Une méthode d'imagerie semi-haut débit et une boîte à outils de visualisation de données pour analyser C. elegans Embryonic Development

Summary

Ce travail décrit un protocole semi-haut débit qui permet l'imagerie simultanée en time-lapse 3D de l'embryogenèse dans 80-100 embryons d'élegans de C. dans une seule course de nuit. En outre, des outils de traitement d'image et de visualisation sont inclus pour rationaliser l'analyse des données. La combinaison de ces méthodes avec des souches de reporter personnalisées permet une surveillance détaillée de l'embryogenèse.

Abstract

C. elegans est le premier système d'analyse systématique de la spécification du destin cellulaire et des événements morphogénétiques au cours du développement embryonnaire. Un défi est que l'embryogenèse se déroule dynamiquement sur une période d'environ 13 h; cette demi-journée a limité la portée des expériences en limitant le nombre d'embryons qui peuvent être photographiés. Ici, nous décrivons un protocole semi-haut-débit qui permet l'imagerie simultanée 3D de time-lapse du développement dans 80-100 embryons à la résolution de temps modérée, de jusqu'à 14 conditions différentes, dans une seule course de nuit. Le protocole est simple et peut être mis en œuvre par n'importe quel laboratoire ayant accès à un microscope avec une capacité de visite ponctuelle. L'utilité de ce protocole est démontrée en l'utilisant pour l'image de deux souches sur mesure exprimant des marqueurs fluorescents optimisés pour visualiser les aspects clés de la spécification germinale et de la morphogénèse. Pour analyser les données, un programme personnalisé qui récolte des embryons individuels à partir d'un champ de vision plus large dans tous les canaux, z-étapes, et les points de temps et enregistre les séquences pour chaque embryon dans une pile tiff séparée a été construit. Le programme, qui comprend une interface utilisateur graphique conviviale (GUI), simplifie le traitement des données en isolant, pré-traitant et en orientant uniformément les embryons individuels en vue de la visualisation ou de l'analyse automatisée. Une macro ImageJ qui compile des données d'embryons individuelles dans un fichier multipanel qui affiche la projection de fluorescence d'intensité maximale et les images des champs lumineux pour chaque embryon à chaque moment. Les protocoles et les outils décrits ci-dessus ont été validés en les utilisant pour caractériser le développement embryonnaire après l'élimination de 40 gènes développementaux précédemment décrits ; cette analyse a visualisé les phénotypes développementaux précédemment annotés et en a révélé de nouveaux. En résumé, ce travail détaille une méthode d'imagerie semi-haut débit couplée à un programme de recadrage et à un outil de visualisation ImageJ qui, combiné à des souches exprimant des marqueurs fluorescents informatifs, accélère considérablement les expériences d'analyse développement embryonnaire.

Introduction

L'embryon de C. elegans est un système modèle important pour la biologie cellulaire mécaniste et l'analyse de la spécification du destin cellulaire et des événements morphogénétiques conduisant au développement embryonnaire^1,2,3^{,4 ,5,6,7,8,9}. À ce jour, une grande partie de la caractérisation des événements au niveau cellulaire et de la spécification du destin cellulaire dans l'embryon a été réalisée à l'aide d'expériences d'imagerie ponctuelles à résolution temporelle relativement élevée (c.-à-d. acquisition tous les 10 à 100 s) d'embryons exprimant marqueurs fluorescents. Bien que bien adaptée aux événements de l'ordre de secondes à des dizaines de minutes, cette approche devient techniquement limitative pour la caractérisation de processus plus longs, de l'ordre des heures à des jours. Le développement embryonnaire du premier clivage à la fin de l'allongement prend environ 10 h. À cette échelle temporelle, des méthodes semi-à-haut débit qui permettraient l'imagerie simultanée à faible résolution temporelle (c.-à-d. l'acquisition à des intervalles de temps de 5 à 20 min) de cohortes plus importantes d'embryons, provenant de conditions différentes, ouvriraient une nouvelle gamme d'expériences; par exemple, permettre des efforts systématiques de dépistage à grande échelle et l'analyse d'un nombre suffisant d'embryons pour comparer les conséquences des perturbations moléculaires.

Ici, nous décrivons une méthode semi-haut-débit pour surveiller l'embryogenèse de C. elegans qui permet l'imagerie simultanée 3D de time-lapse du développement dans 80-100 embryons, de jusqu'à 14 conditions différentes, dans une seule course de nuit. Le protocole est simple à mettre en œuvre et peut être réalisé par n'importe quel laboratoire ayant accès à un microscope avec des capacités de visite ponctuelle. Les principales étapes de ce protocole sont décrites à la figure 1. En bref, les embryons sont disséqués à partir d'adultes gravidés exprimant des marqueurs fluorescents d'intérêt et de transférer de jeunes embryons (stade de 2 à 8 cellules) à des puits d'une plaque de 384 puits pour l'imagerie. Dans ce format, la taille relativement petite des embryons de puits entonne les embryons dans une zone étroite, ce qui facilite l'identification des champs contenant plusieurs embryons pour l'imagerie en accéléré. Pour maintenir un développement à peu près synchrone dans la cohorte d'embryons, des dissections sont effectuées dans des médias réfrigérés et la plaque est maintenue sur la glace, ce qui empêche le développement significatif pendant la fenêtre de temps de dissection d'une heure. La plaque est transférée au microscope et les embryons sont filmés dans une pièce à température contrôlée pendant la nuit, à intervalles de 20 min, à l'aide d'une lentille d'immersion d'huile de 60x 1,35 NA, pour recueillir toute la plage de Z en 2 m d'étapes. Cinquante champs, contenant chacun entre 1 et 5 embryons, sont représentés en une seule nuit. Selon l'expérience souhaitée, la résolution temporelle pourrait être augmentée (par exemple, l'imagerie à intervalles de 5 à 10 minutes) en diminuant proportionnellement le nombre de champs d'image.

Avec ce protocole, même une seule course de nuit génère une quantité importante de données (80 à 100 embryons répartis sur 50 champs) et des expériences de plus grande envergure peuvent rapidement devenir ingérables en ce qui concerne l'analyse des données. Pour faciliter le traitement, la visualisation et la rationalisation de l'analyse de ces données, un programme a été conçu pour recadrer et orienter les embryons et effectuer des étapes de prétraitement (facultatif), et une macro ImageJ qui compile les données pour simplifier la visualisation. Ces programmes peuvent être utilisés pour traiter les images recueillies à l'aide d'approches conventionnelles, car elles sont indépendantes de la méthode d'imagerie, ne nécessitant qu'un seul plan brightfield. Le premier programme prend en charge un champ 4D contenant plusieurs embryons (option GUI ou code source embryoCrop.py) ou plusieurs champs 4D contenant plusieurs embryons (screenCrop.py), cultures serrées embryons et les oriente dans une configuration antérieure-postérieure. Ces programmes donnent également aux utilisateurs la possibilité d'effectuer la soustraction de fond, la correction de dérive et la correction d'atténuation. Les fichiers qui en résultent sont des piles de tiff uniformément prétraitées et étroitement recadrées pour chaque embryon qui sont modifiables à l'analyse automatisée de l'image. Pour simplifier la vue de tous les embryons pour chaque condition, une macro ImageJ (OpenandCombine-embsV2.ijm) a été écrite, qui assemble tous les embryons d'une condition donnée dans une seule pile tiff et tableaux images brightfield et la couleur de projection d'intensité maximale ( RGB) recons, côte à côte, pour chaque embryon. Les méthodes ont été validées en les utilisant pour caractériser le développement embryonnaire après l'élimination de 40 gènes développementaux précédemment décrits dans une paire de souches sur mesure exprimant des marqueurs fluorescents optimisés pour visualiser les aspects clés de la couche germinale spécification et morphogenèse^10,11. Ensemble, le protocole d'imagerie embryonnaire à semi-haut débit et les outils de traitement de l'image permettront d'expérimenter un nombre d'échantillons plus élevé et d'intensifier les efforts de dépistage à grande échelle visant à comprendre les processus de développement. En outre, ces souches fourniront également un moyen efficace d'examiner les effets des perturbations moléculaires sur l'embryogenèse.

