Summary
胰腺导管腺癌患者衍生的有机体培养是一种快速建立的三维模型，代表高保真度的上皮肿瘤细胞室，从而能够对这种致命的恶性肿瘤进行转化研究。在这里，我们提供详细的方法来建立和传播有机体，以及使用这些模型执行相关的生物测定。
Abstract
胰腺导管腺癌（PDAC）是最致命的恶性肿瘤之一。最近，介绍了支持该疾病的三维（3D）建模的下一代有机体培养方法。患者衍生的有机体 （PDO） 模型可以从手术标本和小活检中分离出来，并在培养中快速形成。重要的是，有机体模型保存了在患者肿瘤中检测到的致病基因改变，并预测患者的治疗反应，从而支持转化研究。在这里，我们提供用于调整组织培养工作流程以研究3D、基体嵌入式、有机体模型的全面协议。我们详细介绍了隔离和传播初级 PDAC 有机体的方法和注意事项。此外，我们描述了在实验室中如何制备定制有机物介质并控制质量。最后，我们描述了有机体模型的下游表征的测定方法，如核酸分离（DNA和RNA）和药物测试。重要的是，我们为在研究实验室中实施有机体方法提供了重要的考虑因素。
Introduction
胰腺导管腺癌（PDAC）是一种致命的疾病，大多数患者诊断较晚，缺乏有效的治疗方法，导致5年总存活率较低，仍然低于10%1。只有20%的患者被诊断为局部疾病，适合治疗手术干预2，3。其余患者通常使用化疗剂的组合进行治疗，这些药物对少数患者有效4，5。为了满足这些紧迫的临床需求，研究人员正在积极研究早期发现策略和开发更有效的疗法。为了加速重要发现的临床翻译，科学家们正在采用基因工程小鼠模型、患者衍生异种移植物、单层细胞系，以及最近6个有机体模型。
利用生长因子和Wnt-ligand丰富条件刺激未转化祖细胞增殖的三维上皮有机体培养首先为小鼠肠道7进行了描述，并很快适应了正常的人类胰腺组织8。除了正常的导管组织，有机体方法允许分离，扩大和研究人类PDAC8。重要的是，该方法支持建立从手术标本，以及精细和核心针活检，使研究人员研究疾病的所有阶段9，10。有趣的是，患者衍生的有机物重述了描述良好的肿瘤转录组子型，并可能支持开发精密医学平台9，11。
目前PDAC的有机体方案使超过70%的患者样本成功地从化疗患者9中扩展。在这里，我们介绍了我们的实验室用于分离、扩展和表征患者衍生的PDAC有机体的标准方法。其他PDAC有机体方法已被描述12，13，但没有对这些方法进行比较。由于这项技术相对较新且发展迅速，我们预计这些协议将继续改进和改进;然而，组织处理和有机体培养的原则将继续有用。
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Protocol
所有用于研究的人体组织收集都经过内部审查委员会 （IRB） 的审查和批准。在哺乳动物组织培养实验室环境中，以下所有协议均在无菌条件下执行。
1. 媒体准备
- 有条件的介质准备。
注：人体胰腺有机体培养物需要丰富的生长因子和营养，以及条件性介质补充，为器官扩张提供足够的生长刺激。下面描述的两种条件介质都是从市售的细胞系制备的（见材料表）。有关完整的协议和材料，请参阅制造商的网站。- 根据制造商的协议生产 R-spondin1 调节介质。
- 首先，在血清丰富（10%）的情况下，使用适当的抗生素（Zeocin）选择方法扩展表达R-spondin1的293T细胞。当产生有条件的介质时，提取并洗去抗生素选择和血清，使最终条件介质中不存在抗生素和血清。重要的是，在收集后，必须对调节介质进行过滤灭菌（0.2 μm），以防止交叉污染。
- 将无用条件介质储存在 4°C 下，用于短期使用（6 个月内）或 -20°C，用于长期存储（6 个月以上）。应避免冻结-解冻循环。
- 根据制造商的协议生产 L-Wnt-3A 调节介质。
- 首先，在血清丰富（10%）的情况下，使用适当的抗生素（G-418）选择方法，扩大表达L-Wnt-3A的L-M（TK-）细胞。生产有条件介质时，提取并洗去抗生素选择，使最终调节介质中不存在抗生素;然而，在整个培养和调理过程中保持血清。重要的是，收集的调节介质必须经过过滤灭菌（0.2 μm），以防止交叉污染。
- 将无用空调介质储存在 4°C 以用于短期使用，或-20°C 用于长期存储。应避免冻结-解冻循环。
