Summary
本研究では、80~100 C.エレガンス胚の3Dタイムラプスイメージングを1回の夜間実行で可能にするセミハイスループットプロトコルについて説明します。さらに、データ分析を合理化するために、画像処理ツールと視覚化ツールが含まれています。カスタムレポーター株とこれらの方法の組み合わせは、胚発生の詳細なモニタリングを可能にします。
Abstract
C.エレガンスは、胚発生時の細胞運命仕様と形態形成過程の系統的解析のための最高のシステムです。1つの課題は、胚発生が約13時間にわたって動的に展開することです。この半日のタイムスケールは、画像化できる胚の数を制限することによって実験の範囲を制限している。ここでは、1回の夜間実行で、中程度の時間分解能で80~100個の胚の同時3Dタイムラプスイメージングを可能にするセミハイスループットプロトコルについて説明します。プロトコルは簡単で、ポイント訪問容量の顕微鏡へのアクセスを持つ任意の実験室によって実装することができる。このプロトコルの有用性は、生殖層の仕様および形態形成の主要な側面を視覚化するために最適化された蛍光マーカーを発現する2つのカスタム構築された株を画像化することによって実証される。データを分析するために、すべてのチャネル、Z ステップ、およびタイムポイントで、より広い視野から個々の胚をトリミングし、各胚のシーケンスを別々の tiff スタックに保存するカスタム プログラムが作成されました。ユーザーフレンドリーなグラフィカルユーザーインターフェイス(GUI)を含むプログラムは、可視化または自動分析の準備のために個々の胚を分離、前処理、均一に指向することにより、データ処理を合理化します。また、個々の胚データをマルチパネルファイルにコンパイルし、各時点で各胚の最大強度蛍光投影と明視野画像を表示するImageJマクロも提供されています。本明細書に記載されているプロトコルおよびツールは、40の前に説明した発達遺伝子のノックダウン後に胚発生を特徴付けるためにそれらを使用することによって検証された;この分析は、以前にアノトされた発達表現型を可視化し、新しいものを明らかにした。要約すると、この研究では、クロッピングプログラムとImageJ可視化ツールを組み合わせた半ハイスループットイメージング法の詳細を説明し、有益な蛍光マーカーを発現する株と組み合わせることで、実験を大幅に加速して分析します。胚。
Introduction
C.エレガンス胚は、機械学的細胞生物学のための重要なモデルシステムであり、胚発生を駆動する細胞運命の仕様と形態形成過程の解析1、2、3、4 ,5,6,7,8,9.現在までに、胚における細胞レベルの事象と細胞運命仕様の両方の特徴付けの多くは、比較的高い時間分解能を1回に1回のイメージング実験(すなわち、10~100s毎に取得)を用いて達成されてきた。蛍光マーカー。数秒から数十分の順序でのイベントには適していますが、このアプローチは、時間単位から数日の順序で、より長いプロセスの特性評価を技術的に制限するようになります。最初の切断から伸びの終わりまでの胚の発達は約10時間かかります。この時間スケールでは、胚のより大きなコホートの同時に低い時間分解能イメージング(すなわち、5〜20分の時間間隔での取得)を可能にするセミハイスループット法は、異なる条件から、新しい範囲の実験を開くだろう。例えば、体系的な大規模スクリーニングの努力を可能にし、分子摂動の結果を比較するための十分な数の胚の分析を可能にする。
ここでは、C.エレガンス胚発生をモニタリングするセミハイスループット法について、最大14の異なる条件から、1回の夜間走行で、80~100個の胚における同時3Dタイムラプスイメージングを可能にする方法について説明する。プロトコルは実装が簡単で、ポイント訪問機能を備えた顕微鏡へのアクセスを持つ任意の実験室で行うことができます。このプロトコルの主な手順を図 1に示します。要するに、胚は、関心のある蛍光マーカーを発現する重症成人から解剖され、若い胚(2〜8細胞段階)をイメージング用の384ウェルプレートのウェルに移す。この形式では、比較的小さいウェルサイズのじょうごは、狭い領域に胚を漏斗し、タイムラプスイメージングのために複数の胚を含むフィールドの同定を容易にする。胚のコホート全体でほぼ同期的な発達を維持するために、解剖は冷蔵された媒体で行われ、プレートは氷の上に保持され、1時間の解剖時間枠の間に大きな発達を防ぐ。プレートを顕微鏡に移し、胚を一晩温度調節された部屋で撮影し、20分間隔で、60xオイル浸漬1.35 NAレンズを使用して、2μmステップで全Z範囲を収集する。1~5個の胚を含む50個のフィールドが、1回の夜間走行で画像化されます。目的の実験に応じて、画像化されたフィールドの数を比例的に減らすことで、時間分解能を増やすことができます(たとえば、5~10分間隔でのイメージング)。
このプロトコルを使用すると、1 回の夜間実行でも大量のデータ (50 フィールドに広がる 80 ~ 100 個の胚) が生成され、より大きな実験では、データ分析に関してすぐに管理不能になる可能性があります。このデータの処理、可視化、分析の合理化を容易にするために、胚をトリミングして指向し、前処理手順 (オプション) を実行するプログラムと、データをコンパイルして表示を簡略化する ImageJ マクロを作成しました。これらのプログラムは、イメージング方法に依存せず、単一の明視野面のみを必要とするため、従来のアプローチを使用して収集された画像を処理するために使用できます。最初のプログラムは、複数の胚(GUIオプションまたはソースコードembryoCrop.py)または複数の胚(screenCrop.py)を含む複数の4Dフィールドを含む4Dフィールドを取り込み、胚をしっかりとトリミングし、後部構成で向けます。これらのプログラムは、バックグラウンド減算、ドリフト補正、および減衰補正を実行するオプションもユーザーに提供します。結果として得られるファイルは、自動画像解析に修正可能な各胚に対して、均一に処理され、しっかりとトリミングされた tiff スタックです。各条件のすべての胚を簡単に表示できるように、ImageJ マクロ (OpenandCombine_embsV2.ijm) が書かれ、特定の条件からすべての胚を単一の tiff スタックにアセンブルし、明るいフィールドイメージと最大強度投影色 (RGB) オーバーレイは、各胚に対して並べて表示されます。この方法は、生殖層の主要な側面を可視化するために最適化された蛍光マーカーを発現する一対のカスタム構築された株で、40個の前に記述された発達遺伝子をノックダウンした後の胚発生を特徴付けるためにそれらを使用して検証された。仕様および形態形成10、11。セミハイスループット胚イメージングプロトコルと画像処理ツールを組み合わせることで、より高いサンプル数の実験と、開発プロセスの理解を目的とした大規模なスクリーニング作業が可能になります。さらに、これらの株はまた、胚発生に対する分子摂動の影響を調べるための効率的な手段を提供する。
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Protocol
1. セミハイスループットイメージングのためのC.エレガンス胚の準備
