Ein Instrument zur Analyse der C. elegans Embryonal development

Summary

Diese Arbeit beschreibt ein semi-high-throughput-Protokoll, das eine gleichzeitige 3D-Zeitraffer-Bildgebung der Embryogenese in 80–100 C. elegans Embryonen in einem einzigen Nachtlauf ermöglicht. Darüber hinaus sind Bildverarbeitungs- und Visualisierungstools enthalten, um die Datenanalyse zu optimieren. Die Kombination dieser Methoden mit kundenspezifischen Reporterstämmen ermöglicht eine detaillierte Überwachung der Embryogenese.

Abstract

C. elegans ist das führende System zur systematischen Analyse der Zellschicksalsspezifikation und morphogenetischen Ereignisse während der embryonalen Entwicklung. Eine Herausforderung besteht darin, dass sich die Embryogenese über einen Zeitraum von etwa 13 h dynamisch entfaltet; diese halbtägige Zeitskala hat den Umfang der Experimente eingeschränkt, indem die Anzahl der Embryonen, die abgebildet werden können, begrenzt wurde. Hier beschreiben wir ein Protokoll mit halbhohem Durchsatz, das die gleichzeitige 3D-Zeitraffer-Bildgebung der Entwicklung bei 80–100 Embryonen bei moderater Zeitauflösung von bis zu 14 verschiedenen Bedingungen in einem einzigen Nachtlauf ermöglicht. Das Protokoll ist einfach und kann von jedem Labor mit Zugang zu einem Mikroskop mit Punktbesuchskapazität implementiert werden. Der Nutzen dieses Protokolls wird demonstriert, indem es verwendet wird, um zwei kundenspezifische Stämme abzubilden, die fluoreszierende Marker ausdrücken, die optimiert sind, um schlüsselwichtige Aspekte der Keimschichtspezifikation und Morphogenese zu visualisieren. Um die Daten zu analysieren, wurde ein benutzerdefiniertes Programm erstellt, das einzelne Embryonen aus einem breiteren Sichtfeld in allen Kanälen, Z-Schritten und Zeitpunkten schneidet und die Sequenzen für jeden Embryo in einen separaten Tiff-Stack speichert. Das Programm, das eine benutzerfreundliche grafische Benutzeroberfläche (GUI) umfasst, optimiert die Datenverarbeitung durch Isolierung, Vorverarbeitung und gleichmäßige Ausrichtung einzelner Embryonen zur Vorbereitung auf Visualisierung oder automatisierte Analyse. Ebenfalls mitgeliefert wird ein ImageJ-Makro, das einzelne Embryodaten in eine Multi-Panel-Datei zusammenfasst, die maximale Fluoreszenzprojektion und Hellfeldbilder für jeden Embryo zu jedem Zeitpunkt anzeigt. Die hier beschriebenen Protokolle und Werkzeuge wurden validiert, indem sie zur Charakterisierung der embryonalen Entwicklung nach dem Abbau von 40 zuvor beschriebenen Entwicklungsgenen verwendet wurden; Diese Analyse visualisierte zuvor kommentierte Entwicklungsphänotypen und zeigte neue. Zusammenfassend beschreibt diese Arbeit eine halbhohe Durchsatz-Bildgebungsmethode in Verbindung mit einem Zuschneideprogramm und einem ImageJ-Visualisierungstool, das in Kombination mit Stämmen, die informative Fluoreszenzmarker exdrücken, Experimente zur Analyse erheblich beschleunigt. embryonale Entwicklung.

Introduction

Der C. elegans Embryo ist ein wichtiges Modellsystem für die mechanistische Zellbiologie und Analyse der Zellschicksalsspezifikation und morphogenetischen Ereignisse, die die embryonale Entwicklung antreiben^{1,2,3,4 ,5,6,7,8,9}. Bis heute wurde ein Großteil der Charakterisierung sowohl von Ereignissen auf zellulärer Ebene als auch von Zellschicksalsspezifikationen im Embryo mit relativ hohen zeitlichen Auflösungsexperimenten erreicht, die fluoreszierende Marker. Obwohl dieser Ansatz für Ereignisse in der Größenordnung von Sekunden bis zehn Minuten gut geeignet ist, wird er technisch einschränkend für die Charakterisierung längerer Prozesse in der Reihenfolge von Stunden zu Tagen. Die embryonale Entwicklung von der ersten Spaltung bis zum Ende der Dehnung dauert etwa 10 h. Bei dieser Zeitskala würden halbhohe Durchsatzmethoden, die eine gleichzeitige Bildgebung mit niedrigerer Zeitauflösung (d. h. Erfassung in 5–20 min Zeitintervallen) größerer Kohorten von Embryonen aus unterschiedlichen Bedingungen ermöglichen würden, eine neue Reihe von Experimenten eröffnen; z. B. die Ermöglichung systematischer groß angelegter Screening-Bemühungen und die Analyse einer ausreichenden Anzahl von Embryonen für Vergleiche der Folgen molekularer Störungen.

Hier beschreiben wir eine methode mit einem halbhohen Durchsatz zur Überwachung der C. elegans embryogenese, die die gleichzeitige 3D-Zeitraffer-Bildgebung der Entwicklung in 80–100 Embryonen von bis zu 14 verschiedenen Bedingungen in einem einzigen Nachtlauf ermöglicht. Das Protokoll ist einfach zu implementieren und kann von jedem Labor mit Zugang zu einem Mikroskop mit Punktbesuchsfähigkeiten durchgeführt werden. Die wichtigsten Schritte in diesem Protokoll sind in Abbildung 1beschrieben. Kurz gesagt, Embryonen werden von gravid Erwachsenen seziert, die fluoreszierende Marker von Interesse ausdrücken und junge Embryonen (2–8 Zellstadium) in Brunnen einer 384-Well-Platte für die Bildgebung übertragen. In diesem Format trichtert die relativ kleine Brunnengröße Embryonen in einen engen Bereich, was die Identifizierung von Feldern mit mehreren Embryonen für die Zeitraffer-Bildgebung erleichtert. Um die ungefähr synchrone Entwicklung über die Kohorte von Embryonen hinweg aufrechtzuerhalten, werden Sezierungen in gekühlten Medien durchgeführt und die Platte auf Eis gehalten, was eine signifikante Entwicklung während des stundenlangen Sezierzeitfensters verhindert. Die Platte wird auf das Mikroskop übertragen und Embryonen werden in einem temperaturgeregelten Raum über Nacht gefilmt, in 20 min Zeitintervallen, mit einer 60x Öl-Tauchlinse 1,35 NA-Linse, um den gesamten Z-Bereich in 2 m Schritten zu sammeln. Fünfzig Felder, die jeweils zwischen 1 und 5 Embryonen enthalten, werden in einem einzigen Nachtlauf abgebildet. Je nach gewünschtem Experiment könnte die Zeitauflösung erhöht werden (z. B. Bildgebung in 5–10 min Intervallen), indem die Anzahl der abgebildeten Felder proportional verringert wird.

Mit diesem Protokoll erzeugt selbst ein einziger Nachtlauf eine signifikante Datenmenge (80–100 Embryonen, die über 50 Felder verteilt sind) und größere Experimente können in Bezug auf die Datenanalyse schnell unüberschaubar werden. Um die Verarbeitung, Visualisierung und Rationalisierung dieser Daten zu erleichtern, wurde ein Programm entwickelt, um Embryonen auszuschneiden und auszurichten und Vorverarbeitungsschritte durchzuführen (optional), und ein ImageJ-Makro, das die Daten kompiliert, um die Anzeige zu vereinfachen. Diese Programme können verwendet werden, um Bilder zu verarbeiten, die mit konventionellen Ansätzen gesammelt wurden, da sie unabhängig von der Bildgebungsmethode sind und nur eine einzige Hellfeldebene erfordern. Das erste Programm nimmt ein 4D-Feld auf, das mehrere Embryonen (GUI-Option oder Quellcode embryoCrop.py) oder mehrere 4D-Felder enthält, die mehrere Embryonen enthalten (screenCrop.py), schneidet Embryonen fest und orientiert sie in einer vorderen Posterior-Konfiguration. Diese Programme geben Benutzern auch die Möglichkeit, Hintergrundsubtraktion, Driftkorrektur und Dämpfungskorrektur durchzuführen. Die resultierenden Dateien sind einheitlich vorverarbeitete, eng zugeschnittene Tiff-Stacks für jeden Embryo, die für die automatisierte Bildanalyse geändert werden können. Um das Anzeigen aller Embryonen für jede Bedingung zu vereinfachen, wurde ein ImageJ-Makro (OpenandCombine_embsV2.ijm) geschrieben, das alle Embryonen aus einem bestimmten Zustand zu einem einzigen Tiff-Stack zusammenfügt und hellfeldbildende Bilder und eine Projektionsfarbe mit maximaler Intensität ( RGB) Überlagerungen, nebeneinander, für jeden Embryo. Die Methoden wurden validiert, indem sie verwendet wurden, um die embryonale Entwicklung nach dem Abbau von 40 zuvor beschriebenen Entwicklungsgenen in einem Paar von kundenspezifischen Stämmen zu charakterisieren, die fluoreszierende Marker exdrücken, die optimiert sind, um Schlüsselaspekte der Keimschicht zu visualisieren. Spezifikation und Morphogenese^10,11. Zusammen werden das semi-hohe Durchsatz-Embryo-Bildgebungsprotokoll und bildverarbeitende Werkzeuge höhere Probenzahlenexperimente und groß angelegte Screening-Bemühungen ermöglichen, die darauf abzielen, Entwicklungsprozesse zu verstehen. Darüber hinaus werden diese Stämme auch ein effizientes Mittel zur Untersuchung der Auswirkungen molekularer Störungen auf die Embryogenese bieten.