- 为了进行质量控制，根据先前发布的协议14，执行TOPFLASH测定，单独测试R-spondin1和L-Wnt-3A调节介质的Wnt活性。
- 根据制造商的协议生产 R-spondin1 调节介质。
- 基础介质准备：使用基础介质准备完整的有机体介质，以及器官工作的洗涤步骤。用最终浓度为1x的谷氨酰胺补充先进的DMEM/F-12，HEPES（10 mM）和青霉素/链霉素（100 U/mL）。将基底介质储存在 4°C 下。
- 有机体 完整的介质准备：用R-spondin1条件介质补充基基介质，最终浓度为10%v/v，L-Wnt-3A调节介质最终浓度为50%v/v， 人类EGF（50纳克/mL）、人类FGF（100纳克/mL）、人类胃一体I（10 nM）、小鼠诺金（100纳克/mL）、A83-01（500 nM）、B27补充剂（1x）、尼古丁酰胺（10 mM）、N-乙酰半胱氨酸（1.25 mM）和普列莫辛（100微克/mL）。
- 对于原发性有机体分离，解冻的有机体培养物和从单细胞开始的培养物包括Rho激酶抑制剂Y-27632，最终浓度为10.5μM。
- 在冰上制备人体器官完整介质，并在4°C下储存，在一个月内使用。因此，我们建议每周重新准备一次媒体。
2. PDAC有机体的隔离
注：在4°C环境（冰箱或冷藏室）的冰上解冻基底膜提取物（BME）溶液（生长因子降低;参见材料表），使用前至少12小时。在37°C培养箱中孵育组织培养板，在使用前至少12小时。
- 收集和运输手术切除的肿瘤标本，用于缓冲存储溶液中的研究，以保持组织的活力。使用基础介质或市售组织存储解决方案。
- 在收到标本后，尽快分离有机物。组织可储存在手术后长达24小时的储存溶液中，并且仍能产生有机物。
- 一旦进入实验室，将肿瘤转移到10厘米的组织培养盘，并取出储存溶液。
- 在用金属钳处理组织时，用#10手术刀将肿瘤切成1毫米3或更小的小碎片。较大的片段需要更长的时间才能消化;因此，旨在生成均质组织片段大小。如果组织已经分解或小于 1 mm3片段，请跳过此步骤。
- 将组织碎片转移到含有10 mL基底介质的15 mL锥形管中。通过反转管多次混合。将管在 200 x g下离心 5 分钟。旋转后，小心取下基底介质，以免失去组织碎片。
- 在含有组织片段的管中加入9 mL的基础培养基和10x温和胶原酶/海洛尼酶溶液。为了避免在消化过程中细胞聚集，用20μL的10mg/mL脱酸酶I溶液补充此溶液。通过反转管多次混合。
- 在37°C的营养器或旋转器上孵育酶消化。为了在消化过程中充分混合，组织碎片必须不断地通过溶液移动。
注：肿瘤酶分离的时间必须为每个标本进行经验确定。肿瘤的成功消化的特点是组织碎片的大小减少，直到肉眼无法清晰辨别。同时，随着微观组织片段的释放，溶液的不集中性将会增加。 - 30分钟后，从37°C培养箱中取出锥形管并观察。如果组织碎片仍然清晰可见，在37°C下继续解散，并持续混合。每30分钟重复一次这个观察，直到大部分或所有组织碎片分离。根据混合的严格性以及肿瘤片段的大小和数量，对于小样本，此步骤只需 30 分钟，对于较大的肿瘤样本，只需 12 小时。
- 一旦酶分离完成，将管在200 x g下离心5分钟。旋转后，细胞颗粒应该是可见的，上清液应该清晰，表明所有细胞都已从溶液中剥离出来。如果不是这样，请重复旋转。
- 小心地去除上清液，避免失去细胞颗粒。立即用10 mL基底介质清洗细胞，轻轻混合管与反转。在200 x g下将管子离心5分钟。小心地取出基底介质，避免细胞流失，并重复一次洗涤步骤，共洗两次。
- 第二次清洗后，小心地取下所有基底介质，并将管子放在冰上5分钟。
- 此时，将有机体完整介质的等分置于 37°C 水浴中进行预热。
- 将细胞颗粒与冰冷的BME混合，同时保持管在冰上。对于有机体分离，播种密度应很高。对于小颗粒（±50 μL体积），使用200μL的BME，而对于大颗粒（±200μL体积），使用800μL的BME。使用 p200 移液器将冰上的细胞和 BME 混合，直到溶液看起来均匀，同时避免在溶液中产生气泡。
- 使用 p200 移液器在预加热 12 孔板的井中心点一个 100 μL 圆顶。重复此操作，直到分发所有 BME 解决方案。小心地将板转移到 37°C 培养箱，使 BME 凝胶凝固。
- 10分钟后，取回板，并每孔加入1mL的预加热有机体完全介质。在井侧分配介质，以避免 BME 圆顶中断。