注:プロトコルのこの部分の目的は、半同期(2〜8細胞段階)C.エレガンス胚の集団を、適切なマーカー株から解剖し、イメージング用のガラス底384ウェルプレートにロードすることです。他のプレートフォーマットも機能する可能性がありますが、384ウェルプレートは、小さなウェルサイズが比較的小さな領域への胚の広がりを制約するため、タイムラプスイメージングのために複数の胚を含むフィールドの同定を容易にするため、好ましい。胚を大まかに同期させることで、現場の胚ごとに開発の完全な過程が確実に捕捉されます。
- 氷冷M9培地に溶解したテトラミソール塩酸塩(TMHC)麻酔薬の0.1mg/mL溶液を5~10mL調製し、氷冷M9培地(0.45M Na2HPO4∙7H2O、0.11 M KH2PO4、0.04M NaCl、0.09 MNH4Cl)を使用する解剖およびイメージング。この媒体は、孵化した幼虫を動かすことが初期の発達段階で胚のイメージングを妨げないことを保証する麻酔薬を含む。
注:トリミングおよび可視化ツールを使用して、標準のアガロースパッドの取り付け方法を使用して取得したデータを分析する場合は、以下のセクション 3 に進んでください。 - アリクォート70°Lの調製溶液をガラス底384ウェルプレートの個々のウェルに、各条件に1つのウェルを備えています。エッジ効果を防ぐために、プレートの外側の 2 行を避けてください。
注:接着PCRプレート箔(図1Dの例を参照)を使用して周囲の井戸をマスクすると、将来の実験のために隣接する井戸を保存し、解剖顕微鏡下で適切なウェルを見つけやすくするのに役立ちます。溶液が引用されたら、解剖全体を通して氷の上にプレートと残りの溶液を保ちます。 - うつ病のスライド(重力ヘルマフロダイトが解剖される場所)から井戸に胚を移すための口のピペットを生成します。炎の上にキャピラリーピペット(25°Lの校正ピペット)を引っ張り、細かいテーパーエンドを生成します(図1D)。クロスコンタミネーションを防ぐために、条件ごとに1つのピペットが必要です。使用後にピペットを廃棄します。
- 細かいピンセットを使用して、解剖範囲の下で〜10の重力成人を、各状態のうつ病スライドに引用した氷冷TMHC溶液の150°Lに移します。ピンセットとメスを使用して、胚を放出するためにワームを解剖します。
- ピペットに含まれる吸引器付属品に引っ張られた毛細管ピペットをロードし、口のピペットを2〜8細胞の胚の全てを調製したプレートの個々のウェルに移す(図1D)。後期胚や解剖破片の移送は避けてください。解剖スコープの下で調べ、胚の凝集体が存在する場合は、口が上下にピペットするか、ピペットチップで胚の塊をタップして分散させます。
注:クロスコンタミネーションを防ぐために、きれいな解剖装置を使用し、条件間を移動しながら新鮮な口のピペットを使用します。プレートをディスセクションの間の氷の上に保管します。 - すべての条件からのワームが解剖され、胚が適切な井戸に置かれたら、384ウェルプレートを600 x gで1分間回転させ、胚を沈着させます。
- プレートの底部をエタノール浸漬ワイプで拭き取り、残留物を取り除き、温度管理された環境でプレートホルダーを装備した共焦点顕微鏡にプレートを置きます。
注:次の手順では、ラボセットアップを使用してこの方法について詳しく説明します。実験ニーズや機器に合わせて取得条件を変更してください。ここでは、マイクロレンズ強化デュアルニプコウスピニングディスクを搭載した共焦点スキャナーボックス、512 x 512 EM-CCDカメラ、高精度オートXYステージ(指定解像度0.1μm)と電動Z軸制御(指定解像度0.1μm)を使用しています。このシステムは16°Cの部屋に保たれ、一晩のイメージ投射の間に21と23 °Cの間の顕微鏡温度を維持する。 - 適切な胚を持つフィールドを識別するには、10x 0.4 NAの目的と適切なイメージングソフトウェアを使用して、各ウェルの事前スキャンを実行します。最も最適なフィールドは、他の胚と同じ焦点面にある複数の初期胚を含み、理想的には隣接する胚間の接触を最小限に抑えます。適切な領域の位置をマークします。
- 撮像場を選択するには、60倍の目的に切り替え、各点訪問時に焦点面を調整して胚を適切に断面化します。ウェルごとに 1 ~ 4 個のフィールドがイメージされ、14 のウェル全体で合計 50 個のフィールドがイメージされ、各フィールドには 1 ~ 5 個の胚を含めることができます。全体として、4〜15個の胚が高解像度イメージングの各条件から選択される。
注:このステップで重要な変数は、十分なオイルの使用です。目的に油を置き、各井戸のポイントを訪問し、すべての井戸の表面の周りに油を広げ、フィールドの選択の前に目的に油の追加の滴を適用します。 - 60x 1.35 NA目標を使用して選択したフィールドをイメージし、20 分ごとに 18 z セクションを 10 時間取得します。生殖層および形態形成レポーター株を用いたイメージング条件は以下の通りである:明視野、90%の力、25 ms、20%の利益;488 nm、100%の電力、200ミリ秒、60%の利益;568 nm、45%の電力、150ミリ秒、60%の利益。
- イメージングが完了したら、夜間イメージングの開始後に低倍率(10x 0.4 NA目標)全体の明るいフィールドスキャン〜20〜24時間を行うことによって胚致死率を評価します。
2. 胚致死性スコアリング
- ポストラン10倍のスキャンフィールドを使用して、各井戸の孵化したワームと未孵化胚を数えることによって、胚の致死率と幼虫の欠陥を評価します。
- 胚致死として未孵化した胚をスコア付けします。若い解剖された胚が時々卵殻形成を完了できず(メイオシスIIがまだ完了していない場合)、透水性欠陥が最初の2つの間に浸透性合併症を引き起こす可能性があるため、致死率カウントから1〜4段階の胚を逮捕除外する部門。
- 部分的に孵化したワームや、ダンプリーや麻痺などの行動上の欠陥を「異常な幼虫」として採点する。
3. 自動トリミング (図 3A)
注:ソフトウェアは2つの場所に収容されています:(1)ゼノドは、任意のプログラミングの専門知識を必要としないソフトウェア12のユーザーフレンドリーなバージョンを収容しています。(2) Githubには、Python の習熟度を必要とするembryoCropUI.pyおよびscreenCrop.pyソフトウェア13のソース コードが含まれています。プログラムの両方のバージョンをダウンロードして操作するための詳細な手順は、以下で見つけることができます。
- 胚クロップUI実行可能バージョンを使用した自動トリミング(ユーザーフレンドリーなバージョン)
- embryoCropUIプログラムを使用するには、まずゼノド(https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w)12からプログラムをダウンロードします。
- プログラムの MacOS または Windows 形式のバージョンをダウンロードします (MacOS バージョンには MacOS X10.11 以降が必要です)。
- 命令ファイル (GUI_命令_ゼノド_レポV2.docx) をダウンロードします。
