C. elegans Embriyonik Gelişimi Analiz Etmek Için Yarı-yüksek-throughput Görüntüleme Yöntemi ve Veri Görselleştirme Araç Seti

Summary

Bu çalışma, embriyogenezin 80-100 C.'de eşzamanlı 3Boyutlu hızlandırılmış görüntülemesine olanak tanıyan yarı-yüksek iş letme protokolünü açıklamaktadır. Ayrıca, veri çözümlemesi kolaylaştırmak için görüntü işleme ve görselleştirme araçları dahildir. Bu yöntemlerin özel muhabir suşları ile birleşimi embriyogenezin ayrıntılı olarak izlenmesini sağlar.

Abstract

C. elegans, embriyonik gelişim sırasında hücre kader özelliklerinin ve morfogenetik olayların sistematik analizinde önde gelen sistemdir. Bir sorun embriyogenez dinamik yaklaşık 13 saat bir süre içinde gelişir; bu yarım günlük zaman ölçeği, görüntülenebilen embriyo sayısını sınırlayarak deneylerin kapsamını kısıtlamıştır. Burada, orta zaman çözünürlükte 80-100 embriyoda, 14 farklı koşuldan, tek bir gecede, aynı anda 3D hızlandırılmış gelişim görüntülemesağlayan yarı-yüksek iş letme protokolü açıklıyoruz. Protokol basittir ve nokta ziyaret kapasitesine sahip bir mikroskoba erişimi olan herhangi bir laboratuvar tarafından uygulanabilir. Bu protokolün yararı, mikrop tabakası belirtimi ve morfogenezin önemli yönlerini görselleştirmek için optimize edilmiş floresan işaretleri ifade eden iki özel olarak üretilmiş suşları görüntülemek için kullanılarak gösterilmiştir. Verileri analiz etmek için, tüm kanallarda, z adımlarında ve zaman noktalarında tek tek embriyoları daha geniş bir görüş alanından eken ve her embriyo için dizileri ayrı bir tiff yığınına kaydeden özel bir program oluşturulmuştür. Kullanıcı dostu bir grafik kullanıcı arabirimi (GUI) içeren program, görselleştirme veya otomatik analize hazırlık olarak bireysel embriyoları izole ederek, ön işlemeye ve tek tip yönlendirerek veri işlemeyi kolaylaştırır. Ayrıca her zaman noktasında her embriyo için maksimum yoğunlukfloresan projeksiyon ve brightfield görüntüleri görüntüleyen bir çok panelli dosya içine bireysel embriyo verileri derleyen bir ImageJ makro. Burada açıklanan protokoller ve araçlar, daha önce tanımlanmış 40 gelişimsel genin yıkılmasından sonra embriyonik gelişimi karakterize etmek için kullanılarak doğrulanmıştır; bu analiz daha önce açıklamalı gelişimsel fenotipleri görselleştirmiş ve yenilerini ortaya koymuştur. Özetle, bu çalışma ayrıntıları bir kırpma programı ve ImageJ görselleştirme aracı ile birleştiğinde bir yarı-yüksek-throughput görüntüleme yöntemi, bilgilendirici floresan belirteçleri ifade suşları ile birleştiğinde, büyük ölçüde analiz etmek için deneyler hızlandırır embriyonik gelişim.

Introduction

C. elegans embriyo mekanistik hücre biyolojisi ve hücre kader özellikleri ve morfogenetik olayların analizi için önemli bir model sistemi embriyonik gelişim^{sürüş 1,2,3,4 ,5,6,7},^8,9. Bugüne kadar, embriyodaki hem hücresel düzeydeki olayların hem de hücre kaderi özelliklerinin karakterizasyonunun büyük bir kısmı, embriyoların her 10-100'de bir kez elde edilmesiyle göreceli olarak yüksek zamansal çözünürlük tesviye si kullanılarak elde edilmiştir. floresan belirteçler. Saniyeler ile on dakika arasında olan olaylar için çok uygun olsa da, bu yaklaşım teknik olarak daha uzun işlemlerin karakterizasyonu için, saat sırasına göre gün sınırlamaolur. Embriyonik gelişim ilk bölünmeden uzama sonuna kadar yaklaşık 10 saat sürer. Bu zaman ölçeğinde, farklı koşullardan daha büyük embriyo kohortlarının aynı anda daha düşük zaman çözünürlüğü görüntülemesini (yani, 5-20 dk zaman aralıklarında edinimi) sağlayacak yarı yüksek iş hacmi yöntemleri yeni bir deney yelpazesi ni açacak; örneğin, sistematik büyük ölçekli tarama çabalarının ve moleküler tedirginliklerin sonuçlarının karşılaştırılması için yeterli sayıda embriyonun analizini sağlamak.

Burada, 80-100 embriyoda, 14 farklı koşullarda, tek bir gecede gelişimin eşzamanlı 3Boyutlu hızlandırılmış görüntülemesini sağlayan C. elegans embriyogenezi izlemek için yarı-yüksek iş lenme yöntemini tanımlıyoruz. Protokolün uygulanması kolaydır ve nokta ziyaret yeteneklerine sahip bir mikroskoba erişimi olan herhangi bir laboratuvar tarafından gerçekleştirilebilir. Bu protokoldeki önemli adımlar Şekil 1'deözetlenmiştir. Kısacası, embriyolar ilgi floresan belirteçleri ifade gravid yetişkin ve görüntüleme için 384-well plaka kuyuları genç embriyolar (2-8 hücre evresi) transfer kesilir. Bu formatta, nispeten küçük ve iyi boyutlu huniler embriyoları dar bir alana aktararak, zaman atlamalı görüntüleme için birden fazla embriyo içeren alanların belirlenmesini kolaylaştırır. Embriyo kohort genelinde kabaca senkron gelişimi korumak için, diseksiyonlar soğutulmuş ortamda yapılır ve plaka buz üzerinde tutulur, hangi bir saat süren diseksiyon süresi sırasında önemli gelişmeyi önler. Plaka mikroskoba aktarılır ve embriyolar 2 μm adımlarda tam z aralığı toplamak için, 60x yağ daldırma 1.35 NA lens kullanılarak, 20 dakika zaman aralıkları, bir gecede sıcaklık kontrollü bir odada filme alınır. Her biri 1-5 embriyo içeren elli alan, tek bir gecede görüntülenir. İstenilen deneye bağlı olarak, görüntülenmiş alanların sayısını orantılı olarak azaltarak zaman çözünürlüğü (örneğin, 5-10 dk aralıklarla görüntüleme) artırılabilir.

Bu protokolle, tek bir gecede bile önemli miktarda veri (50 alana yayılmış 80-100 embriyo) üretir ve daha büyük deneyler veri analizi açısından hızla yönetilemez hale gelebilir. Bu verilerin işlenmesini, görselleştirilmesini ve çözümlenmesini kolaylaştırmak için, embriyoları kırpmak ve yönlendirmek ve ön işleme adımlarını (isteğe bağlı) gerçekleştirmek için bir program ve görüntülemeyi kolaylaştırmak için verileri derleyen bir ImageJ makrosu oluşturulmuştür. Bu programlar, yalnızca tek bir parlak alan düzlemi gerektiren görüntüleme yönteminden bağımsız olduklarından, geleneksel yaklaşımlar kullanılarak toplanan görüntüleri işlemek için kullanılabilir. İlk program birden fazla embriyo içeren bir 4D alan alır (GUI seçeneği veya kaynak kodu embryoCrop.py) veya birden fazla embriyo içeren birden fazla 4D alanları (screenCrop.py), sıkıca embriyolar bitkileri ve ön-posterior yapılandırma onları yönlendirir. Bu programlar ayrıca kullanıcılara arka plan çıkarma, sürüklenme düzeltme ve zayıflatma düzeltmesi yapma seçeneği de verir. Elde edilen dosyalar, otomatik görüntü analizi için değiştirilebilir her embriyo için düzgün bir şekilde önceden işlenmiş, sıkıca kırpılmış tiff yığınlarıdır. Her durum için tüm embriyoları görüntülemeyi kolaylaştırmak için, belirli bir durumdan tüm embriyoları tek bir tiff yığınına ve diziparlak görüntülere ve maksimum yoğunluklu projeksiyon rengine monte eden bir ImageJ makrosu (OpenandCombine_embsV2.ijm) yazıldı. RGB) her embriyo için yan yana bindirmeler. Yöntemler, mikrop tabakasının önemli yönlerini görselleştirmek için optimize edilmiş floresan işaretleri ifade eden özel olarak üretilmiş bir çift suşta daha önce tanımlanmış 40 gelişimgenin yıkılmasından sonra embriyonik gelişimi karakterize etmek için kullanılarak doğrulandı. özellikleri ve morfogenez^10,11. Birlikte, yarı-yüksek iş letme embriyo görüntüleme protokolü ve görüntü işleme araçları daha yüksek örnek numarası deneyleri ve gelişimsel süreçleri anlamaya yönelik büyük ölçekli tarama çabaları sağlayacaktır. Buna ek olarak, bu suşlar da embriyogenez üzerinde moleküler pertürbations etkilerini incelemek için etkili bir araç sağlayacaktır.

