Undvik att överföra embryon från sena stadiet och dissekera skräp. Undersök under en dissektion omfattning och om aggregat av embryon är närvarande, munnen Pipettera upp och ner eller knacka klumpar av embryon med Pipettera tips för att skingra.
   Anmärkning: För att förhindra korskontaminering, rengör dissektion utrustning och använda en ny mun Pipettera medan du flyttar mellan förhållanden. Förvara plattan på isen mellan dissektioner.
6. När maskar från alla förhållanden har dissekeras och embryon placeras i deras lämpliga väl, snurra 384-brunn plattan för 1 min på 600 x g att reglera embryon.
7. Torka av bottenplattan med en etanol-dränkt torka för att ta bort alla rester och placera plattan på ett konfokalmikroskop utrustad med en tallrik hållare i en temperaturkontrollerad miljö.
   Anmärkning: Stegen som följer i detalj den här metoden med hjälp av labb inställningar; Vänligen ändra förvärvs villkoren för att passa experimentella behov och utrustning. Här, en konfokal Scanner Box utrustad med en microlens-förstärkt Dual Nipkow spinning disk, en 512 x 512 EM-CCD-kamera, en hög precision Auto-XY-steg (utsedd upplösning 0,1 μm) och motoriserad z-axel kontroll (utsedd upplösning 0,1 μm) används. Detta system förvaras i ett rum i 16 ° c, som upprätthåller Mikroskop temperaturen mellan 21 och 23 ° c vid över natten avbildning.
8. För att identifiera fält med lämpliga embryon, utför en för skanning av varje brunn med hjälp av en 10X 0,4 NA objektiv och lämplig bildprogram. De mest optimala fälten kommer att innehålla mer än ett tidigt embryo som är i samma fokalplan som andra embryon och helst kommer att ha minimal kontakt mellan angränsande embryon. Markera positioner för lämpliga regioner.
9. För att välja Imaging Fields, växla till 60x mål och justera fokalplanet vid varje punkt besök på lämpligt avsnitt embryona. 1 – 4 fält per brunn avbildas, totalt 50 fält i 14 brunnar, och varje fält kan innehålla mellan ett och fem embryon. Sammantaget väljs 4 till 15 embryon från varje villkor för högupplöst avbildning.
   Anmärkning: En nyckelvariabel i detta steg är användningen av tillräcklig olja; Placera olja på målet, besöka punkter i varje brunn för att sprida oljan runt ytan av alla brunnar och sedan tillämpa en extra droppe olja till målet före valet av fält.
10. Bild de valda fälten med en 60x 1,35 NA mål att förvärva 18 z sektioner med 2 μm intervall var 20 min för 10 h. Imaging villkor med hjälp av bakterie-skiktet och morfogenes reporter stammar är följande: brightfield, 90% effekt, 25 MS, 20% Gain; 488 nm, 100% effekt, 200 MS, 60% förstärkning; 568 nm, 45% effekt, 150 ms, 60% förstärkning.
11. Efter avbildning är klar, bedöma embryonal dödlighet genom att utföra en låg förstoring (10X 0,4 NA mål) hela väl brightfield Scan ~ 20 – 24 h efter starten av övernattning Imaging.

2. bedömning av embryonal dödlighet

1. Med hjälp av post-Run 10X scannade fält, bedöma embryonal dödlighet och larv defekter genom att räkna kläckta maskar och okastade embryon för varje brunn.
2. Betyg okläckta embryon som embryonala dödliga. Utesluta arresterad en-till fyra-cell-skede embryon från dödlighet räknas, eftersom unga dissekerade embryon ibland misslyckas med att slutföra äggskal formation (om meios II ännu inte är fullständig) och permeabilitet defekter kan leda till osmotiska komplikationer under de två första Divisioner.
3. Score delvis kläckts eller helt kläckts maskar med kroppsmorfologi eller beteendemässiga defekter, såsom dumpy eller förlamad, som "onormal larv".

3. automatiserad beskärning (figur 3a)

Anmärkning: Programvaran är inrymt i två platser: (1) Zenodo hus en användarvänlig version av programvaran¹² som inte kräver någon programmering expertis. (2) GitHub innehåller källkoden för vår embryoCropUI.py och screenCrop.py programvara¹³, som kräver skicklighet med python. Detaljerade instruktioner för att ladda ner och driva båda versionerna av programmet finns nedan.