Protocol

1. Vorbereitung von C. elegans Embryonen für die Bildgebung mit hohem Durchsatz

HINWEIS: Das Ziel dieses Teils des Protokolls ist es, eine Population von halbsynchronisierten (2 bis 8-Zellen-Stadium) C. elegans Embryonen, die von geeigneten Markerstämmen seziert werden (Abbildung 2), in eine Glasbodenplatte 384-Well-Platte für die Bildgebung zu laden. Andere Plattenformate könnten ebenfalls funktionieren, aber die 384 Brunnenplatten werden bevorzugt, weil die geringe Brunnengröße die Ausbreitung von Embryonen auf einen relativ kleinen Bereich beschränkt, was die Identifizierung von Feldern erleichtert, die mehrere Embryonen für die Zeitraffer-Bildgebung enthalten. Die ungefähre Synchronisierung der Embryonen stellt sicher, dass der gesamte Entwicklungsverlauf für jeden der Embryonen auf einem Feld erfasst wird.

1. 5–10 ml 0,1 mg/ml Lösung des Tetramisolehydrochlorids (TMHC) in eiskaltem M9-Medium gelöst (0,45 M Na₂HPO₄-7H₂O, 0,11 M KH₂PO₄, 0,04 M NaCl, 0,09 M NH₄Cl) während der Sezier- und Bildgebung. Dieses Medium enthält ein Anästhetikum, um sicherzustellen, dass sich bewegende geschlüpfte Larven die Bildgebung von Embryonen in früheren Entwicklungsstadien nicht stören.
   HINWEIS: Wenn Sie die Zuschneide- und Visualisierungstools zum Analysieren von Daten verwenden, die mit standardmäßigen Agarose-Pad-Montagemethoden erfasst wurden, fahren Sie mit Abschnitt 3 weiter fort.
2. Aliquot 70 l der vorbereiteten Lösung in einzelne Brunnen einer Glasboden-384-Well-Platte mit einem Brunnen für jeden Zustand; vermeiden Sie die äußeren zwei Reihen der Platte, um Kanteneffekte zu verhindern.
   HINWEIS: Es ist nützlich, umliegende Brunnen mit klebebarer PCR-Plattenfolie zu maskieren (siehe Beispiel in Abbildung 1D), dies bewahrt benachbarte Brunnen für zukünftige Experimente und erleichtert das Auffinden geeigneter Brunnen unter dem Seziermikroskop. Sobald die Lösung aliquoted ist, halten Sie die Platte und die verbleibende Lösung während der gesamten Sezierung auf Eis.
3. Generieren Sie Mundpipetten für die Übertragung von Embryonen aus der Depressionsrutsche (wo die gravid hermaphrodites seziert werden) zu den Brunnen. Kapillarpipezen (25 l kalibrierte Pipetten) über eine Flamme ziehen und brechen, um ein feines verjüngtes Ende zu erzeugen(Abbildung 1D). Eine Pipette wird pro Zustand benötigt, um Kreuzkontamination zu verhindern; Pipetten nach Gebrauch entsorgen.
4. Verwenden Sie eine feine Pinzette, um 10 Gravid-Erwachsene unter einem Sezierbereich in 150 l der eiskalten TMHC-Lösung zu übertragen, die für jede Erkrankung auf eine Depressionsrutsche aufgenommen wird. Sezieren Sie die Würmer mit der Pinzette und einem Skalpell, um die Embryonen freizusetzen.
5. Laden Sie eine gezogene Kapillarpipette in den mit den Pipetten enthaltenen Saugeraufsatz und mundpipet, um alle 2 bis 8-Zellen-Embryos in einen individuellen Brunnen der vorbereiteten Platte zu übertragen (Abbildung 1D). Vermeiden Sie die Übertragung von Embryonen im späten Stadium und Sezierreste. Untersuchen Sie unter einem Sezierbereich und ob Aggregate von Embryonen vorhanden sind, Mundpipette nach oben und unten oder Tippen Klumpen von Embryonen mit Pipettenspitze zu dispergieren.
   HINWEIS: Um Kreuzkontamination zu vermeiden, reinigen Sie Seziergeräte und verwenden Sie eine frische Mundleitung, während Sie sich zwischen den Bedingungen bewegen. Platte zwischen den Sezierungen auf Eis lagern.
6. Sobald Würmer aus allen Bedingungen seziert und Embryonen in ihren entsprechenden Brunnen gelegt wurden, drehen Sie die 384-Well-Platte für 1 min bei 600 x g, um die Embryonen zu begleichen.
7. Wischen Sie den Boden der Platte mit einem mit Ethanol getränkten Tuch ab, um Rückstände zu entfernen, und legen Sie die Platte auf ein konfokales Mikroskop, das mit einem Plattenhalter ausgestattet ist, in einer temperaturgeregelten Umgebung.
   HINWEIS: Die folgenden Schritte beschreiben diese Methode mithilfe der Lab-Einrichtung. bitte ändern Sie die Erfassungsbedingungen an die experimentellen Bedürfnisse und Ausrüstungen. Hier kommt eine konfokale Scannerbox mit einer mikrolens-verstärkten Dual-Nipkow-Spinnscheibe, einer 512 x 512 EM-CCD-Kamera, einer hochpräzisen Auto-XY-Bühne (bezeichnete Auflösung 0,1 m) und einer motorisierten Z-Achsen-Steuerung (bezeichnete Auflösung 0,1 m) zum Einsatz. Dieses System wird in einem Raum von 16 °C aufbewahrt, der die Mikroskoptemperatur während der Nachtbildgebung zwischen 21 und 23 °C hält.
8. Um Felder mit geeigneten Embryonen zu identifizieren, führen Sie einen Vorscan von jedem Brunnen mit einem 10x 0.4 NA Objektiv und geeigneter Bildgebungssoftware durch. Die optimalsten Felder enthalten mehr als einen Embryo im Frühstadium, der sich in derselben Fokalebene wie andere Embryonen befindet und idealerweise nur minimalen Kontakt zwischen benachbarten Embryonen hat. Markieren Sie Positionen geeigneter Regionen.
9. Um Bildgebungsfelder auszuwählen, wechseln Sie zum 60-fachen Objektiv und passen Sie die Brennebene bei jedem Punktbesuch an, um die Embryonen entsprechend zu sektionieren. 1–4 Felder pro Brunnen werden abgebildet, für insgesamt 50 Felder in 14 Brunnen, und jedes Feld kann zwischen einem und fünf Embryonen enthalten. Insgesamt werden aus jeder Erkrankung 4 bis 15 Embryonen für hochauflösende Bildgebung ausgewählt.
   HINWEIS: Eine Schlüsselvariable in diesem Schritt ist die Verwendung von ausreichend Öl; Legen Sie Öl auf das Ziel, Besuch Punkte in jedem Brunnen, um das Öl um die Oberfläche aller Brunnen zu verteilen und dann einen zusätzlichen Tropfen Öl auf das Ziel vor der Auswahl der Felder anwenden.
10. Stellen Sie die ausgewählten Felder mit einem 60x 1,35 NA-Ziel ab, um 18 z Abschnitte in 2'm-Intervallen alle 20 min für 10 h zu erfassen. Die bildgebenden Bedingungen mit den Keimschicht- und Morphogenese-Reporterstämmen sind wie folgt: Hellfeld, 90% Leistung, 25 ms, 20% Gewinn; 488 nm, 100% Leistung, 200 ms, 60% Gewinn; 568 nm, 45% Leistung, 150 ms, 60% Gewinn.
11. Nach Abschluss der Bildgebung, bewerten Embryonale Letalität durch durchführung einer niedrigen Vergrößerung (10x 0,4 NA Objektiv) ganze gut hellfeldscan 20-24 h nach dem Beginn der Nacht Bildgebung.