Protocol

1. Préparation des embryons de C. elegans pour l'imagerie semi-haute débit

REMARQUE: L'objectif de cette partie du protocole est de charger une population d'embryons de C. elegans semi-synchronisés (stade de 2 à 8 cellules), disséqués à partir de souches de marqueurs appropriées (figure 2), dans une plaque de 384 puits à fond de verre pour l'imagerie. D'autres formats de plaques pourraient également fonctionner, mais les 384 plaques de puits sont préférées parce que la petite taille du puits limite la propagation des embryons à une zone relativement petite, ce qui facilite l'identification des champs contenant plusieurs embryons pour l'imagerie en accéléré. La synchronisation grossière des embryons garantit que le cours complet du développement est capturé pour chacun des embryons dans un champ.

1. Préparer une solution de 5 à 10 ml de 0,1 mg/mL d'hydrochlorure de téramisole (TMHC) dissous dans un milieu M9 froid (0,45 M Na₂HPO₄à 7 H₂O, 0,11 M KH₂PO₄, 0,04 M NaCl, 0,09 M NH₄Cl) à utiliser pendant dissection et imagerie. Ce média comprend un anesthésique pour s'assurer que les larves écloses en mouvement ne perturbent pas l'imagerie des embryons à un stade de développement précoce.
   REMARQUE: Si vous utilisez les outils de culture et de visualisation pour analyser les données acquises à l'aide de méthodes standard de montage de coussinets d'agarose, passez à la section 3 ci-dessous.
2. Aliquot 70 l de la solution préparée dans les puits individuels d'une plaque de 384 puits en verre avec un puits pour chaque condition ; éviter les deux rangées extérieures de la plaque pour prévenir les effets de bord.
   REMARQUE: Il est utile de masquer les puits environnants à l'aide d'une feuille de plaque PCR adhésive (voir l'exemple de la figure 1D)qui préserve les puits adjacents pour de futures expériences et facilite la localisation des puits appropriés sous le microscope à dissection. Une fois que la solution est aliquoted, garder la plaque et la solution restante sur la glace tout au long de la dissection.
3. Générer des pipets buccaux pour le transfert d'embryons de la dépression (où les hermaphrodites gravid sont disséqués) aux puits. Tirer les pipets capillaires (25 pipets calibrés ll) au-dessus d'une flamme et casser pour générer une extrémité effilée fine(figure 1D). Un tuyau d'epiphe est nécessaire par condition pour prévenir la contamination croisée; jeter la tuyauterie après utilisation.
4. Utilisez des pinces fines pour transférer les adultes gravid s'agitent de 10 degrés dans une portée de dissection dans 150 L de la solution TMHC glacée indiquée sur une glissière de dépression pour chaque condition. À l'aide de la pince à épiler et d'un scalpel, disséquer les vers pour libérer les embryons.
5. Chargez un tuyau tapillaire tiré dans l'attachement de l'aspirateur inclus avec les pipets, et la tuyauterie buccale pour transférer tous les embryons de 2 à 8 cellules dans un puits individuel de la plaque préparée (Figure 1D). Évitez de transférer des embryons à un stade avancé et de dissectionr les débris. Examiner sous une portée de dissection et si des agrégats d'embryons sont présents, tuyauter la bouche vers le haut et vers le bas ou taper des amas d'embryons avec la pointe de pipet pour se disperser.
   REMARQUE: Pour éviter la contamination croisée, nettoyer l'équipement de dissection et utiliser un tuyau d'oreille frais tout en se déplaçant entre les conditions. Conserver la plaque sur la glace entre les dissections.
6. Une fois que les vers de toutes les conditions ont été disséqués et les embryons placés dans leur puits approprié, faites tourner la plaque de 384 puits pendant 1 min à 600 x g pour régler les embryons.
7. Essuyez le fond de la plaque à l'œil d'une lingette imbibée d'éthanol pour enlever tout résidu et placez la plaque sur un microscope confocal équipé d'un porte-plaque dans un environnement à température contrôlée.
   REMARQUE: Les étapes qui suivent détaillent cette méthode à l'aide de la configuration de laboratoire; veuillez modifier les conditions d'acquisition en fonction des besoins et de l'équipement expérimentaux. Ici, une boîte de scanner confocale équipée d'un double disque pivotant Nipkow amélioré par microlens, d'une caméra 512 x 512 EM-CCD, d'une auto-XY-Stage de haute précision (résolution désignée de 0,1 m) et d'un contrôle motorisé de l'axe z (résolution désignée 0,1 m) est utilisée. Ce système est conservé dans une pièce de 16 oC, qui maintient la température du microscope entre 21 et 23 oC pendant la nuit d'imagerie.
8. Pour identifier les champs avec des embryons appropriés, effectuez un pré-scan de chaque puits à l'aide d'un logiciel d'imagerie objectif 10x 0.4 NA et approprié. Les champs les plus optimaux contiendront plus d'un embryon à un stade précoce qui se trouve dans le même plan focal que les autres embryons et qui, idéalement, aura un contact minimal entre les embryons adjacents. Marquer les positions des régions appropriées.
9. Pour sélectionner les champs d'imagerie, passez à l'objectif 60x et ajustez le plan focal à chaque visite ponctuelle pour sectionner convenablement les embryons. 1/4 champs par puits sont représentés, pour un total de 50 champs répartis dans 14 puits, et chaque champ peut contenir entre un et cinq embryons. Dans l'ensemble, 4 à 15 embryons sont sélectionnés dans chaque condition pour une imagerie à haute résolution.
   REMARQUE: Une variable clé à cette étape est l'utilisation d'un pétrole suffisant; placer le pétrole sur l'objectif, visiter des points dans chaque puits pour répartir le pétrole autour de la surface de tous les puits, puis appliquer une goutte supplémentaire de pétrole à l'objectif avant la sélection des champs.
10. Imagez les champs sélectionnés à l'aide d'un objectif de 60x 1,35 NA pour acquérir 18 sections z à 2 m d'intervalle toutes les 20 min pendant 10 h. Les conditions d'imagerie utilisant les souches de reporter de couche germinale et de morphogenèse sont les suivantes : brightfield, 90% puissance, 25 ms, 20% gain ; 488 nm, 100% de puissance, 200 ms, 60% de gain; 568 nm, 45% de puissance, 150 ms, 60% de gain.
11. Une fois l'imagerie terminée, évaluez la létalité embryonnaire en effectuant un faible grossissement (objectif de 10x 0,4 NA) de balayage complet et lumineux de 20 à 24 h après le début de l'imagerie de nuit.