- test_files.zip をダウンロードして、プログラムがプラットフォーム上で正しく機能しているかどうかをテストします (手順を参照)。
- ダウンロードが完了したら、解凍して胚作物の実行可能ファイル (...\胚作物 UI\\\WINDOWS\胚作物UI\胚作物UI.exe)または (...\胚クロップUI\_MacOS\胚クロップUI\胚クロップUI.exe)を見つけます。ダブルクリックして起動 (または 「で開く」ターミナルを選択)し、embryoCropUI 実行可能ファイルを実行します。
- GUI 実行可能ファイルは、一度に 1 つの 4D 視野をトリミングします。左上隅にある開くボタンを選択して、トリミングする特定のフィールドを読み込みます(マルチティフ)。複数の寸法(z、時間、チャネル)で tiff シリーズをトリミングする場合は、フォルダ内のシリーズの最初のイメージのみをロードします(フォルダごとに 1 つの tiff シリーズ)。
- イメージが読み込まれたら、z-スライスの数、(Z)、タイムポイント数(T)、チャンネル数(C)、DICまたはブライトフィールドに対応するチャンネル(1番目=1、2番目=2など)などの情報を指定します。
- イメージに対して実行する追加の処理を選択します。プログラムは、ドリフト補正、背景減算、および減衰補正を提供しています。
- GUI プロンプトで処理作業をガイドするために、バックグラウンド減算および減衰補正のパラメータを指定します。[バックグラウンド減算] で、意味のある信号のサイズを反映する最大フィーチャ サイズを定義します。この機能のサイズは背景と見なせず、奇数の値である必要があります。減衰補正に 0 ~ 1 の値を入力します。減衰補正値は、イメージされるオブジェクトの最も遠い深さに残る元の強度のパーセンテージを反映します。
注:バックグラウンド減算と減衰補正は一緒に実行する必要があります。 - イメージの収集順序 (チャネル z 時間 (czt)、または z チャネル時間 (zct)) を指定します。
- 使用するカメラに基づいて、イメージのピクセルあたりのミクロンを指定します。
注:ピクセル サイズが適切に定義されていない場合、イメージのトリミングが不適切になります。 - 左下隅にある [実行]を選択します。"トリミング" というラベルの付いた新しいサブフォルダが、トリミングされていないフォルダと同じパスに作成されます。トリミングされたバージョンはこの場所に保存されます。ファイルサイズに応じて、トリミングは数秒から数分以内に完了する必要があります。
- embryoCropUIプログラムを使用するには、まずゼノド(https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w)12からプログラムをダウンロードします。
- screenCrop.pyを使用した自動トリミング (上記の胚クロップGUIに代わるバッチバージョン。Python に精通したユーザーのみ)10,13
- screenCrop.py使用するには、より大きなデータセットをバッチ形式でトリミングするための Python ソフトウェアバージョンを Github (github.com/renatkh/embryo_crop.git)から複製またはダウンロードします。
- 適切な仮想環境を構成するための指示を読み、説明されているファイル命名システムに従ってください。どちらも Github リポジトリのREADMEファイルで詳しく説明されています: https://github.com/renatkh/embryo_crop/blob/master/README.md。
- 環境変数と命名規則が適切に確立されたら、parameters.pyを開き、任意のエディターでscreenCrop.pyします。
- ソース コードに触れずに調整可能なパラメータを変更するには、parameters.pyファイルを編集します。
注: screenCrop.pyのヘッダー内でパラメータを直接変更することもできます。- parameters.py構成ファイルを使用する場合は、use_configure設定を True に変更します。screenCrop.py内で直接編集を使用する場合は、use_configure設定を False のままにします。
- parameters.py ファイル内で次の情報を見つけて、必要なイメージング パラメータとファイル構造に合わせて変更を加えます。
- loadFolder (9 行目): ファイルが格納されているドライブに変更します (Z:/、D://など)
- 日付 (7 行目): イメージング セッション用のファイルを含むフォルダに移動します。これは、CSV トラッキング ファイルでは「実験フォルダー名」と呼ばれます (手順を参照)。
- trackingFile (11 行目): 実験情報が格納されている CSV ファイルへのパスに変更します。
- z (ライン 13): z 平面の数として設定します。
- nT (行 14): タイムポイントの数として設定します。
- nWells(19行目):使用する井戸の数として設定します。
- ポイントビジット(ライン 20):ポイント訪問の最大数(ウェルあたり)として設定します。
- 10 行目で、'CV1000/' が現在占有している場所を見つけ、ファイル パスで使用されている外側のフォルダを入力します。問題を回避するには、次の規則 'XXXXXXX/' を使用します。
- 12 行目で、トリミングされたデータの縦横比データを格納するための有効なファイル パスを入力します。
- 15 行目、16 行目、17 行目、および 18 行目で、イメージが次の処理を通過するかどうかをTrue/Falseと入力します。
- 15 行目のドリフト補正の場合は、True または False を入力します。
- 16 行目の背景減算の場合は、True または False を入力します。特徴のサイズは、異なるマーカー株とピクセルサイズに対して経験的に決定する必要があります。ここでの構成では、特徴のサイズは、生殖層株の場合は41、形態形成株では201と定義した。背景の減算は、減衰補正と組み合わせて行う必要があります。
- 17 行目の減衰補正の場合は、True または False を入力します。
- 18 行目の前後回転の場合は、True または False を入力します。
- すべての変更が行われると、トリミングを開始できます。これを行うには、screenCrop.pyに切り替えてツールバーの再生アイコンを選択し、ドロップダウン メニューで [実行] > [Python 実行]を選択します。
- 大規模なデータセット (50 ポイントが 18 z ステップ、3 チャネル、31 タイムポイントを訪問) の場合、トリミングが完了するまでに数時間かかる場合があります。トリミングが完了すると、保存する前にトリミングされた画像のプレビューが小さなウィンドウに表示されます。イメージごとに 3 つのオプションがあります。
- 保存:画像が切り取られて目的の領域が切り取られずに画像が正しくトリミングされている場合は、スペースバーを押して画像を保存します。
- X:画像に関心のある領域が切り取られたように見える場合は、Xキーを押します。イメージは、他のイメージと区別するために、名前の前に X と共に保存されます。