- 使用在明场使用4x透镜使用倒组织培养显微镜观察细胞片段。
注：单个细胞和微观组织片段应清晰可见。成功的隔离的特点是在24-48小时后出现10个以上有机体;文化应该在一周内汇平。由于肿瘤标本是异质的，一些有机体分离更具挑战性，因为只有少数有机体生长每井，如图1所示。在这种情况下，允许培养继续长达两周，以最大化可用于传递的细胞数。为了考虑培养过程中的介质消耗和蒸发，每 5 天用 200 μL 的预加热有机体完整介质加高培养物。
3. PDAC 有机体的传递
- 从组织培养箱中取回盘子。使用无菌细胞升降机，轻轻抬起 BME 圆顶，使其漂浮在整个介质中。避免刮井底部，以免去除附着在塑料上的任何单层细胞，因为这些细胞通常是成纤维细胞。
- 使用 p1000 移液器，小心地将 BME 圆顶和介质转移到 15 mL 锥形管中。对每口含有机物的井重复此步骤。
- 用1 mL的冷基底培养基轻轻清洗每口井，并转移到含有有机物的15 mL管中。
- 将溶液和有机物与p1000移液器彻底混合，以200 x g旋转5分钟。旋转后，在悬浮液中含有有机物的BME层和有机物颗粒将出现在管的底部。小心地去除上清液，避免BME/有机体层的损失。将管子放在冰上。
- 将10 mL的冰冷细胞回收溶液 （CRS） 添加到管中，并通过反转彻底混合。这将在4°C下去聚合凝胶BME的蛋白质基质。在冰上孵育30分钟，每3分钟通过倒置混合。如果可用，将管子放在冷室或 4°C 冰箱的旋转搅拌机上 30 分钟。
- 孵育30分钟后，在200 x g下旋转5分钟。有机物颗粒应明显，而BME层应消失。如果 BME 层尺寸减小但仍可见，则在 4°C 下再孵育 30 分钟，然后混合和重复旋转。
- 一旦BME被去聚，去除留下的有机物颗粒的CRS。与倒置混合，用10 mL基底介质清洗有机物。以 200 x g向下旋转 5 分钟，然后取出上清液。将带有有机物颗粒的管子放在冰上至少 5 分钟。
- 可有，如果需要单细胞制备，孵育3mL胰蛋白酶的有机物，辅以30μL10mg/mL DNAE溶液，以避免消化过程中细胞聚集。
- 在37°C下孵育酶反应，每2分钟进行一次温和的反演混合，长达10分钟。 监测并确认在明场显微镜下成功的单细胞解散。
- 要停止酶反应，加入10 mL的冰冷基底介质，并在200 x g下旋转5分钟。
- 通过温和倒置混合，用10 mL基底介质清洗细胞。以 200 x g旋转 5 分钟，取出上清液，再重复洗涤一次。将带细胞颗粒的管子放在冰上至少5分钟。
注意：我们建议在定期维护器官期间每 3-5 个通道执行此步骤，以生成具有大量有机物的同质培养物。
- 将冰冷的 BME 加入细胞颗粒，并在冰上轻轻混合，直到使用 p200 移液器将溶液均匀化。在避免在混合物中产生气泡的同时，移液器上下至少 5~10 倍，将移液器的尖端靠近管的底部，以帮助机械地分解有机体。作为指南，使用 BME/细胞颗粒体积的 4-6 倍，使分割比从一个通道到另一个通道不超过 1：2。
- 使用 p200 移液器在预加热 12 孔板的井中心点一个 100 μL 圆顶;重复，直到所有 BME 解决方案都已分发。小心地将板转移到 37°C 培养箱，使 BME 凝胶凝固。10分钟后，取回板，并每孔加入1mL的预加热有机体完全介质。在井侧分配介质，以避免 BME 圆顶中断。
- 有机体应在24小时内进行改造并开始生长。 组织素培养物通常要经过7-10天，这取决于培养密度和细胞增殖。如有必要，每 5 天用 200 μL 的预加热有机体完整介质加高培养物，以补偿生长因子消耗和蒸发。
4. PDAC有机体的冷冻和解冻
- 要冻结有机物，请按照步骤 3.1_3.7 中所述，继续采集有机物并去聚合 BME。
- 在细胞颗粒中，加入1mL的冷冻介质，轻轻混合，并将混合物转移到预先标记的冷冻液中。
- 将冷冻室放入冷冻容器中，以保持安全恒定的温度降低，并放置在-80°C冷冻箱中。24至48小时后，将冷冻小瓶转移到液氮储存中。使用这种方法，有机体可以冷冻数月到数年。
- 要解冻有机物，从液氮储存中取回冷冻冷冻物。将冷冻小瓶运送到组织培养室。
- 将冷冻冷冻液放入37°C水浴中，迅速解冻有机物，并将小瓶内内容物转移到含有9 mL基底介质的15 mL锥形管中加热至室温。
