Summary
الثقافات العضوية المستمدة من المريض من سرطانات الغدة السرطانية الاقنيه البنكرياس هي نموذج بسرعة 3-الابعاد التي تمثل المقصورات الخلايا الظهاريه الورم مع الإخلاص عاليه, تمكين البحوث متعديه في هذا الخبيثة القاتلة. هنا ، ونحن نقدم أساليب مفصله لإنشاء ونشر العضوية وكذلك لاجراء الاختبارات البيولوجية ذات الصلة باستخدام هذه النماذج.
Abstract
سرطان الغدد السرطانية في البنكرياس (PDAC) هو من بين الأورام الخبيثة الأكثر فتكا. في الاونه الاخيره ، تم وصف الجيل التالي من أساليب الثقافة العضوية التي تمكن من النمذجة ثلاثية الابعاد (3D) لهذا المرض. ويمكن عزل نماذج العضو العضوي المشتقة من المريض من كل من العينات الجراحية وكذلك الخزعات الصغيرة والشكل السريع في الثقافة. والاهم من ذلك ، تحافظ النماذج العضوية علي التعديلات الوراثية المسببة للامراض المكتشفة في ورم المريض وهي تنبئي باستجابة المريض للعلاج ، التالي تمكين الدراسات الانتقالية. هنا ، ونحن نقدم بروتوكولات شامله للتكيف الانسجه ثقافة سير العمل لدراسة 3D ، مصفوفة مضمنه ، نماذج organoid. نحن التفاصيل الطرق والاعتبارات لعزل ونشر الاساسيه PDAC العضوي. وعلاوة علي ذلك ، فاننا نوضح كيف يتم اعداد وسائل الاعلام العضوية مفصل والجودة التي تسيطر عليها في المختبر. وأخيرا ، فاننا وصف الاختبارات لتوصيف المصب من النماذج العضوية مثل عزل الأحماض النووية (DNA و RNA) ، واختبار المخدرات. ومن المهم ان نقدم الاعتبارات الحاسمة لتنفيذ منهجيه organoid في مختبر البحوث.
Introduction
سرطان الغدد السرطانية في البنكرياس (PDAC) هو مرض مميت يتميز بالتشخيص المتاخر في معظم المرضي ، ونقص العلاجات الفعالة ، وما ينجم عنه من انخفاض معدل البقاء الكلي لمده 5 سنوات والذي لا يزال اقل من 10%1. يتم تشخيص 20 ٪ فقط من المرضي مع مرض موضعي مناسبه للتدخل الجراحي العلاجي2،3. وعاده ما يتم التعامل مع المرضي المتبقيين مع مزيج من عوامل العلاج الكيميائي التي تكون فعاله في اقليه من المرضي4,5. لتلبيه هذه الاحتياجات السريرية الملحة ، يعمل الباحثون بنشاط علي استراتيجيات الكشف المبكر وتطوير علاجات أكثر فعاليه. لتسريع الترجمة السريرية من الاكتشافات الهامه ، والعلماء يستخدمون نماذج الماوس المهندسة وراثيا ، المريض المستمدة xenografts ، خطوط الخلايا أحاديه الطبقة ، و ، في الاونه الاخيره ، نماذج organoid6.
الثقافة العضوية الظهاريه ثلاثية الابعاد باستخدام عامل النمو و Wnt-ligand الظروف الغنية لتحفيز انتشار الخلايا السلف غير المتحولة ووصفت لأول مره للأمعاء الفئران7 وتم تكييفها بسرعة لأنسجه البنكرياس البشرية العادية8. بالاضافه إلى الانسجه الانبوبيه العادية ، ومنهجيه organoid يسمح للعزل ، والتوسع ، ودراسة PDAC الإنسان8. الأهم من ذلك ، فان الطريقة تدعم إنشاء organoids من العينات الجراحية ، فضلا عن الخزعات الدقيقة والاساسيه ابره ، مما يسمح للباحثين لدراسة جميع مراحل المرض9،10. ومن المثير للاهتمام ان العضوية المشتقة من المريض تلخص الأنواع الفرعية الموصوفة جيدا للورم وقد تمكن من تطوير منصات الطب الدقيقة9,11.
البروتوكولات العضوية الحالية ل PDAC تمكين التوسع الناجح لأكثر من 70 ٪ من عينات المريض من العلاج الكيميائي الساذج المرضي9. هنا نقدم الأساليب القياسية المستخدمة من قبل المختبر لدينا لعزل ، وتوسيع ، وتوصيف المستمدة من المريض العضوي PDAC. وقد وصفت منهجيات organoid أخرى pdac12،13 ولكن لم يتم اجراء مقارنه لهذه الطريقة بدقه. وبما ان هذه التكنولوجيا جديده نسبيا وتتقدم بسرعة ، فاننا نتوقع ان تستمر هذه البروتوكولات في التطور والتحسن ؛ ومع ذلك فان مبادئ التعامل مع الانسجه والثقافة العضوية ستظل مفيده.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم استعراض جميع جمع الانسجه البشرية لاستخدام البحوث والموافقة عليها من قبل مجلس المراجعة الداخلية لدينا. يتم تنفيذ جميع البروتوكولات التالية في ظل ظروف عقيمه في بيئة مختبر ثقافة الثدييات الانسجه.
1. اعداد وسائل الاعلام
- اعداد وسائل الاعلام المكيفة.