-
削除: Dキーを押して、画像が正しくトリミングされていない場合、または胚が満足できない場合は、トリミングした画像を削除します。
注 : イメージは、ロード フォルダ (プログラムの 9 行目で定義) の "トリミング" という名前のサブフォルダに保存されます。
4. 視覚化 (図 4)
注:OpenandCombine_embsV2.ijm10、12は、特定の歪みと条件のすべての画像からtiffファイルを表示しやすいを構築するImageJマクロです。FIJI/ImageJ14、15のインストールが必要です。このマクロは、ファイル構造に従って実行されます。他のファイル構造で動作するように変更する必要があります。適切なファイル構造と重要な考慮事項の詳細な説明については、Zenodo リポジトリのGUI_Instructions_zenodo_repoV2.docxファイルの末尾にあります。このマクロと最適なインターフェイスにファイルに正しい名前と構造を付けるためにイメージングする前に、これらの手順を完全に読んでください。参考までに、ファイルの場所の構造は次のようになります。
Z:\トリミングされた\ターゲット\ひずみ\Emb#\ターゲット_Emb#_15 桁一意識別子 _W##F#_T##_Z##_C#.tif
次のように、Z:\トリミングされた\EMBD0001\GLS\Emb1\EMBD0001_Emb1_20140327T135219_W02F1_T01_Z01_C1.tif
- ゼノド(https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w)からOpenandCombine_embsV2およびGUI_命令_ゼノド_レポV2.docxをダウンロードしてください。
- 次の情報を準備します。
- イメージ フォルダが保存されている場所(トリミング後)。
-処理する特定の条件のイメージ フォルダ名 (EMBD0002 など)。これは、上記の例では「ターゲット」と呼ばれています。
-特定の夜間実験に固有の 15 桁の英数字一意識別子 - この識別子は、データ取得フォルダー名 (20140402T140154) であり、一意の識別子が個々の tiff ファイル名 (EMBD0002_Emb1_20140402T140154_W06F2_T01_Z01_C1) その日に画像化されたすべての胚について。このマクロは、この識別子を使用して、同じ日付に取得された胚をチェックし、別々の日付で繰り返し条件を別々の ImageJ ファイルにまとめることができます。 - ImageJ を開き、マクロ ファイルOpenandCombine_embsV2.ijmを ImageJ バーにドラッグ アンド ドロップするか、マクロを直接開きます。
-
マクロを開いたら、3 行目と 4 行目を見つけます。次の手順に従って、(セクション4.2)で収集した情報を入力します。
- 3 行目 (RNAL) に、処理するイメージのターゲット名を入力します。次の構造体に各ターゲットを入力します。見積を含めます。一度に複数の条件を実行するには、コンマで区切り、すべてのターゲット名をかっこ内に収めます (つまり、newArray("EMBD0000/","EMBD0001/","EMBD0002/")。
- 4 行目 (日付) に、15 桁の英数字の一意の識別子を引用符で入力します(例: newArray("20140402T140154)。
- マクロ ウィンドウの左下にある[実行]をクリックします。ウィンドウが表示され、トリミングされたイメージ フォルダ (4.4.1 で指定) を含む外側のフォルダに移動するように求めるプロンプトが表示されます。
-
選択すると、別のウィンドウが表示され、イメージングパラメータを指定できるようになります。
- チャンネル数、Z スライスの数、コンパイル済み画像のラベル付けに使用されるテキストのフォントサイズ、および各チャンネルの色を入力します。
- すべてのチャンネルで自動コントラストのオン/オフをオン/オフします。
- すべてのパラメータを指定したら、ウィンドウの下部にある[OK]をクリックします。 複合ファイルのアセンブルが開始されます。この操作が完了するまでに数分かかります。
- 完了したら、必要に応じて開いたままのファイルを確認します。マクロは、次の方法で名前が付けられた新しく作成されたフォルダにファイルを保存しているので、保存せずに閉じることができます: 外部フォルダ名 (セクション 4.5 のプロンプトで指定) + "-fiji-processed-output" (つまり、Z:\トリミングされたフィジー処理出力\EMBD0002_GLS_20140402T140154.tif)。
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Representative Results
C.エレガンス胚発生に対する分子摂動の影響を特徴付ける上で重要な課題は、胚が最初の切断から20°16で伸びの終わりまで進行するのに約10時間かかることです。胚の大きなコホートを同時に画像化できるセミハイスループット法は、各条件に対して十分なアンサンブルサイズと並行して複数の条件をイメージングできるため、このタイムスケールのイベントに役立ちます。定量分析 (図 1A)
セミハイスループットイメージング法とマルチマーカー株
ここで説明するセミハイスループットイメージング方法(図1Bで概説)は、384ウェルガラス底板を採用しています。マルチウェル形式では、最大14の条件を並列に配列することができ、井戸の小さなサイズは、高解像度イメージングのための胚を含むフィールドの識別を簡素化し、検索領域を制約します。ここでは、マイクロレンズ強化デュアルニプコウスピニングディスク、512 x 512 EM-CCDカメラ、高精度オートXYステージ(指定解像度0.1μm)、電動Z軸制御(指定解像度0.1μm)を搭載した共焦点スキャナボックスを使用しました。しかし、プロトコルは精密な点訪れる機能および多井戸版を収容できる段階アダプターが付いている任意の共焦点顕微鏡のために合わせることができる。この方法を開発する上で重要な課題は、各分野のすべての胚に対して開発の全体を捕捉できるように、同じ発達段階で胚のプレートを生成する手段を考案することであった。これは、最初にイメージングプレートに配列された胚が、後のサンプルが解剖される間に発達し続け、その結果、井戸全体のステージングの勾配をもたらすので、これは課題です。この問題を回避するために、初期段階の胚(2-8細胞ステージ)が選択され、解剖媒体とイメージングプレートを氷の上に保ちます。これは、胚の生存率10に大きな影響を与えることなく、すべての条件が配列されるまで、解剖胚のための胚発生を失速させる。胚が氷の上に座る時間を1時間に制限するために、2人の研究者が同時に解剖を行い、約50分で14の異なる条件のセットアップを可能にする。解剖後、プレートは600 x gで1分間回転し、胚と井戸を低倍率で事前にスキャンし、高倍率イメージングに適した胚のグループを持つフィールドを見つけます。ポイント訪問場所がマークされます。胚は60xオイル浸漬1.35 NAレンズを使用して一晩温度調節された部屋で撮影される。サンプルは実験で使用される版の表面積が22 x 22 mm2標準カバースリップに匹敵するように4ウェル×4ウェル領域で構成され、60倍のオイル目的を使用することができます。イメージング開始前にこの地域全体に石油を均一に拡散させることは、長期的な画像取得を成功させるために不可欠です。発達中の胚は麻酔薬を含む溶液中で画像化される。これにより、ウェル内の古い胚が孵化しても、その動きは画像化されている隣接する若い胚の位置を妨げません。卵殻の不可解な性質のために、麻酔薬は孵化前の動きに影響を与えない。これらの条件下では、3Dタイムラプスデータは、1回の一晩の実験で合計80〜100個の胚について3チャネルで収集されます(以下で詳しく説明します)。
