En semi-høy gjennomstrømming imaging metode og data visualisering Toolkit å analysere C. elegans embryonale utvikling

Summary

Dette arbeidet beskriver en protokoll for semi-høy gjennomstrømning som muliggjør samtidig 3D-embryogenesis i 80 – 100 C. elegans embryo i én nattkjøring. I tillegg er bildebehandlings-og visualiseringsverktøy inkludert for å effektivisere dataanalyse. Kombinasjonen av disse metodene med tilpassede reporter stammer muliggjør detaljert overvåking av embryogenesis.

Abstract

C. elegans er det fremste systemet for systematisk analyse av celle skjebne spesifikasjon og Morfogenetiske hendelser under embryonale utviklingen. En utfordring er at embryogenesis dynamisk utfolder seg over en periode på ca 13 h; Denne halv dag lange tidsskalaen har begrenset omfanget av eksperimenter ved å begrense antall embryo som kan bli avbildet. Her beskriver vi en semi-høy gjennomstrømming protokoll som gjør det mulig for samtidig 3D time-lapse Imaging av utviklingen i 80-100 embryo ved moderat tid oppløsning, fra opptil 14 forskjellige forhold, i en enkelt overnatting kjøre. Protokollen er grei og kan implementeres av ethvert laboratorium med tilgang til et mikroskop med punkt Besøks kapasitet. Nytten av denne protokollen er demonstrert ved å bruke den til bilde to spesialbygde stammer uttrykke fluorescerende markører optimalisert for å visualisere viktige aspekter av bakterie-lags spesifikasjon og morphogenesis. Å analysere dataene, et egendefinert program som beskjærer individuelle embryo ut av et bredere synsfelt i alle kanaler, z-trinn, og tidspunkter og lagrer sekvensene for hvert embryo i en egen TIFF-stabel ble bygget. Programmet, som inkluderer et brukervennlig grafisk brukergrensesnitt (GUI), effektiviserer databehandling ved å isolere, pre-prosessering, og jevnt orientere individuelle embryo i forberedelse til visualisering eller automatisert analyse. Også leveres er en ImageJ makro som kompilerer individuelle embryo data i en multi-panel fil som viser maksimal intensitet fluorescens projeksjon og brightfield bilder for hvert embryo på hvert tidspunkt. Protokollene og verktøyene som er beskrevet her, ble validert ved å bruke dem til å karakterisere embryonale utviklingen etter knock-Down av 40 tidligere beskrev utviklings gener; Denne analysen viste tidligere kommenterte utviklingsmessige fenotyper og avslørte nye. Oppsummert dette arbeidet detaljer en semi-høy gjennomstrømming imaging metode kombinert med et beskjæring program og ImageJ visualisering verktøy som, når kombinert med stammer uttrykker informative fluorescerende markører, akselererer sterkt eksperimenter for å analysere embryoutvikling.

Introduction

Den C. elegans embryo er en viktig modell system for mekanistisk cellebiologi og analyse av celle skjebne spesifikasjon og Morfogenetiske hendelser kjøring embryoutvikling^{1,2,3,4 ,5,6,7,8,9}. Hittil er mye av karakterisering av både Cellular-Level Events og celle skjebne spesifikasjon i fosteret er oppnådd ved hjelp av relativt høy Temporal oppløsning en-til-en-time Imaging eksperimenter (dvs. oppkjøpet hver 10-100 s) av embryo uttrykke fluorescerende markører. Selv godt egnet for hendelser på rekkefølgen av sekunder til titalls minutter, denne tilnærmingen blir teknisk begrensende for karakterisering av lengre prosesser, på rekkefølgen av timer til dager. Embryonale utviklingen fra første kløft til slutten av forlengelse tar ca 10 h. På denne tidsskala, semi-høy gjennomstrømming metoder som ville tillate samtidig lavere tid oppløsning Imaging (dvs. oppkjøp på 5-20 min tidsintervaller) av større kohorter av embryo, fra ulike forhold, ville åpne opp en ny rekke eksperimenter; for eksempel, muliggjør systematisk storstilt screening innsats og analyse av tilstrekkelig antall embryo for sammenligninger av konsekvensene av molekylær forstyrrelser.

Her beskriver vi en semi-høy gjennomstrømming metode for overvåking C. elegans embryogenesis som muliggjør samtidig 3D time-lapse Imaging av utviklingen i 80-100 embryo, fra opp til 14 ulike forhold, i en enkelt overnatting kjøre. Protokollen er grei å implementere og kan utføres av ethvert laboratorium med tilgang til et mikroskop med punkt besøk evner. De viktigste trinnene i denne protokollen er skissert i figur 1. Kort sagt, embryo er dissekert fra gravid voksne uttrykker fluorescerende markører av interesse og overføre unge embryo (2-8 celle scenen) til brønner av en 384-brønn plate for Imaging. I dette formatet, den relativt liten brønn størrelse trakter embryo inn i et smalt område, noe som forenkler identifisering av felt som inneholder flere embryo for time-lapse Imaging. For å opprettholde omtrent synkron utvikling på tvers av kohort av embryo, er dissections utført i kjølt Media og platen holdes på isen, noe som hindrer betydelig utvikling i løpet av time lange disseksjon tid vinduet. Platen er overført til mikroskopet og embryo er filmet i en temperatur-kontrollerte rom over natten, ved 20 min tidsintervaller, ved hjelp av en 60x olje nedsenking 1,35 NA linse, for å samle hele z-serien i 2 μm trinn. 50 felt, som hver inneholder mellom 1 til 5 embryo, er avbildet i en enkelt overnatting kjøre. Avhengig av det ønskede eksperimentet kan tids oppløsningen økes (for eksempel ved 5 – 10 minutters intervaller) ved å redusere antallet bildefelter proporsjonalt.

Med denne protokollen, selv en eneste natten kjører genererer en betydelig mengde data (80-100 embryo spredt ut over 50 felt) og større eksperimenter kan raskt bli uhåndterlig med hensyn til dataanalyse. For å lette behandlingen, visualisering og effektivisere analysen av disse dataene, ble et program bygget for å beskjære ut og orientere embryo og utføre pre-prosessering trinn (valgfritt), og en ImageJ makro som kompilerer dataene for å forenkle visning. Disse programmene kan brukes til å behandle bilder som er samlet inn ved hjelp av konvensjonelle tilnærminger, som de er uavhengige av tenkelig metode, som krever bare en enkelt brightfield fly. Det første programmet tar i en 4D-feltet som inneholder flere embryo (GUI alternativ eller kildekoden embryoCrop.py) eller flere 4D felt som inneholder flere embryo (screenCrop.py), tett avlinger embryo og orienterer dem i en fremre-bakre konfigurasjon. Disse programmene også gi brukerne muligheten til å utføre bakgrunns subtraksjon, drift korreksjon, og demping korreksjon. Den resulterende filene er jevnt pre-behandlet, tett beskjæres TIFF stabler for hvert embryo som er amendable til automatisert bildeanalyse. For å gjøre det enklere å se alle embryo for hver betingelse, en ImageJ makro (OpenandCombine_embsV2. ijm) ble skrevet, som samler alle embryo fra en gitt tilstand i en enkelt TIFF stack og arrays brightfield bilder og maksimal intensitet projeksjon farge ( RGB)-overlegg, side ved side, for hvert embryo. Metodene ble validert ved å bruke dem til å karakterisere embryoutvikling etter knock-Down av 40 tidligere beskrevet utviklingsmessige gener i et par spesialbygde stammer uttrykke fluorescerende markører optimalisert for å visualisere viktige aspekter av bakterie-lag spesifikasjon^{og morphogenesis.} Sammen vil den semi-høy gjennomstrømming embryo Imaging Protocol og bildebehandling verktøy muliggjør høyere sample antall eksperimenter og stor skala screening innsats som tar sikte på å forstå utviklingsmessige prosesser. I tillegg vil disse stammene også gi et effektivt middel for å undersøke virkningene av molekylær forstyrrelser på embryogenesis.