ملاحظه: تتطلب وسائل الاعلام العضوية البنكرياس البشري وفره عوامل النمو والمواد الغذائية ، فضلا عن مكملات وسائل الاعلام المكيفة لتوفير التحفيز النمو الكافي للتوسع organoid. ويتم اعداد كل من وسائل التكييف الموصوفة أدناه من خطوط الخلايا المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد). للحصول علي البروتوكولات والمواد الكاملة ، يرجى الرجوع إلى مواقع الشركات المصنعة.- إنتاج spondin1 وسائل الاعلام المكيفة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
- أولا ، قم بتوسيع خلايا 293T التي تعبر عن spondin1 باستخدام المضادات الحيوية المناسبة (Zeocin) طرق الاختيار في وجود المصل وفيرة (10 ٪). عند إنتاج وسائل الاعلام المكيفة ، وسحب وغسل بعيدا اختيار المضادات الحيوية والمصل بحيث لا يوجد المضادات الحيوية والمصل موجودة في وسائل الاعلام النهائية المكيفة. والاهم من ذلك ، يجب ان تكون وسائل الاعلام المكيفة معقمه بعد الجمع (0.2 ميكرومتر) لمنع التلوث العرضي.
- تخزين وسائل الاعلام المكيفة المقتبسة في 4 درجه مئوية للاستخدام علي المدى القصير (في غضون 6 أشهر) أو عند-20 درجه مئوية للتخزين علي المدى الطويل (أكثر من 6 أشهر). وينبغي تجنب دورات تجميد الذوبان.
- إنتاج وسائل الاعلام المكيفة L-Wnt-3A وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
- أولا ، قم بتوسيع خلايا L-M (TK-) التعبير عن L-Wnt-3A باستخدام المضادات الحيوية المناسبة (G-418) طرق الاختيار في وجود المصل وفيرة (10 ٪). عند إنتاج وسائل الاعلام المكيفة ، وسحب وغسل بعيدا اختيار المضادات الحيوية بحيث لا يوجد مضاد حيوي في وسائل الاعلام النهائية مكيفه ؛ ومع ذلك ، الحفاظ علي المصل في جميع انحاء الخياطة وتكييف. والاهم من ذلك ، يجب ان تكون وسائل الاعلام المجمعة التي تم جمعها معقمه (0.2 μm) لمنع التلوث المتقاطع.
- تخزين وسائل الاعلام المكيفة المقتبسة في 4 درجه مئوية للاستخدام علي المدى القصير ، أو-20 درجه مئوية للتخزين علي المدى الطويل. وينبغي تجنب دورات تجميد الذوبان.
- لمراقبه الجودة ، واجراء فحص TOPFLASH لاختبار النشاط Wnt من spondin1 والوسائط المكيفة L-Wnt-3A وحدها وفي تركيبه وفقا لبروتوكول14المنشورة سابقا.
- إنتاج spondin1 وسائل الاعلام المكيفة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
- اعداد وسائل الاعلام القاعدية: استخدام وسائل الاعلام القاعدية لاعداد وسائل الاعلام العضوي كامله ، فضلا عن خطوات الغسيل للعمل organoid. الملحق DMEM/F-12 المتقدمة مع الجلوتامين في تركيز نهائي من 1x ، HEPES (10 ملم) ، والبنسلين/ستربتومايسين (100 U/mL). تخزين الوسائط القاعدية في 4 درجه مئوية.
- Organoid اعداد وسائل الاعلام كامله: تكمله وسائل الاعلام القاعدية مع وسائل الاعلام المكيفة spondin1 في تركيز نهائي من 10 ٪ v/v ، L-Wnt-3A وسائل الاعلام المكيفة في تركيز نهائي من 50 ٪ v/v ، EGF الإنسان (50 ng/mL) ، الإنسان FGF (100 ng/mL) ، الإنسان الذواقة الأول (10 نانومتر) ، الماوس نوجين (100 ng/mL) ، A83 (500 nM) ، B27 الملحق (1x) ، نيكوتيناميد (10 ملم) ، N-اسيتيل (1.25 mM) ، و Primocin (100 ميكروغرام/مل).
- لانعزالية العضوية الاوليه ، والثقافات العضوية المذابة ، والثقافات بدءا من خلايا واحده ، وتشمل رو كيناز المثبط Y-27632 في تركيز نهائي من 10.5 μM.
- اعداد الإنسان العضوية الاعلاميه كامله علي الجليد وتخزين في 4 درجه مئوية للاستخدام في غضون شهر واحد. ولهذا السبب ، نوصي باعداد الوسائط الجديدة أسبوعيا.
2. عزل العضو العضوي PDAC
ملاحظه: ذوبان محلول الغشاء السفلي (BME) الحل (انخفاض عامل النمو ؛ انظر جدول المواد) علي الجليد في بيئة 4 درجه مئوية (ثلاجة أو غرفه بارده) لمده 12 ساعة علي الأقل قبل الاستخدام. احتضان لوحات ثقافة الانسجه للثقافة العضوية في حاضنه 37 درجه مئوية لمده 12 ساعة علي الأقل قبل الاستخدام.
- جمع ونقل عينه الورم المزالة جراحيا للبحث في حل تخزين مخزنه للحفاظ علي سلامه الانسجه. استخدام وسائل الاعلام القاعدية أو حل تخزين الانسجه المتاحة تجاريا.
- المضي قدما لعزل organoids في أقرب وقت ممكن بعد تلقي العينة. يمكن تخزين الانسجه في محلول التخزين ما يصل إلى 24 ساعة بعد الجراحة وما زالت الغلة العضوي.
- مره واحده في المختبر ، نقل الورم إلى صحن ثقافة الانسجه 10 سم وأزاله حل التخزين.
