Um método de imagem semi-alta-fonte e um kit de ferramentas de visualização de dados para analisar o desenvolvimento embrionário de C. elegans

Summary

Este trabalho descreve um protocolo semi-alta de supressão que permite imagens simultâneas de lapso de tempo 3D de embriaênese embrionária em embriões de 80-100 C. elegans em uma única corrida noturna. Além disso, as ferramentas de processamento e visualização de imagens são incluídas para simplificar a análise de dados. A combinação destes métodos com tensões personalizadas do repórter permite a monitoração detalhada do embryogenesis.

Abstract

C. elegans é o principal sistema para a análise sistemática da especificação do destino celular e eventos morfogenéticos durante o desenvolvimento embrionário. Um desafio é que a embriogênese se desdobra dinamicamente durante um período de cerca de 13 h; este prazo de meio dia restringiu o âmbito das experiências, limitando o número de embriões que podem ser imageados. Aqui, descrevemos um protocolo de meia-alta de supressão que permite a imagem simultânea de lapso de tempo 3D de desenvolvimento em 80-100 embriões em resolução de tempo moderado, de até 14 condições diferentes, em uma única corrida noturna. O protocolo é simples e pode ser implementado por qualquer laboratório com acesso a um microscópio com capacidade de visita de ponto. A utilidade deste protocolo é demonstrada usando-o para imagem duas cepas personalizadas expressando marcadores fluorescentes otimizados para visualizar aspectos-chave da especificação da camada germinativa e morgênese. Para analisar os dados, um programa personalizado que cultiva embriões individuais fora de um campo de visão mais amplo em todos os canais, z-passos e pontos de tempo e salva as seqüências para cada embrião em uma pilha de tiff separada foi construído. O programa, que inclui uma interface gráfica de usuário (GUI) amigável, simplifica o processamento de dados isolando, pré-processamento e orientando uniformemente embriões individuais em preparação para visualização ou análise automatizada. Também é fornecido uma macro ImageJ que compila dados de embriões individuais em um arquivo multi-painel que exibe projeção de fluorescência de intensidade máxima e imagens de campo brilhante para cada embrião em cada ponto de tempo. Os protocolos e ferramentas aqui descritos foram validados usando-os para caracterizar o desenvolvimento embrionário após a queda de 40 genes de desenvolvimento previamente descritos; esta análise visualizou fenótipos de desenvolvimento previamente anotados e revelou novos. Em resumo, este trabalho detalha um método de imagem semi-alta-desperação juntamente com um programa de corte e ferramenta de visualização ImageJ que, quando combinado com cepas expressando marcadores fluorescentes informativos, acelera muito os experimentos para analisar desenvolvimento embrionário.

Introduction

O embrião C. elegans é um importante sistema modelo para biologia celular mecanicista e análise da especificação do destino celular e eventos morfogenéticos que impulsionam o desenvolvimento embrionário^{1,2,3,4 ,5,6,7,8,9}. Até o momento, grande parte da caracterização de eventos de nível celular e especificação do destino celular no embrião foi alcançada usando experimentos de imagem de resolução de imagem de resolução única (ou seja, aquisição a cada 10 a 100 s) de embriões expressando marcadores fluorescentes. Embora bem adequado para eventos na ordem de segundos a dezenas de minutos, essa abordagem torna-se tecnicamente limitante para a caracterização de processos mais longos, na ordem de horas a dias. O desenvolvimento embrionário desde a primeira clivagem até o fim do alongamento leva cerca de 10 h. Nesta escala de tempo, semi-alta-geração de métodos que permitiriam simultaneamente menor resolução de tempo de imagem (ou seja, aquisição em intervalos de tempo de 5-20 minutos) de coortes maiores de embriões, de diferentes condições, abriria uma nova gama de experimentos; por exemplo, permitindo esforços sistemáticos de triagem em larga escala e a análise de um número suficiente de embriões para comparações das consequências das perturbações moleculares.

Aqui, descrevemos um método de semi-alta-alta-entrada para monitorar c. elegans embrigenesis que permite a imagem de desenvolvimento simultânea de lapso de tempo 3D em 80-100 embriões, de até 14 condições diferentes, em uma única corrida noturna. O protocolo é simples de implementar e pode ser realizado por qualquer laboratório com acesso a um microscópio com capacidades de visita de ponto. Os principais passos deste protocolo são descritos na Figura 1. Em suma, os embriões são dissecados de adultos gravid expressando marcadores fluorescentes de interesse e transferir embriões jovens (estágio de 2-8 células) para poços de uma placa de 384 poços para imagem. Neste formato, o tamanho relativamente pequeno do poço canaliza embriões em uma área estreita, que facilite a identificação dos campos que contêm embriões múltiplos para a imagem latente do time-lapse. Para manter o desenvolvimento aproximadamente síncrono em toda a coorte de embriões, dissecções são realizadas em meios de comunicação refrigerados e a placa é mantida no gelo, o que impede o desenvolvimento significativo durante a janela de tempo de dissecação de uma hora de duração. A placa é transferida para o microscópio e embriões são filmados em uma sala com temperatura controlada durante a noite, em intervalos de tempo de 20 minutos, usando uma imersão de óleo 60x 1,35 NA lente, para coletar a gama z completa em 2 passos μm. Cinquenta campos, cada um contendo entre 1-5 embriões, são imagemdos em uma única corrida durante a noite. Dependendo do experimento desejado, a resolução de tempo pode ser aumentada (por exemplo, imagens em intervalos de 5 a 10 minutos) diminuindo proporcionalmente o número de campos de imagem.

Com este protocolo, mesmo uma única corrida noturna gera uma quantidade significativa de dados (80-100 embriões espalhados por 50 campos) e experimentos maiores podem rapidamente se tornar incontroláveis no que diz respeito à análise de dados. Para facilitar o processamento, visualização e racionalização da análise desses dados, um programa foi construído para cortar e orientar embriões e realizar etapas de pré-processamento (opcional) e uma macro ImageJ que compila os dados para simplificar a visualização. Esses programas podem ser usados para processar imagens coletadas usando abordagens convencionais, pois são independentes do método de imagem, exigindo apenas um único plano de campo brilhante. O primeiro programa leva em um campo 4D contendo vários embriões (opção GUI ou código-fonte embryoCrop.py) ou múltiplos campos 4D contendo vários embriões (screenCrop.py), planta embriões firmemente e os orienta em uma configuração anterior-posterior. Esses programas também dão aos usuários a opção de realizar subtração em segundo plano, correção de deriva e correção de atenuação. Os arquivos resultantes são uniformemente pré-processados, pilhas de tiff bem cortadas para cada embrião que são alteráveis à análise de imagem automatizada. Para tornar mais simples ver todos os embriões para cada condição, foi escrita uma macro ImageJ (OpenandCombine_embsV2.ijm), que reúne todos os embriões de uma determinada condição para uma única pilha de tiff e matrizes de imagens de campo brilhante e cor de projeção de intensidade máxima ( RGB) sobrecoloca, lado a lado, para cada embrião. Os métodos foram validados usando-os para caracterizar o desenvolvimento embrionário após a queda de 40 genes de desenvolvimento previamente descritos em um par de cepas personalizadas expressando marcadores fluorescentes otimizados para visualizar aspectos-chave da camada germinal especificação e morgênese^10,11. Juntos, o protocolo de imagem embrionário semi-alta e as ferramentas de processamento de imagem permitirão experimentos de maior número amostral e esforços de triagem em larga escala destinados a entender os processos de desenvolvimento. Além disso, essas cepas também fornecerão um meio eficiente para examinar os efeitos das perturbações moleculares na embriogênese.