Protocol

1. C. elegans Embriyolarının Yarı-yüksek-yüksek-throughput Görüntüleme için hazırlanması

NOT: Protokolün bu bölümünün amacı, uygun marker suşlarından(Şekil 2)parçalanmış yarı senkronize (2 ila 8 hücreli evre) C. elegans embriyolarından oluşan bir popülasyonu görüntüleme için cam dipli 384 kuyulu bir plakaya yüklemektir. Diğer plaka biçimleri de işe yarayabilir, ancak küçük kuyu boyutu embriyoların yayılmasını nispeten küçük bir alana kısıtladığı için 384 kuyu plakası tercih edilir, bu da zaman atlamalı görüntüleme için birden fazla embriyo içeren alanların belirlenmesini kolaylaştırır. Kabaca embriyosenkronize bir alanda embriyoların her biri için gelişim tam ders yakalanan sağlar.

1. Buz gibi soğuk M9 ortamda çözünmüş tetramisole hidroklorür (TMHC) anestezik 5-10 mL çözeltisi (0.45 M Na₂HPO₄7H₂O, 0.11 M KH₂PO₄, 0.04 M NaCl, 0.09 M NH₄Cl) diseksiyon ve görüntüleme. Bu ortam, hareketli yumurtadan çıkan larvaların daha erken gelişim evrelerinde embriyoların görüntülenmelerini engellememesini sağlamak için bir anestezi içerir.
   NOT: Standart agarose pad montaj yöntemleri kullanılarak elde edilen verileri analiz etmek için kırpma ve görselleştirme araçlarını kullanıyorsanız, aşağıdaki bölüm 3'e geçin.
2. Aliquot 70 μL her durum için bir kuyu ile cam alt 384-iyi plaka bireysel kuyular içine hazırlanan çözüm; kenar efektlerini önlemek için plakanın dış iki satır kaçının.
   NOT: Yapışkan PCR plaka folyosu kullanarak kuyuları çevreleyen kuyuları maskelemek yararlıdır (Şekil 1D'dekiörneğe bakın) bu, gelecekteki deneyler için bitişik kuyuları korur ve diseksiyon mikroskobu altında uygun kuyuların bulunmasını kolaylaştırır. Çözelti bir kez aliquoted sonra, diseksiyon boyunca buz üzerinde plaka ve kalan çözelti tutun.
3. Depresyon slayt (gravid hermafroditler kesilir) kuyulara embriyo transferi için ağız pipetler oluşturun. Kılcal boruları (25°L kalibre edilmiş pipetleri) bir alev üzerinde çekin ve ince konik bir uç oluşturmak için kırın(Şekil 1D). Çapraz kontaminasyonu önlemek için her koşulda bir pipet gereklidir; kullandıktan sonra pipet atın.
4. Her durum için bir depresyon slayt üzerine aliquoted buz soğuk TMHC çözeltisi 150 μL içine bir diseksiyon kapsamı altında ~ 10 gravid yetişkin aktarmak için ince cımbız kullanın. Cımbız ve neşter kullanarak, embriyoları serbest bırakmak için solucanları inceleyin.
5. Pipetler ile birlikte aspiratör ek içine çekilmiş bir kılcal pipet yükve ağız pipet hazırlanan plaka bireysel bir kuyuiçine 2 ila 8 hücreli sahne embriyoların tüm aktarmak için(Şekil 1D). Geç evre embriyolar ve diseksiyon enkaz transfer kaçının. Bir diseksiyon kapsamı altında inceleyin ve embriyo ların agregaları mevcutsa, ağız boruyukarı ve aşağı veya dağıtmak için pipet ucu ile embriyoların kümeleri dokunun.
   NOT: Çapraz kontaminasyonu önlemek için, diseksiyon ekipmanlarını temizleyin ve koşullar arasında hareket ederken taze bir ağız pipeti kullanın. Diseksiyonlar arasında buz üzerinde plaka saklayın.
6. Her koşuldan solucanlar kesildikten ve embriyolar uygun kuyuya yerleştirildikten sonra, 384 kuyulu plakayı 1 dk 600 x g'de döndürün.
7. Herhangi bir kalıntıyı çıkarmak için plakanın altını etanollü bir mendille silin ve plakayı sıcaklık kontrollü bir ortamda plaka tutucuyla donatılmış bir konfokal mikroskoba yerleştirin.
   NOT: İzleyen adımlar, laboratuvar kurulumlarını kullanarak bu yöntemi ayrıntıya girer; lütfen satın alma koşullarını deneysel ihtiyaçlara ve ekipmanlara uyacak şekilde değiştirin. Burada, mikrolensle geliştirilmiş çift Nipkow iplik diski, 512 x 512 EM-CCD kamera, yüksek hassasiyetli otomatik XY-Stage (0,1 μm olarak belirlenmiş çözünürlük) ve motorlu z ekseni kontrolü (0,1 μm olarak belirlenmiş çözünürlük) ile donatılmış bir konfokal tarayıcı kutusu kullanılmaktadır. Bu sistem, gece görüntüleme sırasında 21 ile 23 °C arasında mikroskop sıcaklığını koruyan 16 °C'lik bir odada tutulur.
8. Uygun embriyolara sahip alanları belirlemek için, 10x 0.4 NA nesnel ve uygun görüntüleme yazılımı kullanarak her kuyunun ön taramasını yapın. En uygun alanlar, diğer embriyolarla aynı odak düzleminde olan birden fazla erken evre embriyo içerecek ve ideal olarak komşu embriyolar arasında en az temasa sahip olacaktır. Uygun bölgelerin konumlarını işaretleyin.
9. Görüntüleme alanlarını seçmek için 60x hedefine geçin ve her noktada odak düzlemini uygun şekilde embriyoları bölüme göre ayarlayın. 14 kuyuda toplam 50 alan için her kuyuda 1-4 alan görüntülenir ve her alan bir ile beş embriyo içerebilir. Genel olarak, 4-15 embriyolar yüksek çözünürlüklü görüntüleme için her koşuldan seçilir.
   NOT: Bu adımda önemli bir değişken yeterli yağ kullanımıdır; tüm kuyuların yüzeyine yağ yaymak ve daha sonra alanların seçimi önce hedefe yağ ek bir damla uygulamak için her kuyuda ziyaret noktaları, objektif yağ yerleştirin.
10. 60x 1.35 NA hedefi kullanarak seçilen alanları 2 μm aralıklarla 10 saat boyunca her 20 dakikada 18 z kesitelde etmek için görüntüleyin. Germ tabakası ve morfogenez muhabiri suşları kullanılarak görüntüleme koşulları aşağıdaki gibidir: brightfield, 90% güç, 25 ms, 20% kazanç; 488 nm, %100 güç, 200 ms, %60 kazanç; 568 nm, %45 güç, 150 ms, %60 kazanç.
11. Görüntüleme tamamlandıktan sonra, embriyonik öldürücülüğü düşük büyütme (10x 0.4 NA hedefi) tüm iyi brightfield taraması ~ 20-24 saat geceleme başladıktan sonra gerçekleştirerek değerlendirmek.