Protocol

1. forbereder C. elegans embryo for semi-høy gjennomstrømming Imaging

Merk: Målet med denne delen av protokollen er å laste en befolkning på semi-synkronisert (2 til 8-celle scenen) C. elegans embryo, dissekert fra egnede markør stammer (figur 2), i et glass-bunn 384-brønn plate for bildebehandling. Andre plateformater kan også fungere, men 384 brønn platene foretrekkes fordi den lille brønn størrelsen begrenser spredningen av embryo til et relativt lite område, noe som forenkler identifisering av felt som inneholder flere embryo for time-lapse Imaging. Grovt synkronisering av embryo sikrer at hele løpet av utviklingen er fanget for hver av embryo i et felt.

1. Forbered 5 – 10 mL 0,1 mg/mL oppløsning av tetramisole hydrochloride (TMHC) anestesi oppløst i Ice Cold M9 medium (0,45 M na₂HPO₄∙ 7H₂O, 0,11 M KH₂PO₄, 0,04 M NaCl, 0,09 m NH₄CL) til bruk under disseksjon og bildebehandling. Dette mediet inneholder en bedøvelse for å sikre at bevegelige skraverte Larven ikke forstyrrer bilde av embryo på tidligere utviklingstrinn.
   Merk: Hvis du bruker beskjæring og visualisering verktøy for å analysere data ervervet ved hjelp av standard agarose pad monteringsmetoder, gå videre til § 3 nedenfor.
2. Alikvot 70 μL av den tilberedte oppløsningen i individuelle brønner av et glass-bunn 384-brønn plate med en brønn for hver tilstand; unngå de ytre to radene av platen for å hindre kanteffekter.
   Merk: Det er nyttig å maskere omkringliggende brønner ved hjelp av selvklebende PCR-folie (se eksempel i figur 1D) dette bevarer tilstøtende brønner for fremtidige eksperimenter og gjør det enklere å finne egnede brønner under det disseksjon mikroskopet. Når løsningen er aliquoted, holde tallerkenen og gjenværende løsning på is gjennom disseksjon.
3. Generer munn pipets for overføring av embryo fra depresjonen raset (der gravid hermafroditter er dissekert) til brønnene. Trekk kapillær pipets (25 μL kalibrert pipets) over en flamme og pause for å generere en fin konisk ende (figur 1D). En Pipet er nødvendig per betingelse for å hindre krysskontaminering; Kast Pipet etter bruk.
4. Bruk fine pinsett til å overføre ~ 10 gravid voksne under en disseksjon omfang i 150 μL av iskald TMHC løsning aliquoted på en depresjon lysbilde for hver tilstand. Bruke pinsett og en skalpell, analysere ormer å løslate embryo.
5. Legg en trukket kapillær Pipet inn i aspirator vedlegget som følger med pipets, og munn Pipet å overføre alle de 2 til 8-celle-scenen embryo inn i en individuell brønn av den preparerte plate (figur 1D). Unngå å overføre sent stadium embryo og disseksjon rusk. Undersøk under en disseksjon omfang og hvis aggregater av embryo er til stede, munn Pipet opp og ned eller trykk klumper av embryo med Pipet spissen å spre.
   Merk: For å hindre krysskontaminering, rengjør disseksjon utstyr og bruk en fersk munn Pipet mens du beveger deg mellom forholdene. Lagre plate på isen mellom dissections.
6. Når ormer fra alle forhold har vært dissekert og embryo plassert i riktig brønn, spinne 384-brønn plate for 1 min ved 600 x g å bosette embryo.
7. Tørk av bunnen av platen med en etanol-gjennomvåt tørk for å fjerne eventuelle rester og plassere platen på et konfokalmikroskopi mikroskop utstyrt med en plate holder i et temperatur kontrollert miljø.
   Merk: Trinnene som følger detaljer denne metoden ved hjelp av lab oppsett; må du endre anskaffelses betingelsene for å passe til eksperimentelle behov og utstyr. Her, en konfokalmikroskopi skanner boks utstyrt med en microlens-forbedret dual Nipkow spinning disk, en 512 x 512 EM-CCD kamera, en høy presisjon Auto-XY-Stage (utpekt oppløsning 0,1 μm) og motorisert z-aksen kontroll (utpekt oppløsning 0,1 μm) brukes. Dette systemet oppbevares i et rom på 16 ° c, som opprettholder temperaturen på mikroskopet mellom 21 og 23 ° c i løpet av natten.
8. Å identifisere felter med passende Foster, utføre en pre-avsøke av hver frisk benytter en 10x 0,4 NA mål og passende tenkelig programvare. De mest optimale feltene vil inneholde mer enn ett tidlig stadium embryo som er i samme fokalplanet som andre embryo og ideelt sett vil ha minimal kontakt mellom tilstøtende embryo. Markere posisjoner for egnede regioner.
9. For å velge bildefelt, Bytt til 60x mål og justere fokalplanet på hvert punkt besøk til riktig delen av embryo. 1 – 4 felt per brønn er avbildet, for totalt 50 felt på tvers av 14 brønner, og hvert felt kan inneholde mellom ett og fem embryo. Totalt er 4 til 15 embryo valgt fra hver betingelse for høyoppløselig bildebehandling.
   Merk: En nøkkel variabel på dette trinnet er bruken av tilstrekkelig olje; plassere olje på målet, besøke poeng i hver brønn for å spre oljen rundt overflaten av alle brønnene og deretter bruke en ekstra dråpe olje til målet før valg av felt.
10. Bilde de valgte feltene ved hjelp av en 60x 1,35 NA mål å erverve 18 z seksjoner på 2 μm intervaller hver 20 min for 10 h. Den tenkelig forhold ved hjelp av bakterie-lag og morphogenesis reporter stammer er som følger: brightfield, 90% strøm, 25 MS, 20% gevinst; 488 NM, 100% strøm, 200 MS, 60% gevinst; 568 NM, 45% strøm, 150 MS, 60% gevinst.
11. Etter Imaging er fullført, vurdere embryonale dødelighet ved å utføre en lav forstørrelse (10x 0,4 NA objektiv) hele brønnen brightfield skanning ~ 20-24 h etter starten på natten Imaging.