2. Notation de la létalité embryonnaire

1. À l'aide des champs numérisés 10x post-run, évaluez la létalité embryonnaire et les défauts larvaires en comptant les vers éclos et les embryons non éclos pour chaque puits.
2. Marquez les embryons non éclos comme embryonnaires mortels. Exclure les embryons d'une à quatre cellules arrêtés du nombre de létalités, puisque les jeunes embryons disséqués ne parviennent parfois pas à terminer la formation de coquilles d'œufs (si la méiose II n'est pas encore terminée) et que les défauts de perméabilité peuvent entraîner des complications osmotiques au cours des deux premiers Divisions.
3. Score vers partiellement éclos ou entièrement éclos avec morphologie du corps ou des défauts comportementaux, tels que dumpy ou paralysé, comme «larve anormale».

3. Culture automatisée (Figure 3A)

REMARQUE: Le logiciel est logé dans deux endroits: (1) Zenodo abrite une version conviviale du logiciel¹² qui ne nécessite aucune expertise en programmation. (2) Github contient le code source de notre embryoCropUI.py et screenCrop.py logiciel¹³, qui nécessitent des compétences avec Python. Des instructions détaillées pour télécharger et exploiter les deux versions du programme peuvent être trouvées ci-dessous.

1. Recadrage automatisé à l'aide de la version exécutable embryoCropUI (version conviviale)
   1. Pour utiliser le programme embryoCropUI, téléchargez d'abord le programme de Zenodo (https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w)¹².
      1. Téléchargez la version MacOS ou Format Windows du programme (à noter que la version MacOS nécessite MacOS X10.11 ou plus).
      2. Téléchargez le fichier d'instructions (GUI-Instructions-zenodo-repoV2.docx), qui fournit des instructions étape par étape pour le test et l'utilisation du programme embryoCropUI.
      3. Téléchargez le test-files.zip pour vérifier si le programme fonctionne correctement sur la plate-forme (voir les instructions).
   2. Une fois téléchargé, décompresser et naviguer pour trouver l'embryonCropUI exécutable (...-embryoCropUI-WINDOWS-embryoCropUI-embryoCropUI.exe) ou (...embryoCropUI-MacOS-embryoCropUI-embryoCropUI.exe ). Double clic pour lancer (ou choisir 'ouvrir avec' terminal) et exécuter l'embryoCropUI exécutable.
   3. L'interface graphique récolte exécutable un champ de vision 4D à la fois. Dans le coin supérieur gauche, sélectionnez le bouton ouvert pour charger le champ spécifique à la culture (multi-tiff). Si le recadrage d'une série tiff, avec plusieurs dimensions (c.-à-d., z, temps, canal), ne chargez que la première image de la série dans le dossier (une série de tiff par dossier).
   4. Une fois les images chargées, spécifiez les informations suivantes : nombre de tranches z, (Z), nombre de points de temps (T), nombre de canaux (C), canal qui correspond au DIC ou au champ lumineux (premier 1, deuxième, etc.).
   5. Sélectionnez le traitement supplémentaire pour exécuter sur les images. Le programme offre la correction de dérive, la soustraction de fond, et la correction d'atténuation.
   6. Spécifiez les paramètres de la correction de soustraction et d'atténuation de fond pour guider les efforts de traitement dans l'invite guiguie. Pour la soustraction d'arrière-plan, définissez la plus grande taille d'entité pour refléter la taille du signal significatif ; cette taille d'entité ne doit pas être considérée comme arrière-plan et doit être une valeur de nombre impair. Entrée d'une valeur de 0-1 pour la correction d'atténuation. La valeur de correction d'atténuation reflète le pourcentage d'intensité d'origine qui reste à la profondeur la plus éloignée de l'objet en cours d'image.
      REMARQUE: Contexte La correction de soustraction et d'atténuation doit être exécuté ensemble.
   7. Spécifiez l'ordre de collecte d'images (c.-à-d. le temps de canal-z-time (czt), ou z-canal-temps (zct)).
   8. Spécifiez les microns par pixel pour les images en fonction de l'appareil photo utilisé.
      REMARQUE: Un mauvais recadrage d'image se produira si la taille des pixels n'est pas correctement définie.
   9. Sélectionnez Exécuter dans le coin inférieur gauche. Un nouveau sous-dossier étiqueté «culture» sera créé dans le même chemin que le dossier non recadré; les versions recadrées seront enregistrées à cet endroit. Selon la taille du fichier, le recadrage doit se terminer en quelques secondes à quelques minutes.
2. Culture automatisée à l'aide de screenCrop.py (version de lot alternative à l'interface graphique embryoCrop décrite ci-dessus ;Python utilisateurs avertis seulement)^10,13
   1. Pour utiliser screenCrop.py, la version logicielle Python pour la culture de plus grands ensembles de données dans un format de lot, cloner ou télécharger le code source de Github (github.com/renatkh/embryo_crop.git).
   2. Lisez les instructions pour configurer un environnement virtuel approprié et suivez le système de dénomination des fichiers décrit; qui sont tous deux détaillés dans le fichier README dans le référentiel Github: https://github.com/renatkh/embryo_crop/blob/master/README.md.
   3. Une fois que les variables environnementales et les conventions de nommage ont été correctement établies, ouvrez parameters.py et screenCrop.py dans un éditeur de choix.
   4. Pour modifier les paramètres réglables sans toucher au code source, modifiez le fichier parameters.py.
      REMARQUE : il est également possible de modifier directement les paramètres dans l'en-tête de screenCrop.py.
      1. Si vous utilisez le fichier de configuration parameters.py, modifiez le paramètre d'utilisation configuré en True. Si vous utilisez l'édition directe dans screenCrop.py, laissez le paramètre d'utilisation configuré à False.
      2. Localisez les renseignements suivants dans le dossier parameters.py et modifiez les paramètres d'imagerie et la structure des fichiers souhaités :
         1. loadFolder (ligne 9) : Modifier le lecteur sur lequel les fichiers sont stockés (p. ex., Z : D://, etc.)
         2. date (ligne 7) : Modification du dossier contenant des fichiers pour la session d'imagerie. C'est ce qu'on appelle le « nom du dossier d'expérience » dans le fichier de suivi CSV (voir les instructions).
         3. suiviFichier (ligne 11) : Modification du chemin vers le fichier CSV dans lequel les informations d'expérience sont stockées.
         4. z (ligne 13): Définir comme le nombre de avions z.
         5. nT (ligne14) : Définir le nombre de points de temps.
         6. nWells (ligne 19): Définir comme le nombre de puits utilisés.
         7. pointVisites (ligne 20) : Définir comme le nombre maximum de visites ponctuelles (par puits).
         8. Dans la ligne 10 trouver l'emplacement actuellement occupé par «CV1000/» et entrer le dossier externe utilisé dans le chemin de fichier. Pour éviter les problèmes, utilisez la convention suivante : 'XXXXXXX/'.
         9. Dans la ligne 12, entrez un chemin de fichier valide pour stocker les données de ratio d'aspect pour les données recadrées.
         10. Dans les lignes 15, 16, 17 et 18, vous entrez True/False pour savoir si les images passent par le traitement suivant :
             1. Entrée vrai ou fausse pour la correction de la dérive sur la ligne 15.
             2. Entrée vrai ou faux pour soustraction de fond sur la ligne 16. La taille des entités doit être déterminée empiriquement pour différentes souches de marqueurs et tailles de pixels. Dans la configuration ici, la taille des entités a été définie comme 41 pour la souche Germ-Layer et 201 pour la souche Morphogenesis. La soustraction de fond doit être effectuée en conjonction avec la correction d'atténuation.
             3. Entrée vrai ou fausse pour correction d'atténuation sur la ligne 17.
             4. Entrée Vrai ou Faux pour la rotation postérieure antérieure sur la ligne 18.
   5. Une fois que tous les changements ont été apportés, le recadrage peut commencer. Pour ce faire, passez à screenCrop.py et sélectionnez l'icône de jeu dans la barre d'outils, dans le menu déroulant sélectionnez Run As 'gt; Python Run.
   6. Comme le recadrage peut prendre plusieurs heures pour terminer pour un grand jeu de données (50 visites de points 18 z étapes, 3 canaux, 31 points de temps), suivre les progrès de la culture dans la fenêtre de la console. Une fois le recadrage terminé, une petite fenêtre affiche des aperçus des images recadrées avant d'enregistrer. Pour chaque image, il y a 3 options :
      1. Enregistrer : Appuyez sur barre d'espace pour enregistrer l'image si l'image est recadrée correctement sans qu'aucun domaine d'intérêt ne soit coupé.
      2. X: Appuyez sur X si l'image semble avoir des zones d'intérêt coupées; l'image sera enregistrée avec un X devant le nom pour la séparer des autres images.
      3. Supprimer: Appuyez sur D pour supprimer l'image recadrée si l'image n'est pas recadrée correctement ou si l'embryon n'est pas satisfaisant.
         REMARQUE : Les images seront enregistrées dans un dossier nommé "Cropped" dans le dossier de charge (défini dans la ligne 9 du programme).