2. Embriyonik Öldürücülük Puanlama

1. Post-run 10x taranmış alanları kullanarak, her kuyu için yumurtadan solucanlar ve yumurtadan çıkmamış embriyolar sayarak embriyonik öldürücülük ve larva kusurları değerlendirmek.
2. Yumurtadan çıkmamış embriyoları embriyonik öldürücü olarak puanla. Genç parçalanmış embriyolar bazen yumurta kabuğu oluşumunu tamamlayamadığından (mayoz II henüz tamamlanmamışsa) ve geçirgenlik kusurları ilk iki sinde ozmotik komplikasyonlara yol açabileceğinden, tutuklanan bir ila dört hücreli embriyoları öldürücü lük sayısından hariç tutabilirsiniz. Bölüm.
3. Puan kısmen yumurtadan veya tamamen yumurtadan solucanlar vücut morfolojisi veya davranışsal kusurları ile, dumpy veya felç gibi, 'anormal larva' olarak.

3. Otomatik Kırpma (Şekil 3A)

NOT: Yazılım iki yerde yer almaktadır: (1) Zenodo herhangi bir programlama uzmanlığı gerektirmeyen yazılım¹² kullanıcı dostu bir sürümünü evler. (2) Github, Python ile yeterlilik gerektiren embryoCropUI.py ve screenCrop.py^{yazılımımız 13'ün}kaynak kodunu içerir. Programın her iki versiyonunu indirmek ve işletmek için ayrıntılı talimatlara aşağıda niçin yer bulabilirsiniz.

1. embryoCropUI çalıştırılabilir sürümü kullanarak otomatik kırpma (kullanıcı dostu sürümü)
   1. embriyoCropUI programı kullanmak için, ilk Zenodo programı indirmek (https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w)¹².
      1. Programın MacOS veya Windows formatında sürümünü indirin (MacOS sürümünün MacOS X10.11 veya üzeri gerektirdiğini unutmayın).
      2. Test etmek ve embriyoCropUI programını kullanmak için adım adım talimat veren talimatlar dosyasını(GUI_Instructions_zenodo_repoV2.docx)indirin.
      3. Programın platformda düzgün çalışıp çalışmamasını test_files.zip'i indirin (talimatlara bakın).
   2. Bir kez indirilen, unzip ve embriyoCropUI yürütülebilir bulmak için gidin (...\embriyoCropUI\_WINDOWS\embryoCropUI\embryoCropUI.exe)veya (...\embriyoCropUI\_MacOS\embryoCropUI\embryoCropUI\embryoCropUI.exe). Çift tıklayın başlatmak için (veya 'ile açık' terminalseçti) ve embriyoCropUI yürütülebilir çalıştırın.
   3. GUI çalıştırılabilir bir seferde bir 4B görüş alanı ekinler. Sol üst köşede, kırpma (multi-tiff) için belirli bir alanı yüklemek için açık düğmesini seçin. Birden çok boyutu (örneğin, z, zaman, kanal) içeren bir tiff serisini kırpmak, yalnızca klasör içindeki serideki ilk görüntüyü (klasör başına bir tiff serisi) yükler.
   4. Görüntüler yüklendikten sonra aşağıdaki bilgileri belirtin: z- dilim sayısı, (Z), zaman noktası sayısı (T), kanal sayısı (C), DIC veya brightfield'a karşılık gelen kanal (birinci=1, ikinci=2, vb.).
   5. Görüntülerde çalıştırmak için ek işleme seçin. Program Drift Düzeltme, Arka Plan Çıkarma ve Zayıflama Düzeltme söner.
   6. GUI isteminde işleme çabalarını yönlendirmek için Arka Plan Çıkarma ve Zayıflama Düzeltmesi parametrelerini belirtin. Arka Plan Çıkarma için, anlamlı sinyalboyutunu yansıtacak en büyük özellik boyutunu tanımlayın; bu özellik boyutu arka plan olarak kabul edilmemeli ve tek bir sayı değeri olmalıdır. Zayıflama Düzeltmesi için 0-1'den bir değer girişi. Zayıflatma Düzeltme değeri, görüntülenen nesnenin en uzak derinliğinde kalan orijinal yoğunluğun yüzdesini yansıtır.
      NOT: Arka Plan Çıkarma ve Zayıflama Düzeltmesi birlikte çalıştırılmalıdır.
   7. Görüntü toplama sırasını (yani kanal-z-time (czt) veya z-kanal zamanı (zct)) belirtin.
   8. Kullanılan kameraya dayalı görüntüler için piksel başına mikronları belirtin.
      NOT: Piksel boyutu düzgün tanımlanmamışsa, kötü görüntü kırpma oluşur.
   9. Sol alt köşede Çalıştır'ı seçin. Kırpılmamış klasörle aynı yolda "kırpma" etiketli yeni bir alt klasör oluşturulur; kırpılmış sürümler bu konumda kaydedilir. Dosya boyutuna bağlı olarak, kırpma saniye ler dakika içinde tamamlanmalıdır.
2. screenCrop.py kullanarak otomatik kırpma (yukarıda açıklanan embryoCrop GUI için toplu sürüm alternatif;Python anlayışlı kullanıcılar sadece)^10,13
   1. screenCrop.py kullanmak için, python yazılım sürümü daha büyük veri kümelerini toplu biçimde kırpmak, klonlamak veya kaynak kodu Github'dan indirmek için (github.com/renatkh/embryo_crop.git).
   2. Uygun bir sanal ortamı yapılandırma yönergelerini okuyun ve açıklanan dosya adlandırma sistemini izleyin; her ikisi de Github deposundaki README dosyasında ayrıntılı olarak açıklanır: https://github.com/renatkh/embryo_crop/blob/master/README.md.
   3. Çevresel değişkenler ve adlandırma kuralları düzgün bir şekilde oluşturulduktan sonra, açık parameters.py ve tercih edilen bir editörde screenCrop.py.
   4. Kaynak koduna dokunmadan ayarlanabilir parametreleri değiştirmek için parameters.py dosyasını düzeltin.
      NOT: screenCrop.py üstbilgi içindeki parametreleri doğrudan değiştirmek de mümkündür.
      1. yapılandırma parameters.py kullanıyorsanız, use_configure ayarını True olarak değiştirin. screenCrop.py içinde doğrudan düzenleme kullanıyorsanız, use_configure ayarını False'da bırakın.
      2. parameters.py dosyasında aşağıdaki bilgileri bulun ve istenilen görüntüleme parametrelerine ve dosya yapısına uygun değişiklikler yapın:
         1. loadFolder (satır 9): Dosyaların depolandığı sürücüye göre değiştirin (örn. Z:/, D://, vb.)
         2. tarih (satır 7): Görüntüleme oturumu için dosya içeren klasöre değiştirin. Buna CSV izleme dosyasında 'Deneme Klasör Adı' adı verilir (yönergelere bakın).
         3. trackingFile (satır 11): Deneme bilgilerinin depolandığı CSV dosyasına giden yolu değiştirin.
         4. z (satır 13): z düzlemlerinin sayısı olarak ayarlayın.
         5. nT (satır14): Zaman noktaları nın sayısı olarak ayarlayın.
         6. nWells (satır 19): Kullanılan kuyu sayısı olarak ayarlayın.
         7. pointVisits (satır 20): En fazla nokta ziyaret sayısı olarak ayarlayın (kuyu başına).
         8. Satır 10'da şu anda 'CV1000/' tarafından işgal edilen konumu bulun ve dosya yolunda kullanılan dış klasörü girin. Sorunları önlemek için aşağıdaki kuralı kullanın: 'XXXXXXX/'.
         9. Satır 12'de kırpılmış veriler için en boy oranı verilerini depolamak için geçerli bir dosya yolu girin.
         10. 15, 16, 17 ve 18 satırında, görüntülerin aşağıdaki işleme girip girmediğine göre True/False girişi:
             1. Satır 15'te sürüklenme düzeltmesi için Doğru veya Yanlış girişi.
             2. Satır 16'da arka plan çıkarma için Doğru veya Yanlış girişi. Özellik boyutu, farklı işaretleyici suşları ve piksel boyutları için ampirik olarak belirlenmelidir. Buradaki yapılandırmada özellik boyutu Germ-Layer suşu için 41 ve Morfogenez suşu için 201 olarak tanımlanmıştır. Arka plan çıkarma zayıflama düzeltmesi ile birlikte yapılmalıdır.
             3. Satır 17'de zayıflama düzeltmesi için Doğru veya Yanlış girişi.
             4. Satır 18'de ön arka döndürme için True veya False girişi.
   5. Tüm değişiklikler yapıldıktan sonra kırpma başlayabilir. Bunu yapmak için screenCrop.py'ye geçin ve araç çubuğundaki oynat simgesini seçin, açılan menüde Çalıştır > Python Çalıştır'ıseçin.
   6. Kırpma büyük bir veri kümesi (50 nokta ziyaret 18 z adımları, 3 kanal, 31 zaman noktaları) tamamlamak için birkaç saat sürebilir gibi, konsol penceresinde kırpma ilerleme izleyin. Kırpma tamamlandıktan sonra, küçük bir pencere kaydetmeden önce kırpılan görüntülerin önizlemelerini gösterir. Her görüntü için 3 seçenek vardır:
      1. Kaydet: Görüntü, ilgi alanı kesilmeden düzgün kırpılırsa görüntüyü kaydetmek için Space Bar'a basın.
      2. X: Görüntünün ilgi alanları kesilmiş gibi görünüyorsa X tuşuna basın; görüntü, diğer resimlerden ayırmak için ismin önündeki X ile kaydedilir.
      3. Delete: Görüntü düzgün kırpılmış değilse veya embriyo tatmin edici değilse kırpılmış görüntüyü silmek için D tuşuna basın.
         NOT: Görüntüler Yük Klasöründe "Kırpılmış" adlı bir alt klasöre kaydedilir (programın 9 satırında tanımlanır).