2. embryonale dødelighet scoring

1. Ved hjelp av post-Run 10x skannede felt, vurdere embryonale dødelighet og larvestadiet defekter ved å telle klekket ormer og uklekket embryo for hver brønn.
2. Score uklekket embryo som embryonale dødelige. Ekskluder arrestert en-til fire-celle-scenen embryo fra dødelighet teller, siden unge dissekert embryo noen ganger ikke klarer å fullføre eggeskall formasjon (hvis meiose II er ennå ikke fullført) og permeabilitet defekter kan føre til osmotisk komplikasjoner i løpet av de to første Divisjoner.
3. Score delvis klekket eller fullstendig klekket ormer med kropps morfologi eller atferds feil, slik som dumpy eller lam, som "unormal Larven".

3. automatisert beskjæring (Figur 3A)

Merk: Programvaren er plassert på to steder: (1) Zenodo huser en brukervennlig versjon av programvaren¹² som ikke krever noen programmering ekspertise. (2) GitHub inneholder kildekoden for våre embryoCropUI.py og screenCrop.py programvare¹³, som krever dyktighet med Python. Detaljert instruksjoner for dataoverfører og fungerer begge to versjoner av programmet kan grunnlegge neden.

1. Automatisert beskjæring bruke embryoCropUI kjørbar versjon (brukervennlig versjon)
   1. Hvis du vil bruke embryoCropUI-programmet, må du først laste ned programmet fra Zenodo (https://zenodo.org/Record/3235681#.XPAnn4hKg2w)¹².
      1. Last ned MacOS-eller Windows-format versjonen av programmet (Merk at MacOS-versjonen krever MacOS X-10.11 eller høyere).
      2. Dataoverføre veiledningene arkiv (GUI_Instructions_zenodo_repoV2. docx), hvilke skaffer skritt for skritt instruksjoner for tester og benytter det embryoCropUI program.
      3. Last ned test_files. zip for å teste om programmet fungerer på riktig måte på plattformen (se instruksjoner).
   2. En gang dataoverførte, unzip og navigere å finner det embryoCropUI startbar (... \embryoCropUI\_WINDOWS\embryoCropUI\embryoCropUI.exe) eller (... \embryoCropUI\_MacOS\embryoCropUI\embryoCropUI.exe). Dobbel falle i staver å innlede (eller valgte ' åpen med ' Terminal) og løpe det embryoCropUI startbar.
   3. Den GUI kjørbar avlinger en 4D synsfelt om gangen. I øvre venstre hjørne, velg Åpne-knappen for å laste inn det spesifikke feltet for å beskjære (multi-TIFF). Hvis beskjæring av en TIFF-serie, med flere dimensjoner (dvs. z, tid, kanal), lastes bare det første bildet i serien i mappen (én TIFF-serie per mappe).
   4. Når bildene er lastet inn, angir du følgende informasjon: antall z-skiver, (Z), antall tids punkt (T), antall kanaler (C), kanalen som tilsvarer DIC eller brightfield (første = 1, sekund = 2, etc.).
   5. Velg Tilleggsbehandling for å kjøre på bildene. Programmet tilbyr drift korreksjon, bakgrunn subtraksjon, og demping korreksjon.
   6. Angi parametere for bakgrunns subtraksjon og dempings korrigering for å veilede behandlings arbeidet i GUI-ledeteksten. For bakgrunn trekk fra, definere den største funksjonen størrelse for å reflektere størrelsen på meningsfulle signal; Denne ansiktstrekk størrelse burde ikke være betraktet som miljøet og må være en odde antallet salgsverdi. Angi en verdi fra 0-1 for dempings korreksjon. Dempings Korrigerings verdien gjenspeiler prosentandelen av den opprinnelige intensiteten som gjenstår lengst i dybden på objektet som blir avbildet.
      Merk: Bakgrunns subtraksjon og demping korreksjon må kjøres sammen.
   7. Angi rekkefølgen for bilde samlingen (for eksempel kanal-z-tid (CZT) eller z-kanal-tid (zct)).
   8. Angi mikron per piksel for bildene basert på kameraet som brukes.
      Merk: Dårlig bilde beskjæring vil skje hvis pikselstørrelsen ikke er riktig definert.
   9. Velg Kjør nederst i venstre hjørne. En ny undermappe merket "beskjære" vil bli opprettet i samme bane som uncropped mappen; beskjæres versjoner vil bli lagret på denne plasseringen. Avhengig av filstørrelsen bør beskjæring fullføres i løpet av sekunder til minutter.
2. Automatisert beskjæring ved hjelp av screenCrop.py (bakst versjon alternativ å embryoCrop GUI beskrevet over;Python kunnskapsrike brukere bare)^10,13
   1. Hvis du vil bruke screenCrop.py, Python programvareversjon for beskjæring av større datasett i en batch-format, klone eller laste ned kildekoden fra GitHub (GitHub.com/renatkh/embryo_crop.git).
   2. Les instruksjonene for konfigurering av et skikkelig virtuelt miljø og følg fil navngivnings systemet som er beskrevet. som begge er beskrevet i readme -filen i GitHub-depotet: https://GitHub.com/renatkh/embryo_crop/blob/Master/readme.MD.
   3. Når miljømessige variabler og navnekonvensjoner er riktig etablert, åpne Parameters.py og screenCrop.py i en redaktør av valget.
   4. Hvis du vil endre justerbare parametre uten å berøre kildekoden, redigerer du Parameters.py -filen.
      Merk: det er også mulig å endre parametere direkte i overskriften til screenCrop.py.
      1. Hvis du bruker konfigurasjonsfilen for parameters.py, endrer du use_configure -innstillingen til sann. Hvis du bruker direkte redigering i screenCrop.py, lar du use_configure -innstillingen være på False.
      2. Finn følgende informasjon i parameters.py-filen, og gjør endringer for å passe til ønskede bildeparametere og filstruktur:
         1. loadFolder (linje 9): endre til stasjonen der filene er lagret (f. eks Z:/, D://, etc.)
         2. dato (linje 7): Bytt til mappen som inneholder filer for bildebehandlings økten. Dette kalles «eksperiment mappenavn» i CSV-sporingskoden (se instruksjoner).
         3. trackingFile (linje 11): endre til banen til CSV-filen der eksperiment informasjonen lagres.
         4. z (linje 13): Angi som antall z-plan.
         5. nT (line14): Angi som antall tidspunkter.
         6. nWells (linje 19): Angi som antall brønner som brukes.
         7. pointVisits (linje 20): Angi som maksimalt antall poeng besøk (per brønn).
         8. I linje 10 finne stedet for tiden okkupert av ' CV1000/' og input den ytre mappen som brukes i filbanen. Hvis du vil unngå problemer, kan du bruke følgende konvensjon: ' XXXXXXX/'.
         9. I linje 12 legger du inn en gyldig filbane for lagring av størrelsesforhold for data som er beskåret.
         10. I linje 15, 16, 17 og 18 input Sann/usann for om bildene går gjennom følgende behandling:
             1. Inn data sann eller USANN for drift korreksjon på linje 15.
             2. Inn data sann eller USANN for bakgrunnen subtrahere på linje 16. Funksjons størrelsen må være empirisk bestemt for ulike markør belastninger og piksel størrelser. I konfigurasjonen her, har størrelsen ble definert som 41 for bakterie-lag belastning og 201 for Morphogenesis belastning. Bakgrunn subtrahere må gjøres i forbindelse med demping korreksjon.
             3. Input true eller False for demping korreksjon på linje 17.
             4. Input sann eller USANN for fremre bakre rotasjon på linje 18.
   5. Når alle endringene er gjort, kan beskjæring begynne. For å gjøre dette, Bytt til screenCrop.py og velg avspillingsikonet i verktøylinjen, i rullegardinmenyen velger du Kjør som > Python Run.
   6. Som beskjæring kan ta flere timer å fullføre for et stort datasett (50 poeng besøk 18 z trinn, 3 kanaler, 31 tidspunkter), spore fremdriften av beskjæring i konsollvinduet. En gang høster er fullført, en liten vindu ville viser forpremierer av det beskåret profilen tidligere bevarer. For hvert bilde er det 3 alternativer:
      1. Lagre: Trykk på mellomromstasten for å lagre bildet hvis bildet beskjæres riktig uten interesseområder som kuttes av.
      2. X: Trykk på X hvis bildet ser ut til å ha interesseområder avskåret; bildet vil bli lagret med en X foran navnet for å skille den fra de andre bildene.
      3. Delete: Trykk på D for å slette det beskjæres bildet hvis bildet ikke beskjæres riktig eller embryo er ikke tilfredsstillende.
         Merk: bildene blir lagret i en undermappe med navnet "beskåret" i Last mappen (definert i linje 9 i programmet).