2. Embryonale Letalität Scoring

1. Anhand der nachdem durchscannten Felder werden embryonale Letalität und Larvendefekte bewertet, indem Sie geschlüpfte Würmer und ungeschlüpfte Embryonen für jeden Brunnen zählen.
2. Erzielen Sie ungeschlüpfte Embryonen als embryonales Tödliches. Ausschließen von verhafteten Ein- bis Vier-Zellen-Embryonen von der Tödlichkeitszahl, da junge sezierte Embryonen manchmal die Eischalenbildung nicht abschließen (wenn die Meiose II noch nicht vollständig ist) und Durchlässigkeitsfehler zu osmotischen Komplikationen in den ersten beiden Jahren führen können. Geschäftsbereiche.
3. Partitur teilweise geschlüpfte oder vollständig geschlüpfte Würmer mit Körpermorphologie oder Verhaltensstörungen, wie dumpy oder gelähmt, als "abnormale Larve".

3. Automatisiertes Zuschneiden (Abbildung 3A)

HINWEIS: Die Software ist an zwei Standorten untergebracht: (1) Zenodo beherbergt eine benutzerfreundliche Version der Software^12, die keine Programmierkenntnisse erfordert. (2) Github enthält den Quellcode für unsere embryoCropUI.py und screenCrop.py Software¹³, die Kenntnisse mit Python erfordern. Detaillierte Anweisungen zum Herunterladen und Bedienen beider Versionen des Programms finden Sie unten.

1. Automatisiertes Zuschneiden mit embryoCropUI ausführbarer Version (benutzerfreundliche Version)
   1. Um das embryoCropUI-Programm zu verwenden, laden Sie zuerst das Programm von Zenodo (https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w)¹²herunter.
      1. Laden Sie die MacOS- oder Windows-Formatversion des Programms herunter (beachten Sie, dass für die MacOS-Version MacOS X10.11 oder höher erforderlich ist).
      2. Laden Sie die Instruktionsdatei (GUI_Instructions_zenodo_repoV2.docx) herunter, die Schritt für Schritt Anleitung zum Testen und Verwenden des embryoCropUI-Programms bietet.
      3. Laden Sie test_files.zip herunter, um zu testen, ob das Programm auf der Plattform ordnungsgemäß funktioniert (siehe Anweisungen).
   2. Entpacken sie einmal, entpacken und navigieren Sie, um die ausführbare embryoCropUI-Datei (...'embryoCropUI-_WINDOWS-EmbryoCropUI-embryoCropUI-embryoCropUI.exe) oder (...'embryoCropUI_MacOS-embryoCropUI-embryoCropUI.exe) zu finden. Doppelklicken Sie, um das Terminal zu starten (oder wählen Sie "Öffnen mit" und führen Sie die ausführbare Datei embryoCropUI aus.
   3. Die ausführbare GUI schneidet jeweils ein 4D-Sichtfeld zu. Wählen Sie in der oberen linken Ecke die Schaltfläche "Öffnen", um das bestimmte Feld zum Zuschneiden (Multi-Tiff) zu laden. Wenn Sie eine Tiff-Serie mit mehreren Dimensionen (z, Zeit, Kanal) zuschneiden, laden Sie nur das erste Bild der Serie innerhalb des Ordners (eine Tiff-Serie pro Ordner).
   4. Sobald Bilder geladen wurden, geben Sie die folgenden Informationen an: Anzahl der Z-Slices, (Z), Anzahl der Zeitpunkte (T), Anzahl der Kanäle (C), der Kanal, der DIC oder hellfeld entspricht (first=1, second=2, etc.).
   5. Wählen Sie eine zusätzliche Verarbeitung aus, die für die Bilder ausgeführt werden soll. Das Programm bietet Drift-Korrektur, Hintergrundsubtraktion und Dämpfungskorrektur.
   6. Geben Sie Parameter für Die Hintergrundsubtraktion und Dämpfungskorrektur an, um den Verarbeitungsaufwand in der GUI-Eingabeaufforderung zu steuern. Definieren Sie für Hintergrundsubtrahieren die größte Featuregröße, die die Größe des aussagekräftigen Signals widerspiegelt. Diese Feature-Größe sollte nicht als Hintergrund betrachtet werden und muss ein ungerader Zahlenwert sein. Geben Sie einen Wert von 0-1 für Diedämpfungskorrektur ein. Der Wert für die Dämpfungskorrektur spiegelt den Prozentsatz der ursprünglichen Intensität wider, der in der entferntesten Tiefe des abgebildeten Objekts verbleibt.
      HINWEIS: Hintergrundsubtraktion und Dämpfungskorrektur müssen zusammen ausgeführt werden.
   7. Geben Sie die Bildsammlungsreihenfolge (d. h. channel-z-time (czt) oder z-channel-time (zct)) an.
   8. Geben Sie die Mikrometer pro Pixel für die Bilder basierend auf der verwendeten Kamera an.
      HINWEIS: Ein schlechter Zuschnitt des Bildes tritt auf, wenn die Pixelgröße nicht richtig definiert ist.
   9. Wählen Sie Ausführen in der unteren linken Ecke aus. Ein neuer Unterordner mit der Bezeichnung "Crop" wird im gleichen Pfad wie der nicht zugeschnittene Ordner erstellt. abgeschnittene Versionen werden an diesem Speicherort gespeichert. Je nach Dateigröße sollte das Zuschneiden innerhalb von Sekunden bis Minuten abgeschlossen sein.
2. Automatisiertes Zuschneiden mit screenCrop.py (Batch-Version Alternative zu embryoCrop GUI oben beschrieben;Nur Python-affine Benutzer)^10,13
   1. Um screenCrop.py zu verwenden, die Python-Softwareversion zum Zuschneiden größerer Datensätze in einem Batch-Format, klonen oder laden Sie den Quellcode von Github (github.com/renatkh/embryo_crop.git ).
   2. Lesen Sie die Anweisungen zum Konfigurieren einer geeigneten virtuellen Umgebung, und folgen Sie dem beschriebenen Dateibenennungssystem. beide sind in der README-Datei im Github-Repository detailliert: https://github.com/renatkh/embryo_crop/blob/master/README.md.
   3. Sobald Umweltvariablen und Namenskonventionen ordnungsgemäß festgelegt wurden, öffnen Sie parameters.py und screenCrop.py in einem Editor ihrer Wahl.
   4. Um einstellbare Parameter zu ändern, ohne den Quellcode zu berühren, bearbeiten Sie die parameters.py Datei.
      HINWEIS: Es ist auch möglich, Parameter direkt im Header von screenCrop.py zu ändern.
      1. Wenn Sie die parameters.py Konfigurationsdatei verwenden, ändern Sie die use_configure-Einstellung in True. Wenn Sie die direkte Bearbeitung innerhalb screenCrop.py verwenden, lassen Sie die use_configure-Einstellung unter False.
      2. Suchen Sie die folgenden Informationen in der parameters.py Datei und nehmen Sie Änderungen an die gewünschten Bildparameter und Dateistruktur vor:
         1. loadFolder (Zeile 9): Wechseln Sie zu dem Laufwerk, auf dem die Dateien gespeichert sind (z. B. Z:/, D:// usw.)
         2. Datum (Zeile 7): Wechseln Sie in den Ordner, der Dateien für die Imaging-Sitzung enthält. Dies wird in der CSV-Tracking-Datei als "Experiment Folder Name" bezeichnet (siehe Anweisungen).
         3. trackingFile (Zeile 11): Wechseln Sie zum Pfad zur CSV-Datei, in der Experimentinformationen gespeichert werden.
         4. z (Zeile 13): Wird als Anzahl der z-Ebenen festgelegt.
         5. nT (Zeile14): Geben Sie die Anzahl der Zeitpunkte an.
         6. nWells (Zeile 19): Geben Sie die Anzahl der verwendeten Brunnen an.
         7. pointVisits (Zeile 20): Wird als maximale Anzahl von Punktbesuchen (pro Brunnen) festgelegt.
         8. In Zeile 10 finden Sie den Ort, der derzeit von 'CV1000/' belegt ist, und geben Sie den äußeren Ordner ein, der im Dateipfad verwendet wird. Um Probleme zu vermeiden, verwenden Sie die folgende Konvention: 'XXXXXXX/'.
         9. Geben Sie in Zeile 12 einen gültigen Dateipfad zum Speichern von Seitenverhältnisdaten für zugeschnittene Daten ein.
         10. In den Zeilen 15, 16, 17 und 18 geben True/False ein, ob die Bilder die folgende Verarbeitung durchlaufen:
             1. Eingabe True oder False für drift korrektur auf Line 15.
             2. Eingabe True oder False für Hintergrundsubtrahieren in Zeile 16. Die Feature-Größe muss empirisch für verschiedene Markerstämme und Pixelgrößen bestimmt werden. In der Konfiguration wurde die Feature-Größe als 41 für den Germ-Layer-Stamm und 201 für den Morphogenese-Stamm definiert. Hintergrundsubtrahieren muss in Verbindung mit Dämpfungskorrektur erfolgen.
             3. Eingabe True oder False für Dämpfungskorrektur auf Zeile 17.
             4. Eingabe True oder False für vordere hintere Drehung auf Zeile 18.
   5. Sobald alle Änderungen vorgenommen wurden, kann mit dem Zuschneiden begonnen werden. Wechseln Sie dazu zu screenCrop.py und wählen Sie das Wiedergabesymbol in der Symbolleiste aus, wählen Sie im Dropdown-Menü Ausführen als > Python ausführenaus.
   6. Da das Zuschneiden für ein großes Dataset mehrere Stunden dauern kann (50 Punktbesuche 18 z Schritte, 3 Kanäle, 31 Zeitpunkte), verfolgen Sie den Fortschritt des Zuschneidens im Konsolenfenster. Sobald das Zuschneiden abgeschlossen ist, zeigt ein kleines Fenster eine Vorschau der zugeschnittenen Bilder vor dem Speichern an. Für jedes Bild gibt es 3 Optionen:
      1. Speichern: Drücken Sie die Leertaste, um das Bild zu speichern, wenn das Bild ordnungsgemäß abgeschnitten wird, ohne dass Bereiche von Interesse abgeschnitten werden.
      2. X: Drücken Sie X, wenn das Bild Bereiche von Interesse abgeschnitten zu haben scheint; Das Bild wird mit einem X vor dem Namen gespeichert, um es von den anderen Bildern zu trennen.
      3. Löschen: Drücken Sie D, um das zugeschnittene Bild zu löschen, wenn das Bild nicht richtig beschnitten wird oder der Embryo nicht zufriedenstellend ist.
         HINWEIS: Die Bilder werden in einem Unterordner mit dem Namen "Cropped" im Lastordner gespeichert (definiert in Zeile 9 des Programms).