4. Görselleştirme (Şekil 4)

NOT: OpenandCombine_embsV2.ijm^10,12 belirli bir gerginlik ve durum için tüm görüntülerden tiff dosyasını görüntülemek kolay bir imageJ makrodur. FIJI/ImageJ^14,15 kurulumu gereklidir. Bu makro dosya yapımıza göre çalışır; diğer dosya yapıları ile çalışmak için değiştirilmesi gerekir. Zenodo deposundaki GUI_Instructions_zenodo_repoV2.docx dosyasının sonunda uygun dosya yapısı ve önemli hususların ayrıntılı açıklaması için bir kılavuzbulunabilir. Lütfen bu makro ile en iyi arayüz için düzgün isim ve yapı dosyaları görüntüleme önce tamamen bu yönergeleri okuyun. Başvuru için, dosya konum yapımız şuna benzer:
Z:\kırpılmış\Hedef\Strain\Emb#\Target_Emb#_15 Haneli Benzersiz Tanımlayıcı _W##F#_T##_Z##_C#.tif
yani Z:\kırpılmış\EMBD0001\GLS\Emb1\EMBD0001_Emb1_20140327T135219_W02F1_T01_Z01_C1.tif

1. Karşıdan yükleme OpenandCombine_embsV2 ve GUI_Instructions_zenodo_repoV2.docx from Zenodo (https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w).
2. Aşağıdaki bilgileri hazırlayın:
   -Resim klasörlerinin depolandığı konum (kırpmadan sonra).
   -Belirli bir koşul(lar) için görüntü klasörü adı(lar) işlenecek (yani, EMBD0002). Bu, yukarıdaki örnekte "Hedef" olarak adlandırılır
   -Belirli bir gecede denemeye özgü 15 basamaklı alfa-sayısal benzersiz tanımlayıcı-bu tanımlayıcı veri toplama klasöradıdır (yani, 20140402T140154) ve benzersiz tanımlayıcı tek tek tiff dosya adına gömülüdür (EMBD0002_Emb1_ 20140402T140154_W06F2_T01_Z01_C1) o gün resimde her embriyo için. Makro, aynı tarihte edinilen embriyoları denetlemek için bu tanımlayıcıyı kullanır ve ayrı tarihlerde tekrarlanan koşulları ayrı ImageJ dosyalarında biraraya getirebilir.
3. ImageJ'i açın ve makro dosyasını, OpenandCombine_embsV2.ijm'isürükle ve bırak, ImageJ çubuğuna veya makroyu doğrudan açın.
4. Makro açıldıktan sonra 3 ve 4. (Bölüm 4.2) içinde toplanan bilgileri aşağıdaki adımlara göre girdi:
   1. Satır 3'te (RNAL), işlenecek görüntülerin hedef adını girin. Aşağıdaki yapı newArray her hedef girin("XXXXXXXX/"); tırnak ekle. Aynı anda birden fazla koşulu çalıştırmak için, virgülle ayırmak ve tüm hedef adları parantez içinde tutmak için ("EMBD00000/","EMBD0001/","EMBD0002/").
   2. Satır 4'te (tarih), 15 basamaklı alfa-sayısal benzersiz tanımlayıcıyı tırnak içinde girin, örneğin newArray("20140402T140154").
5. Makro penceresinin sol alt kısmında çalıştır'a basın. Kırpılmış resim klasörlerini içeren (4.4.1'de belirtilen) dış klasöre gitmek için bir istem başlatacak bir pencere görüntülenir.
6. Seçildikten sonra, görüntüleme parametrelerinin belirtimine izin verecek başka bir pencere görüntülenir.
   1. Kanal sayısını, Z dilimlerinin sayısını, derlenen görüntüleri etiketlemede kullanılan metnin yazı tipi boyutunu ve her bir kanalın rengini girin.
   2. Tüm kanallarda otomatik zıtlığı kontrol edin/kapatın.
7. Tüm parametreler belirtildikten sonra, pencerenin altındaki Tamam'ı tıklatın. Bileşik dosya biraraya başlayacak; bu, durum başına, tamamlamak için birkaç dakika sürer.
8. Tamamlandıktan sonra, istenirse açık bırakılan dosyaları gözden geçirin. Makro zaten aşağıdaki şekilde adlandırılmış yeni oluşturulan bir klasöre dosyaları kaydetmiş gibi, kaydetmeden kapatılabilir: dış klasör adı (bölüm 4.5 isteminde belirtilen) + "-fiji-işlenmiş-çıktı" (yani, Z:\ kırpılmış-fiji-işlenmiş-çıktı\EMBD0002_GLS_20140402T140154.tif).

Representative Results

Moleküler tedirginliklerin C. elegans embriyonik gelişimi üzerindeki etkisini karakterize etmede önemli bir zorluk, embriyoların ilk bölünmeden 20°^16'dauzama nın sonuna kadar ilerlemesi için yaklaşık 10 saat almasıdır. Büyük embriyo kohortlarının aynı anda görüntülenebileceği yarı yüksek iş yapma yöntemi, bu zaman ölçeğindeki olaylar için yararlıdır, çünkü her koşul için yeterli topluluk boyutuna paralel olarak birden fazla koşulun görüntülenmesine izin verir. kantitatif analiz (Şekil 1A).