Protocol

1. Preparando c. elegans embriões para imagens semi-alta-throughput

Nota: O objetivo desta parcela do protocolo é carregar uma população de embriões c. elegans semisincronizados (estágio de 2 a 8 células), dissecados de cepas de marcadores adequadas (Figura 2),em uma placa de 384 poços com fundo de vidro para imagem. Outros formatos de placa também podem funcionar, mas as 384 placas de poço são preferidas porque o pequeno tamanho do poço restringe a propagação de embriões a uma área relativamente pequena, o que facilita a identificação de campos contendo vários embriões para imagens de lapso de tempo. Sincronizar aproximadamente os embriões garante que o curso completo de desenvolvimento seja capturado para cada um dos embriões em um campo.

1. Prepare 5-10 mL de 0,1 mg/mL solução de cloridrato de tetramisole (TMHC) anestésico dissolvido em gelo frio M9 médio (0,45 M Na₂HPO_4º7H₂O, 0,11 M KH₂PO₄, 0,04 M NaCl, 0,09 NH M_{4 Cl)}para usar durante dissecação e imagem. Esta mídia inclui um anestésico para garantir que a larva eclodida em movimento não interrompa a imagem de embriões em estágios de desenvolvimento anteriores.
   Nota: Se usar as ferramentas de cultivo e visualização para analisar os dados adquiridos usando métodos padrão de montagem de almofadas de agarose, pule para a seção 3 abaixo.
2. Aliquot 70 μL da solução preparada em poços individuais de uma placa de 384 poços com fundo de vidro com um poço para cada condição; evitar as duas linhas externas da placa para evitar efeitos de borda.
   Nota: É útil mascarar poços circundantes usando folha de placa PCR adesiva (veja exemplo na Figura 1D)isso preserva poços adjacentes para experimentos futuros e facilita a localização de poços apropriados o microscópio de dissecção. Uma vez que a solução é alicitada, mantenha a placa e a solução restante no gelo durante todo a dissecação.
3. Gerar tubos bucais para a transferência de embriões do slide dedepressão (onde os hermafroditas gravidas são dissecados) para os poços. Puxe pipetas capilares (25 μL tubos calibrados) sobre uma chama e quebrar para gerar uma extremidade cílado fina(Figura 1D). Um pipet é necessário por condição para evitar a contaminação cruzada; descartar pipet após o uso.
4. Use pinças finas para transferir ~ 10 adultos gravidas um escopo de dissecação em 150 μL da solução TMHC gelada alicitada em um slide de depressão para cada condição. Usando a pinça e um bisturi, dissecar os vermes para liberar os embriões.
5. Carregue um pipet capilar puxado no acessório do aspirador incluído com os pipets, e o pipet da boca para transferir todos os embriões do 2-8-pilha-estágio em um poço individual da placa preparada(figura 1D). Evite transferir embriões em estágio avançado e detritos de dissecação. Examine um escopo de dissecação e se os agregados dos embriões estão presentes, boca pipet para cima e para baixo ou torneira grupos de embriões com ponta pipet para dispersar.
   Nota: Para evitar a contaminação cruzada, equipamentode dissecação limpa e usar um tubo de boca fresca, enquanto se deslocam entre as condições. Placa da loja no gelo entre dissecções.
6. Uma vez que os sem-fins de todas as circunstâncias foram dissecados e os embriões coloc em seu poço apropriado, gire a placa de 384 poços para 1 min em 600 x g para estabelecer os embriões.
7. Limpe o fundo da placa com uma limpeza embebido em etanol para remover qualquer resíduo e coloque a placa em um microscópio confocal equipado com um suporte de placa em um ambiente de temperatura controlada.
   Nota: As etapas que seguem detalham este método usando a configuração do laboratório; por favor, modifique as condições de aquisição para atender às necessidades e equipamentos experimentais. Aqui, uma caixa de scanner confocal equipada com um disco de fiação Nipkow duplo aprimorado por microlente, uma câmera EM-CCD 512 x 512, um auto-XY-Stage de alta precisão (resolução designada 0,1 μm) e controle motorizado de eixo z (resolução designada 0,1 μm). Este sistema é mantido em uma sala de 16 °C, que mantém a temperatura do microscópio entre 21 e 23 °C durante a imagem durante a noite.
8. Para identificar campos com embriões adequados, realize uma pré-digitalização de cada poço usando um objetivo de 10x 0,4 NA e software de imagem adequado. Os campos mais ideais conterão mais de um embrião em estágio inicial que está no mesmo plano focal que outros embriões e, idealmente, terá contato mínimo entre embriões adjacentes. Marque posições de regiões adequadas.
9. Para selecionar campos de imagem, mude para o objetivo 60x e ajuste o plano focal em cada ponto de visita para seção adequada dos embriões. 1-4 campos por poço são imagemdos, para um total de 50 campos em 14 poços, e cada campo pode conter entre um e cinco embriões. No geral, 4 a 15 embriões são selecionados de cada condição para imagens de alta resolução.
   Nota: Uma variável-chave nesta etapa é o uso de petróleo suficiente; coloque o petróleo no objetivo, visitando pontos em cada poço para espalhar o óleo ao redor da superfície de todos os poços e, em seguida, aplicar uma gota adicional de óleo para o objetivo antes da seleção de campos.
10. Imagem dos campos selecionados usando um objetivo de 60x 1.35 NA para adquirir 18 seções z em intervalos de 2 μm a cada 20 min por 10 h. As condições de imagem usando as cepas de repórter de camada germinal e morgênese são as seguintes: brightfield, 90% de potência, 25 ms, 20% de ganho; 488 nm, 100% de potência, 200 ms, 60% ganho; 568 nm, 45% de potência, 150 ms, 60% de ganho.
11. Depois que a imagem latente está completa, avalie a letalidade embrionária executando uma baixa ampliação (objetivo de 10x 0.4 NA) varredura well well well brightfield ~20-24 h que segue o começo da imagem latente de noite.

2. Letalidade embrionária Pontuação

1. Usando os campos digitalizados de 10x pós-corrida, avalie a letalidade embrionária e defeitos larvais contando vermes eclodinhados e embriões não eclodidos para cada poço.
2. Pontuar embriões não chocados como letal embrionário. Excluir embriões presos de um a quatro estágios da contagem de letalidade, uma vez que os embriões dissecados jovens às vezes não conseguem completar a formação de casca de ovo (se a meiose II ainda não estiver completa) e os defeitos de permeabilidade podem levar a complicações osmóticas durante os dois primeiros Divisões.
3. Pontuação parcialmente chocado ou totalmente chocado vermes com morfologia do corpo ou defeitos comportamentais, tais como dumpy ou paralisado, como "larva anormal".