1. Automatiserad beskärning med hjälp av den körbara versionen av embryoCropUI (användarvänlig version)
   1. För att använda embryoCropUI programmet, först ladda ner programmet från Zenodo (https://zenodo.org/Record/3235681#.XPAnn4hKg2w)¹².
      1. Hämta MacOS-eller Windows-formatversionen av programmet (Observera att MacOS-versionen kräver MacOS X 10.11 eller senare).
      2. Ladda ner instruktionsfilen (GUI_Instructions_zenodo_repoV2. docx), som ger steg för steg instruktion för att testa och använda embryoCropUI programmet.
      3. Data överför den test_files. zip till prov om den program är riktig fungerande på det plattform (se instruktionerna).
   2. När du har hämtat, packa upp och navigera för att hitta den embryoCropUI körbara (... \Embryocropui\_windows\embryocropui\embryocropui.exe) eller (... \Embryocropui\_macos\embryocropui\embryocropui.exe). Dubbel klick till sjösätta (eller valde ' öppen med ' slutstation) och springa den embryoCropUI verkställare.
   3. Den GUI körbara grödor en 4D synfält i taget. I det övre vänstra hörnet väljer du knappen öppna för att ladda det specifika fältet till Beskär (Multi-TIFF). Om du beskär en TIFF-serie, med flera dimensioner (d.v.s. z, tid, kanal), laddar du bara den första bilden i serien i mappen (en TIFF-serie per mapp).
   4. När bilderna har lästs in anger du följande information: antal z-segment, (Z), antal tid punkter (T), antal kanaler (C), den kanal som motsvarar DIC eller brightfield (första = 1, Second = 2, etc.).
   5. Välj ytterligare bearbetning för att köra på bilderna. Programmet erbjuder avdrift korrigering, bakgrund subtraktion, och dämpning korrigering.
   6. Ange parametrar för bakgrunds subtraktion och dämpning korrigering för att vägleda bearbetning ansträngningar i GUI-prompten. För bakgrund subtrahera, definiera den största funktions storleken för att återspegla storleken på meningsfull signal; den här funktions storleken bör inte betraktas som bakgrund och måste vara ett udda tal värde. Mata in ett värde från 0-1 för dämpning korrigering. Dämpnings korrektions värdet återspeglar den procentuella ursprungliga intensitet som återstår vid det yttersta djupet av det objekt som avbildas.
      Anmärkning: Bakgrunds subtraktion och dämpning korrigering måste köras tillsammans.
   7. Ange bild insamlings ordningen (t. ex. kanal-z-tid (CZT) eller z-kanaltid (zct)).
   8. Ange mikrometer per pixel för bilderna baserat på den kamera som används.
      Anmärkning: Dålig bild beskärning kommer att inträffa om pixelstorleken inte är korrekt definierad.
   9. Välj Kör i det nedre vänstra hörnet. En ny undermapp med etiketten "Beskär" kommer att skapas i samma sökväg som den Okuperade mappen. beskurna versioner kommer att sparas på denna plats. Beroende på filstorlek bör beskärning slutföras inom några sekunder till minuter.
2. Automatiserad beskärning med screenCrop.py (alternativ för batchversion till det grafiska gränssnittet embryoCrop som beskrivs ovan;Endast python savvy-användare)^10,13
   1. Om du vill använda screenCrop.py, python programvara version för beskärning av större datauppsättningar i en batch-format, klona eller hämta källkoden från GitHub (GitHub.com/renatkh/embryo_crop.git).
   2. Läs instruktionerna för konfigurering av en korrekt virtuell miljö och följ det beskrivna filnamn systemet; båda beskrivs i README -filen i GitHub-databasen: https://github.com/renatkh/embryo_crop/BLOB/Master/Readme.MD.
   3. När miljövariabler och namngivningskonventioner har upprättats på rätt sätt, öppna Parameters.py och screenCrop.py i en redaktör för val.
   4. Om du vill ändra justerbara parametrar utan att vidröra källkoden redigerar du filen Parameters.py .
      Anmärkningar: det är också möjligt att direkt ändra parametrar i huvudet på screenCrop.py.
      1. Om du använder konfigurationsfilen parameters.py ändrar du inställningen use_configure till true. Om du använder direktredigering inom screenCrop.py, lämna den use_configure inställningen falskt.
      2. Leta upp följande information i filen parameters.py och gör ändringar som passar önskade avbildnings parametrar och filstruktur:
         1. loadFolder (rad 9): Byt till den enhet där filerna lagras (t. ex. Z:/, D://, etc.)
         2. datum (rad 7): Byt till mappen som innehåller filer för bildsessionen. Detta kallas "namn på experiment mapp" i CSV-spårningsfilen (se instruktioner).
         3. trackingFile (rad 11): ändra till sökvägen till CSV-filen där experiment informationen lagras.
         4. z (rad 13): Ange som antal z-plan.
         5. nT (Line14): Ange som antal tidspunkter.
         6. nWells (linje 19): Ställ in som antalet brunnar som används.
         7. Pointbesök (rad 20): Ange som maximalt antal poäng besök (per brunn).
         8. I linje 10 hitta den plats som för närvarande upptas av "CV1000/" och mata in den yttre mappen som används i filsökvägen. För att undvika problem, Använd följande konvention: ' XXXXXXX/'.
         9. I rad 12 matar du in en giltig filsökväg för lagring av bild bredds data för beskurna data.
         10. I raderna 15, 16, 17 och 18 indata True/false för om bilderna går igenom följande bearbetning:
             1. Indata sant eller falskt för avdrift korrigering på rad 15.
             2. Indata sant eller falskt för bakgrunden subtrahera på rad 16. Funktions storlek måste bestämmas empiriskt för olika markör stammar och pixel storlekar. I konfigurationen här, funktionen storlek definierades som 41 för bakterie-skiktet stam och 201 för morfogenes stam. Bakgrunds subtrahera måste göras i samband med dämpning korrigering.
             3. Indata sant eller falskt för dämpning korrigering på rad 17.
             4. Indata true eller false för främre bakre rotation på linje 18.
   5. När alla ändringar har gjorts kan beskärning påbörjas. För att göra detta, växla till screenCrop.py och välj spela-ikonen i verktygsfältet, i rullgardinsmenyn Välj Kör som > python Run.
   6. Eftersom beskärning kan ta flera timmar att slutföra för en stor datauppsättning (50 punkt besök 18 z steg, 3 kanaler, 31 timepoints), spåra förloppet för beskärning i konsolfönstret. När beskärningen är klar, ett litet fönster kommer att Visa förhandsvisningar av de beskurna bilderna innan du sparar. För varje bild finns 3 alternativ:
      1. Spara: Tryck på mellanslags tangenten för att spara bilden om bilden beskärs ordentligt utan att några områden av intresse skärs av.
      2. X: Tryck på X om bilden verkar ha intresseområden avskurna; bilden kommer att sparas med ett X framför namnet för att separera det från de andra bilderna.
      3. Ta bort: Tryck på D för att ta bort den beskurna bilden om bilden inte beskärs ordentligt eller om embryot inte är tillfredsställande.
         Obs: bilderna kommer att sparas i en undermapp som heter "beskuren" i load-mappen (definierad i rad 9 i programmet).