Yarı-yüksek iş lenme görüntüleme yöntemi ve çok marker suşları
Burada açıklanan yarı yüksek iş lenme görüntüleme yöntemi (Şekil 1B'deözetlenmiştir), 384 kuyulu cam alt plaka kullanır; çok iyi format, 14'e kadar koşulun paralel olarak dizilmesine olanak sağlar ve kuyuların küçük boyutu arama alanını kısıtlar ve yüksek çözünürlüklü görüntüleme için embriyo içeren alanların tanımlanmasını kolaylaştırır. Burada, mikrolensle geliştirilmiş çift Nipkow iplik diski, 512 x 512 EM-CCD kamera, yüksek hassasiyetli otomatik XY-Stage (0,1 μm çözünürlükte) ve motorize z ekseni kontrolü (0,1 μm olarak belirlenmiş çözünürlük) ile donatılmış bir konfokal tarayıcı kutusu kullanılmıştır. Ancak protokol, hassas nokta ziyaret yeteneklerine ve çok kuyulu bir plakaya sahip bir sahne adaptörüne sahip herhangi bir konfokal mikroskop için uyarlanabilir. Bu yöntemin geliştirilmesinde önemli bir sorun, gelişimin bütününün her alandaki tüm embriyolar için ele geçirilebilmeleri için aynı gelişim aşamasında bir dizi embriyo oluşturmak için bir araç geliştirmekti. Bu bir meydan okumadır, çünkü görüntüleme plakasına dizili embriyolar daha sonra örnekler kesilirken gelişmeye devam eder ve bu da kuyular arasında evreleme nin bir degradesi ile sonuçlanır. Bu sorunu aşmak için, erken evre embriyolar (2-8 hücre evresi) seçilir ve diseksiyon ortamı ve görüntüleme plakası buz üzerinde tutmak; tüm koşullar önemli ölçüde embriyonik canlılık¹⁰etkilemeden dizili olana kadar bu diseksiyon embriyogenez için embriyogenez duraklar . Embriyoların buzüzerinde kalma süresini 1 saatle sınırlamak için, iki araştırmacı diseksiyonları aynı anda gerçekleştirir, bu da yaklaşık 50 dakika içinde 14 farklı koşulun ayarını sağlar. Diseksiyon dan sonra, plaka embriyoları tortulamak için 1 dakika için 600 x g döndürüldü ve kuyular yüksek büyütme görüntüleme için uygun embriyo grupları ile alanları bulmak için düşük büyütme önceden taranmış; nokta ziyaret konumları işaretlenir. Embriyolar bir gecede 60x yağ daldırma 1.35 NA lens kullanılarak sıcaklık kontrollü bir odada filme alınır. Numuneler 4 kuyu ile 4 kuyu bölgesinde yapılandırılır, böylece bir deneyde kullanılan plakanın yüzey alanı 60x yağ amacının kullanılmasını sağlayan 22 x²² mm 2 standart kapak lı ile karşılaştırılabilir. Görüntüleme başlamadan önce petrolün bu bölgeye tek tip olarak yayılması, başarılı uzun vadeli görüntü edinimi için kritik öneme yöneliktir. Gelişmekte olan embriyolar anestezi içeren bir çözelti de görüntülenir; bu, kuyu ambarı içindeki yaşlı embriyoların hareketlerinin, görüntüleniyor olan komşu genç embriyoların konumunu bozmamasını sağlar. Yumurta kabuğunun aşılmaz doğası nedeniyle, anestezi yumurtadan çıkmadan önce hareketi etkilemez. Bu koşullar altında, 3D hızlandırılmış veriler tek bir gecede yapılan deneyde toplam 80-100 embriyo için 3 kanalhalinde toplanır (aşağıda daha fazla tartışılmıştır).

C. elegans embriyonik gelişim iki aşamada gerçekleşir. İlk olarak, hücre kader belirtimi ile birleştiğinde hücre bölünmesi 10 tur 6 saatlik bir süre içinde üç mikrop katmanları (ektoderm, mezoderm ve endoderm) oluşturmak¹⁷. Aşağıdaki 7 saat, morfogenetik olaylar farklılaşmış dokuların oluşumusürücü^8,16. Geliştirmenin bu iki yönünü yakalamak için, bir çift özel suş inşa ettik, Mikrop Tabakası ve Morfogenez suşları¹⁰ (Şekil 2A), ve her iki suştan gelen embriyoları görüntülemek için yarı-yüksek iş lenme protokolünü kullandık. Germ Layer türü, ektoderm, mezoderm ve endoderm'deki çekirdekleri kırmızı, sarı ve yeşil olarak işaretleyen transgen kodlu floresan proteinleri ifade eder. Bu tür üç muhabir transgenes içerir: (1) pha-4 ifade eden bir transgen::GFP bu bağırsak ve farinks çekirdekleri işaretleri (yeşil endoderm)^10,18,19, (2) bir transgen ifade epidermisin de mCherry-histone füzyon ve nöronların ~ 1/3 (kırmızı ektoderm; Şekil 2A), ve (3) aynı anda vücut duvar kas (sarı mezoderm) mCherry ve GFP etiketli histones ifade eden bir transgen. Morfogenez suş ekspres iki transgen vardır: (1) bir yeşil epitel kavşak belirteci (DLG-1::GFP) epidermis, ve (2) bir mCherry etiketli plazma membran marker, ~ 1/3 nöronlar (Pcnd-1 organizatörü; Şekil 2A). RNAi etkinliğini artırmak için, her iki suş da RNAi-sensitizing mutasyonlar bir çift içerecek şekilde tasarlanmış(nre-1(hd20) lin-15b(hd126)²⁰. Bunlar, embriyonik gelişim için gerekli olan ~2.000 genin büyük ölçekli RNAi tabanlı bir taramasını gerçekleştirmek amacıyla inşa edilmiştir. Ancak, bu suş çifti aynı zamanda mutantlarda gelişimsel kusurları değerlendirmek için ve gelişimde farklı proteinlerin rollerinin daha ayrıntılı analizleri için geniş kapsamlı standartlaştırılmış bir platform oluşturacaktır.

Bu yarı yüksek iş verisi formatında veri toplama için, bu suşlarla, yeşil, kırmızı ve parlak alanz serisi (18 x 2 μm² aralık) toplanır, her ~20 dk, 16 °C sıcaklık kontrollü bir odada 10 saat süreyle; bu çalışma sırasında 21-23 °C arasında mikroskop tutar. 20 dk zaman aralığı bize deney başına embriyoların 50 alanları (nokta ziyaretleri) görüntü sağlar. Kullanıcılar, satın almaları daha az nokta ziyaretiyle daha kısa aralıklara veya deneysel hedeflerine en uygun noktaya daha fazla nokta ziyaretiyle daha uzun aralıklara uyarlayabilir. Bu suşlar için erken gelişimsel zaman noktaları görüntülenmez, çünkü marker ekspresyonu kullanan dokuya özgü muhabirler orta-geç gastrulation'a kadar ifade etmeye başlamaz. Bu erken evrede, kuyular düşük büyütme (10x) olarak tarandı ve yüksek büyütme görüntüleme için alanlar seçildi. Birden fazla erken evre embriyo içeren alanların seçilmesi önerilir, ancak embriyoların kısmen örtüştüğü, aşırı kalabalık olduğu veya kuyunun aşırı kenarında bulunduğu alanlardan kaçınmak önerilir. Bir gecede 60x görüntülemenin ardından, embriyoların normal görünümde (WT), görünür anormallikleri (larva anormali) olan veya değerlendirilen her durum için embriyonik öldürücü olup olmadığını belirlemek için düşük büyütme (10x) bütün kuyu taraması yapılır ( Şekil 1B). Bu adım, daha büyük bir popülasyondaki öldürücülüğü değerlendirmek için paralel olarak plaka lar kurmak için kolay bir alternatif görevi görmekte; tüm iyi 10x post-tcan durum başına 50-80 embriyolar üzerinde embriyonik öldürücüveri verileri sağlar. Bu ölçüyü, popülasyon embriyonik öldürücülük verilerini, koşular arasındaki kontroller için karşılaştırmak için kullanmak, suşların sağlığı ve çevre koşulları ve işleme adımları açısından tutarlılık sağlayan yararlı bir kontroldür. Birlikte görüntülendiğinde, iki özel muhabir suşları hücre kader belirtimi, dorsal intercalation, epidermal muhafaza, uzama ve nörogenez (temsilcisi dahil olmak üzere en önemli gelişimsel olaylar için bilgilendirici okumalar sağlar kontrol görüntüleri Şekil 2B'degösterilmiştir , ayrıca bkz. Wang ve ark.¹⁰).

Veri işleme: otomatik embriyo kırpma ve oryantasyon
Görüntüleme protokolümüz ile her yüksek çözünürlüklü görüntüleme alanı 1 ile 5 embriyo içerir; bu embriyolar rastgele yönlendirilir ve sık sık hemen birbirlerine bitişik konumlandırılır. Geleneksel embriyo montaj teknikleri kullanılarak toplanan veriler de aynı zorluklardan muzdarip. Verileri sonraki görselleştirme ve analiziçin hazırlamak için, embriyo dizilerini kırpmak ve yönlendirmek için önemli pratik manipülasyona ihtiyaç vardır, ayrıca arka planı çıkarmak, sürüklenme için düzeltme ve sinyal zayıflatma larını telafi etmek için bunları önceden işlemek için derinliği ile. Bu süreci kolaylaştırmak için, her embriyoyu daha geniş bir alandan izole eden ve yönlendiren özel bir embriyo kırpma programı oluşturulmuştu(Şekil 1C, Şekil 3). Bu program, bir embriyo alanının 3D hızlandırılmış sırasını içine alabilen ve tek tek tiff serisine dönüştürebilen grafiksel kullanıcı arabirimi (GUI, çoğu görüntüleme platformundan gelen verilerle uyumlu) kullanıcı dostu, tek başına bir program olarak paketlenmiştir. alandaki her embriyo için(Şekil 3B, https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w mevcuttur)^10,12. GUI (embryoCropUI.py) için Python kaynak kodu ve bu programın toplu sürümü (screenCrop.py) github (https://github.com/renatkh/embryo_crop.git)^10,13deneyimli Python kullanıcıları için de kullanılabilir. Bu programın temel işlevi, anterior-posterior ekseni boyunca embriyo bulmak, kırpma ve yönlendirmek. Aynı anda, isteğe bağlı ayarlanabilir ayarlar kullanılarak veri setinde arka plan çıkarma, zayıflatma düzeltme ve sürüklenme düzeltme sayılabilir.