- 以 200 x g向下旋转 5 分钟，然后取出上清液。将带有有机物颗粒的管子放在冰上至少 5 分钟。
- 继续在 BME 中重新悬浮，并按照步骤 3.9_3.11 中所述为有机体板。
注意：有机体培养物在冻结/解冻周期后恢复缓慢，因此培养物在通过前可能生长长达两周。
5. PDAC有机物的特性
注：器官的表征应在若干通道后在已建立的培养物上进行，以减少非上皮细胞类型（如成纤维细胞和免疫细胞）的污染风险。
- 从PDAC有机物中提取核酸
- 12孔板上的板状有机物，专用于核酸提取。每孔的BME的板数不超过100μL。对于足够的DNA/RNA产量，每个培养层至少打2⁄4口井。生长有机物长达5天，直到培养物接近融合，但不存在在长期培养中积累的过多细胞碎片。
- 从 37°C 培养箱中取回板，并完全去除所有有机体完整介质的痕迹，只留下板上含有有机物的 BME 圆顶。
- 在每个井中加入900 μL的酸酚试剂（见材料表），并使用p1000移液器彻底混合，直到溶液变均匀为止。BME将完全溶解在酸酚试剂中，有机体在5分钟的孵育后会赖舍。
注意：酸性苯酚是一种可引起化学烧伤的危险化学品。使用适当的保护和技术小心处理。 - 将同质溶液转移到2 mL管中，加入200μL的氯仿。孵育5分钟，在12，000 x g下孵化15分钟，在4°C下。
- 根据制造商的协议进行RNA和DNA提取。RNA可以从水相中提取，而DNA可以从相间和有机相中提取。一旦纯化和量化，从同一培养的不同孔中分离出的RNA和DNA可以汇集起来，以提高产量。
注：（1） 虽然我们强烈建议将这种核酸提取方法用于RNA，但有许多好方法可以分离出DNA与培养细胞。（2） 为了确定有机体培养中是否存在肿瘤细胞，我们建议使用您首选的下一代测序方法对DNA进行测序，以识别PDAC标志基因（KRAS、TP53、SMAD4、CDKN2A）内的突变。
- PDAC有机体的药理学
- 如上文步骤3.1~3.8所述，从有机物中分离单个细胞。为了最大化细胞数量，收获至少10口12孔板的汇流井
- 在1mL人体器官完整培养物中重新悬浮单个细胞。小细胞团群（±2~10细胞）的存在是可以接受的，但是较大的细胞团块会对下游分析产生负面影响。
- 使用自动细胞计数器对细胞进行计数，并记录细胞的生存能力。计算 1 mL 悬架中存在的细胞和活细胞的总数。
- 用于治疗性测试，每孔 384 孔板的板 1，000 个活细胞。对于 384 孔板，我们估计将使用 400，000 个活细胞（计算 400 口孔）。
- 通过在含有细胞的7.2 mL有机体完整介质中混合800μL的BME，制备电镀细胞。将混合物放在冰面上，每口 384 孔板的板 20 μL。使用保存在冰上的12通道移液器和储液罐，有效地盘片电池。为了避免板材过度蒸发，外井可用作储液罐（每口井60μL PBS或水），但这将导致76口实验井流失。
- 在回转铲斗中，以 100 x g将板向下旋转 1 分钟。这允许小 20 μL 体积和有机物在板的底部沉降。
- 将板放在37°C组织培养箱中，使有机物形成。24小时后，使用明场显微镜检查是否存在有机物。
- 使用药物打印机或等效仪器将溶解在 DMSO 中的治疗性化合物添加到板上。在至少三倍的井中测试每种药物剂量。要执行有效的剂量反应分析，请根据经验确定每种药物的剂量范围，从低剂量、无效剂量开始，以观察到最大效果的高剂量结束。化疗化合物的剂量范围的例子最近已经发表9。
- 将细胞暴露于治疗化合物中3~5天。
- 或者，在测定结束时，将板图像化，以评估对器官大小、数量和形态的治疗效果。
- 根据制造商的协议，使用每孔发光细胞活力试剂20μL（见材料表）评估生存能力。数据采集需要光度计，数据分析需要图形软件。
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Representative Results
为了说明与从PDAC分离有机体相关的挑战，我们展示了从小低细胞肿瘤样本中建立患者衍生的有机体培养物。初始电镀后，每口井只可以看到几个有机物，如图1所示。有机体被允许在2周内变大，并根据我们的协议通过，以建立一个更强大的文化，如早期和后期段落1代表性图片（图1）。需要注意的是，在晚期原体分离物中观察到的较大的囊性有机体在有机物与冰冷的BME混合过程中很容易分解成更小的碎片，如步骤2.13所述。