3. Corte automatizado (Figura 3A)

Nota: O software está alojado em dois locais: (1) Zenodo abriga uma versão amigável do software¹² que não requer qualquer experiência de programação. (2) O Github contém o código-fonte para o nosso software embryoCropUI.py e screenCrop.py^13,que requer proficiência com python. Instruções detalhadas para baixar e operar ambas as versões do programa podem ser encontradas abaixo.

1. Corte automatizado usando versão executável embryoCropUI (versão amigável)
   1. Para usar o programa embryoCropUI, primeiro baixe o programa de Zenodo(https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w)¹².
      1. Baixe a versão do formato MacOS ou Windows do programa (note que a versão MacOS requer MacOS X10.11 ou superior).
      2. Baixe o arquivo de instruções(GUI_Instructions_zenodo_repoV2.docx),que fornece instrução passo a passo para testar e usar o programa embryoCropUI.
      3. Baixe o test_files.zip para testar se o programa está funcionando corretamente na plataforma (ver instruções).
   2. Uma vez baixado, descompactar e navegar para encontrar o embriãoCropUI executável (...\embryoCropUI\_WINDOWS\embryoCropUI\embryoCropUI.exe) ou (...\embryoCropUI\_MacOS\embryoCropUI\embryoCropUI.exe). Clique duas vezes para lançar (ou escolheu o terminal "aberto com" e execute o embryoCropUI executável.
   3. O GUI executável culturas um campo de visão 4D de cada vez. No canto superior esquerdo, selecione o botão aberto para carregar o campo específico para cortar (multi-tiff). Se cortar uma série de tiff, com múltiplas dimensões (ou seja, z, tempo, canal), carregar apenas a primeira imagem da série dentro da pasta (uma série tiff por pasta).
   4. Uma vez que as imagens foram carregadas, especifique as seguintes informações: número de z-fatias, (Z), número de pontos de tempo (T), número de canais (C), o canal que corresponde a DIC ou brightfield (first=1, second=2, etc.).
   5. Selecione processamento adicional para ser executado nas imagens. O programa oferece correção de drift, subtração de fundo e correção de atenuação.
   6. Especifique parâmetros para a correção de subtração e atenuação em segundo plano para orientar os esforços de processamento na solicitação de GUI. Para a Subtrain de fundo, defina o maior tamanho de recurso para refletir o tamanho do sinal significativo; este tamanho da característica não deve ser considerado como fundo e deve ser um valor de número ímpar. Entrada de um valor de 0-1 para correção de atenuação. O valor da Correção de Atenuação reflete a porcentagem da intensidade original que permanece na profundidade mais distante do objeto que está sendo imagem.
      Nota: A correção de subtração e atenuação em segundo plano deve ser executada em conjunto.
   7. Especifique a ordem de coleta de imagens (ou seja, canal-z-time (czt) ou z-channel-time (zct)).
   8. Especifique os mícrons por pixel para as imagens com base na câmera que está sendo usada.
      Nota: O corte de imagem ruim ocorrerá se o tamanho do pixel não for devidamente definido.
   9. Selecione Correr no canto inferior esquerdo. Uma nova subpasta rotulada de "cultura" será criada no mesmo caminho que a pasta não cortada; versões cortadas serão salvas neste local. Dependendo do tamanho do arquivo, a corte deve ser concluída em segundos a minutos.
2. Corte automatizado usando screenCrop.py (alternativa de versão em lote para embryoCrop GUI descrita acima;Usuários experientes python apenas)^10,13
   1. Para usar screenCrop.py, a versão de software Python para o corte de conjuntos de dados maiores em um formato de lote, clone ou baixar o código fonte do Github (github.com/renatkh/embryo_crop.git).
   2. Leia as instruções para configurar um ambiente virtual adequado e siga o sistema de nomeação de arquivos descrito; ambos são detalhados no arquivo README no repositório Github: https://github.com/renatkh/embryo_crop/blob/master/README.md.
   3. Uma vez que as variáveis ambientais e as convenções nomeando foram estabelecidas corretamente, parameters.py abertas e screenCrop.py em um editor da escolha.
   4. Para modificar parâmetros ajustáveis sem tocar no código fonte, edite o arquivo parameters.py.
      NOTA: também é possível alterar diretamente os parâmetros dentro do cabeçalho de screenCrop.py.
      1. Se usar o arquivo de configuração parameters.py, altere a configuração use_configure para True. Se usar a edição direta dentro de screenCrop.py, deixe a configuração use_configure no False.
      2. Localizar as seguintes informações dentro do arquivo parameters.py e fazer modificações para atender parâmetros de imagem desejados e estrutura de arquivos:
         1. loadFolder (linha 9): Alteração na unidade em que os arquivos são armazenados (por exemplo, Z:/, D://, etc.)
         2. data (linha 7): Alterar para a pasta contendo arquivos para a sessão de imagem. Isto é referido como "Nome da pasta de experimento" no arquivo de rastreamento CSV (ver instruções).
         3. trackingFile (linha 11): Alterar o caminho para o arquivo CSV em que as informações do experimento são armazenadas.
         4. z (linha 13): Definido como o número de aviões z.
         5. nT (line14): Definido como o número de pontos de tempo.
         6. nWells (linha 19): Definido como o número de poços utilizados.
         7. pointVisits (linha 20): Definido como o número máximo de visitas ponto (por poço).
         8. Na linha 10 encontrar o local atualmente ocupado por 'CV1000/' e entrada da pasta externa utilizada no caminho do arquivo. Para evitar problemas, use a seguinte convenção: 'XXXXXXX/'.
         9. Na Linha 12, insere um caminho válido de arquivo para armazenar dados de relação de aspecto para dados cortados.
         10. Nas linhas 15, 16, 17 e 18 entradas Verdadeiras/Falsas para saber se as imagens passam pelo seguinte processamento:
             1. Entrada verdadeira ou falsa para correção de deriva na Linha 15.
             2. Entrada verdadeira ou falsa para subtrair fundo na linha 16. O tamanho do recurso deve ser empiricamente determinado para diferentes cepas de marcadores e tamanhos de pixels. Na configuração aqui, o tamanho da característica foi definido como 41 para a tensão da Germ-Camada e 201 para a tensão do Morphogenesis. Subtrair de fundo deve ser feito em conjunto com a correção de atenuação.
             3. Entrada verdadeira ou falsa para correção de atenuação na Linha 17.
             4. Entrada verdadeira ou falsa para rotação posterior anterior na Linha 18.
   5. Uma vez que todas as mudanças foram feitas, a recorte pode começar. Para fazer isso, mude para screenCrop.py e selecione o ícone de jogo na barra de ferramentas, no menu suspenso selecione Run As > Python Run.
   6. Como o corte pode levar várias horas para ser concluído para um grande conjunto de dados (50 pontos visita 18 z passos, 3 canais, 31 pontos de tempo), acompanhar o progresso do corte na janela do console. Uma vez que o corte é concluído, uma pequena janela irá mostrar previews das imagens cortadas antes de salvar. Para cada imagem existem 3 opções:
      1. Salvar: Press Space Bar para salvar a imagem se a imagem é cortada corretamente, sem áreas de interesse a ser cortado.
      2. X: X: X: X: Pressione X se a imagem parece ter áreas de interesse cortadas; a imagem será salva com um X na frente do nome para separá-lo das outras imagens.
      3. Excluir: Pressione D para excluir a imagem cortada se a imagem não for cortada corretamente ou o embrião não for satisfatório.
         NOTA: As imagens serão salvas para uma subpasta chamada "Cortada" na Pasta de Carga (definida na Linha 9 do programa).