Kısaca, otomatik kırpma yazılımı, parlak alan görüntülerinden elde edilen ikili maskedeki tek tek embriyoları tekrartekrar algılar ve tüm kanallardan embriyoları sırayla eker ve görüntüleri ön-posterior eksen boyunca yönlendirir (Şekil 3 B, ilk Wang ve ark.¹⁰açıklanan). Kırpma dan önce, yazılım sürüklenme için düzeltir, arka planı çıkarır ve her floresan kanalında (isteğe bağlı) derinlik azaltma düzeltmesi gerçekleştirir. İkili maskeyi elde etmek için, yazılım canny kenar algılama^21'i parlak alan görüntülerine uygular, üç merkezi düzlemin maksimum yoğunluklu projeksiyonunu gerçekleştirir ve küçük delikleri doldurur. Algoritma, ikili maske anahattının bir bölümüne cassini oval takarak tek tek embriyoları algılar (Bkz. Şekil 3B, 3C). Oval'i ana ekseni boyunca hizaladıktan sonra, yazılım izole embriyonun her yarısında kırmızı floresan yoğunluğunu ölçer ve embriyoyu kırmızı yoğunluğu nisbeten sola doğru yönlendirilir, bu da embriyonun her iki ekseni için de sola bu çalışmada kullanılan muhabir suşları (Şekil 3D). Bu yazılımın pilot luk ları, embriyoların çoğunun beklendiği gibi verimli bir şekilde kırpıldığını ortaya çıkardı. Embriyo kayması, geçici odak düzlemi kaybı (yağdaki kabarcıklar nedeniyle) veya embriyoların kalabalık alanları gibi küçük görüntüleme sorunları genellikle başarılı kırpma bozmadı. Ancak, büyük embriyo kümelerinin olduğu alanlar için (z'de bir miktar örtüşen), görüntüleme düzlemi içinde önemli ölçüde eğilmiş embriyolar (Z'de), uzun süreli fokal düzlem kaybı veya kısmen kesilmiş embriyolar için, başarılı kırpma her zaman Elde. Bu sorunlar, veri toplama aşamasında daha iyi alan seçimi ile kolayca atlatılabilir. Genel olarak, bu yarı-yüksek iş lenme yöntemi yle toplanan veya geleneksel montaj yöntemleri kullanılarak toplanan ön işleme verileri, embriyonik veri kümelerini görselleştirmek ve analiz etmek için yararlı bir ilk adımdır.

Görüntü toplama ve veri işleme yöntemlerinin doğrulanması: daha önce tanımlanmış 40 genin yıkılmasından sonra embriyonik gelişimi görselleştirin
Bu yarı yüksek işlemli görüntü toplama yöntemini ve özel kırpma rejimini doğrulamak için, hücre kader belirtimi ve morfogenezde daha önce tanımlanmış fonksiyonlara sahip 40 genin karşısına yönlendirilen özel suşlarda küçük bir RNAi ekranı yapılmıştır ( Wang, Ochoa, Khaliullin ve meslektaşları^10,11)tarafından açıklanan. Bunu yapmak için, dsRNA her hedefe karşı oluşturuldu, her suş L4 hayvanlar enjekte, 20-24 saat bekledi, ve sonra dışarı diseksiyon ve yukarıda açıklanan protokolü kullanarak embriyogörüntü (tam veri seti^10,11için). RNAi ile gelişimsel fenotiplerin elde edilebilmektedir hem maternal hem de zigotik gen ekspresyonunun inhibisyonu gerektirir. Gelişimsel genler anne tarafından ifade edilebilir, ortaya çıkan protein ürünleri embriyolara yüklenir, ya da zigotik olarak embriyoda ifade edilir, ya da, birçok durumda, her ikisi de^10,22,23. Enjeksiyon ve embriyo çekimi arasındaki zaman, anneve zigotik olarak ifade edilmiş popülasyonları etkili bir şekilde hedeflemek için kritik bir değişkendir; zamanlama, zigotik^ekspresyonu önlemek için embriyoya yüklenen enjekte edilen dsRNA miktarını ve maternal protein tükenmesinin derecesini belirler. DSRNA enjeksiyonundan sonra hedeflenen gene karşılık gelen maternal mRNA bozulur ve ilgili zaman aralığında iyileşmez. Önceden var olan protein tükenmesi embriyo üretimini gerektirir, bu da maternal proteini germline dokularından embriyo oluşturmaya yükleyerek dışarı çıkarır. 20 °C'de 20-24 saat, tutarlı anne tükenmesine izin veren en kısa kuluçka süresidir; maternal tükenmesi daha sonraki zaman noktalarında daha iyi olur (yani, enjeksiyondan sonra 36-42 saat). Embriyoya yüklenen enjekte edilen dsRNA miktarı zigotik gen ekspresyonunun önlenmesinin ne kadar etkili olacağını belirler. Enjekte edilen materyalle embriyolar ilk döllendiğinde, enjeksiyondan sonra yüklenen RNA miktarı yaklaşık 5-10 saat eve ulaşır ve bundan sonra azalmaktadır. Deneyimlerimize göre, enjeksiyondan 24 saat sonra, maternal protein tükenmesi ve zigotik gen ekspresyonunun inhibisyonu etkili olan optimal bir zaman noktasıdır. Bu çalışmada kullanılan özel muhabir suşlarında, 40 test geni nin toplamında, fenomeniplerin analizi, kombine protokolümüzün hücre kaderinde yer alan genlerin geniş bir spektrumu arasında farklı, son derece tekrarlanabilir imza fenotipleri ortaya çıkardığını gösterdi. özellikleri ve morfogenez (bkz. Wang ve ark.^10); tam veri kümesi kullanılabilir¹¹). Bu verilere örnek olarak, kontrol için dört farklı embriyonun hareketsiz görüntüleri, pha-4(RNAi), pal-1(RNAi)ve mex-3(RNAi) mikrop tabakası muhabiri suşu şekil 4A'dagösterilmiştir. 40 genli RNAi ekranında gözlenen fenotiplerin daha kapsamlı bir şekilde tartışılması için Wang ve ark.¹⁰

ImageJ makro: Belirli bir durum için tüm verilerin derlenmesi ve görüntülenmesi
Tek tek tiff yığınlarından çok sayıda embriyonun görselleştirilmesi sıkıcı ve zaman alıcı olabilir. İlk çabamızdan itibaren >400 bireysel embriyolar yukarıda açıklanan özel otomatik kırpma programı kullanılarak izole edildi. İlk geçiş analizini hızlandırmak için, belirli bir gerinim arka planında belirli bir RNAi durumu için görüntülenmiş tüm embriyolardan oluşan bir dizi oluşturan bir ImageJ makrosu oluşturduk(Şekil 4B). Dizideki her embriyo için, bir bileşik film dosyası oluşturmak için her zaman noktası için bir brightfield görüntüsü ve maksimum yoğunluklu projeksiyon görüntüsü yan yana sunulur. Bu makro dosya yapımızla çalışacak şekilde yazılmış olsa da, kullanıcının dosya yapısına uyacak şekilde düzenlenebilir. Ancak en iyi sonuçlar için, kullanıcılar protokolde belirtilen adlandırma ve dosya yapısı kurallarını izlemelidir (Python ve ImageJ uygulama adlandırma kuralları için daha fazla ayrıntı için Zenodo veya Github README dosyalarına bakın). ImageJ işlenmiş verilerin tümünün görüntülenmesi ve 40 gen test seti için gözlenen fenotiplerin daha ayrıntılı analizini almak için lütfen Dryad veritabanında biriken verilere bakın^10,11. Bu ImageJ görselleştirme biçimi, genel fenotip ve penetrasyon hızlı bir değerlendirme sağlar ve enkaz varlığı veya odak düzlemi kaybı gibi veri kalitesi sorunları bayrak kolaylaştırır. Genel olarak, yarı-yüksek-iş hacmi veri toplama yöntemi, kırpma programı ve ImageJ görselleştirme aracı, özel muhabir suşları ile birlikte kombinasyonu, büyük ölçüde embriyonik gelişimi çalışma için daha büyük ölçekli çabaları kolaylaştırır.