为了证明药典方案的结果，我们根据该协议中所述，从已建立且快速生长的具有代表性的PDAC有机体制备了单个细胞。每口井中镀有1，000个活细胞，在细胞毒性化疗剂Gemcitabine和Paclitaxel被给之前，允许在24小时以上恢复。我们在三联中进行了9点剂量反应测定，从低剂量100 pM开始，以2μM的高剂量结束。经过5天的处理，为车辆（DMSO）、2 μM Gemcitabine和2μM帕利塔塞尔处理井拍摄了具有代表性的照片（图2）。拍照后，立即使用发光细胞活力试剂评估细胞活力，并使用绘图软件绘制（图2）。
图1：第一次通道后，显示了PDAC有机体隔离的代表性图片。早期（1~3天）和晚点（7~10天）都显示出来说明器官随时间的生长。比例尺 = 200 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：剂量反应分析。（左）使用已建立的PDAC有机体培养物获得代表性剂量响应分析，三分位的标准偏差显示为误差条。（右）图片说明在车辆 （DMSO） 处理的测定结束时的效果，以及 2 μM Gemcitabine 和 2 μM 帕利塔塞尔。比例尺 = 100 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
在这里，我们提出用于隔离、扩展和描述患者衍生的PDAC有机体的当前方案。目前，我国建立有机体栽培的成功率超过70%;因此，这些方法尚未完善，并有望随着时间的推移而改进和发展。应重视样本大小，因为PDAC具有低肿瘤细胞性。因此，小标本将包含很少的肿瘤细胞，并且只会产生少量的有机物。此外，许多患者在手术干预15之前接受化疗和/或化疗为基础的新辅助治疗。如果治疗对特定患者有效，肿瘤组织可能缺乏活细胞。在最初优化这些方法时，最好采集化疗患者样本，但这并不总是可能的。有趣的是，我们发现，在手术切除肿瘤组织之后的缺血时间不是成功分离有机体的主要标准，只要样品在24小时内处理。
胰腺导管腺癌是一种疾病，其特征是具有很强的脱塑性反应和致密的基质基质沉积。虽然有机体是上皮腔快速隔离和扩展的极好工具，但该模型并不重述PDAC的复杂频闪。其他方法，如患者衍生的异种移植16或空气液体界面培养17允许一个基质隔间，但他们可能难以迅速扩展。在选择模型系统时，研究者应仔细考虑每个6的优缺点。
这种疾病的异质生物学影响器官的建立，因为一些患者衍生的有机体在我们的条件下生长得非常好，而其他则比比较慢得多。上述协议描述了一个Wnt配体丰富的条件，以分离和扩大所有患者衍生的有机体，但其他人已经表明，一些病人的肿瘤能够在没有Wnt条件介质11，12生长。需要进一步的测试，以确定是否使用一系列介质条件加强有机体的成功建立，如最近证明卵巢癌有机体18。然而，这种多路复用方法受到从小患者样本中分离的肿瘤细胞数量少的限制。此外，正常的未转化的导体器官可能来自有机体分离，特别是如果肿瘤组织是毗邻正常组织9。为了降低正常有机体污染的风险，较大的组织样本可以使用形态差异（如血管化（血液可见）与血管下区域、硬结节与软组织）细分为更小的独立片段。
此处介绍的方法和协议是我们实验室中用于有机体分离的当前标准方法，它们应针对每个实验室环境进行测试和调整。例如，肿瘤组织的酶分离（步骤2.6至2.9）对优化尤为重要。设备差异小（螺母与旋转器混合器）可能导致此步骤的时序明显不同。此外，组织解散可以通过增加或减少胶原酶/海洛尼酶混合物的浓度来微调。必须小心不要以同样的方式处理所有样品。例如，在某些情况下，有机体可以从高级 PDAC 患者的腹水液中分离出来，无需机械或酶分离。
DNA测序是当前的黄金标准，以确定肿瘤有机体是否存在，因为PDAC是由KRAS、TP53、SMAD4和CDKN2A的频繁突变驱动的。转录组分析可以揭示不同的肿瘤亚型，而药典可以发现患者特定的治疗弱点9。这些协议使PDAC研究人员能够开发自己的患者衍生器官库，并分析这些模型的生物学特征。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢加州大学圣地亚哥摩尔斯癌症中心生物储存和组织技术共享资源，洛伊实验室的成员，以及加州大学圣地亚哥外科部，外科肿瘤科的支持。AML 得到 NIH CA155620、SU2C CRUK 卢斯特加滕基金会胰腺癌梦团队奖（SU2C-AACR-DT-20-16）的慷慨支持，以及治疗胰腺癌基金的捐赠者。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 channel pipette (p20, p100, or p200) with tips | |||