4. visualisering (figur 4)

Obs: OpenandCombine_embsV2. IJM^10,12 är en imagej makro som kommer att konstruera en lätt att visa TIFF-fil från alla bilder för en viss stam och skick. Installation av Fiji/imagej^14,15 krävs. Detta makro körs enligt vår filstruktur; Det kommer att behöva ändras för att arbeta med andra filstrukturer. En guide till korrekt filstruktur och detaljerad beskrivning av viktiga överväganden kan hittas i slutet av GUI_Instructions_zenodo_repoV2. docx filen på Zenodo förvaret. Läs igenom dessa instruktioner helt innan avbildning för att korrekt namn och strukturera filer till gränssnittet bäst med detta makro. Som referens ser vår fil lokaliserings struktur ut så här:
Z:\cropped\Target\Strain\Emb # \Target_Emb # _ 15 siffra unik identifierare _ W # #F # _ T # #_Z # #_C #. tif
dvs. Z:\cropped\EMBD0001\GLS\Emb1\EMBD0001_Emb1_20140327T135219_W02F1_T01_Z01_C1.tif

1. Hämta OpenandCombine_embsV2 och GUI_Instructions_zenodo_repoV2. docx från zenodo (https://zenodo.org/Record/3235681#.XPAnn4hKg2w).
2. Förbered följande information:
   -Platsen där bildmapparna lagras (efter beskärning).
   -Bildmappens namn för det eller de specifika villkor som ska bearbetas (d.v.s. EMBD0002). Detta kallas "target" i exemplet ovan
   -En 15-siffrig alfanumerisk unik identifierare som är specifik för ett givet övernattnings experiment – den här identifieraren är mappnamnet för datainsamling (d.v.s. 20140402T140154) och den unika identifieraren bäddas in i det enskilda TIFF-filnamnet (EMBD0002_Emb1_ 20140402T140154_W06F2_T01_Z01_C1) för varje embryo avbildas den dagen. Makrot använder denna identifierare för att söka efter embryon som erhållits på samma datum och kan sammanställa upprepade villkor, med separata datum, i separata ImageJ filer.
3. Öppna ImageJ och dra och släpp makro filen, OpenandCombine_embsV2. IJM, till imagej-fältet, eller öppna makrot direkt.
4. När makrot är öppet letar du upp raderna 3 och 4. Mata in den information som samlats in i (avsnitt 4,2) enligt följande steg:
   1. I linje 3 (RNAL), mata in målnamnet för de bilder som ska bearbetas. Mata in varje mål i följande struktur newArray ("XXXXXXXX/"); inkludera offerter. För att köra flera villkor samtidigt, separera med ett kommatecken och Behåll alla mål namn inom parentesen (dvs. Newarray ("EMBD0000/", "EMBD0001/", "EMBD0002/").
   2. I linje 4 (datum), mata in den 15-siffriga alfanumeriska alfanumeriskt unika identifierare i offerter, till exempel Newarray ("20140402t140154").
5. Tryck på Kör längst ned till vänster i makrofönstret. Ett fönster kommer att visas, vilket kommer att starta en uppmaning att navigera till den yttre mappen som innehåller de beskurna bildmapparna (anges i 4.4.1).
6. En gång valde, en annan fönster vilja framträda, vilken vilja tillåta specifikationen av tänkbar paramenterna.
   1. Ange antalet kanaler, antalet Z-segment, teckenstorleken för texten som används vid etikettering av de kompilerade bilderna och färgen för varje kanal.
   2. Kontrollera på/av Auto kontrasterande i alla kanaler.
7. När alla parametrar har angetts klickar du på OK längst ned i fönstret. Komposit filen kommer att börja samlas; Detta kommer att ta flera minuter, per villkor, för att slutföra.
8. När du är klar granskar du de filer som lämnas öppna om du vill. De kan stängas utan att spara, eftersom makrot har redan sparat filerna till en nyskapad mapp som namnges på följande sätt: yttre mappnamn (anges i prompten i avsnitt 4,5) + "-Fiji-bearbetade-output" (dvs., Z:\ cropped-fiji-processed-output\EMBD0002_GLS_20140402T140154.tif).

Representative Results

En betydande utmaning i att karakterisera effekten av molekylära störningar på C. elegans embryonal utveckling är att det tar ca 10 h för embryon att utvecklas från första klyvning till slutet av tånet vid 20 °¹⁶. En metod med semi-högt dataflöde där stora kohorter av embryon kan avbildas samtidigt är användbart för händelser i denna tidsskala eftersom det medger avbildning av flera villkor parallellt med en tillräcklig Ensemble storlek för varje villkor för att möjliggöra kvantitativ analys (figur 1A).