Şekil 1. Yüksek içerikli görüntüleme yöntemine, veri işleme prosedürüne ve temel araçlara genel bakış. (A) C. elegans embriyolarının yarı-yüksek-yüksek üretim çok kuyulu görüntüleme yaklaşımına monte edilmesi için standart agarose pad tabanlı yöntemin özelliklerinin karşılaştırılması burada açıklanmıştır. (B) Embriyonik gelişimi izlemek için yarı-yüksek iş lenme yöntemine genel bakış. Ayrıntılar için metne bakın. (C) Geleneksel agarose pad tabanlı montaj prosedürü veya burada açıklanan yarı yüksek iş letimatlı çok kuyulu plaka tabanlı yöntem kullanılarak elde edilen verilerde kullanılabilecek veri işleme ve görselleştirme araçlarına genel bakış. Bir alandan (solda) veya birden fazla 3 kanaldan tek bir 3 kanallı zaman atlamalı embriyo dizisi, 4 boyutlu embriyo veri alanları (sağda) çoğu görüntüleme platformunda yakalanan verilerle uyumlu olan özel kırpma programı kullanılarak işlenebilir. Programın grafik kullanıcı arayüzü (GUI) sürümü kullanıcı dostudur ve herhangi bir programlama uzmanlığı gerektirmez. screenCrop.py uygulaması Python uzmanlığı gerektirir, ancak toplu iş biçiminde kırpma kullanabilirsiniz ekledi. Bu adımın çıktısı sıkıca kırpılır, anterior-posterior odaklı embriyo tiff yığınları. Tek bir koşuldaki tüm verileri görselleştirmek için, her zaman noktasında her embriyo için bir parlak alan görüntüsü ve maksimum yoğunluk projeksiyonu göstermek için kırpılmış, döndürülmüş tiff yığınlarını derleyen bir ImageJ makrosu oluşturulmuştu. (D) Panel, yarı yüksek iş letimatif görüntüleme formatının diseksiyonve kurulumu için gerekli temel araçları gösterir. Wang ve ark.^10'unizniyle çoğaltılan bazı figür bileşenleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2. C. elegans embriyogenezinin yüksek içerikli görüntülemesi için üretilen özel suşlar. (A) Şemalar, Germ Tabakası (üstte) ve Morfogenez (altta) suşları oluşturmak için kullanılan transgenleri göstermektedir. (B) Maksimum yoğunluklu projeksiyon panelleri Morfogenez (üst) ve Germ Tabakası (alt) suşlarında gelişimsel zaman rotasını gösterir. Şemalarda (solda) gösterildiği gibi ventral görünüm gösterilir. Zaman virgül aşamasına göredir (t = 0), her iki suşta da kolayca tanımlanabilir. Ölçek çubuğu = 10 μm. Şekil Wang ve ark.¹⁰izni ile çoğaltılır . Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3. Özel kırpma programı, bireysel embriyoları görüntüleme alanlarından izole eder ve yönlendirir. (A) Şema özel embriyo kırpma programının özelliklerini gösterir ve bu programa erişmek için iki seçenek vurgulamaktadır: hiçbir programlama uzmanlığı gerektiren ve Zenodo (solda) ve bir kullanılabilir kullanıcı dostu GUI arayüzü Python deneyimi gerektiren ve Github'da (sağda) kullanılabilen programın toplu kırpma sürümü. (B) Grafik otomatik kırpma algoritması özetler - bir ikili maske 8-bit brightfield görüntüleri oluşturulur ve bireysel embriyolar tespit edilir, kırpılır, ve ön-posterior ekseni boyunca yönlendirilir. Ölçek çubuğu 10 μm. (C) Şemalar, ikili maskedeki embriyoları yinelemeli olarak tespit etmek için kullanılan prosedürü ayrıntıya kadar ayrıntılı olarak içerir. (D) Şema, embriyoları anterior-posterior eksenboyunca yönlendirmek için kullanılan yöntemi göstermektedir. Paneller B-D Wang ve ark.¹⁰izni ile çoğaltılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4. Özel ImageJ makro, her koşul için bileşik dosyalar oluşturarak RNAi tarama verilerinin görselleştirilmesini sağlar. (A) 40-gen test kümesinden üç örnek RNAi koşulları için embriyolar (bkz. Wang ve ark.^10,tam veri kümesi için¹¹⁾ her biri için elde edilen farklı imza fenotipleri vurgulamak gösterilir (sağda) durumu ve her koşulda fenotiplerin tekrarlanabilirliği. Panel Wang ve ark.¹⁰izni ile uyarlanmıştır. (B) Panel, özel ImageJ makrosu (OpenandCombine_embsV2.ijm) belirli bir RNAi durumundan embriyoları, her zaman noktasında her embriyo için parlak alan ve maksimum yoğunluk projeksiyonlarını dizileyen bileşik bir ImageJ dosyasına nasıl diziler olduğunu göstermektedir. Yalnızca bir örnek vurgulanmış olsa da, bu makro birçok RNAi koşulu için verileri aynı anda derleyebilir. ImageJ makro Zenodo¹²mevcuttur. Ölçek çubuğu = 10 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Bu çalışma, C. elegansembriyonik gelişim genlerin işlevini profilini daha büyük ölçekli çabaları sağlamak için geliştirilen araçlar ve yöntemler bir paketi açıklanır. Yarı yüksek iş yöntemimiz, tek bir deneyde 80-100 embriyo için 20 dk çözünürlükte embriyonik gelişimin 3Boyutlu hızlandırılmış görüntülemesini sağlar. Bu protokol istenilen herhangi bir belirteç suş (lar) ile kullanılmak üzere adapte edilebilir iken, bu çalışma embriyogenez sırasında olayları izlemek için geliştirilen iki özel suşları kullanarak yöntemin potansiyelini göstermektedir: (1) bir mikrop tabakası muhabiri gerginlik, hangi doku özgü organizatörler endoderm, mezoderm ve ektoderm çekirdekleri işaretlemek için floresan histones ifade sürücü, ve (2) hücre kavşaklarında floresan belirteçleri ifade sürücü epidermal ve nöronal organizatörler kullanan bir morfogenez muhabiri suşu, ve plazma zarı. İki suş görüntüleyerek, hücre kader özellikleri ve morfogenetik olaylar moleküler tedirginliksonuçları dikkate değer ayrıntılarla yakalanabilir. Bu yöntemtarafından oluşturulan veri miktarının getirdiği zorlukları gidermek için, veri işleme ve görselleştirmeyi kolaylaştırmak amacıyla özel araçlar geliştirilmiştir. İlk araç, embriyoları standart bir anterior-posterior oryantasyona döndürürken ve arka plan çıkarma, sürüklenme düzeltmeve zayıflama düzeltmesini gerçekleştirirken, tek tek embriyoları 3B zaman atlamalı dizilerde bir alandan çıkarır. Bu program kullanıcı dostu GUI (https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w) olarak paketlenmiş ve kaynak kodu ve Python anlayışlı kullanıcılar için programın daha gelişmiş bir toplu sürümü (github.com/renatkh/embryo_crop.git) 10^,12,13sağlanır . Son olarak, bu işlenmiş verileri anlamlı bir biçimde görselleştirmek için bir ImageJ makrosu geliştirildi; bu, kullanıcının her zaman noktasında her embriyo için parlak alan ve maksimum yoğunluk projeksiyonu gösteren çok panelli bir filmde belirli bir RNAi durumundan tüm embriyoları görselleştirmesini sağlar. Birlikte, suşları, protokol ve veri işleme araçları, daha büyük ölçekli daha uygun bir çaba C elegans embriyogenez çalışma çabaları olun.