4. Visualisierung (Abbildung 4)

HINWEIS: OpenandCombine_embsV2.ijm^10,12 ist ein ImageJ-Makro, das eine einfach zu erkennende tiff-Datei aus allen Bildern für eine bestimmte Dehnung und Bedingung erstellt. Installation von FIJI/ImageJ^14,15 erforderlich. Dieses Makro wird entsprechend unserer Dateistruktur ausgeführt. Es muss geändert werden, um mit anderen Dateistrukturen zu arbeiten. Eine Anleitung zur richtigen Dateistruktur und eine detaillierte Beschreibung wichtiger Überlegungen finden Sie am Ende der GUI_Instructions_zenodo_repoV2.docx-Datei im Zenodo-Repository. Bitte lesen Sie diese Anweisungen vollständig durch, bevor Sie die Bildgebung zum ordnungsgemäßen Namen und Strukturieren von Dateien anzeigen, um die beste Schnittstelle mit diesem Makro zu erhalten. Als Referenz sieht unsere Dateispeicherortstruktur wie folgt aus:
Z:-zugeschnittene ,,Target'Strain'Emb'Target_Emb'_15 Digit Unique Identifier _W'#F_T'#_Z'#_C'.tif
z.B. Z:-cropped-EMBD0001-GLS-Emb1-EMBD0001_Emb1_20140327T135219_W02F1_T01_Z01_C1.tif

1. Laden Sie OpenandCombine_embsV2 und GUI_Instructions_zenodo_repoV2.docx von Zenodo (https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w herunter.
2. Bereiten Sie die folgenden Informationen vor:
   -Der Speicherort, an dem die Bildordner gespeichert werden (nach dem Zuschneiden).
   -Die Bildordnernamen für die zu verarbeitenden spezifischen Bedingungen (z. B. EMBD0002). Dies wird im obigen Beispiel als "Ziel" bezeichnet.
   -Ein 15-stelliger alphanumerischer eindeutiger Bezeichner, der für ein bestimmtes Nachtexperiment spezifisch ist – dieser Bezeichner ist der Name des Datenerfassungsordners (d. h. 20140402T140154) und der eindeutige Bezeichner ist in den individuellen tiff-Dateinamen eingebettet (EMBD0002_Emb1_ 20140402T140154_W06F2_T01_Z01_C1) für jeden embryonalen Embryo, der an diesem Tag abgebildet wurde. Das Makro verwendet diesen Bezeichner, um nach Embryonen zu suchen, die am selben Datum erworben wurden, und kann wiederholte Bedingungen mit separaten Datumsangaben in separaten ImageJ-Dateien zusammenstellen.
3. Öffnen Sie ImageJ, und ziehen Sie die Makrodatei OpenandCombine_embsV2.ijmin die ImageJ-Leiste, oder öffnen Sie das Makro direkt.
4. Sobald das Makro geöffnet ist, suchen Sie die Zeilen 3 und 4. Geben Sie die in Abschnitt 4.2 gesammelten Informationen gemäß den folgenden Schritten ein:
   1. Geben Sie in Zeile 3 (RNAL) den Zielnamen für die zu verarbeitenden Bilder ein. Geben Sie jedes Ziel in der folgenden Struktur newArray("XXXXXXXX/"); Zitate enthalten. Um mehrere Bedingungen gleichzeitig auszuführen, trennen Sie ein Komma und behalten Sie alle Zielnamen in der Klammer (z. B. newArray("EMBD0000/","EMBD0001/","EMBD0002/").
   2. Geben Sie in Zeile 4 (Datum) den 15-stelligen alphanumerischen eindeutigen Bezeichner in Anführungszeichen ein, z. B. newArray("20140402T140154").
5. Drücken Sie Ausführung unten links im Makrofenster. Es wird ein Fenster angezeigt, in dem eine Eingabeaufforderung zum äußeren Ordner mit den zugeschnittenen Bildordnern (in 4.4.1) gestartet wird.
6. Einmal ausgewählt, wird ein weiteres Fenster angezeigt, das die Angabe von Bildparametern ermöglicht.
   1. Geben Sie die Anzahl der Kanäle, die Anzahl der Z-Slices, die Schriftgröße für den Text, der zum Beschriften der kompilierten Bilder verwendet wird, und die Farbe für jeden Kanal ein.
   2. Check On /Off Auto Kontrast in allen Kanälen.
7. Nachdem alle Parameter angegeben wurden, klicken Sie unten im Fenster auf OK. Die zusammengesetzte Datei beginnt zu montieren; Dies dauert mehrere Minuten pro Bedingung.
8. Überprüfen Sie nach Abschluss die Dateien, die bei Bedarf geöffnet bleiben. Sie können ohne Speichern geschlossen werden, da das Makro die Dateien bereits in einem neu erstellten Ordner gespeichert hat, der wie folgt benannt ist: äußerer Ordnername (in der Eingabeaufforderung von Abschnitt 4.5 angegeben) + "-fiji-processed-output" (d.h. Z:" cropped-fiji-processed-output-EMBD0002_GLS_20140402T140154.tif).

Representative Results

Eine große Herausforderung bei der Charakterisierung der Wirkung molekularer Störungen auf die embryonale Entwicklung von C. elegans besteht darin, dass es etwa 10 h dauert, bis Embryonen von der ersten Spaltung bis zum Ende der Dehnung bei 20°¹⁶fortschreiten. Eine Methode mit halbhohem Durchsatz, bei der große Kohorten von Embryonen gleichzeitig abgebildet werden können, ist für Ereignisse auf dieser Zeitskala nützlich, da sie die Abbildung mehrerer Bedingungen parallel zu einer ausreichenden Ensemblegröße für jede Bedingung ermöglicht, um quantitative Analyse (Abbildung 1A).