- اثناء التعامل مع الانسجه مع ملقط معدني ، المفروم الورم مع مشرط #10 إلى شظايا صغيره من 1 مم3 أو أصغر. ستستغرق الشظايا الكبيرة وقتا أطول للهضم ؛ لذلك ، تهدف إلى توليد احجام متجانسة الانسجه جزء. إذا كانت الانسجه مصنفه بالفعل أو في أجزاء أصغر من 1 مم3 ، فقم بتخطي هذه الخطوة.
- نقل شظايا الانسجه إلى أنبوب مخروطي 15 مل يحتوي علي 10 مل من وسائل الاعلام القاعدية. مزيج من خلال عكس الأنبوب عده مرات. الطرد المركزي أنبوب في 200 x g لمده 5 دقائق. بعد الدوران ، قم بازاله الوسائط القاعدية بعناية لتجنب فقدان شظايا الانسجه.
- إلى الأنبوب الذي يحتوي علي شظايا الانسجه أضافه 9 مل من وسائل الاعلام القاعدية و 1 مل من 10x لطيف كولاجيناز/الحل الهيلوندداز. لتجنب تكتل الخلايا اثناء الهضم ، تكمله هذا الحل مع 20 μL من 10 ملغ/مل DNAse I الحل. مزيج من خلال عكس الأنبوب عده مرات.
- احتضان الهضم الانزيمي في 37 درجه مئوية علي البندق أو المدورة. لخلط كافيه اثناء الهضم ، شظايا الانسجه يجب ان تتحرك باستمرار من خلال الحل.
ملاحظه: يجب تحديد توقيت هذا التفكك الانزيمي للورم تجريبيا لكل عينه. ويتميز الهضم الناجح للورم من انخفاض في حجم شظايا الانسجه حتى انها ليست واضحة ملموسه للعين المجردة. التزامن مع ذلك ، فان عتامه الحل ستزداد مع الإفراج عن شظايا الانسجه المجهرية. - بعد 30 دقيقه ، وأزاله أنبوب مخروطي من 37 درجه مئوية حاضنه ومراقبه. إذا كانت شظايا الانسجه لا تزال مرئية بوضوح ، والاستمرار في التفكك في 37 درجه مئوية مع خلط مستمر. كرر هذه الملاحظة كل 30 دقيقه حتى يتم فصل معظم أو جميع شظايا الانسجه. اعتمادا علي صرامة من خلط وكذلك حجم وكميه من شظايا الورم ، وهذه الخطوة يمكن ان يستغرق اقل من 30 دقيقه للعينات صغيره أو طالما 12 ح لعينات الورم أكبر.
- بمجرد اكتمال التفكك الانزيمي ، الطرد المركزي الأنبوب في 200 x g لمده 5 دقائق. بعد تدور ، يجب ان تكون الخلية بيليه مرئية وينبغي ان تكون واضحة ماده طافي ، مشيرا إلى ان جميع الخلايا قد نسج من الحل. إذا لم يكن الأمر كذلك ، كرر الدوران.
- بعناية أزاله ماده طافي لتجنب فقدان بيليه الخلية. يغسل فورا الخلايا مع 10 مل وسائل الاعلام القاعدية عن طريق خلط بلطف الأنابيب مع انعكاس. الطرد المركزي الأنبوب في 200 x g لمده 5 دقائق بعناية أزاله وسائل الاعلام القاعدية لتجنب فقدان الخلايا وكرر هذه الخطوة الغسيل مره أخرى لما مجموعه اثنين من يغسل.
- بعد الغسيل الثاني ، قم بازاله جميع وسائل الاعلام القاعدية بعناية ووضع الأنبوب علي الجليد لمده 5 دقائق.
- في هذا الوقت ، ووضع قسامه من وسائل الاعلام الكاملة organoid في 37 درجه مئوية حمام المياه إلى ما قبل الحارة.
- خلط بيليه الخلية مع الجليد الباردة BME مع الحفاظ علي أنبوب علي الجليد. يجب ان تكون كثافة البذر عاليه للعزل organoid. لبيليه صغيره (~ 50 حجم μL) استخدام 200 μL من BME ، في حين ان لبيليه كبيره (~ 200 μL حجم) استخدام 800 μL من BME. تخلط الخلايا و BME علي الجليد باستخدام ماصه p200 حتى يظهر المحلول متجانسا مع تجنب خلق فقاعات في المحلول.
- بقعه 100 μL قبة في وسط بئر من درجه حرارة 12 جيدا باستخدام ماصه p200. كرر هذا حتى يتم الاستغناء عن حل BME. نقل بعناية لوحه إلى حاضنه 37 درجه مئوية للسماح لهلام BME ليصلب.
- بعد 10 دقيقه ، واسترداد لوحه وأضافه 1 مل من وسائل الاعلام الكاملة العضوية قبل تسخينها لكل بئر. الاستغناء عن وسائل الاعلام علي جانب البئر لتجنب تعطيل قبة BME.
- مراقبه شظايا الخلايا باستخدام المجهر ثقافة الانسجه المقلوبة باستخدام عدسه 4x في برايت فيلد.
ملاحظه: يجب ان تكون الخلايا المفردة وأجزاء الانسجه المجهرية مرئية بوضوح. تتميز العزلة الناجحة بظهور أكثر من 10 organoids بعد 24 – 48 ساعة. يجب ان متموج الثقافة في غضون أسبوع واحد. وبما ان العينات السرطانية غير متجانسة ، فان بعض العوازل العضوية تكون أكثر تحديا لان عددا قليلا من الأرغن ينمو في بئر ، كما هو مبين في الشكل 1. في هذه الحالة ، اسمح للثقافة بالاستمرار لمده تصل إلى أسبوعين لزيادة عدد الخلايا المتوفرة للتمرير. لحساب استهلاك وسائل الاعلام والتبخر خلال الثقافة ، واعلي الثقافات مع 200 μL من الوسائط الكاملة العضوية قبل تسخينها كل 5 أيام.