C.エレガンス胚発生は2つの段階で起こる。まず、細胞運命仕様に結合した10発の細胞分裂は、6時間周期17にわたって3つの生殖層(外胚葉、中胚葉、内胚葉)を生成する。以下の7時間において、形態遺伝学的事象は、分化組織8、16の形成を駆動する。開発のこれらの2つの側面をキャプチャするために、我々は、カスタム株のペアを構築し、生殖層および形態形成株10(図2A)、および両方の株から胚を画像化するために半ハイスループットプロトコルを使用しました。生殖細胞層株は、外胚葉、中胚葉、内胚葉の核を赤、黄、緑でマークするトランスジーンコード蛍光タンパク質を発現します。この株には3つのレポータートランスジーンが含まれています:(1)腸内の核をマークするPHA-4::GFP(緑色の内胚葉)10、18、19、(2)を発現するトランスジーンmCherry-ヒストン融合表皮とニューロンの〜1/3(赤い外皮;図2A)および(3)体壁筋(黄色の中皮)においてmCherryとGFPタグ付きヒストンを同時に発現するトランスジーンである。形態形成株は、表皮の緑色の上皮接合マーカー(DLG-1::GFP)と(2)mCherryタグ付き血漿膜マーカーを発現する2つのトランスジーンを有する(Pcnd-1プロモーター;図 2A)RNAiの有効性を高めるために、両方の株はまた、RNAi感作変異のペアを含むするように設計された(nre-1(hd20)lin-15b(hd126)20.これらは、胚発生に必要な約2,000個の遺伝子の大規模なRNAiベースのスクリーンを行う目的で構築されました。しかし、この株のペアはまた、突然変異体の発達欠陥を評価し、開発中の異なるタンパク質の役割のより詳細な分析のために広く有用な標準化されたプラットフォームを構成します。
このセミハイスループット形式のデータ収集では、これらの株を使用して、緑、赤、明視野Zシリーズ(18 x 2 μm2間隔)が収集され、~20分ごとに16°Cの温度制御ルームで10時間の間収集されます。これは走行中に21-23 °Cの間の顕微鏡を維持する。20分の時間間隔では、実験ごとに50個の胚(ポイント訪問)を画像化することができます。ユーザーは、より少ないポイント訪問で短い間隔に取得を調整したり、実験目標に最適なポイント訪問でより長い間隔を調整したりできます。これらの株の場合、マーカー発現を駆動する組織特異的レポーターは中期から後期ガストル化まで発現し始めないので、初期の発達のタイムポイントは画像化されない。この初期段階では、低倍率(10倍)で井戸をスキャンし、高倍率イメージングのためにフィールドを選択しました。複数の初期段階の胚を含むフィールドを選択することをお勧めしますが、胚が部分的に重なり合っている、過度に混雑しているフィールド、または井戸の極端な端に見られるフィールドを避けることをお勧めします。一晩60倍のイメージングに続いて、低倍率(10x)全体のウェルスキャンが実行され、胚が正常な外観(WT)で孵化するか、目に見える異常を伴うハッチ(幼虫異常)、または評価された各状態に対して胚致死性であるかを判断します(図 1B) 。このステップは、より大きな集団全体の致死性を評価するために並行してプレートを設定する簡単な代替手段として機能します。全体の井戸10xポストスキャンは、状態あたり50〜80胚に胚致死性データを提供します。このメジャーを使用して、実行間の制御に対する集団胚致死率データを比較することは、ひずみの健全性および環境条件および処理ステップに関して一貫性を確保する有用な制御である。組み合わせて画像化すると、2つのカスタムレポーター株は、細胞運命仕様、後方インターカレーション、表皮エンクロージャ、伸び、神経新生(代表的な)を含む、ほとんどの主要な発達イベントのための有益な読み出しを提供します制御イメージを図2Bに示します ( Wang et al.10) も参照してください。
データ処理:自動胚のトリミングと向き
当社のイメージングプロトコルでは、各高解像度イメージングフィールドに1~5個の胚が含まれています。これらの胚はランダムに配向され、しばしば互いに隣接して配置される。従来の胚取り付け技術を使用して収集されたデータは、同じ課題に苦しんでいます。その後の可視化と分析のためにデータを準備するには、胚シーケンスのトリミングと方向付け、背景の減算、ドリフトの補正、信号減衰の補正を前処理するために、かなりの実践的な操作が必要です。深さ付き。このプロセスを合理化するために、より広範なフィールドから各胚を分離および向けるカスタム胚トリミングプログラムが構築されました(図1C、図3)。このプログラムは、胚のフィールドの3Dタイムラプスシーケンスを取り込み、個々のtiffシリーズに処理することができるグラフィカルユーザーインターフェイス(GUI、ほとんどのイメージングプラットフォームからのデータと互換性がある)を備えたユーザーフレンドリーなスタンドアロンプログラムとしてパッケージ化されています。フィールド内の各胚について(図3B、https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2wで入手可能)10、12。GUI の Python ソース コード (embryoCropUI.py) とこのプログラムのバッチ バージョン (screenCrop.py) は、GitHub (https://github.com/renatkh/embryo_crop.git)10、13の経験豊富な Python ユーザーにも使用できます。このプログラムのコア機能は、前後軸に沿って胚を見つけ、トリミングし、方向付けすることです。同時に、背景減算、減衰補正、およびドリフト補正は、オプションの調整可能な設定を使用してデータセットに対して実行できます。