Bild metod med semi-högt dataflöde och Multimarkör-stammar
Bild metoden med semi-högt dataflöde som beskrivs här (beskrivs i figur 1B), sysselsätter en 384-väl glasbotten plattan; den många--brunn formaten tillåt för upp till 14 författningarna till vara klädd samtidig och den liten storlek om brunn begränsar sökan areal, förenkla identifieringen av fälten innehållet embryon för hög beslutsamhet tänkbar. Här, en konfokal skanner låda användes, utrustad med en microlens-förstärkt Dual Nipkow spinning disk, en 512 x 512 EM-CCD-kamera, en hög precision Auto-XY-steg (utsedd upplösning 0,1 μm) och motoriserad z-axel kontroll (utsedd upplösning 0,1 μm). Protokollet kan dock anpassas för alla konfokala Mikroskop med precision Point-besökande kapacitet och en scenadapter som kan rymma en multi-well tallrik. En betydande utmaning i utvecklingen av denna metod var att utforma ett sätt att generera en tallrik med embryon i samma utvecklingsstadiet så att hela utvecklingen kan fångas för alla embryon i varje fält. Detta är en utmaning eftersom de embryon som klädd på bildplattan först kommer att fortsätta att utvecklas medan senare prover dissekeras, vilket resulterar i en gradient av iscensättningen över brunnarna. För att kringgå denna fråga, är tidiga embryon (2-8 cell stadiet) väljs och hålla dissektion media och avbildning plattan på is; Detta bås embryogenes för dissekerade embryon tills alla villkor har klädd utan signifikant påverkar embryonal livskraft¹⁰. För att begränsa den tid som embryona sitta på is till 1 timme, två forskare utföra dissektioner samtidigt, vilket gör det möjligt att ställa upp 14 olika förhållanden i ca 50 min. Efter dissektion, plattan är spunnet på 600 x g för 1 min till sediment embryona och brunnar är pre-skannas vid låg förstoring för att lokalisera fält med grupper av lämpliga embryon för hög förstoring Imaging; platser för punkt besök är markerade. Embryon filmas i ett temperaturkontrollerat rum över natten med hjälp av en 60x Oil Immersion 1,35 NA lins. Proverna är konfigurerade i en 4 brunn av 4 väl regionen så att ytan av plattan som används i ett experiment är jämförbar med en 22 x 22 mm² standard täckslip, som möjliggör användning av en 60x olja mål. Enhetlig spridning av olja i denna region före starten av Imaging är avgörande för framgångsrik långsiktig bild förvärv. Utvecklingen av embryon avbildas i en lösning som innehåller bedövningsmedel; Detta säkerställer att när de äldre embryona i brunnen luckan, deras rörelse inte störa positionen av intilliggande yngre embryon som håller på att avbildas. På grund av äggskalets ogenomträngliga natur påverkar bedövningsmedlet inte rörelse före kläckningen. Under dessa förhållanden, 3D-tidsfördröjnings data samlas i 3-kanaler för totalt 80-100 embryon i en enda övernattning experiment (diskuteras mer nedan).

C. elegans embryonal utveckling sker i två faser. Först 10 rundor av celldelning kopplad till cell Fate specifikation generera de tre bakterie lagren (ectoderm, mesoderm och endoderm) under en 6 timmars period¹⁷. I följande 7 h, morfogenetiska händelser driva bildandet av differentierade vävnader^8,16. För att fånga dessa två aspekter av utveckling, byggde vi ett par anpassade stammar, bakterie skiktet och morfogenes stammar¹⁰ (figur 2a), och använde semi-High-dataflöde protokoll till bild embryon från båda stammarna. Den bakterie skikt stammen uttrycker Transgene-kodade fluorescerande proteiner som markerar kärnor i ectoderm, mesoderm och endoderm i rött, gult och grönt. Denna stam innehåller tre reporter transgener: (1) en transgenens som uttrycker Pha-4:: GFP som markerar kärnor i tarmen och svalget (gröna endoderm)^10,18,19, (2) en transgenens som uttrycker en mCherry-histone fusion i epidermis och i ~ 1/3 av nervceller (röd ektoderm; Figur 2a) och (3) en transgenens som samtidigt uttrycker mcherry och GFP-märkta histoner i kroppen vägg muskel (gula mesoderm). Den morfogenes stammen har två transgener som uttrycker: (1) en grön epitelial knutpunkt markör (DLG-1:: GFP) i epidermis, och (2) en mCherry-märkta plasmamembran markör, i ~ 1/3 av neuroner (PCND-1 promotor; Figur 2A). För att effektivisera RNAi var båda stammarna också konstruerade för att innehålla ett par RNAi-sensibiliserande mutationer (NRE-1 (HD20) lin-15B (hd126)²⁰. Dessa konstruerades med målet att utföra en storskalig RNAi-baserad skärm av de ~ 2 000 gener som krävs för embryonal utveckling. Men detta par stammar kommer också att utgöra en allmänt användbar standardiserad plattform för bedömning av utvecklingsdefekter i mutanter, och för mer detaljerade analyser av rollerna av olika proteiner i utvecklingen.

För datainsamling i detta semi-High genomströmning format, med dessa stammar, gröna, röda och ljusa fält z-serien (18 x 2 μm² intervall) samlas in, varje ~ 20 min, under en period av 10 h i en 16 ° c temperaturkontrollerade rum; Detta underhåller mikroskopet mellan ° c 21-23 under körningen. Den 20 min tidsintervall tillåter oss att bild 50 fält av embryon (punkt besök) per experiment. Användare kan skräddarsy förvärv till kortare intervaller med färre punkt besök, eller längre intervaller med fler punkt besök för att bäst passa deras experimentella mål. För dessa stammar, den tidiga utvecklingen tidspunkter är inte avbildas eftersom de vävnadsspecifika reportrar som kör markör uttryck inte börjar uttrycka fram till mitten till slutet av gastrulation. Under denna tidiga fas skannades brunnar vid låg förstoring (10X) och fält har valts för fotografering med hög förstoring. Att välja fält som innehåller mer än ett embryo i ett tidigt skede rekommenderas, men att undvika fält där embryon delvis överlappar varandra, alltför trångt eller finns vid den extrema kanten av brunnen. Efter över natten 60x Imaging, en låg förstoring (10X) hela väl Skanna utförs för att avgöra om embryon kläcks med normal utseende (WT), kläcks med synliga avvikelser (larv onormal), eller är embryonala dödliga för varje bedömt tillstånd ( Figur 1B). Detta steg fungerar som ett enkelt alternativ till att sätta upp plåtar parallellt för att bedöma dödlighet i en större population; hela brunnen 10X post-Scan ger embryonala dödlighet data på 50-80 embryon per tillstånd. Genom att använda denna åtgärd för att jämföra data för embryonal dödlighet för kontroller mellan körningar är en användbar kontroll som säkerställer konsekvens med avseende på hälsan hos stammarna och miljöförhållanden och bearbetningssteg. När avbildas i kombination, de två anpassade reporter stammar ger informativ avläsning för de flesta större händelser i utvecklingen, inklusive cell Fate specifikation, dorsala intercalation, epidermal hölje, töjning, och neurogenes (representativa kontroll bilder visas i figur 2B, se även Wang et al.¹⁰).