3. المرور من Organoids PDAC
- استرداد لوحه من الانسجه ثقافة الحاضنة. مع رافع الخلية المعقمة ، ارفع برفق قبة BME بحيث تطفو في وسائل الاعلام الكاملة. تجنب كشط الجزء السفلي من البئر وذلك لعدم أزاله اي خلايا أحاديه الطبقة تعلق علي البلاستيك ، وهذه هي عاده الليفية.
- مع ماصه p1000 ، نقل بعناية قبة BME ووسائل الاعلام إلى أنبوب مخروطي 15 مل. كرر هذه الخطوة لكل التي تحتوي علي الشكل العضوي.
- يغسل برفق كل بئر التي تم حصادها مع 1 مل من وسائل الاعلام القاعدية الباردة ، ونقل إلى أنبوب 15 مل التي تحتوي علي organoids.
- اخلط المحلول والهيكل العضوي بشكل جيد مع ماصه p1000 وأدره في 200 × g لمده 5 دقائق. بعد الغزل ، سوف تظهر طبقه BME التي تحتوي علي organoids في التعليق وبيليه العضوي في الجزء السفلي من الأنبوب. بعناية أزاله سوبرناتانت ، وتجنب فقدان طبقه BME/organoid. ضع الأنبوب علي الثلج
- أضافه 10 مل من حل استعاده الخلايا الباردة الجليد (CRS) إلى أنبوب وتخلط تماما عن طريق عكس. وهذا سوف ديبوليميريزي مصفوفات البروتين من BME المقطوعة في 4 درجه مئوية. احتضان علي الجليد لمده 30 دقيقه في حين خلط كل 3 دقائق عن طريق الانقلاب. إذا كانت متوفرة ، ضع الأنبوب علي خلاط الدورية في غرفه بارده أو 4 درجه مئوية الثلاجة لمده 30 دقيقه.
- بعد الحضانة 30 دقيقه ، تدور في 200 x g لمده 5 دقائق. يجب ان يكون بيليه العضوي واضحا في حين يجب ان تختفي طبقه BME. إذا انخفضت طبقه BME في الحجم ولكن لا تزال مرئية ، احتضان لمده 30 دقيقه اضافيه في 4 درجه مئوية مع خلط وتكرار تدور.
- بمجرد ان يتم ديبوليميريزيد BME ، أزاله CRS ترك وراء بيليه العضوي. اغسل العضو العضوي مع 10 مل من الوسائط القاعدية عن طريق المزج مع الانقلاب. تدور في 200 x g لمده 5 دقائق وأزاله supernatant. وضع أنبوب مع بيليه العضوي علي الجليد لمده 5 دقائق علي الأقل.
- اختياريا ، إذا كان من المرغوب فيه اعداد خليه واحده ، احتضان العضو العضوي مع تريبسين مل 3 تستكمل مع 30 μL من 10 ملغ/مل DNAse انا الحل لتجنب تكتل الخلايا اثناء الهضم.
- احتضان رد الفعل الانزيمي في 37 درجه مئوية مع انعكاس لطيف خلط كل 2 دقيقه لمده تصل إلى 10 دقيقه. مراقبه وتاكيد التفكك خليه واحده ناجحه تحت مجهر برايت.
- لوقف التفاعل الانزيمي ، أضافه 10 مل من الجليد وسائل الاعلام القاعدية الباردة وتدور في 200 x g لمده 5 دقائق.
- غسل الخلايا مع 10 مل وسائل الاعلام القاعدية عن طريق خلط مع انعكاس لطيف. تدور في 200 x g لمده 5 دقائق وأزاله ماده طافي وتكرار غسل مره أخرى. وضع أنبوب مع بيليه الخلية علي الجليد لمده 5 دقائق علي الأقل.
ملاحظه: نوصي بتنفيذ هذه الخطوة كل 3-5 الممرات اثناء الصيانة العادية من الهيكل التنظيمي لتوليد ثقافة متجانسة مع عدد كبير من الorganoids.
- يضاف الجليد البارد BME إلى الخلية بيليه ويخلط برفق علي الجليد حتى يصبح المحلول متجانسا باستخدام ماصه p200. في حين تجنب توليد فقاعات في الخليط ، ماصه صعودا وهبوطا علي الأقل 5-10x ، ووضع غيض من الماصة علي مقربه من الجزء السفلي من الأنبوب للمساعدة في تفتيت الهيكل العضوي ميكانيكيا. كدليل ، استخدم 4 – 6x حجم BME/cell بيليه بحيث نسبه التقسيم ليست أكثر من 1:2 من ممر واحد إلى الآخر.
- بقعه 100 μL قبة في وسط بئر من درجه حرارة ما قبل 12 جيدا لوحه باستخدام ماصه p200; أكرر حتى يتم الاستغناء عن حل BME. نقل بعناية لوحه إلى حاضنه 37 درجه مئوية للسماح لهلام BME ليصلب. بعد 10 دقيقه ، واسترداد لوحه وأضافه 1 مل من وسائل الاعلام الكاملة العضوية قبل تسخينها لكل بئر. الاستغناء عن وسائل الاعلام علي جانب البئر لتجنب تعطيل قبة BME.
- يجب ان التنظيمية الإصلاح والبدء في النمو في غضون 24 ساعة. وعاده ما يتم المرور الثقافات Organoids من اي وقت مضي 7-10 أيام اعتمادا علي كثافة الثقافة وانتشار الخلايا. إذا لزم الأمر ، اعلي الثقافات مع 200 μL من الوسائط الكاملة العضوية قبل تسخينها كل 5 أيام للتعويض عن نضوب عامل النمو والتبخر.