4. visualisering (Figur 4)

Merk: OpenandCombine_embsV2. ijm^10,12 er en ImageJ makro som vil konstruere en enkel å vise TIFF-fil fra alle bildene for en bestemt belastning og tilstand. Installasjon av FIJI/ImageJ^14,15 er nødvendig. Denne makroen kjøres i henhold til filstrukturen. Det må endres for å fungere med andre filstrukturer. En guide til riktig filstruktur og detaljert beskrivelse av viktige hensyn kan bli funnet på slutten av GUI_Instructions_zenodo_repoV2. docx filen på zenodo depotet. Les gjennom disse instruksjonene fullstendig før avbildning til riktig navn og struktur filer til grensesnittet best med denne makroen. For referanse, vår filplassering struktur ser slik ut:
Z:\cropped\Target\Strain\Emb # \Target_Emb # _15 siffer unik identifikator _W # #F # _T # #_Z # #_C #. tif
dvs. Z:\cropped\EMBD0001\GLS\Emb1\EMBD0001_Emb1_20140327T135219_W02F1_T01_Z01_C1.tif

1. Last ned OpenandCombine_embsV2 og GUI_Instructions_zenodo_repoV2. docx fra zenodo (https://zenodo.org/Record/3235681#.XPAnn4hKg2w).
2. Klargjør følgende informasjon:
   -Plasseringen der bilde mappene er lagret (etter beskjæring).
   -Bildemappe navnene (e) for de spesifikke betingelsene som skal behandles (dvs. EMBD0002). Dette er referert til som "target" i eksempelet ovenfor
   -En 15-sifret alfanumerisk unik identifikator som er spesifikk for et gitt overnight-eksperiment – Denne identifikatoren er navnet på datainnsamlings mappen (det vil si 20140402T140154), og den unike identifikatoren er innebygd i det individuelle TIFF-filnavn (EMBD0002_Emb1_ 20140402T140154_W06F2_T01_Z01_C1) for hvert embryo avbildet på den dagen. Makroen bruker denne identifikatoren til å se etter embryo ervervet på samme dato og kan sette sammen gjentatte betingelser, med separate datoer, i separate ImageJ-filer.
3. Åpne ImageJ, dra og slipp makrofilen, OpenandCombine_embsV2. ijm, til ImageJ-linjen, eller åpne makroen direkte.
4. Når makroen er åpen, finner du linje 3 og 4. Skriv inn informasjonen som er samlet inn (avsnitt 4,2) i henhold til følgende trinn:
   1. I linje 3 (eksterne), Skriv inn mål navnet for bildene som skal behandles. Input hvert mål i følgende struktur newArray ("XXXXXXXX/"); inkludere tilbud. Hvis du vil kjøre flere betingelser samtidig, skiller du med et komma og beholder alle målnavnene i parentesen (dvs. newArray ("EMBD0000/", "EMBD0001/", "EMBD0002/").
   2. Inne line 4 (dato), input det 15 tall alfa-numerisk enestående kjennemerke inne sitater, for eksempel newArray ("20140402T140154").
5. Trykk Kjør nederst til venstre i makrovinduet. En vindu ville komme, hvilke ville innlede en spørsmål å navigere å det ytre brosjyre inneholder det beskåret image brosjyre (spesifiserte inne 4.4.1).
6. En gang valgt, en annen vindu ville komme, hvilke ville tillate spesifikasjon av tenkelig parameterene.
   1. Angi antall kanaler, antall Z-stykker, skriftstørrelsen for teksten som brukes i merkingen av de kompilerte bildene, og fargen for hver av kanalene.
   2. Sjekk på/av automatisk kontrast i alle kanaler.
7. Når alle parametere er angitt, klikker du på OK nederst i vinduet. Den sammensatte filen vil begynne å sette sammen. Dette vil ta flere minutter, per betingelse, å fullføre.
8. En gang fullført, anmelde filene det er igjen åpen hvis ønsket. De kan lukkes uten å lagre, som makroen har allerede lagret filene til en nyopprettet mappe som er navngitt på følgende måte: ytre mappenavn (angitt i prompt i § 4,5) + "-Fiji-behandlet-output" (dvs. Z:\ cropped-fiji-processed-output\EMBD0002_GLS_20140402T140154.tif).

Representative Results

En betydelig utfordring i karakteriserer effekten av molekylær forstyrrelser på C. elegans embryoutvikling er at det tar ca 10 h for embryo å gå videre fra første kløft til slutten av forlengelse ved 20 °¹⁶. En semi-høy gjennomstrømming metode der store kohorter av embryo kan samtidig avbildet er nyttig for hendelser på denne tidsskala fordi den tillater Imaging av flere forhold parallelt med en tilstrekkelig ensemble størrelse for hver betingelse for å muliggjøre kvantitativ analyse (figur 1A).