Data behandling: automatiserad embryobeskärning och orientering
Med vårt avbildnings protokoll innehåller varje högupplöst bild fält mellan 1 och 5 embryon; dessa embryon är slumpmässigt orienterade och placeras ofta omedelbart intill varandra. Data som samlats in med konventionella embryomonteringstekniker lider av samma utmaningar. För att förbereda data för efterföljande visualisering och analys behövs betydande praktisk manipulation för att beskära och orientera embryosekvenser, samt för att Förbearbeta dem för att subtrahera bakgrund, korrigera för drift och kompensera för signal dämpning med djup. För att effektivisera denna process byggdes ett anpassat embryo odlings program som isolerar och orienterar varje embryo från det bredare fältet (figur 1C, figur 3). Detta program har paketerats som ett användarvänligt, fristående program med grafiskt användargränssnitt (GUI, kompatibel med data från de flesta Imaging plattformar) som kan ta i en 3D-tidsförlopp sekvens av ett fält av embryon, och bearbeta den till enskilda TIFF-serien för varje embryo i fältet (figur 3B, finns på https://zenodo.org/Record/3235681#.XPAnn4hKg2w)^10,12. Python-källkoden för GUI (embryoCropUI.py) och en batchversion av det här programmet (screenCrop.py) är också tillgängliga för erfarna python-användare på GitHub (https://github.com/renatkh/embryo_crop.git)^10,13. Kärnan funktioner i detta program är att lokalisera, beskära, och orientera embryot längs främre-bakre axeln. Samtidigt kan bakgrunds subtraktion, dämpning korrigering och drift korrigering utföras på datauppsättningen med valfria justerbara inställningar.

Kortfattat, den automatiserade beskärning programvara iterativt upptäcker enskilda embryon i en binär mask som erhållits från Bright-fältet bilder och sekventiellt grödor embryon från alla kanaler och orienterar bilderna längs främre-bakre axeln (figur 3 B, som först beskrevs i Wang et al.¹⁰). Före beskärning korrigerar programvaran för drift, drar ifrån bakgrunden och utför djup dämpnings korrigering i varje fluorescenskanal (valfritt). För att få den binära masken, tillämpar programvaran Canny Edge Detection²¹ till Bright-fältet bilder, utför maximal intensitet projektion av de tre centrala planen och fyller i små hål. Algoritmen upptäcker enskilda embryon genom att montera en Cassini oval till en del av den binära mask kontur (se figur 3B, 3c). Efter justering av ovala längs huvudaxeln, programvaran åtgärder röd fluorescens intensitet i varje halva av det isolerade embryot och roterar embryot så att röd intensitet är inriktad mot vänster, som sätter embryot anterior på vänster för båda reporter stammar som används i detta arbete (figur 3D). Pilotering av denna programvara visade att de flesta embryon var effektivt beskäras som förväntat. Mindre Imaging frågor, såsom embryo drift, tillfällig fokal plan förlust (på grund av bubblor i olja), eller trångt fält av embryon inte stör vanligtvis framgångsrik beskärning. Men för områden där det fanns stora klumpar av embryon (överlappande något i z), embryon som var signifikant lutas inom imaging planet (i Z), långsiktig fokal plan förlust, eller embryon som var delvis cutoff, lyckad beskärning var inte alltid Uppnåtts. Dessa problem kan lätt kringgås genom bättre fält urval under datainsamlings fasen. Övergripande, Pre-processing data som samlats in med denna semi-högt dataflöde metod eller med konventionella monteringsmetoder är ett användbart första steg för att visualisera och analysera embryonala DataSet.