4. Visualisation (Figure 4)

REMARQUE: OpenandCombine-embsV2.ijm^10,12 est une macro ImageJ qui va construire un fichier tiff facile à afficher à partir de toutes les images pour une souche spécifique et l'état. L'installation de FIJI/ImageJ^14,15 est nécessaire. Cette macro fonctionne selon notre structure de fichiers; il devra être modifié pour fonctionner avec d'autres structures de fichiers. Un guide de la structure appropriée des fichiers et une description détaillée des considérations importantes peuvent être trouvés à la fin du fichier GUI-Instructions-zenodo-repoV2.docx sur le référentiel Zenodo. S'il vous plaît lire à travers ces instructions complètement avant l'imagerie pour bien nommer et structurer les fichiers pour mieux interagir avec cette macro. Pour référence, notre structure de localisation de fichiers ressemble à ceci :
Z: 'cropped''Target'Strain'Emb'Target'Emb '15 Digit Unique Identifier ' W '#F 'T '#_Z '#_C '.tif
C'est-à-dire Z: 'cropped'EMBD0001'GLS'Emb1'EMBD0001'Emb1'20140327T135219'W02F1'T01'Z01'C1.tif

1. Téléchargez OpenandCombine-embsV2 et GUI-Instructions-zenodo-repoV2.docx de Zenodo (https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w).
2. Préparer les informations suivantes :
   -L'emplacement où les dossiers d'image sont stockés (après le recadrage).
   -Nom du dossier d'image (s) pour le traitement de l'état spécifique (c.-à-d., EMBD0002). C'est ce qu'on appelle « cible » dans l'exemple ci-dessus
   -Un identifiant unique alpha-numérique à 15 chiffres spécifique à une expérience donnée du jour au lendemain — cet identifiant est le nom du dossier d'acquisition de données (c.-à-d. 20140402T140154) et l'identifiant unique est intégré dans le nom de fichier tiff individuel (EMBD0002-Emb1 20140402T140154-W06F2-T01-Z01-C1) pour chaque embryon photographié ce jour-là. La macro utilise cet identifiant pour vérifier les embryons acquis à la même date et peut assembler des conditions répétées, avec des dates séparées, dans des fichiers ImageJ séparés.
3. Ouvrez ImageJ, et faites glisser et déposer le fichier macro, OpenandCombine-embsV2.ijm, à la barre ImageJ, ou ouvrez la macro directement.
4. Une fois la macro ouverte, localisez les lignes 3 et 4. Saisir l'information recueillie dans (section 4.2) selon les étapes suivantes :
   1. Dans la ligne 3 (RNAL), entrez le nom cible pour les images à traiter. Entrée de chaque cible dans la structure suivante newArray ("XXXXXXXX/"); inclure des citations. Pour exécuter plusieurs conditions à la fois, séparez-vous d'une virgule et gardez tous les noms cibles dans la parenthèse (c.-à-d., newArray («EMBD0000/","EMBD0001/","EMBD0002/").
   2. Dans la ligne 4 (date), entrez l'identifiant unique alpha-numérique à 15 chiffres dans les citations, par exemple newArray («20140402T140154 »).
5. Appuyez sur Exécuter en bas à gauche de la fenêtre macro. Une fenêtre s'affiche, qui lancera une invite pour naviguer vers le dossier externe contenant les dossiers d'image recadrée (spécifié dans 4.4.1).
6. Une fois sélectionnée, une autre fenêtre apparaîtra, ce qui permettra la spécification des paramètres d'imagerie.
   1. Entrez le nombre de canaux, le nombre de tranches Z, la taille de la police pour le texte utilisé dans l'étiquetage des images compilées, et la couleur pour chacun des canaux.
   2. Vérifiez le contraste automatique/arrêt dans tous les canaux.
7. Une fois que tous les paramètres ont été spécifiés, cliquez sur OK au bas de la fenêtre. Le fichier composite commencera à s'assembler; cela prendra plusieurs minutes, par condition, pour terminer.
8. Une fois terminé, examinez les fichiers qui restent ouverts si vous le souhaitez. Ils peuvent être fermés sans enregistrement, car la macro a déjà enregistré les fichiers dans un dossier nouvellement créé qui est nommé de la manière suivante: nom du dossier externe (spécifié dans l'invite de la section 4.5) - "-fiji-processed-output" (c.-à-d., Z: cropped-fiji-processed-output-EMBD0002-GLS-20140402T140154.tif).

Representative Results

Un défi important dans la caractérisation de l'effet des perturbations moléculaires sur le développement embryonnaire de C. elegans est qu'il faut environ 10 h pour que les embryons progressent du premier clivage à la fin de l'allongement à 20^'16. Une méthode semi-haut débit dans laquelle de grandes cohortes d'embryons peuvent être simultanément imageest utile pour les événements sur cette échelle de temps, car elle permet l'imagerie de conditions multiples en parallèle avec une taille d'ensemble suffisante pour chaque condition pour permettre l'analyse quantitative (Figure 1A).