簡単に言えば、自動トリミングソフトウェアは、明視野画像から得られたバイナリマスク内の個々の胚を反復的に検出し、すべてのチャネルから胚を順次トリミングし、前後軸に沿って画像を向けます(図3)。 B、まずWang et al.10で説明)トリミングの前に、ソフトウェアはドリフトを補正し、背景を減算し、各蛍光チャネルで深度減衰補正を実行します(オプション)。バイナリマスクを得るために、ソフトウェアは、明視野画像にCannyエッジ検出21を適用し、3つの中央面の最大強度投影を行い、小さな穴を埋める。このアルゴリズムは、カッシーニ楕円をバイナリマスクアウトラインのセクションにフィットさせることによって個々の胚を検出します(図3B、3Cを参照)。楕円を主軸に沿って整列させた後、ソフトウェアは、単離された胚の各半分で赤色蛍光強度を測定し、赤の強度が左に向くように胚を回転させ、胚前部を両方の左側に置きます。この作品で使用されるレポーター株 (図 3D)このソフトウェアのパイロットは、ほとんどの胚が予想どおりに効率的にトリミングされたことを明らかにしました。胚のドリフト、一時的な焦点面の損失(油中の気泡による)、胚の混雑したフィールドなどの軽微なイメージングの問題は、通常、正常なトリミングを妨げませんでした。しかし、胚の塊が大きい(zで幾分重なり合っている)、撮像面内で著しく傾いた胚(Z)、長期焦点面損失、または部分的に遮断された胚の場合、トリミングが成功するとは限らない達成。これらの問題は、データ取得フェーズ中のフィールド選択の改善によって容易に回避できます。全体的に、この半ハイスループット方式または従来の実装方法を使用して収集された前処理データは、胚データセットを視覚化および分析するための有用な最初のステップです。
画像収集とデータ処理方法の検証:前述の40個の遺伝子をノックダウンした後の胚発生を可視化
この半ハイスループット画像収集方法とカスタム作物体制を検証するために、カスタム株で小さなRNAiスクリーンを行い、細胞運命仕様および形態形成に関する前述の機能を有する40個の遺伝子に対して向けられた(王、オチョア、ハリウリンと同僚10、11によって記述された。これを行うために、dsRNAを各標的に対して生成し、各株からL4動物を注入し、20〜24時間待った後、上述のプロトコルを用いて胚を解剖および画像化した(完全なデータセット10、11の場合)。RNAiによる発達表現型を達成するには、母体および頬骨遺伝子発現の両方の阻害が必要である。発達遺伝子は、母体発現することができ、得られたタンパク質産物が胚にロードされるか、または胚で頬骨に発現されるか、または、多くの場合、両方とも10、22、23である。注射と胚の撮影の間の時間は、効果的に母親と頬頭に発現した集団を標的にするための重要な変数です。タイミングは、頬骨発現24を防止するために胚に装填される注入dsRNAの量と母体タンパク質枯渇の程度の両方を決定する。dsRNA注射後、標的遺伝子に対応する母体mRNAは分解され、関連する時間間隔で回復しない。既存のタンパク質の枯渇は胚産生を必要とし、母体タンパク質を形成胚にロードすることによって生殖細胞組織から排出する。20°Cで20-24時間は、一貫した母親の枯渇を可能にする最短のインキュベーション時間です。母親の枯渇は、後の時点で良くなります(すなわち、注射後36-42時間)。胚にロードされる注入dsRNAの量は、接合遺伝子発現の予防がどれほど効果的であるかを決定する。注入後、注射後に約5〜10時間の負荷RNAピークの量は、注入された材料を含む胚が最初に受精し、その後減少する。私たちの経験では、注射後24時間は、母親のタンパク質の枯渇と頬骨遺伝子発現の阻害の両方が有効である最適なタイムポイントです。この研究で使用されるカスタムレポーター株における表現型の解析は、40の試験遺伝子のセットにわたって、我々の結合されたプロトコルが細胞運命に関与する遺伝子の広いスペクトルにわたって明確で、非常に再現性の高いシグネチャ表現型を生み出したことを示した仕様と形態形成(Wang et al.10を参照)。完全なデータセットは11を使用できます。このデータの一例として、胚層レポーター株における制御用の4つの異なる胚の静止画像、pha-4(RNAi)、pal-1(RNAi)、およびmex-3(RNAi)が図4Aに示されている。 40遺伝子RNAi画面で観察される表現型のより包括的な議論については、Wang et al.10を参照してください。
ImageJ マクロ: 特定の条件のすべてのデータのコンパイルと視覚化
個々の tiff スタックから大量の胚を視覚化するのは面倒で、作業に時間がかかる場合があります。最初の取り組みから、>400個の胚は、上記のカスタム自動トリミングプログラムを使用して分離されました。ファーストパス解析を高速化するために、特定の歪みの背景で特定のRNAi状態に対して画像化されたすべての胚の配列を生成するImageJマクロを構築しました(図4B)。配列内の各胚について、明視野画像と最大強度投影画像が並べて表示され、各時点について、合成ムービーファイルを生成する。このマクロはファイル構造で機能するように書かれていますが、ユーザーのファイル構造に合わせて編集できます。ただし、最良の結果を得るには、プロトコルで規定されている名前付け規則とファイル構造規則に従う必要があります (Python および ImageJ アプリケーションの命名規則の詳細については、Zenodo または Github README ファイルを参照してください)。ImageJ処理データをすべて表示し、40遺伝子検査セットについて観察された表現型のより詳細な分析を得るためには、Dryadデータベース10、11に寄託されたデータを参照してください。このImageJ可視化形式は、全体的な表現型とその浸透性の迅速な評価を可能にし、破片の存在や焦点面の損失などのデータ品質の問題にフラグを立てることを容易にします。全体的に、セミハイスループットデータ取得方法、トリミングプログラム、ImageJ可視化ツールの組み合わせは、カスタムレポーター株と組み合わせることで、胚発生を研究するための大規模な取り組みを大幅に容易にします。
図 1.ハイコンテンツイメージング方法、データ処理手順、および重要なツールの概要。(A) ここで説明するセミハイスループット多井戸イメージングアプローチにC.エレガンス胚を取り付けるための標準的なアガロースパッドベースの方法の特徴の比較。(B) 胚発生をモニタリングするためのセミハイスループット法の概要詳細については、テキストを参照してください。(C) 従来のアガロースパッドベースの取り付け手順または本明細書に記載される半ハイスループットマルチウェルプレートベースの方法のいずれかを用いて取得したデータに使用できるデータ処理および可視化ツールの概要。1つのフィールド(左)または複数の3チャンネルからの単一の3チャンネルタイムラプス胚シーケンス、胚データの4次元フィールド(右)は、ほとんどのイメージングプラットフォームでキャプチャされたデータと互換性のあるカスタムトリミングプログラムを使用して処理できます。プログラムのグラフィカルユーザーインターフェイス(GUI)バージョンは、ユーザーフレンドリーであり、任意のプログラミングの専門知識を必要としません。screenCrop.pyアプリケーションには Python の専門知識が必要ですが、バッチ形式でトリミングできる機能が追加されています。このステップの出力はしっかりとトリミングされ、前後方向の胚tiffスタックである。1 つの条件のすべてのデータを視覚化するために、トリミングされた回転した tiff スタックをコンパイルする ImageJ マクロが作成され、各時点で各胚の明るいフィールド 画像と最大強度投影法が表示されます。(D) パネルには、半高スループットイメージング形式の解剖とセットアップに必要な不可欠なツールが表示されます。一部のフィギュアコンポーネントは、Wangら10の許可を得て再現しました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2.C.