Validering av metoder för Bildinsamling och databehandling: visualisera embryonal utveckling efter knock-down av 40 tidigare beskrivna gener
För att validera denna semi-High-genomflöde bild insamlingsmetod och anpassade odlingssystem, en liten RNAi skärm utfördes i den anpassade stammar, riktad mot 40 gener med tidigare beskrivna funktioner i cell Fate specifikation och morfogenes ( beskrivs av Wang, Ochoa, Khaliullin och kollegor^10,11). För att göra detta, dsRNA genererades mot varje mål, injiceras L4 djur från varje stam, väntade 20-24 h, och sedan dissekeras ut och avbildas embryon med hjälp av protokollet som beskrivs ovan (för fullständig dataset^10,11). Att uppnå utvecklingsmässiga fenotyper av RNAi kräver hämning av både maternell och zygotic genuttryck. Utvecklingsgener kan uttryckas för evigt, med de resulterande protein produkterna lastas in i embryon, eller zygotically uttrycks i embryot, eller, i många fall, både^10,22,23. Tiden mellan injektion och embryofilmning är den kritiska variabeln för att effektivt rikta in sig på materneligt och zygotiskt uttryckt populationer. timing bestämmer både mängden injicerat dsRNA som laddas in i embryot för att förhindra zygotic uttryck²⁴ och omfattningen av moderns protein utarmning. Efter dsRNA injektion, moderns mRNA som motsvarar den riktade genen blir degraderad och inte återhämta sig över i ett relevant tidsintervall. Redan existerande protein utarmning kräver embryoproduktion, som matar ut moderns protein från köns cells vävnader genom att ladda den till att bilda embryon. 20-24 h vid 20 ° c är den kortaste inkubationstiden som tillåter konsekvent maternell utarmning; maternell utarmning blir bättre vid senare tidpunkter (dvs., 36-42 h efter injektion). Mängden injicerat dsRNA som läses in i embryot dikterar hur effektivt förebyggande av zygotiska genuttryck kommer att vara. Mängden belastade RNA toppar ca 5-10 h efter injektion, när embryon med injicerat material först befruktas, minskar därefter. Enligt vår erfarenhet, 24 h efter injektion är en optimal timepoint, där moderns protein utarmning och hämning av zygotic genuttryck är båda effektiva. Analys av fenotyper i anpassade reporter stammar som används i detta arbete, över uppsättningen av 40 testgener, visade att vårt kombinerade protokoll gav distinkta, mycket reproducerbara signaturfenotyper över ett brett spektrum av gener involverade i cellens öde specifikation och morfogenes (se Wang et al.¹⁰); den kompletta datauppsättningen är tillgänglig¹¹). Som ett exempel på dessa data, stillbilder av fyra olika embryon för kontroll, Pha-4 (RNAi), PAL-1 (RNAi), och Mex-3 (RNAi) i Groddskiktet reporter stam visas i figur 4A. För en mer omfattande diskussion om de fenotyper som observerats i 40-Gene RNAi-skärmen, se Wang et al.¹⁰

ImageJ Macro: sammanställning och visualisering av alla data för ett givet villkor
Visualisering av ett stort antal embryon från enskilda TIFF-stackar kan vara tråkigt och tidskrävande att arbeta igenom. Från vår första ansträngning var > 400 enskilda embryon isolerade med hjälp av anpassade automatiserade beskärnings program som beskrivs ovan. För att påskynda första passage analys, byggde vi en ImageJ makro, som genererar en matris av alla embryon avbildas för en viss RNAi tillstånd i en viss stam bakgrund (figur 4B). För varje embryo i matrisen visas en brightfield-bild och en maximal intensitetsprojektionsbild sida vid sida, för varje tidspunkt, för att generera en sammansatt filmfil. Medan detta makro skrevs för att fungera med vår filstruktur, kan det redigeras för att rymma användarens filstruktur. För bästa resultat bör dock användare följa namngivnings-och filstruktur konventioner som anges i protokollet (se Zenodo eller GitHub README-filer för mer specifika för python och ImageJ namngivningskonventioner för program). För att se alla ImageJ bearbetade data och få mer djupgående analys av de fenotyper som observerats för 40-gen testuppsättning, se de data som deponeras i dryad databasen^10,11. Detta ImageJ visualiserings format möjliggör snabb bedömning av den totala fenotypen och dess penetrance, och gör det enkelt att flagga datakvalitetsproblem, såsom förekomst av skräp eller förlust av fokalplan. Sammantaget underlättar kombinationen av datainsamlingsmetoden semi-High-throughput, beskärnings program och ImageJ visualiseringsverktyg, kombinerat med anpassade reporter stammar, avsevärt större ansträngningar för att studera embryonal utveckling.