Genel olarak uygulanması kolay olmakla birlikte, burada açıklanan yarı-yüksek üretim edinim yöntemi aşağıda açıklanan birkaç kritik ayrıntılara dikkat gerektirir. İlk olarak, kullanıcıların çok kuyulu plaka tutucu ile donatılmış olabilir hassas nokta ziyaret kapasitesine sahip bir konfokal mikroskop erişimi olmalıdır. Bu protokol için en önemli husus mikroskobun Sıcaklık kontrollü bir odada muhafaza edilmesidir. Birçok mikroskop ısı kapasitesine sahip olsa da, çoğu güvenilir soğutamaz, bu nedenle çevre sıcaklığı sabit bir C. elegans dostu sıcaklık korumak için adapte edilmelidir. Bunu başarmak için görüntüleme odası 16 °C'de tutulur. Cihazın numune alanı görüntüleme sırasında 21-23 °C'ye kadar ısınır. Oda sıcaklığındaki dalgalanmalar gelişimsel zamanlamayı etkileyebilir ve nokta ziyareti sırasında odak düzleminin doğruluğunu kurnazca değiştirebilir ve mümkün olduğunca kaçınılmalıdır. 23 °C'nin üzerindeki sıcaklıklarda koşmanın kontrol koşulları için embriyonik öldürücülükte önemli bir artışa yol açabileceğini ve tavsiye edilmez. Bir diğer önemli husus ise diseksiyon sırasında embriyo seçimi ve dağılmadır. Yaşlı embriyoların görüntüleme kuyularına aktarılmasını önlemeye özen izlenmelidir, çünkü yumurtadan çıkan hayvanlar komşu embriyoları gözden uzak durma eğilimindedirler; bu insidansı medyaya anestezi nin eklenmesiyle azalır. Embriyoların dağılımı, embriyoların büyük kümeleri önlemek için, aynı zamanda kritik bir değişkendir. Kümelenme, embriyolar çok ince çizilmiş kılcal borularda kuyulara transfer edildiğinde veya embriyolar diseksiyon sırasında yeterince dağılmadığında meydana gelme eğilimindedir. Başka bir göz nokta seçimi ve odak düzlemi atonlama zaman alır. Bu işlem sırasında plaka buz üzerinde tutulmaz, bu yüzden embriyolar hemen gelişmeye başlar. Bu çalışmada kullanılan özel marker suşları için, plaka buzdan çıkarıldıktan sonra yaklaşık 90 dk'lık bir pencere vardır ve işaretleyiciler ifade edilmeden önce plaka taraması ve nokta seçimi gerçekleştirilir. Bu suşlarla aletimize kurmak için yeterli bir zaman, ancak diğer mikroskoplar ve suşlar sorun giderme gerektiren ek zaman zorlukları sunabilir. Son olarak, tarif ettiğimiz yöntem, 20 dk aralıklarla 50 tarladan oluşan z-yığınları toplamak için 60 x yağ amacı nı kullanır. Vurguladığımız gibi, görüntülenmiş alanların sayısı azaltılarak zamansal çözünürlük artırılabilir. Örneğin, 10 alan 4 dk zaman çözünürlükte görüntülenebilir. Artan zamansal çözünürlük için ikinci bir alternatif daha düşük büyütme, yüksek sayısal diyafram hedefi kullanmaktır; Bu durumda, daha geniş görüş alanı, çok sayıda embriyonun daha yüksek zaman çözünürlükte görüntülenmesine ve uzamsal çözünürlükte sadece ılımlı bir azalmaya olanak sağlar.

Daha büyük ölçekte veri işleme ve görselleştirmeyi etkinleştirmek için özel araçlar oluşturup serbestçe kullanılabilir hale getirdik. En yaygın olarak kullanışlı araç, çalışması için programlama uzmanlığı gerektirmeyan özel kırpma GUI'dir. GUI, gelişimin tüm aşamalarında embriyoları kırpmak ve yönlendirmek için kullanılabilir ve tüm belirteçlerle uyumludur, bu da sadece gelişimsel biyologlar için değil, aynı zamanda erken embriyo daki süreçleri inceleyen araştırmacılar için de yararlı dır. GUI çıktısı tam olarak kırpılmış, yönlendirilmiş, ölçeklenmiş, sürüklenen veriler olduğundan, veriler kolayca otomatik bir analiz boru hattına aktarılabilir ve bu araç geçmiş ve gelecekteki verilerin analizi için kullanışlı hale getirilebilir; uygun suşlar kullanılırsa, elde eden veri dosyaları embriyogenez hizalama araçları²⁵gibi mevcut otomatik analiz rejimleri için giriş olarak kullanılabilir. Programı kullanabilmek için, kullanıcıların kırpma algoritmasının her adım ve zaman noktası için bir brightfield veya DIC görüntüsünün toplanmasını gerektirdiğini bilmeleri önemlidir. Buna ek olarak, kullanıcılar ön-posterior oryantasyon algoritmasının mikrop tabakası muhabirindeki kırmızı sinyalin dağılımına ve bu çalışmada gösterilen morfogenez rapor suşlarına göre yapılandırıldığına dikkat etmelidirler. Bu nedenle, ap oryantasyonunun diğer belirteç suşlarında doğruluğunun vaka bazında değerlendirilmesi gerekecektir. GUI üç farklı konfokal görüntüleme platformlarında toplanan verilerle test edilmiştir ve çoklu tiff yığınları ve tiff serisi için tüm yönetim kurulunda uyumludur. Kullanıcı dostu sürüme ek olarak, GUI'nin kaynak kodu ve bu programın toplu sürümü de kullanıma sunulmuştur ve programlama deneyiminin gerekli olduğu ve dosya yapılarının ve adlandırma kurallarının izlenmesi gerekir. Son olarak, bir ImageJ işleme makro, her RNAi durumda, tüm embriyolar için ham görüntü yığınları almak ve brightfield ve floresan maksimum yoğunluk projeksiyon her zaman bu durum için tüm embriyolar göstermek için bilgilendirici bir dizi derlemek inşa edilmiştir. Bu araç kullanıcının özelliklerine uyarlanabilir ve veri arama ve kalite kontrol değerlendirmesi basit yapmak için yararlı bir makrodur.

Birlikte, burada açıklanan embriyo kırpma ve görüntü işleme araçları ile birlikte yarı-yüksek iş letme izleme yöntemi mutantlar, tedirginlikler ve marker suşları çeşitli kullanarak C. elegans embriyonik gelişim analizi kolaylaştıracaktır. Kendi laboratuvarımızda, geliştirme için gerekli ~2.000 genin yıkılmasından sonra burada açıklanan iki özel mühendislik suşlarından embriyoları filme almak için bu yöntemleri kullanan büyük ölçekli bir ekran şu anda devam etmektedir. Son olarak, bu çabadan elde edilen veriler, embriyogenez sırasında hücre kaderi belirtimi ve morfogenetik olayları anlama çabalarını geliştirmek için daha fazla kaynak görevi göreceksiniz.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aspirator Tube Assembly	Drummond Scientific	2-000-000
Calibrated Pipette (25 mL)	Drummond Scientific	2-000-025
Cell Voyager Software	Yokogawa Electric Corp	Included with CV1000
Conical Tube (15 mL)	USA Scientific	1475-0501
CV1000 Microscope	Yokogawa Electric Corp	CV1000
Depression slide (3-well)	Erie Scientific	1520-006
Dissection Microscope	Nikon	SMZ-645
Eppendorf Centrifuge 5810R	Eppendorf	5811 07336
ImageJ/FIJI	Open Source	https://imagej.net/Fiji
M9 Buffer	Lab Prepared	https://openwetware.org/wiki/M9_salts
Microcentrifuge Tube (1.5 mL)	USA Scientific	1615-5500
Microseal F-foil Seal	Bio-Rad	MSF1001
NGM Plates	Lab Prepared	http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html#d0e214
Scalpel #15	Bard Parker	REF 371615
Sensoplate Plus, 384 Well, F-bottom, Glass Bottom	Greiner Bio-One	781855
Tetramisole Hydrochloride	Sigma Aldirch	T1512-10G
Tweezers, Dumont #3	Electron Microscopy Sciences	0109-3-PO
U-PlanApo objective (10× 0.4 NA)	Olympus	1-U2B823
U-PlanApo objective (60× 1.35 NA)	Olympus	1-U2B832