Halvhøy gjennomstrømming imaging metode og multi-markør stammer
Den semi-høy gjennomstrømming Imaging metoden beskrevet her (skissert i figur 1B), sysselsetter en 384-brønn glassbunn plate; Multi-brønn formatet tillater opptil 14 forhold som skal plassert parallelt og den lille størrelsen på brønnene begrenser søkeområdet, og forenkler identifisering av felt som inneholder embryo for høyoppløselig bildebehandling. Her, en konfokalmikroskopi Scanner boksen ble brukt, utstyrt med en microlens-forbedret dual Nipkow spinning disk, en 512 x 512 EM-CCD-kamera, en høy presisjon Auto-XY-Stage (utpekt oppløsning 0,1 μm) og motorisert z-aksen kontroll (utpekt oppløsning 0,1 μm). Imidlertid kan protokollen tilpasses ethvert konfokalmikroskopi mikroskop med presisjon pek-besøk evner og en scene adapter som kan romme en multi-brønn plate. En betydelig utfordring i å utvikle denne metoden var å utarbeide et middel til å generere en tallerken med embryo på samme utviklingstrinn slik at helheten av utviklingen kan fanges for alle embryo i hvert felt. Dette er en utfordring fordi embryo plassert på Imaging plate første vil fortsette å utvikle mens senere prøvene er dissekert, noe som resulterer i en gradient på Staging over brønnene. For å omgå dette problemet, tidlig stadium embryo (2-8 celle scenen) er valgt og holde disseksjon Media og bilde plate på isen; Dette boder embryogenesis for dissekert embryo inntil alle forhold har blitt plassert uten signifikant innvirkning embryonale levedyktighet¹⁰. Å begrense tiden som embryo sitte på isen til 1 time, to forskere utføre dissections samtidig, noe som gjør det mulig for oppsett av 14 ulike forhold i ca 50 min. Etter disseksjon, er platen spunnet på 600 x g for 1 min til sediment embryo og brønner er pre-skannet ved lav forstørrelse å finne felt med grupper av egnede embryo for høy forstørrelse Imaging; steder for punkt besøk er merket. Embryo er filmet i en temperatur-kontrollerte rom over natten ved hjelp av en 60x olje nedsenking 1,35 NA linse. Prøvene er konfigurert i en 4 brønn med 4 brønn region slik at overflatearealet av platen som brukes i et eksperiment kan sammenlignes med en 22 x 22 mm² standard dekkglass, som tillater bruk av en 60x olje mål. Uniform spredning av olje i denne regionen før starten av bildebehandling er avgjørende for vellykket langsiktig bildeoppkjøp. Den utviklende embryo er avbildet i en løsning som inneholder bedøvelse; Dette sikrer at når den eldre embryo i brønnen klekkes, ikke deres bevegelse ikke forstyrre plasseringen av tilstøtende yngre embryo som blir avbildet. På grunn av den ugjennomtrengelig natur eggeskall, påvirker bedøvelse ikke bevegelse før klekking. Under disse forholdene samles 3D-tidsforløp data i 3-kanaler for totalt 80-100 embryo i en enkelt overnatting eksperiment (diskutert mer nedenfor).

C. elegans embryoutvikling skjer i to faser. Først, 10 runder av celledeling koplet til celle skjebne spesifikasjonen generere tre bakterie lag (ektoderm, mesoderm, og endoderm) over en 6 timers periode¹⁷. I følgende 7 h, Morfogenetiske hendelser drive dannelsen av differensiert vev^8,16. For å fange disse to aspektene ved utvikling, bygde vi et par tilpassede stammer, bakterie laget og Morphogenesis stammer¹⁰ (figur 2a), og brukte semi-høy gjennomstrømming protokollen til bildet embryo fra begge stammer. Bakterie sjikt belastningen uttrykker transgene-kodede fluorescerende proteiner som markerer kjerner i ektoderm, mesoderm og endoderm i rødt, gult og grønt. Denne stammen inneholder tre reporter transgenes: (1) en transgene uttrykker Pha-4:: GFP som markerer kjerner i tarmen og svelget (grønn endoderm)^10,18,19, (2) en transgene uttrykke en mCherry-histone fusjon i epidermis og i ~ 1/3 av neurons (rød ektoderm; Figur 2a), og (3) en transgene som samtidig uttrykker mCherry og GFP-Tagged histoner i kroppen veggen muskel (gul mesoderm). Morphogenesis-stammen har to transgenes som uttrykker: (1) et grønt epitel knutepunkt (DLG-1:: GFP) i epidermis, og (2) en mCherry-merket plasma membran markør, i ~ 1/3 neurons (PCND-1 promoter; Figur 2A). For å øke effektiviteten av RNAi, begge stammene ble også konstruert for å inneholde et par RNAi-sensibiliserende mutasjoner (nre-1 (hd20) Lin-15B (hd126)²⁰. Disse ble konstruert med mål om å utføre en storstilt RNAi-basert skjerm av ~ 2 000 gener som kreves for embryoutvikling. Imidlertid vil dette paret av stammer også utgjøre et bredt nyttig standardisert plattform for å vurdere utviklingsmessige defekter i mutanter, og for mer detaljerte analyser av rollene til ulike proteiner i utvikling.

For datainnsamling i dette semi-høy gjennomstrømming format, med disse stammer, grønn, rød og lyse felt z-serien (18 x 2 μm² intervaller) er samlet, hver ~ 20 min, for en periode på 10 timer i en 16 ° c temperatur-kontrollerte rom; Dette opprettholder mikroskopet mellom 21-23 ° c under kjøringen. De 20 min tidsintervall tillater oss å bilde 50 felt av embryo (poeng besøk) per eksperiment. Brukere kan skreddersy anskaffelser til kortere intervaller med færre poeng besøk eller lengre intervaller med flere poeng besøk som passer til de eksperimentelle målene. For disse stammene, de tidlige utviklingsmessige tidspunkter er ikke avbildet fordi vevet spesifikke journalister kjøring markør uttrykket ikke begynner å uttrykke før mid-til-sen gastrulation. I løpet av denne tidlige fasen ble brønnene skannet ved lav forstørrelse (10x) og felt er valgt for høy forstørrelse Imaging. Valg av felt som inneholder mer enn ett tidlig stadium er anbefalt, men å unngå felt der embryo er delvis overlappende, altfor overfylt, eller er funnet på den ekstreme kanten av brønnen. Etter over natten 60x bildebehandling, en lav forstørrelse (10x) hele brønnen skanning er utført for å avgjøre om embryo klekkes med normal utseende (WT), klekkes med synlige misdannelser (larvestadiet unormal), eller er embryonale dødelige for hver tilstand vurdert ( Figur 1B). Dette trinnet fungerer som et enkelt alternativ til å sette opp plater parallelt for å vurdere dødelighet over en større befolkning; hele brønnen 10x post-Scan gir embryonale dødelighet data på 50-80 embryo per betingelse. Ved hjelp av dette tiltaket for å sammenligne befolkningen embryonale dødelighet data for kontroller mellom går er en nyttig kontroll som sikrer konsistens med hensyn til helsen til stammene og miljøforhold og behandling trinn. Når avbildet i kombinasjon, de to tilpassede reporter stammer gi informative readouts for de fleste store utviklingsmessige hendelser, inkludert celle skjebne spesifikasjon, rygg innskudds, epidermal kabinett, forlengelse, og neurogenesis (representative kontroll bilder er vist i figur 2B, også se Wang et al.¹⁰).

Data behandling: automatisk embryo beskjæring og orientering
Med vår bildebehandlings protokoll inneholder hvert avbildnings felt med høy oppløsning mellom 1 og 5 embryo. disse embryo er tilfeldig orientert og er ofte plassert umiddelbart ved siden av hverandre. Data som samles inn ved hjelp av konvensjonelle embryo monterings teknikker lider av de samme utfordringene. For å forberede data for påfølgende visualisering og analyse, er betydelig hands-on manipulasjon er nødvendig for å beskjære og orientere embryo sekvenser, samt å pre-prosess dem til å trekke bakgrunn, riktig for drift, og kompensere for signal demping med dybde. For å effektivisere denne prosessen ble et egendefinert embryo beskjæring program bygget som isolerer og orienterer hvert embryo fra det bredere feltet (figur 1C, Figur 3). Dette programmet har blitt pakket som en brukervennlig, frittstående program med grafisk brukergrensesnitt (GUI, kompatibel med data fra de fleste Imaging plattformer) som kan ta i en 3D-time-lapse sekvens av et felt av embryo, og behandle den i individuelle TIFF-serien for hvert embryo i feltet (Figur 3B, tilgjengelig på https://zenodo.org/Record/3235681#.XPAnn4hKg2w)^10,12. Python kildekoden for GUI (embryoCropUI.py), og en batch versjon av dette programmet (screenCrop.py) er også tilgjengelig for erfarne Python brukere på GitHub (https://GitHub.com/renatkh/embryo_crop.git)^10,13. Kjernen funksjonaliteten i dette programmet er å finne, beskjære, og orientere fosteret langs fremre-bakre akse. Samtidig kan det utføres bakgrunns subtraksjon, dempings korrigering og drift korreksjon på datasettet ved hjelp av valgfrie justerbare innstillinger.