Figur 1. Översikt över hög innehålls avbildningsmetod, databehandlings procedur och nödvändiga verktyg. (A) en jämförelse av funktionerna i den standard agaros pad-baserade metoden för montering av C. elegans embryon till semi-högt dataflöde multi-well Imaging tillvägagångssätt beskrivs här. B) Översikt över metoden med semi-högt dataflöde för övervakning av embryonal utveckling. Se text för mer information. (C) Översikt över verktyg för databehandling och visualisering, som kan användas på data som erhållits med antingen en konventionell agaros pad-baserade Monteringsprocedur eller den semi-hög-kapacitet multi-well plåt-baserad metod som beskrivs häri. En enda 3-kanals tidsfördröjd embryosekvens från ett fält (vänster) eller flera 3-kanals, 4-dimensionella fält av embryo-data (höger) kan bearbetas med hjälp av det anpassade beskärnings programmet, som är kompatibelt med data som fångas på de flesta avbildningsplattformar. Den grafiska användargränssnittet (GUI) versionen av programmet är användarvänlig och kräver inte någon programmering expertis. Den screenCrop.py ansökan kräver python expertis, men det har lagt till funktioner-nämligen att det kan beskära i batch-format. Resultatet av detta steg är tätt beskäras, främre-posterior orienterade embryo TIFF stackar. För att visualisera alla data från ett enda villkor, skapades ett ImageJ-makro som kompilerar beskurna, roterade TIFF-stackar för att visa en brightfield-bild och maximal intensitetsprojektion för varje embryo vid varje tidpunkt. (D) panelen visar viktiga verktyg som behövs för dissektion och inställning av semi-High-throughput Imaging format. Vissa figur komponenter återges med tillstånd från Wang et al.¹⁰. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2. Anpassade stammar som genereras för hög innehålls avbildning av C. elegans embryogenes. (A) Schematics illustrerar de transgener som används för att konstruera bakterie skiktet (överst) och morfogenes (botten) stammar. (B) maximal intensitet projektion paneler visar utvecklingen tid-kurs i morfogenes (överst) och bakterie skiktet (botten) stammar. Ventrala Visa visas, som illustreras i scheman (vänster). Tiden är relativ till kommatecken (t = 0), som är lätt att identifiera i båda stammarna. Scale bar = 10 μm. figur återges med tillstånd från Wang et al.¹⁰. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3. Anpassat beskärnings program isolerar och orienterar enskilda embryon från bildbehandlings fält. (A) Schematisk illustrerar funktionerna i det anpassade embryo odlings program och belyser de två alternativen för att komma åt detta program: ett användarvänligt GUI-gränssnitt, som kräver ingen programmering expertis och finns på zenodo (vänster) och en batchbeskärning version av programmet, som kräver python erfarenhet och finns på GitHub (höger). (B) grafisk sammanfattar den automatiserade beskärning algoritm-en binär mask genereras från 8-bitars brightfield bilder och enskilda embryon upptäcks, beskäras ut, och orienterade längs främre-bakre axeln. Skalstapeln är 10 μm. (C) schematik detaljerat det förfarande som används för att iterativt upptäcka embryon i den binära masken. (D) Schematisk illustrerar den metod som används för att orientera embryon längs den främre bakre axeln. Paneler B-D återges med tillstånd från Wang et al.¹⁰. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4. Anpassad ImageJ Macro möjliggör visualisering av RNAi screeningdata genom att generera sammansatta filer för varje villkor. (A) embryon för tre exempel på RNAi-villkor från 40-gentestuppsättningen (se Wang et al.^10,11 för fullständig datauppsättning) visas (till höger) som belyser de distinkta signaturfenotyper som erhålls för varje och reproducerbarheten av fenotyperna inom varje tillstånd. Panel anpassades med tillstånd från Wang et al.¹⁰. (B) panelen illustrerar hur den anpassade imagej Macro (OpenandCombine_embsV2. IJM) matriser embryon från en viss RNAi villkor i en sammansatt imagej fil som arrayer brightfield och maximal intensitet prognoser för varje embryo vid varje timepoint. Även om bara ett exempel är markerat kan det här makrot kompilera data för många RNAi-villkor samtidigt. ImageJ Macro finns på Zenodo¹². Scale bar = 10 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Detta arbete beskriver en uppsättning verktyg och metoder som utvecklats för att möjliggöra större ansträngningar för att profilera funktionen av gener i embryonal utveckling i C. elegans. Vår semi-högt genomströmning metod tillåter 3D tidsförlopp avbildning av embryonal utveckling vid 20 min upplösning för 80 – 100 embryon i ett enda experiment. Även om detta protokoll kan anpassas för användning med någon önskad markör stam (er), detta arbete visar potentialen av metoden med hjälp av två anpassade stammar som utvecklats för att övervaka händelser under embryogenes: (1) en bakterie-skikt reporter stam, där vävnadsspecifika initiativtagare driva uttrycket av fluorescerande histoner att markera endoderm, mesoderm och ektoderm kärnor, och (2) en morfogenes reporter stam, som använder epidermal och neuronala initiativtagare att driva uttrycket av fluorescerande markörer i cell-korsningar och plasmamembranet. Genom avbildning de två stammarna, konsekvenserna av molekylära störningar på cell öde specifikation och morfogenetiska händelser kan fångas med anmärkningsvärt detalj. För att hantera utmaningarna som presenteras av den mängd data som genereras av denna metod, har anpassade verktyg utvecklats för att effektivisera databehandling och visualisering. Det första verktyget grödor enskilda embryon ur ett fält av embryon i 3D tidsförlopp sekvenser samtidigt rotera embryon till en standard främre posteriort orientering och utföra bakgrund subtraktion, drift korrigering, och dämpning korrigering. Detta program paketerades som ett användarvänligt GUI (https://zenodo.org/Record/3235681#.XPAnn4hKg2w) och källkoden och en mer avancerad batchbearbetning version av programmet för python kunniga användare (GitHub.com/renatkh/embryo_crop.git) tillhandahålls^10,12,13. Slutligen, för att visualisera denna bearbetade data i ett meningsfullt format, en ImageJ makro utformades; Detta gör det möjligt för användaren att visualisera alla embryon från ett visst RNAi-tillstånd i en multipanelad film, som visar en brightfield och maximal intensitet projektion för varje embryo vid varje tidpunkt. Tillsammans, de stammar, protokoll och databehandling verktyg, göra ansträngningar för att studera C. elegans embryogenes i större skala en mer genomförbar strävan.

Även enkelt att genomföra på det hela, den semi-High-genomströmning förvärvsmetod som beskrivs här kräver uppmärksamhet på några viktiga detaljer, som diskuteras nedan. Först måste användarna ha tillgång till ett konfokala Mikroskop med precision Point-besökande kapacitet som kan utrustas med en multi-well skylthållare. Det mest kritiska övervägandet för detta protokoll är att mikroskopet upprätthålls i ett temperaturkontrollerat rum. Fördriva många Mikroskop har kapaciteten att värma, mest kan inte pålitligt kyla, således måste den miljö-temperaturen anpassas för att underhålla en konstant C. elegans vänlig temperatur. För att uppnå detta hålls bildrummet vid 16 ° c. Instrumentets provtagningsområde värms upp till 21-23 ° c under bildtagning. Fluktuationer i rumstemperatur kan påverka utvecklingen timing och subtilt förändra fokalplanet noggrannhet under punkt besök och bör undvikas så mycket som möjligt. Observera att löpning vid temperaturer över 23 ° c kan resultera i en avsevärd topp i embryonal dödlighet för kontrollförhållanden och är inte tillrådligt. En annan viktig faktor är embryoval och spridning under dissektion. Försiktighet bör iakttas för att undvika överföring av äldre embryon till Imaging Wells, eftersom, vid kläckning djur tenderar att Swish angränsande embryon ur synvinkel; incidensen av detta minskar genom införandet av bedövningsmedel i media. Spridningen av embryon, för att undvika stora klumpar av embryon, är också en kritisk variabel. Clumping tenderar att inträffa när embryon överförs till brunnarna i kapillärpipets som är alltför tunt utdragna, eller när embryon inte är tillräckligt spridda under dissektion. Ett annat övervägande är att punkt urval och fokal Plane tuning tar tid. Plattan hålls inte på is under denna process, så embryona börjar utvecklas omedelbart. För den anpassade markör stammar som används i denna studie, det finns ungefär en 90 min fönster efter plattan avlägsnas från is för att utföra plattan skanning och punkt val innan markörer börjar uttryckas. Detta är tillräckligt med tid för att sätta upp på vårt instrument med dessa stammar, men andra Mikroskop och stammar kan erbjuda ytterligare tids utmaningar som kommer att kräva felsökning. Slutligen, den metod som vi beskriver sysselsätter en 60x olje mål att samla z-stackar av 50 fält på 20 min tidsintervall. Som vi belyser, kan den temporala upplösningen ökas genom att minska antalet fält avbildas. Till exempel kan 10 fält avbildas vid 4 minuters tidsupplösning. Ett andra alternativ för att öka temporala upplösningen är att använda en lägre förstoring, hög numerisk bländare mål; i detta fall, det större synfält tillåter avbildning av ett stort antal embryon vid högre tid upplösning med endast en måttlig minskning av rumslig upplösning.