4. Visualização (Figura 4)

NOTA: OpenandCombine_embsV2.ijm^10,12 é uma macro ImageJ que irá construir um arquivo de tiff fácil de ver de todas as imagens para uma estirpe e condição específicas. Instalação de FIJI / ImageJ^14,15 é necessário. Esta macro é executado de acordo com a nossa estrutura de arquivo; ele terá de ser modificado para trabalhar com outras estruturas de arquivo. Um guia para a estrutura de arquivo adequada e descrição detalhada de considerações importantes podem ser encontrados no final do arquivo GUI_Instructions_zenodo_repoV2.docx no repositório Zenodo. Por favor, leia essas instruções completamente antes de imagem para nomear corretamente e estruturar arquivos para interagir melhor com esta macro. Para referência, nossa estrutura de localização de arquivos se parece com esta:
Z:\cropped\Target\Strain\Emb#\Target_Emb#_15 Digit Unique Identifier _W##F#_T##_Z##_C#.tif
i.e. Z:\cropped\EMBD0001\GLS\Emb1\EMBD0001_Emb1_20140327T135219_W02F1_T01_C1.tif

1. Baixe OpenandCombine_embsV2 e GUI_Instructions_zenodo_repoV2.docx da Zenodo (https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w).
2. Prepare as seguintes informações:
   -O local onde as pastas de imagem são armazenadas (após o corte).
   -O nome da pasta de imagem (s) para a condição específica (s) a ser processado (ou seja, EMBD0002). Isto é referido como "Alvo" no exemplo acima
   -Um identificador exclusivo alfa-numérico de 15 dígitos que é específico para um determinado experimento durante a noite - este identificador é o nome da pasta de aquisição de dados (ou seja, 20140402T140154) e o identificador exclusivo está incorporado no nome de arquivo tiff individual (EMBD0002_Emb1_ 20140402T140154_W06F2_T01_Z01_C1) para cada embrião imageado naquele dia. A macro usa esse identificador para verificar se há embriões adquiridos na mesma data e pode montar condições repetidas, com datas separadas, em arquivos separados do ImageJ.
3. Open ImageJ, e arrastar-e-soltar o arquivo macro, OpenandCombine_embsV2.ijm, para a barra ImageJ, ou abrir a macro diretamente.
4. Uma vez que o macro está aberto, localizar as linhas 3 e 4. Entrada as informações recolhidas em (seção 4.2) de acordo com as seguintes etapas:
   1. Na Linha 3 (RNAL), insere o nome alvo para que as imagens sejam processadas. Entrada de cada alvo na estrutura a seguir newArray ("XXXXXXXX/"); incluir citações. Para executar várias condições ao mesmo tempo, separe com uma ma e mantenha todos os nomes-alvo dentro do parêntese (ou seja, newArray ("EMBD0000/", "EMBD0001/","EMBD0002 /"
   2. Na Linha 4 (data), insume o identificador exclusivo alfa-numérico de 15 dígitos em citações, por exemplo newArray ("20140402T140154").
5. Press Run na parte inferior esquerda da janela macro. Uma janela aparecerá, que lançará um alerta para navegar até a pasta externa contendo as pastas de imagem cortadas (especificadas em 4.4.1).
6. Uma vez selecionada, outra janela aparecerá, o que permitirá especificação de parâmetros de imagem.
   1. Digite o número de canais, o número de fatias Z, o tamanho da fonte para o texto usado na rotulagem das imagens compiladas, e a cor para cada um dos canais.
   2. Verifique o auto/off contrastando em todos os canais.
7. Uma vez que todos os parâmetros foram especificados, clique OK na parte inferior da janela. O arquivo composto começará a montar; isso levará vários minutos, por condição, para ser concluído.
8. Uma vez concluídos, revise os arquivos que são deixados em aberto, se desejar. Eles podem ser fechados sem salvar, como o macro já salvou os arquivos para uma pasta recém-criada, que é nomeado da seguinte maneira: nome da pasta exterior (especificado no prompt da seção 4.5) + "-fiji-processado-saída" (ou seja, Z:\ cropped-fiji-processado-saída\EMBD0002_GLS_20140402T140154.tif).

Representative Results

Um desafio significativo em caracterizar o efeito de perturbações moleculares no desenvolvimento embrionário de C. elegans é que toma aproximadamente 10 h para que os embriões progridam da primeira clivagem ao fim do alongamento em 20°^16. Um método de meia-alta-entrada em que grandes coortes de embriões podem ser simultaneamente imagem é útil para eventos nesta escala de tempo, pois permite imagens de múltiplas condições em paralelo com um tamanho de conjunto suficiente para cada condição para permitir análise quantitativa (Figura 1A).