エレガンス胚発生の高含有量イメージングのために生成されるカスタム株。(A)回路図は、生殖層(上)および形態形成(下)株の構築に使用されるトランスジーンを示す。(B)最大強度投影パネルは、形態形成(上)および生殖層(下)株における発達時間経過を示す。回路図に示すように、腹部図が表示されます(左)。時間はカンマステージ(t = 0)に対して相対的であり、これは両方の株で容易に識別可能である。スケールバー= 10μm. フィギュアはWangらから許可を得て再現10.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3.カスタムトリミングプログラムは、個々の胚をイメージング分野から分離および配向します。(A) Schematic は、カスタム胚トリミング プログラムの機能を示し、このプログラムにアクセスするための 2 つのオプションを強調しています。Pythonの経験を必要とし、Github(右)で利用可能であるプログラムのバッチトリミングバージョン。(B)グラフィックは、自動トリミングアルゴリズムを要約する — バイナリマスクは8ビットの明るいフィールド画像から生成され、個々の胚が検出され、トリミングされ、前後軸に沿って向き合います。スケールバーは10μmである(C)回路図は、バイナリマスク内の胚を反復的に検出するために使用される手順を詳細に説明する。(D)回路図は、前後軸に沿って胚を配向するために使用される方法を示す。●パネルB-DはWangら10の許可を得て再現。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4.カスタム ImageJ マクロを使用すると、条件ごとに複合ファイルを生成することにより、RNAi スクリーニング データを視覚化できます。(A)40遺伝子検査セットからの3つのRNAi条件の例の胚(完全なデータセットについてはWang et al.10,11を参照)が表示され、それぞれに対して得られる個別のシグネチャ表現型を強調する(右)各条件内の表現型の状態と再現性。パネルは、Wangらから10.(B) パネルは、特定の RNAi 条件から各時点での各胚の明るいフィールドと最大強度の投影法を配列する合成 ImageJ ファイルに、カスタム ImageJ マクロ (OpenandCombine_embsV2.ijm) 配列がどのように配列するかを示しています。強調表示されている例は 1 つだけですが、このマクロは多くの RNAi 条件のデータを一度にコンパイルできます。ImageJ マクロはゼノド12で入手できます。スケール バー = 10 μm.ここをクリックすると、この図の大きなバージョンが表示されます。
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Discussion
この研究では、C.エレガンスにおける胚発生における遺伝子の機能をプロファイリングするために、より大規模な取り組みを可能にするために開発された一連のツールと方法について説明します。当社のセミハイスループット法により、1回の実験で80~100個の胚に対して20分分解能で胚発生の3Dタイムラプスイメージングが可能です。このプロトコルは任意の所望のマーカー株で使用するために適応することができますが、この研究は、胚発生中のイベントを監視するために開発された2つのカスタム株を使用する方法の可能性を示しています:(1)生殖層レポーター株、組織特異的プロモーターは、内胚葉、中胚葉および外胚葉核をマークするために蛍光ヒストンの発現を駆動し、(2)細胞接合部の蛍光マーカーの発現を駆動するために表皮および神経プロモーターを使用する形態形成レポーター株、プラズマ膜。2つの株をイメージングすることにより、細胞運命の仕様および形態形成事象に対する分子摂動の結果を顕著な詳細に捕捉することができる。この方法で生成されるデータの量によって提示される課題に対処するために、データ処理と視覚化を合理化するためにカスタムツールが開発されました。最初のツールは、個々の胚を3Dタイムラプス配列の胚からトリミングし、同時に胚を標準的な後方の向きに回転させ、背景減算、ドリフト補正、減衰補正を行います。このプログラムは、ユーザーフレンドリーなGUI(https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w)としてパッケージ化され、ソースコードとPython精通したユーザー(github.com/renatkh/embryo_crop.git)のためのプログラムのより高度なバッチバージョンが提供されています10,12,13.最後に、この処理されたデータを意味のある形式で視覚化するために、ImageJ マクロを考案しました。これにより、ユーザーは、各時点で各胚の明るいフィールドと最大強度の投影を示すマルチパネルムービーで、特定のRNAi状態からすべての胚を視覚化することができます。株、プロトコル、およびデータ処理ツールを組み合わせることで、より現実的な努力を大規模にC.エレガンス胚発生の研究に努めています。
全体的に実装するのは簡単ですが、ここで説明するセミハイスループット取得方法では、以下で説明するいくつかの重要な詳細に注意する必要があります。まず、ユーザーは、マルチウェルプレートホルダーを装備することができる精密ポイント訪問能力を持つ共焦点顕微鏡へのアクセス権を持っている必要があります。このプロトコルの最も重要な考慮事項は、顕微鏡が温度制御された部屋で維持されることです。多くの顕微鏡は加熱する能力を持っていますが、ほとんどは確実に冷却できないため、環境温度は一定のC.エレガンスフレンドリーな温度を維持するように調整する必要があります。これを達成するために、撮像室は16°Cで保持される。器械のサンプル区域はイメージ投射の間に21-23 °Cまで熱する。室温の変動は、発達のタイミングに影響を与え、ポイント訪問中の焦点面の精度を微妙に変化させ、可能な限り避けるべきです。23°Cを超える温度で走ることは、対照条件に対する胚性致死性のかなりのスパイクをもたらす可能性があり、お勧めできません。もう一つの重要な考慮事項は、解剖中の胚の選択と分散です。動物を孵化すると隣接する胚が視界から消える傾向があるので、古い胚をイメージングウェルに移さないように注意する必要があります。この発生率は、メディアに麻酔薬を含めることによって減少する。胚の分散は、胚の大きな塊を避けるために、重要な変数でもある。塊状は、薄く引き出されすぎた毛細管の井戸に胚が移る場合や、解剖中に胚が十分に分散していない場合に生じる傾向がある。もう 1 つの考慮事項は、ポイントの選択とフォーカル平面のチューニングに時間がかかるということです。プレートは、このプロセス中に氷上に保持されないので、胚はすぐに発達し始めます。この研究で使用されるカスタムマーカー株については、プレートが氷から取り出されてから約90分の窓があり、マーカーが発現し始める前にプレートスキャンとポイント選択を達成します。これは、これらの株で私たちの機器にセットアップするのに十分な時間ですが、他の顕微鏡や株は、トラブルシューティングを必要とする追加の時間の課題を提供する可能性があります。最後に、60倍の石油目標を用い、20分間隔で50フィールドのZスタックを収集します。強調表示すると、イメージするフィールドの数を減らすことで、時間的な解像度を増やすことができます。たとえば、10 個のフィールドを 4 分の時間解像度でイメージできます。時間分解能を高めるための第2の選択肢は、より低い倍率、高い開口目標を使用することです。この場合、より大きな視野では、空間分解能を適度に低減するだけで、より高い時間分解能で多数の胚をイメージングすることができます。