För att möjliggöra databearbetning och visualisering i större skala, byggde vi anpassade verktyg och gjorde dem fritt tillgängliga. Det mest användbara verktyget är den anpassade beskärning GUI, som kräver ingen programmering expertis för att fungera. GUI kan användas för att beskära ut och orientera embryon i alla utvecklingsstadier och är kompatibel med alla markörer, vilket gör det användbart inte bara för utvecklingsbiologer, men också för forskare som studerar processer i det tidiga embryot. Eftersom utdata från GUI är exakt beskäras, orienterade, skalas, avdrift-korrigerade data, kan data enkelt kanaliseras till en automatiserad analyspipeline, vilket gör detta verktyg användbart för analys av tidigare och framtida data; om lämpliga stammar används, kan resulterande datafiler användas som indata för befintliga automatiserade analyssystem, till exempel embryogenes Alignment tools²⁵. För att kunna använda programmet är det viktigt för användarna att vara medvetna om att beskärningsalgoritmen kräver att en brightfield-eller DIC-avbildning samlas in för varje steg och tidspunkt. Dessutom, användare bör notera att främre-posterior orienteringsalgoritm är uppbyggd baserat på fördelningen av den röda signalen i bakterie-skiktet reporter och morfogenes rapport stammar, visas i detta arbete. Således måste noggrannheten hos AP-orienteringen i andra markör stammar utvärderas från fall till fall. GUI har testats med data som samlats in på tre olika konfokalmikroskopi Imaging plattformar och är kompatibel över hela linjen för multi-TIFF stackar och TIFF-serien. Förutom den användarvänliga versionen har källkoden för GUI och en batchversion av detta program också gjorts tillgänglig, med förbehållet att programmeringserfarenhet krävs, och filstrukturer och namngivningskonventioner måste följas. Slutligen, en ImageJ bearbetning makro byggdes för att ta RAW-bildstackar för alla embryon, i varje RNAi skick, och sammanställa en informativ array för att visa alla embryon för detta tillstånd i brightfield och fluorescens maximal intensitet projektion vid varje tidpunkt. Detta verktyg kan anpassas till användarens specifikationer och är ett användbart makro för att göra data utforskning och kvalitetskontroll utvärdering enklare.

Tillsammans, den semi-högt dataflöde inspelnings metod tillsammans med embryo beskärning och bildbehandling verktyg som beskrivs häri kommer att underlätta analys av C. elegans embryonal utveckling med hjälp av en mängd olika mutanter, perturbations och markörer markör. I vårt eget labb, en storskalig skärm som använder dessa metoder för att filma embryon från de två anpassade konstruerade stammar som beskrivs här efter knockdown av ~ 2 000 gener som krävs för utveckling, pågår för närvarande. Slutligen kommer data från denna ansträngning att fungera som en ytterligare resurs för att öka insatserna för att förstå cell Fate specifikation och morfogenetiska händelser under embryogenes.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aspirator Tube Assembly	Drummond Scientific	2-000-000
Calibrated Pipette (25 mL)	Drummond Scientific	2-000-025
Cell Voyager Software	Yokogawa Electric Corp	Included with CV1000
Conical Tube (15 mL)	USA Scientific	1475-0501
CV1000 Microscope	Yokogawa Electric Corp	CV1000
Depression slide (3-well)	Erie Scientific	1520-006
Dissection Microscope	Nikon	SMZ-645
Eppendorf Centrifuge 5810R	Eppendorf	5811 07336
ImageJ/FIJI	Open Source	https://imagej.net/Fiji
M9 Buffer	Lab Prepared	https://openwetware.org/wiki/M9_salts
Microcentrifuge Tube (1.5 mL)	USA Scientific	1615-5500
Microseal F-foil Seal	Bio-Rad	MSF1001
NGM Plates	Lab Prepared	http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html#d0e214
Scalpel #15	Bard Parker	REF 371615
Sensoplate Plus, 384 Well, F-bottom, Glass Bottom	Greiner Bio-One	781855
Tetramisole Hydrochloride	Sigma Aldirch	T1512-10G
Tweezers, Dumont #3	Electron Microscopy Sciences	0109-3-PO
U-PlanApo objective (10× 0.4 NA)	Olympus	1-U2B823
U-PlanApo objective (60× 1.35 NA)	Olympus	1-U2B832