Méthode d'imagerie à débit semi-élevé et souches multimarqueurs
La méthode d'imagerie semi-haut débit décrite ici (décrite à la figure 1B),utilise une plaque inférieure en verre de 384 puits; le format multi-puits permet d'étaler jusqu'à 14 conditions en parallèle et la petite taille des puits limite la zone de recherche, ce qui simplifie l'identification des champs contenant des embryons pour l'imagerie à haute résolution. Ici, une boîte de scanner confocal a été utilisée, équipée d'un double disque pivotant Nipkow amélioré par microlentilles, d'une caméra 512 x 512 EM-CCD, d'une auto-XY-Stage de haute précision (résolution désignée de 0,1 m) et d'un contrôle de l'axe z motorisé (résolution désignée 0,1 m). Cependant, le protocole peut être adapté pour n'importe quel microscope confocal avec des capacités de précision point-visite et un adaptateur de scène qui peut accueillir une plaque multi-puits. Un défi important dans le développement de cette méthode a été de concevoir un moyen de générer une plaque d'embryons au même stade de développement afin que l'ensemble du développement peut être capturé pour tous les embryons dans chaque champ. Il s'agit d'un défi parce que les embryons disposés sur la plaque d'imagerie d'abord continuera à se développer tandis que les échantillons ultérieurs sont disséqués, résultant en un gradient de mise en scène à travers les puits. Pour contourner cette question, les embryons à un stade précoce (2-8 stade cellulaire) sont sélectionnés et gardent le support de dissection et la plaque d'imagerie sur la glace; ce stalle l'embryogenèse pour les embryons disséqués jusqu'à ce que toutes les conditions aient été rangées sans impact significatif sur la viabilité embryonnaire¹⁰. Pour limiter le temps pendant lequel les embryons sont assis sur la glace à 1 heure, deux chercheurs effectuent les dissections simultanément, ce qui permet la mise en place de 14 conditions différentes dans environ 50 min. Après la dissection, la plaque est filée à 600 x g pendant 1 min pour sédimenter les embryons et les puits sont pré-scannés à faible grossissement pour localiser les champs avec des groupes d'embryons appropriés pour l'imagerie à haute grossissement; les lieux de visite ponctuels sont marqués. Les embryons sont filmés dans une pièce à température contrôlée pendant la nuit à l'aide d'une lentille d'immersion d'huile de 60x 1,35 NA. Les échantillons sont configurés dans une région de puits de 4 puits par 4 de sorte que la surface de la plaque utilisée dans une expérience est comparable à un glissement de couverture standard de 22 x 22 mm^2, ce qui permet l'utilisation d'un objectif d'huile de 60x. La diffusion uniforme du pétrole dans cette région avant le début de l'imagerie est essentielle pour réussir l'acquisition d'images à long terme. Les embryons en développement sont représentés dans une solution contenant de l'anesthésique; cela garantit que lorsque les embryons plus âgés à l'intérieur du puits éclosent, leur mouvement ne perturbe pas la position des embryons plus jeunes adjacents qui sont représentés. En raison de la nature impénétrable de la coquille d'œuf, l'anesthésique n'affecte pas le mouvement avant l'éclosion. Dans ces conditions, les données 3D time-lapse sont recueillies en 3 canaux pour un total de 80-100 embryons dans une seule expérience de nuit (discuté plus ci-dessous).

C. elegans développement embryonnaire se produit en deux phases. Tout d'abord, 10 tours de division cellulaire couplé à la spécification du destin cellulaire générer les trois couches germinales (ectoderm, mesoderm, et endoderm) sur une période de 6 heures¹⁷. Dans les 7 heures suivantes, les événements morphogénétiques conduisent à la formation de tissus différenciés^8,16. Pour capturer ces deux aspects du développement, nous avons construit une paire de souches personnalisées, la couche germinale et les souches de morphogénèse¹⁰ (figure 2A), et utilisé le protocole semi-haut débit pour imager les embryons des deux souches. La souche Germ Layer exprime des protéines fluorescentes codées transgéniques qui marquent les noyaux dans l'ectoderme, le mesoderm et l'endoderm en rouge, jaune et vert. Cette souche contient trois transgènes reporter: (1) un transgène exprimant PHA-4::GFP qui marque les noyaux dans l'intestin et le pharynx (endoderm vert)^10,18,19, (2) un transgène exprimant un fusion mCherry-histone dans l'épiderme et dans le 1/3 des neurones (ectoderm rouge; Figure 2A), et (3) un transgène qui exprime simultanément les histones mCherry et GFP-marqués dans le muscle de la paroi du corps (mesoderm jaune). La souche Morphogenesis a deux transgènes qui expriment : (1) un marqueur de jonction épithéliale vert (DLG-1:GFP) dans l'épiderme, et (2) un marqueur de membrane plasmatique mCherry-marqué, dans le '1/3 des neurones(P cnd-1 promoteur; Figure 2A). Pour améliorer l'efficacité de l'ARNi, les deux souches ont également été conçues pour contenir une paire de mutations irriciennes(nre-1(hd20) lin-15b(hd126)²⁰. Ceux-ci ont été construits dans le but d'effectuer un écran à grande échelle à base d'ARNI des 2 000 gènes nécessaires au développement embryonnaire. Cependant, cette paire de souches constituera également une plate-forme standardisée largement utile pour évaluer les défauts de développement chez les mutants, et pour des analyses plus détaillées des rôles des différentes protéines dans le développement.

Pour la collecte de données dans ce format à débit semi-élevé, avec ces souches, les séries z vertes, rouges et brillantes (18 x 2 m² intervalles) sont collectées, toutes les 20 min, pour une période de 10 h dans une pièce à température contrôlée de 16 oC; ceci maintient le microscope entre 21-23 oC pendant la course. L'intervalle de temps de 20 min nous permet d'imager 50 champs d'embryons (visites ponctuelles) par expérience. Les utilisateurs peuvent adapter les acquisitions à des intervalles plus courts avec moins de visites ponctuelles, ou des intervalles plus longs avec plus de visites ponctuelles pour mieux répondre à leurs objectifs expérimentaux. Pour ces souches, les points de temps de développement précoce ne sont pas représentés parce que les journalistes spécifiques de tissu conduisant l'expression de marqueur ne commencent pas à exprimer jusqu'à la gastrulation mi-à-tardive. Au cours de cette phase précoce, les puits ont été numérisés à faible grossissement (10x) et les champs sont sélectionnés pour l'imagerie de grossissement élevé. Il est recommandé de sélectionner des champs contenant plus d'un embryon à un stade précoce, mais d'éviter les champs où les embryons se chevauchent partiellement, surpeuplement ou se trouvent à l'extrémité du puits. Après la formation image de 60x pendant la nuit, un balayage de puits entier s'est peu grossi (10x) pour déterminer si les embryons éclosent avec l'apparence normale (WT), éclosent avec des anomalies visibles (anomalie savave), ou sont mortels embryonnaires pour chaque condition évaluée ( Figure 1B). Cette étape est une alternative facile à la mise en place de plaques en parallèle pour évaluer la létalité dans une population plus importante; l'ensemble 10x puits post-scan fournit des données de létalité embryonnaire sur 50-80 embryons par condition. L'utilisation de cette mesure pour comparer les données sur la létalité embryonnaire de la population pour les contrôles entre les courses est un contrôle utile qui assure l'uniformité en ce qui concerne la santé des souches et les conditions environnementales et les étapes de traitement. Lorsqu'elles sont représentées en combinaison, les deux souches de reporter personnalisées fournissent des informations informatives pour la plupart des événements développementaux majeurs, y compris la spécification du destin cellulaire, l'intercalation dorsal, l'enclos épidermique, l'allongement et la neurogenèse (représentant les images de contrôle sont montrées dans la figure 2B, voir également Wang et al.¹⁰).

Traitement des données : culture et orientation automatisées des embryons
Avec notre protocole d'imagerie, chaque champ d'imagerie haute résolution contient entre 1 et 5 embryons; ces embryons sont orientés au hasard et sont fréquemment placés immédiatement à côté les uns des autres. Les données recueillies à l'aide de techniques conventionnelles de montage d'embryons souffrent des mêmes difficultés. Pour préparer les données à la visualisation et à l'analyse ultérieures, une manipulation pratique considérable est nécessaire pour recadrer et orienter les séquences d'embryons, ainsi que pour les pré-traiter pour soustraire l'arrière-plan, corriger la dérive et compenser l'atténuation du signal. avec profondeur. Pour simplifier ce processus, un programme de culture d'embryons personnalisé a été mis sur pied qui isole et oriente chaque embryon du champ plus large(figure 1C, figure 3). Ce programme a été emballé comme un programme convivial et autonome avec interface utilisateur graphique (GUI, compatible avec les données de la plupart des plates-formes d'imagerie) qui peut prendre dans une séquence 3D time-lapse d'un champ d'embryons, et le traiter en série tiff individuelle pour chaque embryon dans le champ (Figure 3B, disponible à https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w)^10,12. Le code source Python pour l'interface graphique (embryoCropUI.py), et une version par lots de ce programme (screenCrop.py) sont également disponibles pour les utilisateurs expérimentés de Python sur GitHub (https://github.com/renatkh/embryo_crop.git)^10,13. La fonctionnalité de base de ce programme est de localiser, de récolter et d'orienter l'embryon le long de l'axe antérieur-postérieur. Simultanément, la soustraction d'arrière-plan, la correction d'atténuation et la correction de la dérive peuvent être effectuées sur l'ensemble de données à l'aide de paramètres réglables optionnels.