Bildgebungsverfahren mit halbhohem Durchsatz und Multimarker-Stämme
Das hier beschriebene Bildgebungsverfahren mit halbhohem Durchsatz (in Abbildung 1B)verwendet eine 384-Well-Glasbodenplatte; Das Multi-Well-Format ermöglicht die parallele Anordnung von bis zu 14 Bedingungen und die geringe Größe der Brunnen schränkt den Suchbereich ein, wodurch die Identifizierung von Embryonen enthaltenden Feldern für hochauflösende Bildgebung vereinfacht wird. Hier kam eine konfokale Scannerbox zum Einsatz, ausgestattet mit einer mikrolens-verstärkten Dual-Nipkow-Spinnscheibe, einer 512 x 512 EM-CCD-Kamera, einer hochpräzisen Auto-XY-Stufe (bezeichnete Auflösung 0,1 m) und einer motorisierten Z-Achsen-Steuerung (bezeichnete Auflösung 0,1 m). Das Protokoll kann jedoch für jedes konfokale Mikroskop mit präzisen Punkt-Besuchsfunktionen und einem Bühnenadapter angepasst werden, der eine Multi-Well-Platte aufnehmen kann. Eine große Herausforderung bei der Entwicklung dieser Methode bestand darin, ein Mittel zu entwickeln, um eine Platte von Embryonen im gleichen Entwicklungsstadium zu erzeugen, so dass die gesamte Entwicklung für alle Embryonen in jedem Bereich erfasst werden kann. Dies ist eine Herausforderung, da sich die Embryonen, die zuerst auf die Bildplatte geglast sind, weiter entwickeln, während spätere Proben seziert werden, was zu einem Gradienten der Inszenierung über die Brunnen führt. Um dieses Problem zu umgehen, werden Embryonen im Frühstadium (2-8 Zellstadium) ausgewählt und die Seziermedien und die Bildplatte auf Eis halten; Dies stoppt die Embryogenese für die sezierten Embryonen, bis alle Bedingungen angeordnet sind, ohne die embryonale Lebensfähigkeit signifikant zu beeinträchtigen¹⁰. Um die Zeit, in der die Embryonen auf dem Eis sitzen, auf 1 Stunde zu begrenzen, führen zwei Forscher die Sezieren gleichzeitig durch, was die Einrichtung von 14 verschiedenen Bedingungen in ca. 50 min ermöglicht. Nach der Zerlegung wird die Platte bei 600 x g für 1 min gesponnen, um die Embryonen und Brunnen bei geringer Vergrößerung vorscannen zu lassen, um Felder mit Gruppen geeigneter Embryonen für die Bildgebung mit hoher Vergrößerung zu lokalisieren; Punktbesuchsorte sind markiert. Embryonen werden in einem temperaturgeregelten Raum über Nacht mit einer 60-fachen Öl-Tauchlinse gefilmt. Die Proben sind in einem 4-Mal-4-Brunnenbereich so konfiguriert, dass die Oberfläche der in einem Experiment verwendeten Platte mit einem 22 x 22 mm² Standard-Abdeckungsslip vergleichbar ist, der den Einsatz eines 60-fachen Ölobjektivs ermöglicht. Eine gleichmäßige Ölstreuung in dieser Region vor Beginn der Bildgebung ist entscheidend für eine erfolgreiche langfristige Bildaufnahme. Die sich entwickelnden Embryonen werden in einer Anästhesielösung abgebildet; Dadurch wird sichergestellt, dass die Bewegung der älteren Embryonen im Brunnen die Position benachbarter jüngerer Embryonen, die abgebildet werden, nicht stört. Aufgrund der undurchdringlichen Natur der Eierschale hat das Anästhetikum keinen Einfluss auf die Bewegung vor dem Schlüpfen. Unter diesen Bedingungen werden 3D-Zeitrafferdaten in 3 Kanälen für insgesamt 80-100 Embryonen in einem einzigen Nachtexperiment gesammelt (siehe unten).

C. elegans embryonische Entwicklung erfolgt in zwei Phasen. Zunächst erzeugen 10 Runden Zellteilung, gekoppelt an die Zellschicksalsspezifikation, die drei Keimschichten (Ektoderm, Mesoderm und Endoderm) über einen Zeitraum von 6 Stunden¹⁷. In den folgenden 7 h treiben morphogenetische Ereignisse die Bildung differenzierter Gewebe^{an 8,16}. Um diese beiden Aspekte der Entwicklung zu erfassen, haben wir ein Paar von benutzerdefinierten Stämmen, die Keimschicht und die Morphogenese-Stämme¹⁰ (Abbildung 2A), aufgebaut und das Protokoll mit hohem Durchsatz verwendet, um Embryonen aus beiden Stämmen abzubilden. Der Keimschichtstamm exprossiert transgenekodierte fluoreszierende Proteine, die Kerne im Ektoderm, Mesoderm und Endoderm in Rot, Gelb und Grün markieren. Dieser Stamm enthält drei Reportertransgene: (1) ein transgenes ExzessIV PHA-4::GFP, das Kerne im Darm und Rachen (grünes Endeoderm)^10,18,19, (2) ein Transgen markiert, das mCherry-Histon-Fusion in der Epidermis und in 1/3 der Neuronen (rotes Ektoderm; Abbildung 2A) und (3) ein Transgen, das gleichzeitig mCherry- und GFP-markierte Histone im Körperwandmuskel (gelbes Mesoderm) ausdrückt. Der Morphogenese-Stamm hat zwei Transgene, die ausdrücken: (1) einen grünen Epithel-Knotenmarker (DLG-1::GFP) in der Epidermis und (2) einen mCherry-markierten Plasmamembranmarker, in 1/3 der Neuronen (Pcnd-1-Promotor; Abbildung 2A). Um die Wirksamkeit von RNAi zu verbessern, wurden beide Stämme auch entwickelt, um ein Paar RNAi-sensibilisierender Mutationen(nre-1(hd20) lin-15b(hd126)²⁰zu enthalten. Diese wurden mit dem Ziel konstruiert, einen groß angelegten RNAi-basierten Bildschirm der 2.000 Gene durchzuführen, die für die embryonale Entwicklung erforderlich sind. Dieses Sortenpaar wird jedoch auch eine weitgehend nützliche standardisierte Plattform zur Beurteilung von Entwicklungsfehlern bei Mutanten und für detailliertere Analysen der Rolle verschiedener Proteine in der Entwicklung darstellen.

Für die Datenerfassung in diesem halbhohen Durchsatzformat werden mit diesen Stämmen grüne, rote und helle Feld-Z-Reihen (18 x 2 m² Intervalle) alle 20 min für einen Zeitraum von 10 h in einem temperaturgeregelten Raum von 16 °C gesammelt; dies hält das Mikroskop zwischen 21-23 °C während des Laufs. Das Zeitintervall von 20 min ermöglicht es uns, 50 Embryonenfelder (Punktbesuche) pro Experiment abzubilden. Benutzer können Akquisitionen auf kürzere Intervalle mit weniger Punktbesuchen oder längere Intervalle mit mehr Punktbesuchen anpassen, um ihren experimentellen Zielen am besten gerecht zu werden. Für diese Stämme werden die frühen Entwicklungszeitpunkte nicht abgebildet, da die gewebespezifischen Reporter, die den Markerausdruck antreiben, erst mitte bis spät zum Ausdruck kommen. In dieser frühen Phase wurden Brunnen mit geringer Vergrößerung (10x) gescannt und Felder für die Bildgebung mit hoher Vergrößerung ausgewählt. Es wird empfohlen, Felder auszuwählen, die mehr als einen Embryo im Frühstadium enthalten, aber Felder zu vermeiden, in denen Embryonen sich teilweise überlappen, übermäßig überfüllt sind oder sich am äußersten Rand des Brunnens befinden. Nach über Nacht 60x Bildgebung wird eine geringe Vergrößerung (10x) ganze Brunnenscan durchgeführt, um festzustellen, ob Embryonen mit normalem Aussehen (WT), Schlüpfen mit sichtbaren Anomalien (Larven abnormal) schlüpfen oder embryonal für jede untersuchte Erkrankung sind ( Abbildung 1B). Dieser Schritt dient als einfache Alternative zum parallelen Aufstellen von Platten zur Beurteilung der Letalität in einer größeren Population; der gesamte Brunnen 10x Post-Scan liefert embryonale Letalitätsdaten für 50-80 Embryonen pro Zustand. Die Verwendung dieser Maßnahme zum Vergleich der Embryonalitätsdaten der Population für die Kontrolle zwischen durch Läufe ist eine nützliche Kontrolle, die die Konsistenz in Bezug auf die Gesundheit der Stämme und die Umweltbedingungen und Verarbeitungsschritte gewährleistet. In Kombination bieten die beiden benutzerdefinierten Reporterstämme informative Auslesungen für die meisten wichtigen Entwicklungsereignisse, einschließlich Zellschicksalsspezifikation, dorsale Intercalation, epidermale satellische, Dehnung und Neurogenese (repräsentativ Kontrollbilder sind in Abbildung 2Bdargestellt, siehe auch Wang et al.¹⁰).

Datenverarbeitung: automatisiertes Zuschneiden und Orientierung von Embryonen
Mit unserem Bildgebungsprotokoll enthält jedes hochauflösende Bildgebungsfeld zwischen 1 und 5 Embryonen; Diese Embryonen sind zufällig ausgerichtet und werden häufig unmittelbar nebeneinander positioniert. Daten, die mit herkömmlichen Embryomontagetechniken gesammelt werden, stehen unter den gleichen Herausforderungen. Um die Daten für die nachfolgende Visualisierung und Analyse vorzubereiten, ist eine erhebliche praktische Manipulation erforderlich, um die Embryosequenzen zubeschneiden und auszurichten sowie sie vorzuverarbeiten, um Hintergrund zu subtrahieren, Drift zu korrigieren und Signaldämpfung zu kompensieren. mit Tiefe. Um diesen Prozess zu optimieren, wurde ein benutzerdefiniertes Embryo-Zuschneideprogramm entwickelt, das jeden Embryo aus dem breiteren Feld isoliert und ausrichtet (Abbildung 1C, Abbildung 3). Dieses Programm wurde als benutzerfreundliches, eigenständiges Programm mit grafischer Benutzeroberfläche (GUI, kompatibel mit Daten von den meisten Bildverarbeitungsplattformen) verpackt, die eine 3D-Zeitraffersequenz eines Embryofeldes aufnehmen und in einzelne Tiff-Reihen verarbeiten können. für jeden Embryo auf dem Feld(Abbildung 3B, verfügbar unter https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w)^10,12. Der Python-Quellcode für die GUI (embryoCropUI.py) und eine Batch-Version dieses Programms (screenCrop.py) sind auch für erfahrene Python-Benutzer auf GitHub (https://github.com/renatkh/embryo_crop.git)^10,13verfügbar. Die Kernfunktionalität dieses Programms besteht darin, den Embryo entlang der vorderen hinteren Achse zu lokalisieren, zuzuschneiden und zu orientieren. Gleichzeitig können Hintergrundsubtraktion, Dämpfungskorrektur und Driftkorrektur am Dataset mit optional einstellbaren Einstellungen durchgeführt werden.