Método de imagem de geração de massa semi-alta e cepas multimarcadores
O método de imagem semi-alta-alta-throughput descrito aqui (descrito na figura 1B),emprega uma placa inferior de vidro de 384 poços; o formato multi-poço permite que até 14 condições sejam dispostas em paralelo e o pequeno tamanho dos poços restringe a área de pesquisa, simplificando a identificação de campos contendo embriões para imagens de alta resolução. Aqui, uma caixa de scanner confocal foi usada, equipada com um disco de fiação Nipkow duplo aprimorado por microlente, uma câmera EM-CCD 512 x 512, um auto-XY-Stage de alta precisão (resolução designada 0,1 μm) e controle motorizado do eixo z (resolução designada 0,1 μm). No entanto, o protocolo pode ser adaptado para qualquer microscópio confocal com capacidades de visita de ponto de precisão e um adaptador de palco que pode acomodar uma placa multi-poço. Um desafio significativo no desenvolvimento deste método foi a elaboração de um meio de gerar uma placa de embriões na mesma fase de desenvolvimento para que a totalidade do desenvolvimento possa ser capturada para todos os embriões em cada campo. Este é um desafio porque os embriões dispostos na placa de imagem primeiro continuará a desenvolver enquanto amostras posteriores são dissecadas, resultando em um gradiente de encenação através dos poços. Para contornar esta questão, embriões em estágio inicial (estágio 2-8) são selecionados e manter a mídia dissecação e placa de imagem no gelo; esta paralisa embriõesgênese para os embriões dissecados até que todas as condições tenham sido dispostas sem impactar significativamente a viabilidade embrionária¹⁰. Para limitar o tempo em que os embriões se sentam no gelo a 1 hora, dois pesquisadores realizam as dissecções simultaneamente, o que permite a configuração de 14 condições diferentes em cerca de 50 min. Após a dissecação, a placa é girada em 600 x g para 1 min para sedimentar os embriões e poços são pré-digitalizados em baixa ampliação para localizar campos com grupos de embriões adequados para imagens de alta ampliação; os locais de visita ao ponto estão marcados. Embriões são filmados em uma sala de temperatura controlada durante a noite usando uma imersão de óleo 60x 1,35 NA lente. As amostras são configuradas em uma região de 4 poços por 4 poços para que a área de superfície da placa que é usada em um experimento seja comparável a um coverslip padrão de 22 x 22 mm^2, o que permite o uso de um objetivo de óleo de 60x. A disseminação uniforme de petróleo em toda a região antes do início da imagem é fundamental para a aquisição bem-sucedida de imagens de longo prazo. Os embriões em desenvolvimento são imagemdos em uma solução que contém anestésico; isso garante que quando os embriões mais velhos dentro do poço eclodem, seu movimento não interrompa a posição dos embriões mais jovens adjacentes que estão sendo imagemdos. Devido à natureza impenetrável da casca de ovo, o anestésico não afeta o movimento antes da eclosão. Nestas condições, os dados de lapso de tempo 3D são coletados em 3 canais para um total de 80-100 embriões em um único experimento noturno (discutido mais abaixo).

C. elegans desenvolvimento embrionário ocorre em duas fases. Primeiro, 10 rodadas de divisão celular acoplado à especificação do destino celular gerar as três camadas germinativas (ectoderm, mesoderme e endoderme) durante um período de 6 horas¹⁷. Nos seguintes 7 h, os eventos morfogenéticos impulsionam a formação de tecidos diferenciados^8,16. Para capturar esses dois aspectos do desenvolvimento, construímos um par de cepas personalizadas, a Camada Germe e as cepas de Morogênese¹⁰ (Figura 2A), e usamos o protocolo de semi-alta taxa de entrada para imagem embriões de ambas as cepas. A cepa Germ Layer expressa proteínas fluorescentes codificadas por transgenes que marcam núcleos no ectoderm, mesoderme e endoderme em vermelho, amarelo e verde. Esta estirpe contém três transgenes repórter: (1) um transgene expressando PHA-4::GFP que marca núcleos no intestino e faringe (endoderme verde)^10,18,19, (2) um transgene expressando um mCherry-histone fusão na epiderme e em ~ 1/3 de neurônios (ectoderm vermelho; Figura 2A), e (3) um transgene que expressa simultaneamente mCherry e GFP-etiquetado histones no músculo da parede do corpo (mesoderm amarelo). A cepa morphogênese tem dois transgenes que expressam: (1) um marcador de junção epiteliais verde (DLG-1:GFP) na epiderme, e (2) um marcador de membrana plasmática marcado por mCherry, em ~1/3 de neurônios (Promotor Pcnd-1; Figura 2A). Para melhorar a eficácia do RNAi, ambas as cepas também foram projetadas para conter um par de mutações sensibilizadoras para RNAi(nre-1 (hd20) lin-15b (hd126)²⁰. Estes foram construídos com o objetivo de realizar uma tela baseada em RNAi em grande escala dos ~ 2.000 genes necessários para o desenvolvimento embrionário. No entanto, este par de cepas também constituirá uma plataforma padronizada amplamente útil para avaliar defeitos de desenvolvimento em mutantes, e para análises mais detalhadas dos papéis de diferentes proteínas no desenvolvimento.

Para coleta de dados neste formato de geração de massa semi-alta, com essas cepas, verde, vermelho e campo brilhante z-série (18 x 2 μm² intervalos) são coletados, a cada ~ 20 min, por um período de 10 h em um quarto de temperatura c 16 °C controlado; isso mantém o microscópio entre 21-23 °C durante a corrida. O intervalo de tempo de 20 minutos permite-nos a imagem de 50 campos de embriões (visitas por ponto) por experimento. Os usuários podem adaptar as aquisições a intervalos mais curtos com menos visitas de pontos, ou intervalos mais longos com mais visitas de pontos para melhor se adequar aos seus objetivos experimentais. Para estas tensões, os pontos de tempo adiantados do desenvolvimento não são imaged porque os repórteres específicos do tecido que conduzem a expressão do marcador não começam a expressar até o gastrulation mid-to-late. Durante esta fase inicial, os poços foram digitalizados com baixa ampliação (10x) e os campos são selecionados para imagens de alta ampliação. Recomenda-se a seleção de campos contendo mais de um embrião em estágio inicial, mas evitar campos onde os embriões estão parcialmente sobrepostos, excessivamente lotados ou são encontrados na borda extrema do poço. Após a imagem de 60x durante a noite, uma baixa ampliação (10x) toda a varredura do poço é realizada para determinar se os embriões eclodem com aparência normal (WT), eclodem com anormalidades visíveis (anormal larval) ou são letais embrionários para cada condição avaliada ( Figura 1B). Esta etapa serve como uma alternativa fácil para a criação de placas paralelas para avaliar a letalidade em uma população maior; todo o poço 10x pós-digitalização fornece dados de letalidade embrionária em 50-80 embriões por condição. Usar esta medida para comparar os dados de letalidade embrionária da população para controles entre corridas é um controle útil que garante consistência em relação à saúde das cepas e às condições ambientais e às etapas de processamento. Quando imaged em combinação, as duas cepas repórter personalizado fornecer leituras informativas para a maioria dos principais eventos de desenvolvimento, incluindo especificação do destino celular, intercalação dorsal, recinto epidérmico, alongamento e neurogênese (representante imagens de controle são mostradas na Figura 2B, também ver Wang et al.¹⁰).

Processamento de dados: cultivo e orientação automatizados de embriões
Com nosso protocolo de imagem, cada campo de imagem de alta resolução contém entre 1 e 5 embriões; estes embriões são orientados aleatoriamente e são frequentemente posicionados imediatamente adjacentes uns aos outros. Os dados coletados usando técnicas convencionais de montagem de embriões sofrem os mesmos desafios. Para preparar os dados para posterior visualização e análise, considerável manipulação prática é necessária para cortar e orientar as seqüências de embriões, bem como para pré-processá-los para subtrair o fundo, correto para a deriva, e compensar a atenuação do sinal com profundidade. Para agilizar esse processo, foi construído um programa personalizado de cultivo de embriões que isola e orienta cada embrião a partir do campo mais amplo(Figura 1C, Figura 3). Este programa foi embalado como um programa autônomo e amigável com interface gráfica do usuário (GUI, compatível com dados da maioria das plataformas de imagem) que podem levar em uma sequência de lapso de tempo 3D de um campo de embriões e processá-lo em séries individuais de tiff para cada embrião no campo(Figura 3B, disponível em https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w)^10,12. O código-fonte Python para o GUI (embryoCropUI.py), e uma versão em lote deste programa (screenCrop.py) também estão disponíveis para usuários experientes python no GitHub (https://github.com/renatkh/embryo_crop.git)^10,13. A funcionalidade central deste programa é localizar, cortar e orientar o embrião ao longo do eixo anterior-posterior. Simultaneamente, a correção de subtração, atenuação em segundo plano e correção de deriva podem ser realizadas no conjunto de dados usando configurações ajustáveis opcionais.