Kort, den automatiserte beskjæring programvare iteratively oppdager individuelle embryo i en binær maske Hentet fra lyse felt bilder og sekvensielt avlinger embryo fra alle kanaler og orienterer bildene langs fremre-bakre akse (Figur 3 B, først beskrevet i Wang et al.¹⁰). Før beskjæring, korrigerer programvaren for drift, trekker bakgrunnen og utfører dybde demping korreksjon i hver fluorescens kanal (valgfritt). For å få den binære masken, brukerprogramvaren skarpsindig kantdeteksjon²¹ til lyse felt bilder, utfører maksimal intensitet projeksjon av de tre sentrale flyene og fyller i små hull. Algoritmen oppdager individuelle embryo ved å montere en Cassini oval til en del av den binære masken omrisset (se Figur 3B, 3c). Etter samkjøre den ovale langs den viktigste aksen, måler programvaren rød fluorescens intensitet i hver halvdel av det isolerte embryo og roterer embryo slik at rød intensitet er orientert mot venstre, som setter embryo fremre på venstre side for begge som brukes i dette arbeidet (Figur 3D). Pilot av denne programvaren viste at de fleste embryo var effektivt beskjæres som forventet. Minor Imaging problemer, slik som embryo drift, midlertidige fokalplanet tap (på grunn av bobler i olje), eller overfylte felt av embryo ikke vanligvis forstyrre vellykket beskjæring. Men for felt der det var store klumper av embryo (overlappende noe i z), embryo som var betydelig vippet i Imaging Plane (i Z), langsiktige fokalplanet tap, eller embryo som var delvis avkuttet, vellykket beskjæring var ikke alltid Oppnådd. Disse problemene kan lett omgås ved bedre felt valg under datainnsamlings fasen. Total, pre-prosessering data samlet inn med denne semi-høy gjennomstrømming metoden eller ved hjelp av konvensjonelle monteringsmetoder er et nyttig første skritt for å visualisere og analysere embryonale datasett.

Validering av bilde innsamling og databehandling metoder: visualisere embryoutvikling etter knock-Down av 40 tidligere beskrevne gener
For å validere denne halvhøy gjennomstrømming bildesamling metoden og tilpasset beskjæring regime, en liten RNAi skjermen ble utført i den egendefinerte stammer, rettet mot 40 gener med tidligere beskrevne funksjoner i cellen skjebne spesifikasjon og morphogenesis ( beskrevet av Wang, Ochoa, Khaliullin og kolleger^10,11). For å gjøre dette, ble dsRNA generert mot hvert mål, injisert L4 dyr fra hver belastning, ventet 20-24 h, og deretter dissekert ut og avbildet embryo ved hjelp av protokollen som er beskrevet ovenfor (for fullstendig datasett^10,11). Å oppnå utviklingsmessige fenotyper av RNAi krever hemming av både mors og zygotic genuttrykk. Utviklingsmessige gener kan være moderskap uttrykt, med den resulterende protein produkter blir lastet inn i embryo, eller zygotically uttrykt i fosteret, eller, i mange tilfeller, både^10,22,23. Tiden mellom injeksjon og embryo filming er den kritiske variabelen til å effektivt målrette moderskap og zygotically uttrykt populasjoner; timing bestemmer både mengden injisert dsRNA som er lastet inn i fosteret for å hindre zygotic uttrykk²⁴ og omfanget av mors protein nedbryting. Etter dsRNA injeksjon, mors mRNA tilsvarende den målrettede genet blir degradert og ikke komme over i et relevant tidsintervall. Pre-eksisterende protein nedbryting krever embryo produksjon, som kaster ut mors protein fra germline vev ved å laste den inn forming embryo. 20-24 h ved 20 ° c er den korteste inkubasjonstiden som tillater konsekvent mors tømming; mors forringelse blir bedre på senere tidspunkter (dvs. 36-42 h etter injeksjon). Mengden injisert dsRNA som er lastet inn i embryo dikterer hvor effektivt forebygging av zygotic genuttrykk vil bli. Mengden av lastet RNA topper ca 5-10 h etter injeksjon, når embryo med injisert materiale er først befruktet, synkende deretter. I vår erfaring, 24 h etter injeksjon er en optimal timepoint, der mors protein tømming og hemming av zygotic genuttrykk er effektive. Analyse av fenotyper i de tilpassede reporter stammene brukt i dette arbeidet, på tvers av sett av 40 test gener, viste at vår kombinerte protokollen gitt distinkte, svært reproduserbar signatur fenotyper over et bredt spekter av gener involvert i celle skjebne spesifikasjon og morphogenesis (se Wang et al.¹⁰); hele datasettet er tilgjengelig¹¹). Som et eksempel på disse dataene, stillbilder av fire forskjellige embryo for kontroll, Pha-4 (RNAi), PAL-1 (RNAi), og Mex-3 (RNAi) i bakterie lag reporter belastningen er vist i Figur 4A. For en mer helhetlig drøfting av fenotyper observert i 40-genet RNAi skjermen, se Wang et al.¹⁰

ImageJ-makro: kompilering og visualisering av alle data for en gitt betingelse
Visualisering av et stort antall embryo fra individuelle TIFF stabler kan være kjedelig og tidkrevende å arbeide gjennom. Fra vår første innsats, > 400 individuelle embryo ble isolert ved hjelp av tilpasset automatisert beskjæring programmet beskrevet ovenfor. For å fremskynde første-pass analyse, bygde vi en ImageJ makro, som genererer en matrise av alle embryo avbildet for en gitt RNAi tilstand i en gitt stamme bakgrunn (Figur 4B). For hvert embryo i matrisen presenteres et brightfield bilde og et projeksjonsbilde med maksimal intensitet ved siden av hverandre, for hvert tidspunkt, for å generere en sammensatt filmfil. Selv om denne makroen ble skrevet for å fungere med filstrukturen vår, kan den redigeres for å imøtekomme brukerens filstruktur. For best resultat, men bør brukerne følge navngiving og filstruktur konvensjoner fastsatt i protokollen (se Zenodo eller GitHub README-filer for mer spesifikk for Python og ImageJ søknad navnekonvensjoner). Hvis du vil vise alle ImageJ behandlede data og få mer inngående analyse av fenotyper observert for 40-genet test sett, kan du se data avsatt i dryad database^10,11. Dette ImageJ visualisering format muliggjør rask vurdering av den generelle fenotype og dens penetrans, og gjør det enkelt å flagge datakvalitet problemer, for eksempel tilstedeværelsen av rusk eller tap av fokalplanet. Overall, kombinasjonen av semi-høy gjennomstrømming datainnsamling metoden, beskjæring program og ImageJ visualisering verktøyet, kombinert med tilpassede reporter stammer, i stor grad forenkler større skala innsats for å studere embryoutvikling.