Kurz gesagt, erkennt die automatisierte Zuschneidesoftware iterativ einzelne Embryonen in einer binären Maske, die aus den Hellfeldbildern gewonnen wird, und schneidet die Embryonen sequenziell aus allen Kanälen und orientiert die Bilder entlang der vorderen-hinteren Achse(Abbildung 3 B, zuerst beschrieben in Wang et al.¹⁰). Vor dem Zuschneiden korrigiert die Software Drift, subtrahiert Hintergrund und führt Tiefendämpfungskorrektur in jedem Fluoreszenzkanal (optional) durch. Um die binäre Maske zu erhalten, wendet die Software Canny Edge Detection²¹ auf die Hellfeldbilder an, führt maximale Intensitätsprojektion der drei zentralen Ebenen durch und füllt kleine Löcher aus. Der Algorithmus erkennt einzelne Embryonen, indem er ein Cassini-Oval an einen Abschnitt der binären Maskenumrisse anpasst (siehe Abbildung 3B, 3C). Nach dem Ausrichten des Ovals entlang seiner Hauptachse misst die Software die rote Fluoreszenzintensität in jeder Hälfte des isolierten Embryos und dreht den Embryo so, dass die rote Intensität nach links ausgerichtet ist, wodurch der Embryo für beide Reporterstämme, die in dieser Arbeit verwendet werden (Abbildung 3D). Die Pilotisierung dieser Software ergab, dass die meisten Embryonen wie erwartet effizient beschnitten wurden. Kleinere bildgebende Probleme wie Embryodrift, vorübergehender Verlust von Fokalenebenen (aufgrund von Ölblasen) oder überfüllte Felder von Embryonen störten in der Regel nicht die erfolgreiche Ernte. Bei Feldern, in denen es große Klumpen von Embryonen gab (etwas in z überlappend), Embryonen, die innerhalb der Bildebene signifikant geneigt waren (in Z), Langzeit-Fokalen-Flugzeugverlust oder Embryonen, die teilweise abgeschnitten waren, war erfolgreiches Zuschneiden nicht immer Erreicht. Diese Probleme können durch eine bessere Feldauswahl während der Datenerfassungsphase leicht umgangen werden. Insgesamt ist die Vorverarbeitung von Daten, die mit dieser Methode mit hohem Durchsatz oder mit herkömmlichen Montagemethoden gesammelt wurden, ein nützlicher erster Schritt für die Visualisierung und Analyse embryonaler Datensätze.

Validierung von Bildsammlungs- und Datenverarbeitungsmethoden: Visualisierung der embryonalen Entwicklung nach Demknach fallende 40 zuvor beschriebene Gene
Um diese Methode der Bildsammlung mit halb hohem Durchsatz und dem benutzerdefinierten Zuschneideregime zu validieren, wurde ein kleiner RNAi-Bildschirm in den benutzerdefinierten Stämmen durchgeführt, der gegen 40 Gene mit zuvor beschriebenen Funktionen in der Zellschicksalsspezifikation und Morphogenese ( beschrieben von Wang, Ochoa, Khaliullin und Kollegen^10,11). Dazu wurde dsRNA gegen jedes Ziel erzeugt, L4-Tiere aus jedem Stamm injiziert, 20-24 h gewartet und dann Embryonen mit dem oben beschriebenen Protokoll seziert und abgebildet (für den vollständigen Datensatz^10,11). Um Entwicklungsphänotypen durch RNAi zu erreichen, ist eine Hemmung sowohl der mütterlichen als auch der zygotischen Genexpression erforderlich. Entwicklungsgene können mütterlich exprimiert werden, wobei die resultierenden Proteinprodukte in die Embryonen geladen oder im Embryo zygotisch exprimiert werden, oder in vielen Fällen^{sowohl 10,22,23}. Die Zeit zwischen Injektion und Embryo-Filmen ist die entscheidende Variable, um mütterliche und zygotisch ausgedrückte Populationen effektiv anzusprechen; Timing bestimmt sowohl die Menge der injizierten dsRNA, die in den Embryo geladen wird, um zygotische Expression²⁴ zu verhindern, als auch das Ausmaß der erblichen erschöpfung des mütterlichen Proteins. Nach der dsRNA-Injektion wird die dem Zielgen entsprechende mütterliche mRNA abgebaut und erholt sich in einem relevanten Zeitintervall nicht. Bereits vorhandene Proteindepletion erfordert eine Embryoproduktion, die das mütterliche Protein aus Keimbahngewebe ausstößt, indem es es in sich bildende Embryonen einlädt. 20-24 h bei 20 °C ist die kürzeste Inkubationszeit, die eine gleichmäßige erschöpfung der Mütter ermöglicht; die erschöpfende Mutter wird zu späteren Zeitpunkten (d. h. 36-42 h nach der Injektion) besser. Die Menge der injizierten dsRNA, die in den Embryo geladen wird, bestimmt, wie effektiv die Prävention der zygotischen Genexpression sein wird. Die Menge der geladenen RNA erreicht nach der Injektion etwa 5-10 h, wenn Embryonen mit injiziertem Material zuerst befruchtet werden und danach abnehmen. Nach unserer Erfahrung ist 24 h nach der Injektion ein optimaler Zeitpunkt, in dem der erschöpfung des mütterlichen Proteins und die Hemmung der zygotischen Genexpression wirksam sind. Die Analyse von Phänotypen in den in dieser Arbeit verwendeten benutzerdefinierten Reporterstämmen über den Satz von 40 Testgenen zeigte, dass unser kombiniertes Protokoll deutliche, hoch reproduzierbare Signatur-Phänotypen über ein breites Spektrum von Genen ergab, die am Zellschicksal beteiligt waren. Spezifikation und Morphogenese (siehe Wang et al.¹⁰); der vollständige Datensatz ist verfügbar¹¹). Als Beispiel für diese Daten sind Standbilder von vier verschiedenen Embryonen zur Kontrolle, pha-4(RNAi), pal-1(RNAi)und mex-3(RNAi) im Keimschicht-Reporterstamm in Abbildung 4Adargestellt. Für eine umfassendere Diskussion der Phänotypen, die im 40-Gen-RNAi-Bildschirm beobachtet wurden, siehe Wang et al.¹⁰

ImageJ-Makro: Zusammenstellung und Visualisierung aller Daten für eine bestimmte Bedingung
Die Visualisierung einer großen Anzahl von Embryonen aus einzelnen Tiff-Stacks kann mühsam und zeitaufwändig sein. Von unseren anfänglichen Bemühungen wurden >400 einzelne Embryonen mit dem oben beschriebenen benutzerdefinierten automatisierten Zuschneideprogramm isoliert. Um die Erstpassanalyse zu beschleunigen, haben wir ein ImageJ-Makro erstellt, das ein Array aller Embryonen generiert, die für einen bestimmten RNAi-Zustand in einem bestimmten Stammhintergrund abgebildet sind (Abbildung 4B). Für jeden Embryo im Array werden ein Hellfeldbild und ein Projektionsbild mit maximaler Intensität nebeneinander für jeden Zeitpunkt dargestellt, um eine zusammengesetzte Filmdatei zu generieren. Während dieses Makro geschrieben wurde, um mit unserer Dateistruktur zu funktionieren, kann es bearbeitet werden, um die Dateistruktur des Benutzers aufzunehmen. Für optimale Ergebnisse sollten Benutzer jedoch die im Protokoll festgelegten Namens- und Dateistrukturkonventionen befolgen (siehe Zenodo- oder Github README-Dateien für weitere Details zu den Namenskonventionen für Python- und ImageJ-Anwendungen). Um alle von ImageJ verarbeiteten Daten anzuzeigen und eine eingehendere Analyse der für den 40-Gen-Testsatz beobachteten Phänotypen zu erhalten, lesen Sie bitte die in der Dryad-Datenbank^10,11hinterlegten Daten. Dieses ImageJ-Visualisierungsformat ermöglicht eine schnelle Bewertung des gesamten Phänotyps und seiner Penetranz und erleichtert das Kennzeichnen von Problemen mit der Datenqualität, wie z. B. das Vorhandensein von Schmutz oder den Verlust der Brennebene. Insgesamt erleichtert die Kombination der Methode zur Datenerfassung mit halbhohem Durchsatz, dem Zuschneideprogramm und dem ImageJ-Visualisierungstool in Kombination mit benutzerdefinierten Reporterstämmen größere Anstrengungen zur Erforschung der embryonalen Entwicklung.