Resumindo, o software de cultivo automatizado detecta iterativamente embriões individuais em uma máscara binária obtida a partir das imagens de campo brilhante e culturas sequencialmente os embriões de todos os canais e orienta as imagens ao longo do eixo anterior-posterior (Figura 3 B, descrito pela primeira vez em Wang et al.¹⁰). Antes do corte, o software corrige a deriva, subtrai o fundo e executa correção de atenuação de profundidade em cada canal de fluorescência (opcional). Para obter a máscara binária, o software aplica a detecção de borda canny²¹ às imagens de campo brilhante, realiza projeção de intensidade máxima dos três planos centrais e preenche pequenos buracos. O algoritmo detecta embriões individuais, encaixando um oval Cassini para uma seção do contorno da máscara binária (ver Figura 3B, 3C). Depois de alinhar o oval ao longo de seu eixo principal, o software mede a intensidade da fluorescência vermelha em cada metade do embrião isolado e gira o embrião de tal forma que a intensidade vermelha é orientada para a esquerda, o que coloca o embrião anterior à esquerda para ambos os cepas repórter usado neste trabalho (Figura 3D). Pilotagem deste software revelou que a maioria dos embriões foram eficientemente cortadas como previsto. Problemas de imagem menores, como deriva de embriões, perda temporária de aviões focais (devido a bolhas no petróleo) ou campos lotados de embriões normalmente não interrompem o corte bem-sucedido. No entanto, para os campos onde havia grandes grupos de embriões (sobreposição um pouco em z), embriões que foram significativamente inclinados dentro do plano de imagem (em Z), perda de avião focal a longo prazo, ou embriões que foram parcialmente cortados, corte bem sucedido nem sempre foi Alcançado. Esses problemas podem ser facilmente contornados por uma melhor seleção de campo durante a fase de aquisição de dados. No geral, os dados de pré-processamento coletados com este método de meia-alta taxa de produção ou o uso de métodos de montagem convencionais são um primeiro passo útil para visualizar e analisar conjuntos de dados embrionários.

Validação de métodos de coleta de imagens e processamento de dados: visualizar o desenvolvimento embrionário após a queda de 40 genes descritos anteriormente
Para validar este método de coleta de imagens semi-alta-taxa de alta taxa e regime de cultivo personalizado, uma pequena tela RNAi foi realizada nas cepas personalizadas, dirigidas contra 40 genes com funções previamente descritas na especificação do destino celular e morfogênese ( descrito por Wang, Ochoa, Khaliullin e colegas^10,11). Para fazer isso, o dsRNA foi gerado contra cada alvo, injetado l4 animais de cada cepa, esperou 20-24 h, e depois dissecados e fotodos embriões usando o protocolo descrito acima (para conjunto de dados completo^10,11). Alcançar fenótipos de desenvolvimento por RNAi requer inibição da expressão gênica materna e zigota. Genes de desenvolvimento podem ser expressos maternalmente, com os produtos proteicos resultantes sendo carregados nos embriões, ou zigoticamente expressos no embrião, ou, em muitos casos, ambos^10,22,23. O tempo entre a injeção e as filmagens de embriões é a variável crítica para atingir efetivamente populações maternae zigoticamente expressas; o sincronismo determina a quantidade de dsRNA injetado que é carregada no embrião para impedir a expressão zygotic²⁴ e a extensão da depleção materna da proteína. Após a injeção de dsRNA, o mRNA materno correspondente ao gene alvo fica degradado e não se recupera em um intervalo de tempo relevante. O esgotamento de proteínas pré-existente requer a produção de embriões, que ejeta a proteína materna dos tecidos germinos, carregando-a para formar embriões. 20-24 h a 20 °C é o menor tempo de incubação que permite o esgotamento materno consistente; esgotamento materno fica melhor em pontos de tempo posteriores (ou seja, 36-42 h após a injeção). A quantidade de dsRNA injetado que é carregado no embrião dita como eficaz a prevenção da expressão do gene zigotaserá. A quantidade de picos carregados de RNA cerca de 5-10 h após a injeção, quando embriões com material injetado são fertilizados pela primeira vez, declinando depois disso. Em nossa experiência, 24 h após a injeção é um ponto de tempo ideal, no qual a depleção e inibição da expressão gênica zigota da proteína são eficazes. A análise de fenótipos nas cepas de repórter personalizadas usadas neste trabalho, em todo o conjunto de 40 genes de teste, mostrou que nosso protocolo combinado produziu fenótipos distintos e altamente reprodutíveis de assinatura em um amplo espectro de genes envolvidos no destino celular especificação e mordogênese (ver Wang et al.^10); o conjunto de dados completo está disponível^11). Como exemplo desses dados, ainda imagens de quatro embriões diferentes para controle, pha-4 (RNAi), pal-1 (RNAi), e mex-3 (RNAi) na cepa repórter camada germinativa são mostrados na Figura 4A. Para uma discussão mais abrangente dos fenótipos observados na tela rnai de 40 genes, veja Wang et al.¹⁰

ImageJ macro: Compilação e visualização de todos os dados para uma determinada condição
Visualização de um grande número de embriões de pilhas de tiff individuais pode ser tedioso e demorado para trabalhar. De nosso esforço inicial, os embriões individuais >400 foram isolados usando o programa automatizado personalizado de cultivo descrito acima. Para acelerar a análise de primeira passagem, construímos uma macro ImageJ, que gera uma matriz de todos os embriões imagemdos para uma determinada condição RNAi em um determinado fundo de cepa (Figura 4B). Para cada embrião na matriz, uma imagem de campo brilhante e uma imagem de projeção de intensidade máxima são apresentados lado a lado, para cada ponto de tempo, para gerar um arquivo de filme composto. Embora essa macro tenha sido escrita para funcionar com nossa estrutura de arquivos, ela pode ser editada para acomodar a estrutura de arquivos do usuário. Para obter melhores resultados, no entanto, os usuários devem seguir as convenções de nomenclatura e estrutura de arquivos estabelecidas no protocolo (veja os arquivos Zenodo ou Github README para mais detalhes para as convenções de nomenclatura de aplicativos Python e ImageJ). Para visualizar todos os dados processados do ImageJ e obter uma análise mais aprofundada dos fenótipos observados para o conjunto de testes de 40 genes, consulte os dados depositados no banco de dados Dryad^10,11. Este formato de visualização ImageJ permite uma avaliação rápida do fenótipo geral e sua penetração, e facilita a sinalização de problemas de qualidade de dados, como presença de detritos ou perda de plano focal. No geral, a combinação do método de aquisição de dados de meia-alta taxa de produção, programa de corte e ferramenta de visualização ImageJ, combinada com cepas de repórter personalizadas, facilita muito os esforços de maior escala para estudar o desenvolvimento embrionário.