より大きなスケールでデータ処理と視覚化を可能にするために、カスタムツールを構築し、自由に利用できるようにしました。最も広く役に立つツールは、動作するためのプログラミングの専門知識を必要としないカスタムトリミングGUIです。GUIは、開発のすべての段階で胚を作り出し、配向するために使用することができ、すべてのマーカーと互換性があり、発達生物学者だけでなく、初期胚のプロセスを研究する研究者にとっても有用です。GUI の出力は正確にトリミングされ、指向化され、スケーリングされ、ドリフト補正されたデータであるため、データを自動分析パイプラインに簡単に送り込むことができるため、このツールは過去および将来のデータの分析に役立ちます。適切なひずみが使用される場合、得られたデータファイルは、胚発生アライメントツール25などの既存の自動解析体制の入力として使用することができる。プログラムを使用するためには、トリミングアルゴリズムでは、ステップとタイムポイントごとに明るいフィールドまたはDIC画像を収集する必要があることをユーザーが認識することが重要です。さらに、ユーザは、前後方配向アルゴリズムが、この研究に示す生殖層レポーターおよび形態形成報告株における赤色信号の分布に基づいて構成されることに留意すべきである。したがって、他のマーカー株におけるAPオリエンテーションの精度は、ケースバイケースで評価する必要があります。GUIは、3つの異なる共焦点イメージングプラットフォームで収集されたデータでテストされており、マルチtiffスタックとtiffシリーズ用にボード全体で互換性があります。GUI のソース コードとこのプログラムのバッチ バージョンも用意されており、プログラミングの経験が必要な点に注意し、ファイル構造と名前付け規則に従う必要があります。最後に、ImageJ 処理マクロは、各 RNAi 条件ですべての胚の生の画像スタックを取得し、各時点で明視野および蛍光最大強度投影でその状態のすべての胚を表示する有益な配列をコンパイルするために構築されました。このツールは、ユーザーの仕様に適応することができ、データ探索と品質管理評価を簡素化するのに便利なマクロです。
一緒に、本明細書に記載される胚トリミングおよび画像処理ツールと共にセミハイスループット撮影方法は、様々な突然変異体、摂動、およびマーカー株を用いたC.エレガンス胚発生の分析を容易にする。私たち自身の研究室では、開発に必要な約2,000個の遺伝子をノックダウンした後、ここで説明する2つのカスタムエンジニアリング株から胚を撮影するためにこれらの方法を採用した大規模なスクリーンが現在進行中です。最後に、この取り組みからのデータは、胚発生時の細胞運命の仕様と形態形成過程を理解するための取り組みを強化するためのさらなるリソースとして役立ちます。
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Disclosures
なし
Acknowledgments
S.D.O.は、カリフォルニア州サンディエゴ大学サンディエゴ機関研究・学術キャリア開発賞(NIH/IRACDA K12 GM068524)の支援を受けています。A.D.とK.O.は、この研究を支援するために使用される研究資金を提供したルートヴィヒ癌研究所によって支援されました。私たちは、このプロジェクトの初期段階での彼のアドバイス、最初の方法開発段階の後にこのプロジェクトに貢献したロナルド・ビッグス、およびデイブ・ジェンキンスとアンディ・シーアウが小分子発見をサポートし、アクセスするために、彼のアドバイスに感謝していますグループのハイコンテンツイメージングシステム。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aspirator Tube Assembly | Drummond Scientific | 2-000-000 | |
| Calibrated Pipette (25 mL) | Drummond Scientific | 2-000-025 | |
| Cell Voyager Software | Yokogawa Electric Corp | Included with CV1000 | |
| Conical Tube (15 mL) | USA Scientific | 1475-0501 | |
| CV1000 Microscope | Yokogawa Electric Corp | CV1000 | |
| Depression slide (3-well) | Erie Scientific | 1520-006 | |
| Dissection Microscope | Nikon | SMZ-645 | |
| Eppendorf Centrifuge 5810R | Eppendorf | 5811 07336 | |
| ImageJ/FIJI | Open Source | https://imagej.net/Fiji | |
| M9 Buffer | Lab Prepared | https://openwetware.org/wiki/M9_salts | |
| Microcentrifuge Tube (1.5 mL) | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Microseal F-foil Seal | Bio-Rad | MSF1001 | |
| NGM Plates | Lab Prepared | http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html#d0e214 | |
| Scalpel #15 | Bard Parker | REF 371615 | |
| Sensoplate Plus, 384 Well, F-bottom, Glass Bottom | Greiner Bio-One | 781855 | |
| Tetramisole Hydrochloride | Sigma Aldirch | T1512-10G | |
| Tweezers, Dumont #3 | Electron Microscopy Sciences | 0109-3-PO | |
| U-PlanApo objective (10× 0.4 NA) | Olympus | 1-U2B823 | |
| U-PlanApo objective (60× 1.35 NA) | Olympus | 1-U2B832 |
References
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