| 12 well plates | Olympus | 25-106 | |
| 15 ml LoBind conical tubes | Eppendorf | EP0030122208 | |
| 15 ml tube Rotator and/or nutator | |||
| 37 °C CO2 incubator | |||
| 37 °C water bath | |||
| 384 well plates | Corning | 4588 | Ultra low attachment, black and optically clear |
| A 83-01 | TOCRIS | 2939 | |
| ADV DMEM | ThermoFisher | 12634010 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Automated cell counter | |||
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | Reagent that depolymerizes the Basement Membrane Extract at 4 °C |
| CellTiterGlow | Promega | G7570 | Luminescence cell viability reagent |
| Chloroform | Sigma | C2432 | |
| Computer | |||
| CryoStor CS10 | StemCELL Tech | 07930 | Cell Freezing Solution |
| Cultrex R-spondin1 (Rspo1) Cells | Trevigen | 3710-001-K | |
| DMEM | ATCC | 30-2002 | |
| DNase I | Sigma | D5025 | |
| Drug printer | Tecan | D300e | This is the drug printer we use in our laboratory |
| Excel | For data analysis | ||
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11150-10 | |
| FBS | ThermoFisher | 16000044 | |
| G-418 | ThermoFisher | 10131035 | |
| Gastrin I (human) | TOCRIS | 3006 | |
| Gentle Collagenase/hyaluronidase | STEMCELL Tech | 7919 | |
| GlutaMAX | ThermoFisher | 35050061 | Glutamine solution |
| GraphPad Prism | For data analysis | ||
| HEPES | ThermoFisher | 15140122 | |
| Laminar flow tissue culture hood | |||
| Luminometer | |||
| L-Wnt-3A expressing cells | ATCC | CRL-2647 | |
| MACS Tissue Storage Solution | Miltenyi biotec | 130-100-008 | |
| Matrigel Matrix | Corning | 356230 | Basement Membrane Extract (BME), growth factor reduced |