4. تجميد وذوبان العضو العضوي لل PDAC
- لتجميد العضو العضوي ، والمضي قدما لحصاد الهيكل التنظيمي وديبوليميريزي BME كما هو موضح في الخطوات 3.1-3.7.
- إلى الخلية بيليه ، أضافه 1 مل من وسائل الاعلام تجميد ، مزيج بلطف ، ونقل الخليط إلى كريوفيال المسمية مسبقا.
- ضع كريوفيال في حاويه تجميد للحفاظ علي انخفاض درجه حرارة ثابته أمنه ومكان في 80 درجه مئوية الفريزر. بعد 24 إلى 48 h ، نقل القارورات المجمدة إلى تخزين النيتروجين السائل. يمكن ان تكون العضوية بالتبريد لمده أشهر إلى سنوات باستخدام هذا الأسلوب.
- لأذابه الهيكل العضوي ، استرجع الكريوفيال المجمدة من تخزين النيتروجين السائل. نقل القارورة المجمدة علي الجليد الجاف إلى غرفه ثقافة الانسجه.
- ضع كريوفيال المجمدة في حمام الماء 37 درجه مئوية لأذابه الحرارة العضوية بسرعة ونقل محتويات القارورة إلى أنبوب مخروطي بحجم 15 مل يحتوي علي 9 مل من وسائل الاعلام القاعدية التي تم تسخينها إلى درجه حرارتها.
- تدور في 200 x g لمده 5 دقائق وأزاله supernatant. وضع أنبوب مع بيليه العضوي علي الجليد لمده 5 دقائق علي الأقل.
- الشروع في أعاده التعليق في BME ولوحه العضوية كما هو موضح في الخطوات 3.9 – 3.11.
ملاحظه: الثقافات Organoid يتعافى ببطء بعد دوره التجميد/ذوبان الجليد ، التالي قد تزرع الثقافات لمده تصل إلى أسبوعين قبل المرور.
5. توصيف الهيكل التنظيمي لل PDAC
ملاحظه: يجب ان يتم توصيف الهيكل العضوي علي ثقافة راسخة بعد عده مقاطع للتقليل من خطر التلوث من أنواع الخلايا غير الظهاريه مثل الخلايا الليفية والمناعية.
- استخراج الحمض النووي من organoids PDAC
- لوحه organoids علي 12 لوحه جيدا مخصصه لاستخراج الحمض النووي. لوحه لا يزيد عن 100 μL من BME لكل بئر. للحصول علي كميه كافيه من الحمض النووي/RNA ، لوحه علي الأقل 2-4 ابار لكل ثقافة. تنمو العضوية لمده تصل إلى 5 أيام حتى الثقافات قريبه من المتموج ولكن تخلو من الحطام المفرط للخلايا التي تتراكم في الثقافات علي المدى الطويل.
- استرداد لوحه من 37 درجه مئوية حاضنه وأزاله تماما كل اثر من وسائل الاعلام الكاملة organoid ، وترك فقط قبة BME التي تحتوي علي organoid علي لوحه.
- أضافه 900 μL من حمض الفينول كاشف (انظر جدول المواد) لكل بئر وتخلط جيدا باستخدام ماصه p1000 حتى يصبح الحل متجانسة. سيتم حل BME تماما في كاشف حمض الفينول والorganoids سوف lyse بعد قصيرة 5 دقيقه الحضانة.
تحذير: حمض الفينول هو ماده كيميائية خطره يمكن ان تسبب حروقا كيميائية. التعامل مع الرعاية باستخدام الحماية المناسبة وتقنيه. - نقل المحلول متجانسة إلى أنبوب 2 مل وأضافه 200 μL من كلوروفورم. احتضان 5 دقيقه وأجهزه الطرد المركزي في 12,000 x g لمده 15 دقيقه في 4 °c.
- المضي قدما إلى استخراج RNA والحمض النووي وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. ويمكن استخراج RNA من المرحلة المائية في حين يمكن استخراج الحمض النووي من المرحلة البينية والعضوية. وبمجرد تنقيته وكميته ، يمكن تجميع RNA والحمض النووي المعزول من ابار مختلفه من نفس الثقافة لزيادة الغلة.
ملاحظه: (1) في حين اننا نوصي بشده باستخدام هذه الطريقة استخراج الحمض النووي ل RNA ، وهناك العديد من الطرق الجيدة لعزل الحمض النووي من الخلايا المستزرعة. (2) للتاكد من وجود الخلايا السرطانية داخل الثقافة العضوية ، نوصي بترتيب الحمض النووي باستخدام طريقه التسلسل المفضلة للجيل التالي لتحديد الطفرات داخل الجينات المميزة ل PDAC (Kras ، TP53 ، SMAD4 ، CDKN2A).
- التنميط الدوائي لل PDAC العضوي
- عزل الخلايا المفردة من الهيكل العضوي كما هو موضح أعلاه في الخطوات 3.1 – 3.8. لتعظيم عدد الخلايا ، حصاد ما لا يقل عن 10 ابار متموج من 12 لوحه جيدا
- أعاده تعليق الخلايا المفردة في 1 مل من الوسائط العضوية البشرية الكاملة. وجود كتل الخلايا الصغيرة (~ 2 – 10 خلايا) مقبول ، ولكن كتل الخلايا الكبيرة سوف تؤثر سلبا علي تحليل المصب.
- عد الخلايا باستخدام عداد الخلية الألى وسجل قابليه الخلية. حساب العدد الإجمالي للخلايا والخلايا القابلة للحياة الموجودة في تعليق 1 مل.