Figura 1. Visão geral do método de imagem de alto conteúdo, procedimento de processamento de dados e ferramentas essenciais. (A) Uma comparação das características do método padrão à base de almofada sagarose para a montagem de embriões C. elegans para a abordagem de imagem multi-poço semi-alta-taxa de alta taxa descrita aqui. (B) Visão geral do método de meia-alta-alta-throughput para monitorar o desenvolvimento embrionário. Veja o texto para obter detalhes. (C) Visão geral das ferramentas de processamento e visualização de dados, que podem ser usadas em dados adquiridos usando um procedimento convencional de montagem baseado em almofada sagarose ou o método baseado em placas multi-bem de alta produção semi-alta descrito aqui. Uma única sequência de 3 lapsos de tempo de lapso de tempo de canal de um campo (esquerda) ou múltiplo saque 3, campos 4-dimensionais de dados de embriões (à direita) pode ser processado usando o programa de cultivo personalizado, que é compatível com dados capturados na maioria das plataformas de imagem. A versão gráfica da interface do usuário (GUI) do programa é amigável ao usuário e não requer nenhuma experiência de programação. O aplicativo screenCrop.py requer experiência Python, mas adicionou capacidades, ou seja, que ele pode cortar em formato de lote. A saída desta etapa é cortada firmemente, pilhas orientadas anterior-posteriors do tiff do embrião. Para visualizar todos os dados de uma única condição, foi construído um macro ImageJ que compila pilhas de tiff cortadas e giradas para mostrar uma imagem de campo brilhante e projeção de intensidade máxima para cada embrião em cada ponto de tempo. Painelmostra ferramentas essenciais necessárias para dissecação e configuração de formato de imagem semi-alta de saltos. Alguns componentes figura reproduzida com permissão de Wang et al.¹⁰. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figura 2. Cepas personalizadas geradas para imagens de alto conteúdo de C. elegans embrigenesis. (A)Esquemáticas ilustram os transgenes usados para construir as cepas germinal (topo) e Morogênese (inferior). (B) Painéis de projeção de intensidade máxima mostram o curso de desenvolvimento no Morphogenesis (superior) e as cepas germinal (inferior). A visão ventral é mostrada, como ilustrado nos esquemas (à esquerda). O tempo é relativo ao estágio da comma (t = 0), que é facilmente identificável em ambas as tensões. Barra de escala = 10 μm. Figura reproduzida com permissão de Wang et al.¹⁰. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figura 3. O programa de cultivo personalizado isola e orienta embriões individuais a partir de campos de imagem. (A)Schematic ilustra as características do programa de cultivo de embriões personalizados e destaca as duas opções para acessar este programa: uma interface GUI amigável, que não requer experiência em programação e está disponível no Zenodo (à esquerda) e versão de corte em lote do programa, que requer experiência Python e está disponível no Github (à direita). (B) O gráfico resume o algoritmo de corte automatizado - uma máscara binária é gerada a partir de imagens de campo brilhante de 8 bits e embriões individuais são detectados, cortados e orientados ao longo do eixo anterior-posterior. A barra de escala é de 10 μm. (C)Os esquemas detalham o procedimento usado para detectar iterativamente embriões na máscara binária. (D)Schematic ilustra o método utilizado para orientar embriões ao longo do eixo anterior-posterior. Painéis B-D reproduzido com permissão de Wang et al.¹⁰. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figura 4. A macro de ImageJ personalizada permite a visualização de dados de triagem de RNAi, gerando arquivos compostos para cada condição. (A) Embriões para três condições de RNAi de exemplo do conjunto de teste de 40 genes (ver Wang et al.^10,11 para conjunto de dados completo) são mostrados (à direita) que destacam os fenótipos de assinatura distintos que são obtidos para cada condição e a reprodutibilidade dos fenótipos dentro de cada condição. Painel foi adaptado com permissão de Wang et al.¹⁰. Painel (B) Painel ilustra como o personalizado ImageJ macro (OpenandCombine_embsV2.ijm) matrizes embriões de uma determinada condição RNAi em um arquivo ImageJ composto que matrizes o campo brilhante e projeções de intensidade máxima para cada embrião em cada ponto de tempo. Embora apenas um exemplo seja destacado, essa macro pode compilar os dados para muitas condições de RNAi de uma só vez. ImageJ macro está disponível no Zenodo¹². Barra de escala = 10 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Discussion

Este trabalho descreve um conjunto de ferramentas e métodos que foram desenvolvidos para permitir esforços em maior escala para perfilar a função dos genes no desenvolvimento embrionário em C. elegans. Nosso método de meia-alta-geração permite a imagem latente 3D do time-lapse do desenvolvimento embrionário na definição de 20 minutos para 80-100 embriões em uma única experiência. Embora este protocolo possa ser adaptado para uso com qualquer cepa de marcador desejada(s), este trabalho demonstra o potencial do método usando duas cepas personalizadas desenvolvidas para monitorar eventos durante embriogênese: (1) uma cepa repórter de camada germinativa, na qual tecido específico promotores conduzir a expressão de histonas fluorescentes para marcar o endoderm, mesoderm e núcleos ectoderm, e (2) uma cepa repórter morfogênese, que usa promotores epidérmicos e neuronais para conduzir a expressão de marcadores fluorescentes em junções celulares e a membrana plasmática. Ao obter imagens das duas cepas, as conseqüências das perturbações moleculares na especificação do destino celular e eventos morfogenéticos podem ser capturadas com detalhes notáveis. Para enfrentar os desafios apresentados pela quantidade de dados gerados por esse método, ferramentas personalizadas foram desenvolvidas com o objetivo de simplificar o processamento e a visualização de dados. A primeira ferramenta colhe embriões individuais de um campo de embriões em sequências de lapso de tempo 3D, ao mesmo tempo em que gira os embriões para uma orientação anterior-posterior padrão e realização de subtração de fundo, correção de deriva e correção de atenuação. Este programa foi embalado como um GUI amigável (https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w) e o código-fonte e uma versão mais avançada do programa para usuários experientes python (github.com/renatkh/embryo_crop.git) é fornecido^10,12,13. Finalmente, para visualizar esses dados processados em um formato significativo, uma macro ImageJ foi concebida; isso permite que o usuário visualize todos os embriões a partir de uma determinada condição RNAi em um filme multipainelado, que mostra uma projeção de intensidade brilhante e máxima para cada embrião em cada ponto de tempo. Juntas, as ferramentas de cepas, protocolo e processamento de dados fazem esforços para estudar a embriênese embrionária de C. elegans em maior escala um esforço mais viável.