Figur 1. Oversikt over bilde metode med høy innhold, databehandlings prosedyre og viktige verktøy. (A) en sammenligning av funksjonene i standard agarose pad-basert metode for montering C. elegans embryo til semi-høy gjennomstrømming multi-brønn tenkelig tilnærming beskrevet her. (B) oversikt over halvhøy gjennomstrømming metode for overvåking embryoutvikling. Se tekst for detaljer. (C) oversikt over databehandling og visualiseringsverktøy, som kan brukes på data innhentet ved hjelp av en konvensjonell agarose pad-basert montering prosedyre eller semi-høy gjennomstrømming multi-brønn plate-basert metode som er beskrevet her. En enkelt 3 kanals tid forfalle embryo sekvens fra ett felt (til venstre) eller flere 3-kanals, 4-dimensjonale felt av embryo data (til høyre) kan behandles ved hjelp av tilpasset beskjæring programmet, som er kompatibel med data fanget på de fleste Imaging plattformer. Det grafisk bruker grenseflate (GUI) versjon av programmet er bruker vennlig og er ikke forlange alle programmerer ekspertise. Den screenCrop.py programmet krever Python kompetanse, men det har lagt til evner-nemlig at det kan beskjære i batch-format. Utdataene for dette trinnet er tett beskåret, fremre-bakre orientert embryo TIFF stabler. Hvis du vil visualisere alle data fra en enkelt betingelse, ble det bygd en ImageJ-makro som kompilerer beskjæres, roterte TIFF-stakker for å vise et brightfield bilde og maksimal intensitet projeksjon for hvert embryo på hver timepoint. (D)-panelet viser viktige verktøy som trengs for disseksjon og oppsett av bildeformat med halvhøy gjennomstrømming. Noen figur komponenter gjengis med tillatelse fra Wang et al.¹⁰. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2. Egendefinerte stammer generert for høy innholds avbildning av C. elegans embryogenesis. (A) skjematisk illustrerer transgenes som brukes til å konstruere bakterie lag (topp) og Morphogenesis (bunn) stammer. (B) maksimal intensitet projeksjon paneler viser utviklingsmessige tid-kurs i Morphogenesis (øverst) og bakterie lag (nederst) stammer. Ventrale visning vises, som illustrert i skjematisk (venstre). Tid er relativ til komma scenen (t = 0), som er lett identifiserbare i begge stammer. Scale bar = 10 μm. figur gjengitt med tillatelse fra Wang et al.¹⁰. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3. Tilpasset beskjæring programmet isolerer og orienterer individuelle embryo fra Imaging felt. (A) skjematisk illustrerer funksjonene til tilpassede embryo beskjæring programmet og fremhever de to alternativene for å få tilgang til dette programmet: et brukervennlig GUI-grensesnitt, som krever ingen programmering ekspertise og er tilgjengelig på Zenodo (venstre) og en batch beskjæring versjon av programmet, som krever Python erfaring og er tilgjengelig på GitHub (høyre). (B) grafisk oppsummerer den automatiserte beskjæring algoritmen-en binær maske er generert fra 8-bits brightfield bilder og individuelle embryo oppdages, beskjæres ut og orientert langs fremre-bakre aksen. Scale bar er 10 μm. (C) skjematisk detalj prosedyren brukes til å iteratively oppdage embryo i den binære masken. (D) skjematisk illustrerer metoden som brukes for orientere embryo langs den fremre bakre aksen. Paneler B-D gjengitt med tillatelse fra Wang et al.¹⁰. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4. Egendefinert ImageJ-makro muliggjør visualisering av RNAi screening av data ved å generere sammensatte filer for hver betingelse. (A) embryo for tre eksempel RNAi forhold fra 40-gen testsettet (se Wang et al.^10,11 for fullstendig datasett) vises (til høyre) som fremhever de distinkte signatur fenotyper som innhentes for hver tilstand og reproduserbarhet for fenotyper innenfor hver tilstand. Panel ble tilpasset med tillatelse fra Wang et al.¹⁰. (B) panel illustrerer hvordan egendefinerte ImageJ makro (OpenandCombine_embsV2. ijm) arrays embryo fra en gitt RNAi tilstand i en sammensatt ImageJ fil som arrays brightfield og maksimal intensitet anslag for hvert embryo på hver timepoint. Selv om bare ett eksempel er uthevet, kan denne makroen kompilere dataene for mange RNAi-betingelser samtidig. ImageJ-makro er tilgjengelig på Zenodo¹². Scale bar = 10 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Dette arbeidet beskriver en pakke med verktøy og metoder som ble utviklet for å muliggjøre større skala innsats for å Profile funksjonen av gener i embryoutvikling i C. elegans. Vår semi-høy gjennomstrømming metoden tillater 3D time-lapse Imaging av embryoutvikling på 20 min oppløsning for 80-100 embryo i et enkelt eksperiment. Selv om denne protokollen kan tilpasses for bruk med ønsket markør stamme (r), demonstrerer dette arbeidet potensialet i metoden ved hjelp av to tilpassede stammer utviklet for å overvåke hendelser under embryogenesis: (1) en bakterie-lags reporter stamme, der vev spesifikke arrangører drive uttrykk for fluorescerende histoner å markere endoderm, mesoderm og ektoderm kjerner, og (2) en morphogenesis reporter stamme, som bruker epidermal og neuronal arrangører til å drive uttrykk for fluorescerende markører i celle-kryss og plasma membranen. Ved å avbilde de to stammene, kan konsekvensene av molekylær forstyrrelser på celle skjebne spesifikasjon og Morfogenetiske hendelser bli fanget med bemerkelsesverdig detalj. For å møte de utfordringene som presenteres av mengden av data som genereres av denne metoden, ble tilpasset verktøy utviklet for det formål å effektivisere databehandling og visualisering. Det første verktøyet avlinger individuelle embryo ut av et felt av embryo i 3D time-lapse sekvenser samtidig rotere embryo til en standard fremre-bakre orientering og utføre bakgrunn subtraksjon, drift korreksjon, og demping korreksjon. Dette programmet ble pakket som en brukervennlig GUI (https://zenodo.org/Record/3235681#.XPAnn4hKg2w) og kildekoden og en mer avansert gruppering versjon av programmet for Python savvy brukere (GitHub.com/renatkh/embryo_crop.git) er gitt^10,12,13. Til slutt, for å visualisere disse behandlede dataene i et meningsfylt format, ble det utarbeidet en ImageJ-makro. Dette gjør det mulig for brukeren å visualisere alle embryo fra en gitt RNAi tilstand i en multipaneled film, som viser en brightfield og maksimal intensitet projeksjon for hvert embryo på hver timepoint. Sammen stammer, protokoll og databehandling verktøy, gjør arbeidet med å studere C. elegans embryogenesis i større skala en mer gjennomførbart bestrebelser.