- للاختبارات العلاجية ، لوحه 1,000 خلايا قابله للحياة لكل بئر من لوحه 384 جيدا. للوحه جيدا 384 نقدر اننا سوف تستخدم 400,000 خلايا قابله للحياة (محسوبة ل 400 الآبار).
- اعداد الخلايا للطلاء عن طريق الاختلاط علي الجليد 800 μL BME مع 7.2 mL من الوسائط الكاملة organoid التي تحتوي علي الخلايا. الحفاظ علي الخليط علي الجليد ولوحه 20 μL لكل بئر من لوحه 384 جيدا. استخدام ماصه 12 قناه والخزان الاحتفاظ علي الجليد للوحه بكفاءة الخلايا. لتجنب التبخر المفرط من لوحه ، يمكن استخدام الآبار الخارجية كخزان (60 μL المياه المعدنية أو الماء في بئر) ، ولكن هذا سوف يؤدي إلى فقدان 76 الآبار التجريبية.
- تدور لوحه أسفل في 100 x g لمده 1 دقيقه في دلو سوينغ. وهذا يسمح لحجم صغير 20 μL و organoids ليستقر في الجزء السفلي من لوحه.
- وضع لوحه في الحاضنة 37 درجه مئوية الانسجه ثقافة للسماح لتشكيل organoids. بعد 24 ساعة ، تحقق من وجود organoids باستخدام مجهر براوفيلد.
- المضي قدما في الجرعات المركبات العلاجية المذابة في DMSO علي لوحه باستخدام طابعه المخدرات أو ما يعادلها الصك. اختبار كل جرعه المخدرات في ما لا يقل عن ثلاث نسخ الآبار. لاجراء تحليل فعال للجرعة والاستجابة, تحديد نطاق الجرعة لكل دواء تجريبيا, بدءا من انخفاض, غير فعاله, جرعه وتنتهي مع جرعه عاليه حيث لوحظ اقصي قدر من التاثير. وقد نشرت مؤخرا أمثله لنطاقات الجرعات للمركبات العلاجية الكيميائية9.
- تعريض الخلايا للمركبات العلاجية لمده 3 – 5 أيام.
- اختياريا ، في نهاية الفحص ، صوره لوحه لتقييم التاثير العلاجي علي حجم organoid ، وعدد ، والمورفولوجية.
- تقييم القدرة علي البقاء باستخدام 20 μL لكل بئر من كاشف جدوى خليه التلالؤ (انظر جدول المواد) وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. سيكون مقياس الاناره ضروريا للحصول علي البيانات وبرنامج رسوم بيانيه لتحليل البيانات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لتوضيح التحديات المرتبطة بعزل العضو العضوي من PDAC ، فاننا نظهر إنشاء الثقافة العضوية المشتقة من المريض من عينه ورم هيبوسيلولار صغيره. بعد الطلاء الاولي ، فقط عدد قليل من العضوية كانت مرئية في البئر ، كما هو مبين في الشكل 1. وسمح للعضويين بالنمو بشكل أكبر علي مدي أسبوعين وكانوا بالمرور وفقا للبروتوكول الذي وضعناه لإنشاء ثقافة أكثر قوه ، كما هو مبين في البداية المبكرة والمتاخره للصور التمثيلية الاولي (الشكل 1). من المهم ان نلاحظ ان العضوية الكيسية الأكبر التي لوحظت في العزلة الاوليه المتاخره تم تقسيمها بسهوله إلى أجزاء أصغر خلال خلط الأرغن مع BME الجليد الباردة ، كما هو موضح في الخطوة 2.13.
لإثبات نتائج بروتوكول التنميط الدوائي ، قمنا باعداد خلايا واحده من العضوية الراسخة والسريعة النمو العضوي PDAC كما هو موضح في هذا البروتوكول. 1,000 الخلايا القابلة للحياة مطليه بشكل جيد ويسمح لاستعاده أكثر من 24 ساعة قبل وكلاء العلاج الكيميائي السامة للخلايا, Gemcitabine و Paclitaxel, وقد مداوي. أجرينا اختبار استجابه الجرعة من 9 نقاط في ثلاث نسخ تبدا بجرعة منخفضه من 100 م وتنتهي بجرعة عاليه من 2 μM. وبعد 5 أيام من العلاج ، اتخذت الصور التمثيلية للسيارة (DMSO) ، و 2 μM Gemcitabine ، و 2 μM Paclitaxel الآبار المعالجة (الشكل 2). وعلي الفور بعد التقاط الصور ، تم تقييم قابليه الخلية للبقاء باستخدام كاشف القدرة علي البقاء في الخلية ورسمها باستخدام برامج الرسوم البيانية (الشكل 2).