En bref, le logiciel de culture automatisé détecte itérativement les embryons individuels dans un masque binaire obtenu à partir des images de champ lumineux et les cultures séquentiellement de tous les canaux et oriente les images le long de l'axe antérieur-postérieur(figure 3 B, décrit pour la première fois dans Wang et al.¹⁰). Avant le recadrage, le logiciel corrige la dérive, soustrait l'arrière-plan et effectue une correction d'atténuation de profondeur dans chaque canal de fluorescence (facultatif). Pour obtenir le masque binaire, le logiciel applique la détection de bord^{Canny 21} aux images de champ lumineux, effectue la projection d'intensité maximale des trois plans centraux et remplit de petits trous. L'algorithme détecte des embryons individuels en adaptant un ovale Cassini à une section du contour du masque binaire (voir Figure 3B, 3C). Après avoir aligné l'ovale le long de son axe principal, le logiciel mesure l'intensité de la fluorescence rouge dans chaque moitié de l'embryon isolé et fait pivoter l'embryon de telle sorte que l'intensité rouge est orientée vers la gauche, ce qui place l'embryon antérieur sur la gauche pour les deux les souches de journaliste utilisées dans ce travail (Figure 3D). Le pilotage de ce logiciel a révélé que la plupart des embryons ont été cultivés efficacement comme prévu. Les problèmes mineurs d'imagerie, tels que la dérive des embryons, la perte temporaire d'un plan focal (en raison de bulles d'huile) ou les champs d'embryons surpeuplés, n'ont généralement pas perturbé la culture réussie. Cependant, dans les champs où il y avait de gros amas d'embryons (qui se chevauchaient quelque peu en z), les embryons qui étaient considérablement inclinés à l'intérieur du plan d'imagerie (en Z), la perte d'un plan focal à long terme ou les embryons partiellement coupés, la culture réussie n'était pas toujours Atteint. Ces problèmes peuvent être facilement contournés par une meilleure sélection sur le terrain pendant la phase d'acquisition de données. Dans l'ensemble, le prétraitement des données recueillies avec cette méthode semi-haut débit ou à l'aide de méthodes de montage conventionnelles est une première étape utile pour visualiser et analyser les ensembles de données embryonnaires.

Validation des méthodes de collecte d'images et de traitement des données : visualiser le développement embryonnaire après l'élimination de 40 gènes précédemment décrits
Pour valider cette méthode de collecte d'images semi-haut débit et ce régime de culture personnalisé, un petit écran D'ARNI a été réalisé dans les souches personnalisées, dirigées contre 40 gènes ayant des fonctions précédemment décrites dans la spécification et la morphogénèse du destin cellulaire ( décritpar par Wang, Ochoa, Khaliullin et ses collègues^10,11). Pour ce faire, dsRNA a été généré contre chaque cible, injecté des animaux L4 de chaque souche, attendu 20-24 h, puis disséqué et imaged embryons en utilisant le protocole décrit ci-dessus (pour ensemble de données complet^10,11). La réalisation des phénotypes développementaux par ARNi nécessite l'inhibition de l'expression des gènes maternels et zygotiques. Les gènes du développement peuvent être exprimés maternellement, les produits protéiques résultantétantétant chargés dans les embryons, ou zygotically exprimés dans l'embryon, ou, dans beaucoup de cas, les deux^10,22,23. Le temps entre l'injection et le tournage d'embryons est la variable critique pour cibler efficacement les populations exprimées par la mère et la zygotique; le moment détermine à la fois la quantité d'ARNd injecté qui est chargée dans l'embryon pour empêcher l'expression zygotique²⁴ et l'étendue de l'épuisement des protéines maternelles. Après l'injection de dsRNA, l'ARNm maternel correspondant au gène ciblé se dégrade et ne se rétablit pas dans un intervalle de temps pertinent. L'épuisement préexistant des protéines nécessite la production d'embryons, ce qui éjecte la protéine maternelle des tissus germinaux en la chargeant en embryons en formation. 20-24 h à 20 oC est le temps d'incubation le plus court qui permet un épuisement maternel constant; l'épuisement maternel s'améliore à des moments plus tard (c.-à-d., 36-42 h après injection). La quantité de dsARN injecté qui est chargée dans l'embryon dicte l'efficacité de la prévention de l'expression des gènes zygotiques. La quantité d'ARN chargé atteint un maximum d'environ 5-10 h après l'injection, lorsque les embryons avec du matériel injecté sont d'abord fécondés, diminuant par la suite. Dans notre expérience, 24 h après injection est un point de temps optimal, dans lequel l'épuisement et l'inhibition maternelles de l'expression de gène zygotique sont tous les deux efficaces. L'analyse des phénotypes dans les souches de reporter personnalisées utilisées dans ce travail, à travers l'ensemble de 40 gènes de test, a montré que notre protocole combiné a donné des phénotypes de signature distincts et hautement reproductibles à travers un large éventail de gènes impliqués dans le destin cellulaire spécifications et morphogénèse (voir Wang et coll.^10); l'ensemble complet de données est disponible¹¹). À titre d'exemple de ces données, des images fixes de quatre embryons différents pour le contrôle, pha-4 (RNAi), pal-1 (RNAi), et mex-3 (RNAi) dans la souche de report de couche germinale sont montrées dans la figure 4A. Pour une discussion plus complète des phénotypes observés dans l'écran DE l'ARNi de 40 gènes, voir Wang et coll.¹⁰

Macro ImageJ: Compilation et visualisation de toutes les données pour une condition donnée
La visualisation d'un grand nombre d'embryons à partir de piles de tiff individuelles peut être fastidieuse et prendre du temps à travailler à travers. D'après nos efforts initiaux, 400 embryons individuels ont été isolés à l'aide du programme de culture automatisé personnalisé décrit ci-dessus. Pour accélérer l'analyse de la première passe, nous avons construit une macro ImageJ, qui génère un tableau de tous les embryons photographiés pour une condition D'ARNI donnée dans un fond de souche donné (Figure 4B). Pour chaque embryon du tableau, une image brightfield et une image de projection d'intensité maximale sont présentées côte à côte, pour chaque point de temps, pour générer un fichier de film composite. Bien que cette macro ait été écrite pour fonctionner avec notre structure de fichiers, elle peut être modifiée pour s'adapter à la structure de fichier de l'utilisateur. Pour de meilleurs résultats, cependant, les utilisateurs doivent suivre les conventions de nommage et de structure de fichiers énoncées dans le protocole (voir les fichiers ZEnodo ou Github README pour plus de détails pour les conventions de nommage des applications Python et ImageJ). Pour voir toutes les données traitées par ImageJ et obtenir une analyse plus approfondie des phénotypes observés pour l'ensemble de tests de 40 gènes, veuillez consulter les données déposées dans la base de données de la Dryade^10,11. Ce format de visualisation ImageJ permet une évaluation rapide du phénotype global et de sa pénétration, et facilite le signalement des problèmes de qualité des données, tels que la présence de débris ou la perte d'un plan focal. Dans l'ensemble, la combinaison de la méthode d'acquisition de données à semi-haut débit, du programme de culture et de l'outil de visualisation ImageJ, combinée à des souches de journalistes personnalisées, facilite grandement les efforts à plus grande échelle pour étudier le développement embryonnaire.