Mens grei å implementere på det hele, den semi-High-gjennomstrømming oppkjøpet metoden beskrevet her krever oppmerksomhet til noen viktige detaljer, som er omtalt nedenfor. Først må brukerne ha tilgang til et konfokalmikroskopi mikroskop med presisjon punkt-besøk kapasitet som kan utstyres med en multi-brønn plate holderen. Det mest kritiske hensynet til denne protokollen er at mikroskopet opprettholdes i et temperatur kontrollert rom. Mens mange mikroskop har kapasitet til å varme, de fleste kan ikke pålitelig kjølig, og dermed miljø temperaturen må tilpasses for å opprettholde en konstant C. elegans vennlig temperatur. For å oppnå dette holdes bilde rommet ved 16 ° c. Prøveområdet på instrumentet varmes opp til 21-23 ° c under bildebehandling. Svingninger i romtemperatur kan påvirke utviklingsmessige timing og subtilt endre fokalplanet nøyaktighet under punkt på besøk og bør unngås så mye som mulig. Merk at løping ved temperaturer over 23 ° c kan resultere i en betydelig økning i embryonale dødelighet for kontroll forhold og er ikke tilrådelig. En annen viktig vurdering er embryo utvelgelse og spredning under disseksjon. Forsiktighet bør utvises for å unngå å overføre eldre embryo inn i bilde brønner, siden, etter klekking dyr har en tendens til å swish tilstøtende embryo ut av visningen; forekomsten av dette er redusert ved inkludering av bedøvelse i Media. Spredningen av embryo, for å unngå store klumper av embryo, er også en kritisk variabel. Klumper tendens til å oppstå når embryo overføres til brønnene i kapillær pipets som er for tynt trukket ut, eller når embryo ikke er tilstrekkelig spredt under disseksjon. En annen vurdering er at punkt valg og fokalplanet tuning tar tid. Platen er ikke holdt på isen under denne prosessen, slik at embryo begynne å utvikle umiddelbart. For den egendefinerte markør stammer som brukes i denne studien, er det om en 90 min vinduet etter at platen er fjernet fra isen for å oppnå plate skanning og punkt valg før markører begynner å bli uttrykt. Dette er tilstrekkelig tid for å sette opp på instrumentet vårt med disse stammene, men andre mikroskop og belastninger kan gi ekstra tid utfordringer som vil kreve feilsøking. Til slutt, metoden vi beskriver sysselsetter en 60x olje mål å samle z-stabler av 50 felt på 20 min tidsintervaller. Som vi markere, kan den timelige oppløsningen økes ved å redusere antall felt avbildet. For eksempel kan 10 felt bli avbildet ved 4 min tid oppløsning. Et annet alternativ for å øke den timelige oppløsningen er å bruke en lavere forstørrelse, objektiv med høy numerisk blenderåpning; i dette tilfellet tillater det større synsfeltet Imaging av et stort antall embryo ved høyere tidsoppløsning med bare en moderat reduksjon i romlig oppløsning.

For å muliggjøre databehandling og visualisering i større skala, bygde vi tilpassede verktøy og gjorde dem fritt tilgjengelige. Det mest omfattende nyttig verktøy er tilpasset beskjæring GUI, som krever ingen programmering kompetanse til å operere. GUI kan brukes til å beskjære ut og orientere embryo på alle stadier av utvikling og er kompatibel med alle markører, noe som gjør det nyttig ikke bare for utviklingsmessige biologer, men også for forskere som studerer prosesser i tidlig embryo. Fordi produksjonen av GUI er nøyaktig beskåret, orientert, skalert, drift-korrigert data, kan dataene være lett funneled til en automatisert analyse rørledning, noe som gjør dette verktøyet nyttig for analyse av tidligere og fremtidige data; Hvis hensiktsmessig stammer brukes, kan resulterende datafiler brukes som input for eksisterende automatiserte analyse regimer, for eksempel embryogenesis justering verktøy²⁵. For å kunne bruke programmet, er det viktig for brukerne å være klar over at beskjæring algoritmen krever en brightfield eller DIC bildet som skal samles for hvert trinn og timepoint. I tillegg bør brukerne merke til at den fremre bakre orientering algoritmen er strukturert basert på fordelingen av det røde signalet i bakterie-lags reporter og morphogenesis rapporten stammer, vist i dette arbeidet. Dermed nøyaktigheten av AP orientering i andre markør stammer må evalueres på et sak-til sak basis. GUI har blitt testet med data samlet inn på tre forskjellige konfokalmikroskopi tenkelig plattformer og er kompatibel over hele linja for multi-TIFF stabler og TIFF-serien. Foruten det bruker-vennlig versjon, kilden koden for det GUI og en bakst versjon av denne program har likeledes blitt fremstilt anvendelig, med det advarsel det programmerer erfaring er krevde, og arkiv strukturer og navn konvensjoner ville nød å bli føle etter. Til slutt, en ImageJ behandling makroen ble bygget for å ta rå bilde stabler for alle embryo, i hver RNAi tilstand, og kompilere en informativ matrise for å vise alle embryo for den tilstanden i brightfield og fluorescens maksimal intensitet projeksjon på hvert tidspunkt. Dette verktøyet kan tilpasses brukerens spesifikasjoner og er en nyttig makro for å gjøre data leting og kvalitetskontroll vurdering enklere.

Sammen, den semi-høy gjennomstrømming filming metoden sammen med embryo beskjæring og bildebehandling verktøy beskrevet her vil forenkle analyse av C. elegans embryoutvikling ved hjelp av en rekke mutanter, forstyrrelser, og markør stammer. I vår egen Lab, en stor skala skjerm ansette disse metodene for å filme embryo fra de to skreddersydde stammene beskrevet her etter knockdown av ~ 2 000 gener som kreves for utbygging, er for tiden i gang. Til slutt, vil dataene fra dette arbeidet tjene som en ytterligere ressurs for å forbedre arbeidet med å forstå celle skjebne spesifikasjon og Morfogenetiske hendelser under embryogenesis.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aspirator Tube Assembly	Drummond Scientific	2-000-000
Calibrated Pipette (25 mL)	Drummond Scientific	2-000-025
Cell Voyager Software	Yokogawa Electric Corp	Included with CV1000
Conical Tube (15 mL)	USA Scientific	1475-0501
CV1000 Microscope	Yokogawa Electric Corp	CV1000
Depression slide (3-well)	Erie Scientific	1520-006
Dissection Microscope	Nikon	SMZ-645
Eppendorf Centrifuge 5810R	Eppendorf	5811 07336
ImageJ/FIJI	Open Source	https://imagej.net/Fiji
M9 Buffer	Lab Prepared	https://openwetware.org/wiki/M9_salts
Microcentrifuge Tube (1.5 mL)	USA Scientific	1615-5500
Microseal F-foil Seal	Bio-Rad	MSF1001
NGM Plates	Lab Prepared	http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html#d0e214
Scalpel #15	Bard Parker	REF 371615
Sensoplate Plus, 384 Well, F-bottom, Glass Bottom	Greiner Bio-One	781855
Tetramisole Hydrochloride	Sigma Aldirch	T1512-10G
Tweezers, Dumont #3	Electron Microscopy Sciences	0109-3-PO
U-PlanApo objective (10× 0.4 NA)	Olympus	1-U2B823
U-PlanApo objective (60× 1.35 NA)	Olympus	1-U2B832