الشكل 1: يتم عرض الصور التمثيلية للعزل العضوي PDAC وكذلك بعد المقطع الأول. تظهر النقاط الزمنيه المبكرة (1-3 أيام) والمتاخره (من 7 إلى 10 أيام) لتوضيح النمو العضوي علي مر الزمن. شريط مقياس = 200 μm. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تحليل استجابه الجرعة. يسار تحليل استجابه الجرعة التمثيلية التي تم الحصول عليها باستخدام ثقافة اورجانيه PDAC المعمول بها ، مع الانحراف المعياري للثلاثيات التي تظهر كاشرطه خطا. حق في صور توضح التاثير في نهاية فحص السيارة (DMSO) وكذلك 2 μM Gemcitabine و 2 μM باكليتاكسيل. شريط مقياس = 100 μm. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا ، نقدم البروتوكولات الحالية لعزل وتوسيع وتوصيف العضوي PDAC المشتقة من المريض. لدينا معدل النجاح الحالي لإنشاء ثقافة organoid هو أكثر من 70 ٪. التالي ، فان هذه الأساليب لم تكتمل بعد ومن المتوقع ان تتحسن وتتطور مع مرور الوقت. وينبغي إيلاء الاعتبار الهام لحجم العينة ، حيث ان PDAC لديه شريط سينمائي منخفض الأورام. التالي ، فان العينات الصغيرة تحتوي علي عدد قليل من الخلايا السرطانية ، وسوف تولد سوي حفنه من organoids. بالاضافه إلى ذلك ، يتلقى العديد من المرضي العلاج الكيميائي و/أو المعالجة الاضافيه المستندة إلى chemoradiation قبل التدخل الجراحي15. إذا كان العلاج فعالا بالنسبة لمريض معين ، فقد تكون انسجه الورم خاليه من الخلايا القابلة للحياة. ويفضل الحصول علي عينات المريض الكيماوي الساذج للتحسين الاولي لهذه الطرق ، ولكن هذا ليس ممكنا دائما. ومن المثير للاهتمام اننا وجدنا ان نقص التروية الوقت بعد الاستئصال الجراحي للانسجه الورم ليس معيارا رئيسيا للعزل العضوي الناجح ، طالما يتم معالجه العينة في غضون 24 ساعة.
سرطان الغدد السرطانية في البنكرياس هو مرض يتميز بتفاعل قوي من البلاستيك وترسب مصفوفة الورم الكثيفة. في حين ان organoids هي أداه ممتازة للعزل السريع والتوسع في المقصورة الظهاريه ، فان النموذج لا يلخص سدي المعقدة من PDAC. المنهجيات الأخرى مثل المريض المستمدة xenografts16 أو الهواء واجهه السائل الثقافة17 السماح لحجره اللحمية ، ولكن قد يكون من الصعب توسيع بسرعة. عند اختيار نظام نموذجي ، يجب علي الباحث النظر بعناية نقاط القوه والضعف في كل6.
البيولوجيا غير المتجانسة لهذا المرض يؤثر علي إنشاء organoid كما تنمو بعض العضوية المشتقة من المريض بشكل جيد للغاية في ظروفنا في حين ان البعض الآخر إبطا بكثير بالمقارنة. البروتوكولات أعلاه تصف الشرط الغني wnt لعزل وتوسيع جميع العضوية المشتقة من المريض ، ولكن البعض الآخر قد أظهرت ان بعض الأورام المريض قادره علي النمو في غياب wnt وسائل الاعلام المكيفة11،12. سيلزم اجراء المزيد من الاختبارات لتحديد ما إذا كان استخدام مجموعه من الظروف الاعلاميه يعزز الإنشاء الناجح للعانويدات العضوية ، كما ثبت مؤخرا لسرطان المبيض العضوي18. ولكن هذا النهج متعدد الإرسال محدود بالعدد المنخفض للخلايا السرطانية التي يمكن عزلها عن عينات المريض الصغيرة. بالاضافه إلى ذلك ، يمكن ان تنشا organoids الاقنيه العادية غير المتحولة من العزلة العضوية ، وخاصه إذا كان النسيج الورم المتاخمة للانسجه العادية9. للحد من خطر التلوث العضوي الطبيعي ، يمكن تقسيم عينات الانسجه الكبيرة إلى أجزاء أصغر مستقله باستخدام الاختلافات المورفولوجية مثل الاوعيه الدموية جيدا (الدم مرئيا) مقابل المناطق الوعائية ، والعقيدات الصلبة مقابل الانسجه الرخوة.
الأساليب والبروتوكولات الموصوفة هنا هي النهج القياسية الحالية المستخدمة في مختبرنا للعزل العضوي وينبغي اختبارها وتكييفها لكل بيئة مختبريه. علي سبيل المثال ، التفكك الانزيمي (الخطوات 2.6 إلى 2.9) من الانسجه السرطانية مهم بشكل خاص لتحسين. الاختلافات المعدات الصغيرة (البندق مقابل الدوار خلاط) يمكن ان يؤدي إلى توقيت مختلفه بشكل كبير لهذه الخطوة. وعلاوة علي ذلك ، يمكن ضبط تفكك الانسجه بشكل جيد عن طريق زيادة أو تقليل تركيز الخليط كولاجيناز/الهيلونيداز. ويجب توخي الحذر لعدم معالجه جميع العينات بنفس الطريقة. علي سبيل المثال ، في بعض الحالات يمكن عزل العضو العضوي من استسقاء السائل من المرضي PDAC متقدمة دون التفكك الميكانيكية أو الانزيميه.