Abbildung 1. Überblick über die Bildverarbeitungsmethode mit hohem Inhalt, das Datenverarbeitungsverfahren und die wesentlichen Tools. (A) Ein Vergleich der Merkmale des Standard-Agarosepad-basierten Verfahrens zur Montage von C. elegans-Embryonen mit dem hier beschriebenen Multi-Well-Bildgebungsansatz mit semihohem Durchsatz. (B) Überblick über die Methode des halbhohen Durchsatzes zur Überwachung der embryonalen Entwicklung. Weitere Informationen finden Sie im Text. (C) Überblick über die Datenverarbeitungs- und Visualisierungswerkzeuge, die auf Daten verwendet werden können, die entweder mit einem konventionellen Agarosepad-basierten Montageverfahren oder dem hier beschriebenen multi-well-plattenbasierten Verfahren mit halbhohem Durchsatz erfasst werden. Eine einzelne 3-Kanal-Zeitraffer-Embryosequenz aus einem Feld (links) oder mehreren 3-Kanal- 4-dimensionalen Feldern von Embryodaten (rechts) kann mit dem benutzerdefinierten Zuschneideprogramm verarbeitet werden, das mit Daten kompatibel ist, die auf den meisten Bildplattformen erfasst wurden. Die grafische Benutzeroberfläche (GUI) Version des Programms ist benutzerfreundlich und erfordert keine Programmierkenntnisse. Die screenCrop.py Anwendung erfordert Python-Expertise, aber es hat Funktionen hinzugefügt - nämlich, dass es im Batch-Format zuschneiden kann. Die Ausgabe dieses Schritts ist eng beschnitten, vorder-posterior orientierten Embryo Tiff Stapel. Um alle Daten aus einer einzelnen Bedingung zu visualisieren, wurde ein ImageJ-Makro erstellt, das zugeschnittene, gedrehte Tiff-Stacks kompiliert, um ein Hellfeldbild und eine maximale Intensitätsprojektion für jeden Embryo zu jedem Zeitpunkt anzuzeigen. (D) Panel zeigt wichtige Werkzeuge für die Zerlegung und Einrichtung von semi-High-Throughput-Imaging-Format benötigt. Einige Figurenkomponenten reproduziert mit Genehmigung von Wang et al.¹⁰. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2. Benutzerdefinierte Stämme, die für die hochauflösende Bildgebung der C. elegans embryogenesis erzeugtwurden. (A) Schemata veranschaulichen die Transgene, die zum Konstruieren der Keimschichtstämme (oben) und der Morphogenese (unten) verwendet werden. (B) Projektionsflächen mit maximaler Intensität zeigen den Entwicklungszeitverlauf in den Stämmen Morphogenese (oben) und Keimschicht (unten). Ventrale Ansicht wird angezeigt, wie in den Schaltplänen dargestellt (links). Die Zeit ist relativ zur Kommastufe (t = 0), die in beiden Stämmen leicht identifizierbar ist. Maßstabsleiste = 10 m. Figur mit Genehmigung von Wang et al.¹⁰reproduziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3. Das benutzerdefinierte Zuschneideprogramm isoliert und orientiert einzelne Embryonen aus bildgebenden Feldern. (A) Schematic veranschaulicht die Funktionen des benutzerdefinierten Embryo-Zuschneideprogramms und hebt die beiden Optionen für den Zugriff auf dieses Programm hervor: eine benutzerfreundliche GUI-Schnittstelle, die keine Programmierkenntnisse erfordert und auf Zenodo (links) und einem Batch-Zuschneideversion des Programms, die Python-Erfahrung erfordert und auf Github (rechts) verfügbar ist. (B) Grafik fasst den automatisierten Zuschneidealgorithmus zusammen – eine binäre Maske wird aus 8-Bit-Hellfeldbildern erzeugt und einzelne Embryonen werden erkannt, ausgeschnitten und entlang der vorderen hinteren Achse ausgerichtet. Die Maßstabsleiste ist 10 m. (C) Schematische beschreiben das Verfahren, das verwendet wird, um Embryonen in der binären Maske iterativ zu erkennen. (D) Schematisch veranschaulicht die Methode zur Orientierung von Embryonen entlang der vorderen-hinteren Achse. Panels B-D reproduziert mit Genehmigung von Wang et al.¹⁰. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4. Das benutzerdefinierte ImageJ-Makro ermöglicht die Visualisierung von RNAi-Screening-Daten, indem zusammengesetzte Dateien für jede Bedingung generiert werden. (A) Embryonen für drei Beispiel-RNAi-Bedingungen aus dem 40-Gen-Testsatz (siehe Wang et al.^10,11 für den vollständigen Datensatz) werden gezeigt (rechts), die die unterschiedlichen Signatur-Phänotypen hervorheben, die für jeden und die Reproduzierbarkeit der Phänotypen innerhalb jeder Bedingung. Panel wurde mit Genehmigung von Wang et al.¹⁰angepasst. (B) Das Bedienfeld veranschaulicht, wie das benutzerdefinierte ImageJ-Makro (OpenandCombine_embsV2.ijm) Embryonen aus einer bestimmten RNAi-Bedingung in eine zusammengesetzte ImageJ-Datei ausbildet, die die Hellfeld- und Maximalintensitätsprojektionen für jeden Embryo zu jedem Zeitpunkt aufstellt. Obwohl nur ein Beispiel hervorgehoben wird, kann dieses Makro die Daten für viele RNAi-Bedingungen gleichzeitig kompilieren. ImageJ-Makro ist auf Zenodo¹²verfügbar. Maßstabsleiste = 10 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

Diese Arbeit beschreibt eine Reihe von Werkzeugen und Methoden, die entwickelt wurden, um größere Anstrengungen zu ermöglichen, die Funktion von Genen in der embryonalen Entwicklung in C. eleganszu profilieren. Unsere Methode mit hohem Durchsatz ermöglicht eine 3D-Zeitraffer-Bildgebung der embryonalen Entwicklung bei einer Auflösung von 20 min für 80–100 Embryonen in einem einzigen Experiment. Während dieses Protokoll für die Verwendung mit beliebigen Markerstämmen angepasst werden kann, zeigt diese Arbeit das Potenzial der Methode anhand von zwei benutzerdefinierten Stämmen, die zur Überwachung von Ereignissen während der Embryogenese entwickelt wurden: (1) ein Keimschicht-Reporterstamm, bei dem gewebespezifische Promotoren treiben die Expression fluoreszierender Histontöne an, um die Endodermen-, Mesoderm- und Ektoderm-Kerne zu markieren, und (2) einen Morphogenese-Reporterstamm, der epidermale und neuronale Promotoren verwendet, um die Expression von Fluoreszenzmarkern in Zell-Kreuzungen und Plasmamembran. Durch die Abbildung der beiden Stämme können die Folgen molekularer Störungen auf die Zellschicksalsspezifikation und morphogenetische Ereignisse mit bemerkenswerten Details erfasst werden. Um den Herausforderungen zu begegnen, die sich aus der Menge der mit dieser Methode generierten Daten machen, wurden benutzerdefinierte Tools zur Rationalisierung der Datenverarbeitung und -visualisierung entwickelt. Das erste Werkzeug schneidet einzelne Embryonen aus einem Feld von Embryonen in 3D-Zeitraffersequenzen, während die Embryonen gleichzeitig in eine standardmäßige vordere-posterior-Orientierung rotieren und Hintergrundsubtraktion, Driftkorrektur und Dämpfungskorrektur durchführen. Dieses Programm wurde als benutzerfreundliche GUI (https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w) verpackt und der Quellcode und eine erweiterte Batching-Version des Programms für Python versierte Benutzer (github.com/renatkh/embryo_crop.git) wird^10,12,13zur Verfügung gestellt. Um diese verarbeiteten Daten in einem aussagekräftigen Format zu visualisieren, wurde schließlich ein ImageJ-Makro entwickelt; Dies ermöglicht es dem Benutzer, alle Embryonen aus einem bestimmten RNAi-Zustand in einem mehrpaneligen Film zu visualisieren, der eine hellfeld- und maximale Intensitätsprojektion für jeden Embryo zu jedem Zeitpunkt zeigt. Zusammen machen die Stämme, Protokolle und Datenverarbeitungswerkzeuge die Bemühungen, die Embryogenese von C. elegans in größerem Maßstab zu untersuchen, ein machbareres Unterfangen.