Embora simples de implementar em geral, o método de aquisição de semi-alta-taxa de pagamento descrito aqui requer atenção a alguns detalhes críticos, que são discutidos abaixo. Primeiro, os usuários devem ter acesso a um microscópio confocal com capacidade de visita de ponto de precisão que pode ser equipado com um suporte de placa multi-poço. A consideração a mais crítica para este protocolo é que o microscópio esteja mantido em um quarto temperatura-controlado. Quando muitos microscópios tiverem a capacidade aquecer-se, a maioria não podem confiantemente refrigerar, assim a temperatura ambiental tem que ser adaptada para manter uma temperatura amigável constante de C. elegans. Para conseguir isso, a sala de imagem é realizada em 16 °C. A área amostral do instrumento aquece até 21-23 °C durante a imagem. Flutuações na temperatura ambiente podem afetar o tempo de desenvolvimento e sutilmente alterar a precisão do avião focal durante a visita do ponto e devem ser evitados, tanto quanto possível. Observe que correr a temperaturas acima de 23 °C pode resultar em um aumento considerável na letalidade embrionária para condições de controle e não é aconselhável. Outra consideração fundamental é a seleção e dispersão de embriões durante a dissecação. Devem ser tomados cuidados para evitar a transferência de embriões mais antigos para os poços de imagem, uma vez que, ao eclosão de animais tendem a swish embriões adjacentes fora da vista; a incidência disso é diminuída pela inclusão de anestésicos na mídia. A dispersão de embriões, para evitar grandes aglomerados de embriões, também é uma variável crítica. A aglomeração tende a ocorrer quando os embriões são transferidos para os poços em pipetas capilares que são muito finamente desenhados, ou quando os embriões não são suficientemente dispersos durante a dissecação. Outra consideração é que a seleção de pontos e ajuste focal de avião leva tempo. A placa não é mantida no gelo durante este processo, assim que os embriões começam a se desenvolver imediatamente. Para as cepas de marcadores personalizadas usadas neste estudo, há cerca de uma janela de 90 min depois que a placa é removida do gelo para realizar a digitalização de placas e a seleção de pontos antes que os marcadores comecem a ser expressos. Este é tempo suficiente para configurar em nosso instrumento com essas cepas, mas outros microscópios e cepas podem oferecer desafios de tempo adicionais que exigirão solução de problemas. Finalmente, o método que descrevemos emprega um objetivo de óleo 60x para coletar z-pilhas de 50 campos em intervalos de tempo de 20 minutos. Como destacamos, a resolução temporal pode ser aumentada diminuindo o número de campos imageados. Por exemplo, 10 campos podem ser imageados em resolução de 4 min. Uma segunda alternativa para aumentar a resolução temporal é usar uma menor ampliação, objetivo de abertura numérica alta; Neste caso, o maior campo de visão permite a imagem de um grande número de embriões em maior resolução de tempo com apenas uma redução moderada na resolução espacial.

Para permitir o processamento e a visualização de dados em maior escala, construímos ferramentas personalizadas e as disponibilizamos gratuitamente. A ferramenta mais amplamente útil é o GUI de corte personalizado, que não requer experiência em programação para operar. O GUI pode ser usado para cortar e orientar embriões em todas as fases de desenvolvimento e é compatível com todos os marcadores, tornando-o útil não só para biólogos de desenvolvimento, mas também para pesquisadores que estudam processos no embrião precoce. Como a saída do GUI é precisamente cortada, orientada, dimensionada, corrigida por deriva, os dados podem ser facilmente canalizados para um pipeline de análise automatizado, tornando essa ferramenta útil para análise de dados passados e futuros; Se forem utilizadas estirpes adequadas, os ficheiros de dados resultantes podem ser utilizados como entrada para os regimes de análise automatizada existentes, tais como ferramentas de alinhamento de embriões²⁵. Para usar o programa, é importante que os usuários estejam cientes de que o algoritmo de corte requer um campo brilhante ou imagem DIC para ser coletado para cada etapa e ponto de tempo. Além disso, os usuários devem notar que o algoritmo de orientação anterior-posterior é estruturado com base na distribuição do sinal vermelho nas cepas de relatório de relatório de camada germinal e morgênese, mostrada neste trabalho. Assim, a precisão da orientação ap em outras cepas marcador terá de ser avaliada caso a caso. O GUI foi testado com dados coletados em três diferentes plataformas de imagem confocal e é compatível em toda a linha para pilhas multi-tiff e série tiff. Além da versão amigável, o código-fonte para o GUI e uma versão em lote deste programa também foram disponibilizados, com a ressalva de que a experiência de programação é necessária, e estruturas de arquivos e convenções de nomenclatura precisarão ser seguidas. Finalmente, um macro de processamento ImageJ foi construído para tomar pilhas de imagem crua para todos os embriões, em cada condição RNAi, e compilar uma matriz informativa para mostrar todos os embriões para essa condição em brightfield e fluorescência projeção de intensidade máxima em cada ponto de tempo. Esta ferramenta pode ser adaptada às especificações do usuário e é uma macro útil para tornar a exploração de dados e a avaliação de controle de qualidade mais simples.

Juntos, o método de filmagem semi-alta-alta-indústria, juntamente com o cultivo de embriões e ferramentas de processamento de imagem descritas aqui facilitarão a análise do desenvolvimento embrionário de C. elegans usando uma variedade de mutantes, perturbações e cepas de marcadores. Em nosso próprio laboratório, uma tela em grande escala empregando esses métodos para filmar embriões das duas cepas personalizadas projetadas descritas aqui após knockdown de ~ 2.000 genes necessários para o desenvolvimento, está em andamento. Finalmente, os dados desse esforço servirão como um recurso adicional para aumentar os esforços para entender a especificação do destino celular e eventos morfogenéticos durante a embriogênese.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aspirator Tube Assembly	Drummond Scientific	2-000-000
Calibrated Pipette (25 mL)	Drummond Scientific	2-000-025
Cell Voyager Software	Yokogawa Electric Corp	Included with CV1000
Conical Tube (15 mL)	USA Scientific	1475-0501
CV1000 Microscope	Yokogawa Electric Corp	CV1000
Depression slide (3-well)	Erie Scientific	1520-006
Dissection Microscope	Nikon	SMZ-645
Eppendorf Centrifuge 5810R	Eppendorf	5811 07336
ImageJ/FIJI	Open Source	https://imagej.net/Fiji
M9 Buffer	Lab Prepared	https://openwetware.org/wiki/M9_salts
Microcentrifuge Tube (1.5 mL)	USA Scientific	1615-5500
Microseal F-foil Seal	Bio-Rad	MSF1001
NGM Plates	Lab Prepared	http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html#d0e214
Scalpel #15	Bard Parker	REF 371615
Sensoplate Plus, 384 Well, F-bottom, Glass Bottom	Greiner Bio-One	781855
Tetramisole Hydrochloride	Sigma Aldirch	T1512-10G
Tweezers, Dumont #3	Electron Microscopy Sciences	0109-3-PO
U-PlanApo objective (10× 0.4 NA)	Olympus	1-U2B823
U-PlanApo objective (60× 1.35 NA)	Olympus	1-U2B832