تسلسل الحمض النووي هو معيار الذهب الحالي لتحديد وجود أو عدم وجود الورم العضوي كما PDAC هو مدفوع بالطفرات المتكررة في KRAS ، TP53 ، SMAD4 و CDKN2A. يمكن للتحليل الناسخ ان يكشف عن أنواع فرعيه مختلفه من الأورام في حين ان التنميط الدوائي يمكنه الكشف عن نقاط الضعف العلاجية الخاصة بالمريض9. هذه البروتوكولات تمكن الباحثين PDAC لتطوير مكتبتهم الخاصة من العضوية المشتقة من المريض والتعريف بيولوجيا هذه النماذج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
Acknowledgments
ونحن ممتنون لدعم جامعه كاليفورنيا في سان دييغو Moores مركز السرطان الحيوي والانسجه الموارد المشتركة التكنولوجيا ، وأعضاء مختبر Lowy ، وجامعه كاليفورنيا في سان دييغو قسم الجراحة ، قسم الأورام الجراحية. ويدعم AML بسخاء من قبل المعاهد القومية للصحة CA155620, SU2C CRUK Lustgarten مؤسسه السرطان البنكرياس جائزه فريق الحلم (SU2C-20-16), والجهات المانحة للصندوق لعلاج سرطان البنكرياس.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 channel pipette (p20, p100, or p200) with tips | |||
| 12 well plates | Olympus | 25-106 | |
| 15 ml LoBind conical tubes | Eppendorf | EP0030122208 | |
| 15 ml tube Rotator and/or nutator | |||
| 37 °C CO2 incubator | |||
| 37 °C water bath | |||
| 384 well plates | Corning | 4588 | Ultra low attachment, black and optically clear |
| A 83-01 | TOCRIS | 2939 | |
| ADV DMEM | ThermoFisher | 12634010 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Automated cell counter | |||
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | Reagent that depolymerizes the Basement Membrane Extract at 4 °C |
| CellTiterGlow | Promega | G7570 | Luminescence cell viability reagent |
| Chloroform | Sigma | C2432 | |
| Computer | |||
| CryoStor CS10 | StemCELL Tech | 07930 | Cell Freezing Solution |
| Cultrex R-spondin1 (Rspo1) Cells | Trevigen | 3710-001-K | |
| DMEM | ATCC | 30-2002 | |
| DNase I | Sigma | D5025 | |
| Drug printer | Tecan | D300e | This is the drug printer we use in our laboratory |
| Excel | For data analysis | ||
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11150-10 | |
| FBS | ThermoFisher | 16000044 | |
| G-418 | ThermoFisher | 10131035 | |
| Gastrin I (human) | TOCRIS | 3006 | |
| Gentle Collagenase/hyaluronidase | STEMCELL Tech | 7919 | |
| GlutaMAX | ThermoFisher | 35050061 | Glutamine solution |
| GraphPad Prism | For data analysis | ||
| HEPES | ThermoFisher | 15140122 | |
| Laminar flow tissue culture hood | |||
| Luminometer | |||
| L-Wnt-3A expressing cells | ATCC | CRL-2647 | |
| MACS Tissue Storage Solution | Miltenyi biotec | 130-100-008 | |
| Matrigel Matrix | Corning | 356230 | Basement Membrane Extract (BME), growth factor reduced |
| Mr. Frosty Freezing Container | ThermoFisher | 5100-0001 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165 | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
| p1000 pipette with tips | |||
| p200 pipette with tips | |||
| PBS | ThermoFisher | 10010049 | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher | 15630080 | |
| primocin | InvivoGen | ant-pm-2 | |
| Rapid-Flow Filter Units (0.2 µm) | ThermoFisher | 121-0020 | |
| Recombinant Human FGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| Recombinant Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | |
| Sterile Disposable Scalpels, #10 Blade | VWR | 89176-380 | |
| Tissue culture centrifuge | |||
| Tissue Culture Dishes 10 cm | Olympus | 25-202 | |
| TRIZol | ThermoFisher | 15596018 | Acid Phenol solution |
| TrypLE Express | ThermoFisher | 12605010 | |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | |
| Zeocin | ThermoFisher | R25001 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).
- Khorana, A. A., Mangu, P. B., Katz, M. H. G. Potentially Curable Pancreatic Cancer: American Society of Clinical Oncology Clinical Practice Guideline Update Summary. Journal of Oncology Practice. 13 (6), 388-391 (2017).
- Winter, J. M., et al. 1423 pancreaticoduodenectomies for pancreatic cancer: A single-institution experience. Journal of Gastrointestinal Surgery. 10 (9), 1210-1211 (2006).
- Von Hoff, D. D., et al. Increased survival in pancreatic cancer with nab-paclitaxel plus gemcitabine. New England Journal of Medicine. 369 (18), 1691-1703 (2013).
- Conroy, T., et al. FOLFIRINOX versus gemcitabine for metastatic pancreatic cancer. New England Journal of Medicine. 364 (19), 1817-1825 (2011).
- Baker, L. A., Tiriac, H., Clevers, H., Tuveson, D. A. Modeling pancreatic cancer with organoids. Trends in Cancer. 2 (4), 176-190 (2016).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Tiriac, H., et al. Organoid Profiling Identifies Common Responders to Chemotherapy in Pancreatic Cancer. Cancer Discovery. 8 (9), 1112-1129 (2018).
- Tiriac, H., et al. Successful creation of pancreatic cancer organoids by means of EUS-guided fine-needle biopsy sampling for personalized cancer treatment. Gastrointestinal Endoscopy. , (2018).
- Seino, T., et al. Human Pancreatic Tumor Organoids Reveal Loss of Stem Cell Niche Factor Dependence during Disease Progression. Cell Stem Cell. 22 (3), 454-467 (2018).
- Huang, L., et al. Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell- and patient-derived tumor organoids. Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).
- Walsh, A. J., Castellanos, J. A., Nagathihalli, N. S., Merchant, N. B., Skala, M. C. Optical Imaging of Drug-Induced Metabolism Changes in Murine and Human Pancreatic Cancer Organoids Reveals Heterogeneous Drug Response. Pancreas. 45 (6), 863-869 (2016).
- Zhao, C. Wnt Reporter Activity Assay. Bio-Protocol. 4 (14), 1183 (2014).
- Conroy, T., et al. FOLFIRINOX or Gemcitabine as Adjuvant Therapy for Pancreatic Cancer. New England Journal of Medicine. 379 (25), 2395-2406 (2018).
- Jimeno, A., et al. A direct pancreatic cancer xenograft model as a platform for cancer stem cell therapeutic development. Molecular Cancer Therapeutics. 8 (2), 310-314 (2009).
- Neal, J. T., et al. Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment. Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).
- Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).