Die hier beschriebene Methode zur Erfassung mit einem halbhohen Durchsatz ist zwar im Großen und Ganzen einfach zu implementieren, erfordert jedoch die Aufmerksamkeit auf einige wichtige Details, die im Folgenden erläutert werden. Zunächst müssen Benutzer Zugang zu einem konfokalen Mikroskop mit präziser Punkt-Besuchskapazität haben, das mit einem Multi-Well-Plattenhalter ausgestattet werden kann. Die kritischste Überlegung für dieses Protokoll ist, dass das Mikroskop in einem temperaturgeregelten Raum aufbewahrt wird. Während viele Mikroskope die Kapazität zum Heizen haben, können die meisten nicht zuverlässig abkühlen, so dass die Umgebungstemperatur angepasst werden muss, um eine konstante C. elegans freundliche Temperatur zu halten. Um dies zu erreichen, wird der Bildraum bei 16 °C gehalten. Der Probenbereich des Instruments erwärmt sich während der Bildgebung auf 21-23 °C. Schwankungen der Raumtemperatur können das Entwicklungszeitpunkt beeinflussen und die Genauigkeit der Brennebene während des Punktbesuchs subtil verändern und sollten so weit wie möglich vermieden werden. Beachten Sie, dass das Laufen bei Temperaturen über 23 °C zu einem erheblichen Anstieg der embryonalen Letalität für Kontrollbedingungen führen kann und nicht ratsam ist. Ein weiterer wichtiger Aspekt ist die Embryoselektion und -dispersion während der Zerlegung. Es sollte darauf geachtet werden, dass ältere Embryonen nicht in die bildgebenden Brunnen übertragen werden, da beim Schlüpfen von Tieren benachbarte Embryonen aus dem Blickfeld geraten; die Inzidenz dieser wird durch die Aufnahme von Anästhetikum in die Medien verringert. Die Dispersion von Embryonen, um große Klumpen von Embryonen zu vermeiden, ist ebenfalls eine kritische Variable. Verklumpungen treten in der Regel auf, wenn Embryonen in zu dünn herausgezogenen Kapillarpipetten in die Brunnen übertragen werden oder wenn Embryonen während der Zerlegung nicht ausreichend dispergiert werden. Eine weitere Überlegung ist, dass die Punktauswahl und die Fokusebene-Tuning Zeit braucht. Die Platte wird während dieses Prozesses nicht auf Eis gehalten, so dass die Embryonen sofort zu entwickeln beginnen. Für die benutzerdefinierten Markerstämme, die in dieser Studie verwendet werden, gibt es etwa 90 min Fenster, nachdem die Platte aus dem Eis entfernt wurde, um Plattenscans und Punktauswahlen durchzuführen, bevor Marker ausgedrückt werden. Dies ist ausreichend Zeit, um unser Gerät mit diesen Stämmen einzurichten, aber andere Mikroskope und Dehnungen können zusätzliche Zeitherausforderungen mit sich bringen, die eine Fehlerbehebung erfordern. Schließlich verwendet die von uns beschriebene Methode ein 60-faches Ölziel, um Z-Stacks von 50 Feldern in 20 min Zeitintervallen zu sammeln. Wie wir hervorheben, kann die zeitliche Auflösung erhöht werden, indem die Anzahl der abgebildeten Felder verringert wird. Beispielsweise können 10 Felder mit einer Zeitauflösung von 4 min abgebildet werden. Eine zweite Alternative zur Erhöhung der zeitlichen Auflösung besteht darin, ein Ziel mit niedrigerer Vergrößerung, hoher numerischer Blende, zu verwenden; in diesem Fall ermöglicht das größere Sichtfeld die Abbildung einer großen Anzahl von Embryonen bei höherer Zeitauflösung mit nur einer moderaten Reduzierung der räumlichen Auflösung.

Um die Datenverarbeitung und Visualisierung in größerem Maßstab zu ermöglichen, haben wir kundenspezifische Tools entwickelt und frei verfügbar gemacht. Das am weitesten verbreiteten nützliche Tool ist die benutzerdefinierte Zuschneide-GUI, die keine Programmierkenntnisse erfordert, um zu arbeiten. Die GUI kann verwendet werden, um Embryonen in allen Entwicklungsstadien auszupflanzen und zu orientieren und ist mit allen Markern kompatibel, was sie nicht nur für Entwicklungsbiologen nützlich macht, sondern auch für Forscher, die Prozesse im frühen Embryo untersuchen. Da die Ausgabe der GUI präzise zugeschnittene, orientierte, skalierte, driftkorrigierte Daten ist, können die Daten leicht in eine automatisierte Analysepipeline übertragen werden, was dieses Tool für die Analyse vergangener und zukünftiger Daten nützlich macht. Wenn geeignete Stämme verwendet werden, können resultierende Datendateien als Eingabe für bestehende automatisierte Analysesysteme verwendet werden, wie z. B. Embryogenese-Ausrichtungswerkzeuge²⁵. Um das Programm zu verwenden, ist es wichtig, dass Benutzer sich bewusst sind, dass der Zuschneidealgorithmus erfordert, dass ein Hellfeld- oder DIC-Bild für jeden Schritt und Zeitpunkt gesammelt wird. Darüber hinaus sollten Benutzer beachten, dass der vordere-posterior Orientierungsalgorithmus basierend auf der Verteilung des roten Signals in der Keimschicht Reporter und Morphogenese Bericht Stämme strukturiert ist, in dieser Arbeit gezeigt. Daher muss die Genauigkeit der AP-Ausrichtung in anderen Markerstämmen von Fall zu Fall bewertet werden. Die GUI wurde mit Daten getestet, die auf drei verschiedenen konfokalen Bildverarbeitungsplattformen gesammelt wurden, und ist für Multi-Tiff-Stacks und Tiff-Serien kompatibel. Zusätzlich zur benutzerfreundlichen Version wurde auch der Quellcode für die GUI und eine Batch-Version dieses Programms zur Verfügung gestellt, mit dem Vorbehalt, dass Programmiererfahrung erforderlich ist, und Dateistrukturen und Namenskonventionen müssen befolgt werden. Schließlich wurde ein ImageJ-Verarbeitungsmakro erstellt, um rohe Bildstapel für alle Embryonen in jeder RNAi-Bedingung aufzunehmen und ein informatives Array zu kompilieren, um alle Embryonen für diesen Zustand in Hellfeld- und Fluoreszenzprojektion mit maximaler Intensität zu jedem Zeitpunkt anzuzeigen. Dieses Tool kann an die Spezifikationen des Benutzers angepasst werden und ist ein nützliches Makro, um die Datenexploration und Die Bewertung der Qualitätskontrolle zu vereinfachen.

Zusammen werden die semi-high-throughput Filmmethode zusammen mit den hier beschriebenen Embryo-Zuschneide- und Bildverarbeitungswerkzeugen die Analyse der embryonalen Entwicklung von C. elegans mit einer Vielzahl von Mutanten, Störungen und Markerstämmen erleichtern. In unserem eigenen Labor ist derzeit ein groß angelegter Bildschirm im Gange, der diese Methoden zum Filmen von Embryonen aus den beiden maßgeschneiderten Stämmen einsetzt, die hier beschrieben wurden, nachdem 2.000 Gene für die Entwicklung benötigt wurden. Schließlich werden die Daten aus diesen Bemühungen als weitere Ressource dienen, um die Bemühungen um das Verständnis der Spezifikation des Zellschicksals und morphogenetischer Ereignisse während der Embryogenese zu verbessern.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aspirator Tube Assembly	Drummond Scientific	2-000-000
Calibrated Pipette (25 mL)	Drummond Scientific	2-000-025
Cell Voyager Software	Yokogawa Electric Corp	Included with CV1000
Conical Tube (15 mL)	USA Scientific	1475-0501
CV1000 Microscope	Yokogawa Electric Corp	CV1000
Depression slide (3-well)	Erie Scientific	1520-006
Dissection Microscope	Nikon	SMZ-645
Eppendorf Centrifuge 5810R	Eppendorf	5811 07336
ImageJ/FIJI	Open Source	https://imagej.net/Fiji
M9 Buffer	Lab Prepared	https://openwetware.org/wiki/M9_salts
Microcentrifuge Tube (1.5 mL)	USA Scientific	1615-5500
Microseal F-foil Seal	Bio-Rad	MSF1001
NGM Plates	Lab Prepared	http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html#d0e214
Scalpel #15	Bard Parker	REF 371615
Sensoplate Plus, 384 Well, F-bottom, Glass Bottom	Greiner Bio-One	781855
Tetramisole Hydrochloride	Sigma Aldirch	T1512-10G
Tweezers, Dumont #3	Electron Microscopy Sciences	0109-3-PO
U-PlanApo objective (10× 0.4 NA)	Olympus	1-U2B823
U-PlanApo objective (60× 1.35 NA)	Olympus	1-U2B832