Figure 1. Aperçu de la méthode d'imagerie à haute teneur, de la procédure de traitement des données et des outils essentiels. (A) Une comparaison des caractéristiques de la méthode standard à base de tampon salais pour le montage des embryons de C. elegans à l'approche d'imagerie multi-puits semi-haut débit décrite ici. (B) Aperçu de la méthode semi-haut débit pour surveiller le développement embryonnaire. Voir le texte pour plus de détails. (C) Aperçu des outils de traitement et de visualisation des données, qui peuvent être utilisés sur les données acquises à l'aide d'une procédure de montage classique à base de coussinet savane ou de la méthode à base de plaques multi-puits semi-haut débit décrite ci-dessus. Une seule séquence d'embryons à 3 canaux d'un champ (à gauche) ou de plusieurs champs 4 dimensions de données embryonnaires (à droite) peut être traitée à l'aide du programme de culture personnalisé, qui est compatible avec les données capturées sur la plupart des plates-formes d'imagerie. La version graphique de l'interface utilisateur (GUI) du programme est conviviale et ne nécessite aucune expertise en programmation. L'application screenCrop.py nécessite l'expertise de Python, mais elle a ajouté des capacités, à savoir qu'elle peut recadrer en format de lot. La sortie de cette étape est étroitement recadrée, antérieure-postérieure orientée embryon tiff piles. Pour visualiser toutes les données d'une seule condition, une macro ImageJ a été construite qui compile des piles de tiff recadrées et en rotation pour afficher une image brightfield et une projection d'intensité maximale pour chaque embryon à chaque point de temps. (D) Le panneau présente les outils essentiels nécessaires à la dissection et à la configuration du format d'imagerie semi-haut débit. Quelques composants de figure reproduits avec la permission de Wang et autres¹⁰. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2. Souches personnalisées générées pour l'imagerie à haute teneur en embryogenèse de C. elegans . (A) Les schémas illustrent les transgènes utilisés pour construire les souches de couche germinale (en haut) et de morphogenèse (en bas). (B) Les panneaux de projection d'intensité maximale montrent le cours du temps de développement dans les souches de morphogénèse (en haut) et de couche germinale (en bas). La vue ventrale est montrée, comme illustré dans les schémas (à gauche). Le temps est relatif à l'étape de la virgule (t -0), qui est facilement identifiable dans les deux souches. Barre à l'échelle de 10 m. Figure reproduite avec la permission de Wang et coll.¹⁰. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3. Le programme de culture sur mesure isole et oriente les embryons individuels des champs d'imagerie. (A) Schematic illustre les caractéristiques du programme de culture d'embryons personnalisé et met en évidence les deux options pour accéder à ce programme : une interface GUI conviviale, qui ne nécessite aucune expertise en programmation et est disponible sur Zenodo (à gauche) et un version de culture par lots du programme, qui nécessite une expérience Python et est disponible sur Github (à droite). (B) Graphic résume l'algorithme de culture automatisé — un masque binaire est généré à partir d'images 8 bits de brightfield et des embryons individuels sont détectés, recadrés et orientés le long de l'axe antérieur-postérieur. La barre d'échelle est de 10 m. (C) Les schématiques détaillent la procédure utilisée pour détecter itérativement les embryons dans le masque binaire. (D) Schematic illustre la méthode utilisée pour orienter les embryons le long de l'axe antérieur-postérieur. Panneaux B-D reproduits avec la permission de Wang et coll.¹⁰. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4. Custom ImageJ macro permet la visualisation des données de dépistage RNAi en générant des fichiers composites pour chaque condition. (A) Les embryons pour trois conditions d'ARNi d'exemple de l'ensemble de test de 40 gènes (voir Wang et al.^10,11 pour l'ensemble complet de données) sont montrés (à droite) qui mettent en évidence les phénotypes de signature distincts qui sont obtenus pour chaque et la reproductibilité des phénotypes dans chaque condition. Le panel a été adapté avec la permission de Wang et coll.¹⁰. (B) Le panneau illustre comment la macro ImageJ personnalisée (OpenandCombine-embsV2.ijm) regroupe les embryons d'une condition D'ARNI donnée dans un fichier Composite ImageJ qui regroupe les projections de champ lumineux et d'intensité maximale pour chaque embryon à chaque point de temps. Bien qu'un seul exemple soit mis en évidence, cette macro peut compiler les données pour de nombreuses conditions D'ARNI à la fois. ImageJ macro est disponible sur Zenodo¹². Barre d'échelle de 10 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Discussion

Ce travail décrit une série d'outils et de méthodes qui ont été développés pour permettre des efforts à plus grande échelle pour profiler la fonction des gènes dans le développement embryonnaire dans C. elegans. Notre méthode semi-haut débit permet l'imagerie en time-lapse 3D du développement embryonnaire à une résolution de 20 min pour 80 à 100 embryons dans une seule expérience. Bien que ce protocole puisse être adapté pour une utilisation avec n'importe quelle souche de marqueur souhaitée, ce travail démontre le potentiel de la méthode à l'aide de deux souches personnalisées développées pour surveiller les événements pendant l'embryogenèse : (1) une souche de reporter de couche germinale, dans laquelle le tissu spécifique les promoteurs conduisent l'expression des histones fluorescentes pour marquer les noyaux d'endoderm, de mesoderm et d'ectoderm, et (2) une souche de journaliste de morphogenesis, qui emploie des promoteurs épidermiques et neuronaux pour conduire l'expression des marqueurs fluorescents dans les cellules-jonctions et la membrane plasmatique. En imagerie des deux souches, les conséquences des perturbations moléculaires sur la spécification du destin cellulaire et les événements morphogénétiques peuvent être capturées avec des détails remarquables. Pour relever les défis posés par la quantité de données générées par cette méthode, des outils personnalisés ont été développés dans le but de rationaliser le traitement et la visualisation des données. Le premier outil produit des embryons individuels à partir d'un champ d'embryons dans des séquences en time-lapse 3D tout en faisant pivoter les embryons vers une orientation antérieure-postérieure standard et en effectuant la soustraction de fond, la correction de dérive et la correction de l'atténuation. Ce programme a été emballé comme une interface graphique conviviale (https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w) et le code source et une version plus avancée de loting du programme pour les utilisateurs avertis Python (github.com/renatkh/embryo_crop.git) est fourni^10,12,13. Enfin, pour visualiser ces données traitées dans un format significatif, une macro ImageJ a été conçue ; cela permet à l'utilisateur de visualiser tous les embryons d'une condition ARNI donnée dans un film multipaneled, qui montre un champ lumineux et la projection d'intensité maximale pour chaque embryon à chaque point de temps. Ensemble, les souches, le protocole et les outils de traitement des données font des efforts pour étudier l'embryogenèse de C. elegans dans une entreprise plus réalisable à plus grande échelle.

Bien que simple à mettre en œuvre dans l'ensemble, la méthode d'acquisition semi-haut débit décrite ici ne nécessitent une attention à quelques détails critiques, qui sont discutés ci-dessous. Tout d'abord, les utilisateurs doivent avoir accès à un microscope confocal avec une capacité de précision point-visite qui peut être équipé d'un porte-plaque multi-puits. La considération la plus critique pour ce protocole est que le microscope soit maintenu dans une pièce à température contrôlée. Alors que de nombreux microscopes ont la capacité de chauffer, la plupart ne peuvent pas refroidir de façon fiable, de ce fait, la température ambiante doit être adaptée pour maintenir une température constante C. elegans amicale. Pour ce faire, la salle d'imagerie est tenue à 16 oC. La zone d'échantillonnage de l'instrument chauffe jusqu'à 21-23 oC pendant l'imagerie. Les fluctuations de la température ambiante peuvent affecter le moment du développement et modifier subtilement la précision du plan focal lors de la visite du point et doivent être évitées autant que possible. Notez que courir à des températures supérieures à 23 oC peut entraîner un pic considérable de létalité embryonnaire pour les conditions de contrôle et n'est pas conseillé. Une autre considération clé est la sélection et la dispersion des embryons pendant la dissection. Il faut prendre soin d'éviter le transfert d'embryons plus âgés dans les puits d'imagerie, car, à l'éclosion, les animaux ont tendance à swish embryons adjacents hors de vue; l'incidence de ceci est diminuée par l'inclusion de l'anesthésique dans les médias. La dispersion des embryons, pour éviter de gros amas d'embryons, est également une variable critique. L'agglutination a tendance à se produire lorsque les embryons sont transférés dans les puits dans des pipets capillaires qui sont trop finement sortis, ou lorsque les embryons ne sont pas suffisamment dispersés pendant la dissection. Une autre considération est que la sélection des points et l'écoute des avions focals prend du temps. La plaque n'est pas maintenue sur la glace pendant ce processus, de sorte que les embryons commencent à se développer immédiatement. Pour les souches de marqueurs personnalisées utilisées dans cette étude, il y a environ une fenêtre de 90 minutes après que la plaque a été retirée de la glace pour effectuer la numérisation des plaques et la sélection des points avant que les marqueurs commencent à être exprimés. C'est suffisamment de temps pour mettre en place sur notre instrument avec ces souches, mais d'autres microscopes et souches peuvent offrir des défis de temps supplémentaires qui nécessiteront un dépannage. Enfin, la méthode que nous décrivons utilise un objectif d'huile 60x pour recueillir des z-piles de 50 champs à des intervalles de temps de 20 min. Comme nous le soulignons, la résolution temporelle peut être augmentée en diminuant le nombre de champs représentés. Par exemple, 10 champs peuvent être représentés à une résolution de temps de 4 min. Une deuxième alternative pour augmenter la résolution temporelle est d'employer un grossissement inférieur, objectif d'ouverture numérique élevé ; dans ce cas, le plus grand champ de vision permet l'imagerie d'un grand nombre d'embryons à une résolution de temps plus élevée avec seulement une réduction modérée de la résolution spatiale.

Pour permettre le traitement et la visualisation des données à plus grande échelle, nous avons construit des outils personnalisés et les avons rendus disponibles gratuitement. L'outil le plus largement utile est l'interface graphique de culture personnalisée, qui ne nécessite aucune expertise en programmation pour fonctionner. L'interface graphique peut être utilisée pour cultiver et orienter les embryons à tous les stades de développement et est compatible avec tous les marqueurs, ce qui le rend utile non seulement pour les biologistes du développement, mais aussi pour les chercheurs qui étudient les processus dans l'embryon précoce. Étant donné que la sortie de l'interface graphique est précisément recadrée, orientée, mise à l'échelle, corrigée par la dérive, les données peuvent être facilement canalisées dans un pipeline d'analyse automatisé, ce qui rend cet outil utile pour l'analyse des données passées et futures; si des souches appropriées sont utilisées, les fichiers de données résultants peuvent être utilisés comme entrée pour les régimes d'analyse automatisés existants, tels que les outils d'alignement de l'embryogenèse²⁵. Afin d'utiliser le programme, il est important que les utilisateurs soient conscients que l'algorithme de culture nécessite une image brightfield ou DIC à collecter pour chaque étape et le point de temps. En outre, les utilisateurs doivent noter que l'algorithme d'orientation antérieure-postérieure est structuré en fonction de la distribution du signal rouge dans les souches de rapport de rapport de microgerm-couche et de morphogenesis, montrées dans ce travail. Ainsi, l'exactitude de l'orientation AP dans d'autres souches de marqueurs devra être évaluée au cas par cas. L'interface graphique a été testée avec des données recueillies sur trois plates-formes d'imagerie confocale différentes et est compatible dans l'ensemble pour les piles multi-tiff et les séries de tiff. En plus de la version conviviale, le code source de l'interface graphique et une version par lots de ce programme a également été mis à disposition, avec la mise en garde que l'expérience de programmation est nécessaire, et les structures de fichiers et les conventions de nommage devront être suivies. Enfin, une macro de traitement ImageJ a été conçue pour prendre des piles d'images brutes pour tous les embryons, dans chaque condition d'ARNI, et compiler un tableau informatif pour montrer tous les embryons pour cette condition dans la projection d'intensité maximale brightfield et fluorescence à chaque moment. Cet outil peut être adapté aux spécifications de l'utilisateur et est une macro utile pour simplifier l'exploration des données et l'évaluation du contrôle de la qualité.

Ensemble, la méthode de tournage semi-haut débit ainsi que les outils de culture et de traitement d'image d'embryons décrits ci-contre faciliteront l'analyse du développement embryonnaire de C. elegans à l'aide d'une variété de mutants, de perturbations et de souches de marqueurs. Dans notre propre laboratoire, un écran à grande échelle utilisant ces méthodes pour filmer des embryons à partir des deux souches d'ingénierie personnalisées décrites ici après le renversement de 2 000 gènes nécessaires au développement est actuellement en cours. Enfin, les données de cet effort serviront de ressource supplémentaire pour améliorer les efforts visant à comprendre la spécification du destin cellulaire et les événements morphogénétiques au cours de l'embryogenèse.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aspirator Tube Assembly	Drummond Scientific	2-000-000
Calibrated Pipette (25 mL)	Drummond Scientific	2-000-025
Cell Voyager Software	Yokogawa Electric Corp	Included with CV1000
Conical Tube (15 mL)	USA Scientific	1475-0501
CV1000 Microscope	Yokogawa Electric Corp	CV1000
Depression slide (3-well)	Erie Scientific	1520-006
Dissection Microscope	Nikon	SMZ-645
Eppendorf Centrifuge 5810R	Eppendorf	5811 07336
ImageJ/FIJI	Open Source	https://imagej.net/Fiji
M9 Buffer	Lab Prepared	https://openwetware.org/wiki/M9_salts
Microcentrifuge Tube (1.5 mL)	USA Scientific	1615-5500
Microseal F-foil Seal	Bio-Rad	MSF1001
NGM Plates	Lab Prepared	http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html#d0e214
Scalpel #15	Bard Parker	REF 371615
Sensoplate Plus, 384 Well, F-bottom, Glass Bottom	Greiner Bio-One	781855
Tetramisole Hydrochloride	Sigma Aldirch	T1512-10G
Tweezers, Dumont #3	Electron Microscopy Sciences	0109-3-PO
U-PlanApo objective (10× 0.4 NA)	Olympus	1-U2B823
U-PlanApo objective (60× 1.35 NA)	Olympus	1-U2B832