| Mr. Frosty Freezing Container | ThermoFisher | 5100-0001 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165 | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
| p1000 pipette with tips | |||
| p200 pipette with tips | |||
| PBS | ThermoFisher | 10010049 | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher | 15630080 | |
| primocin | InvivoGen | ant-pm-2 | |
| Rapid-Flow Filter Units (0.2 µm) | ThermoFisher | 121-0020 | |
| Recombinant Human FGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| Recombinant Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | |
| Sterile Disposable Scalpels, #10 Blade | VWR | 89176-380 | |
| Tissue culture centrifuge | |||
| Tissue Culture Dishes 10 cm | Olympus | 25-202 | |
| TRIZol | ThermoFisher | 15596018 | Acid Phenol solution |
| TrypLE Express | ThermoFisher | 12605010 | |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | |
| Zeocin | ThermoFisher | R25001 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).
- Khorana, A. A., Mangu, P. B., Katz, M. H. G. Potentially Curable Pancreatic Cancer: American Society of Clinical Oncology Clinical Practice Guideline Update Summary. Journal of Oncology Practice. 13 (6), 388-391 (2017).
- Winter, J. M., et al. 1423 pancreaticoduodenectomies for pancreatic cancer: A single-institution experience. Journal of Gastrointestinal Surgery. 10 (9), 1210-1211 (2006).
- Von Hoff, D. D., et al. Increased survival in pancreatic cancer with nab-paclitaxel plus gemcitabine. New England Journal of Medicine. 369 (18), 1691-1703 (2013).
- Conroy, T., et al. FOLFIRINOX versus gemcitabine for metastatic pancreatic cancer. New England Journal of Medicine. 364 (19), 1817-1825 (2011).
- Baker, L. A., Tiriac, H., Clevers, H., Tuveson, D. A. Modeling pancreatic cancer with organoids. Trends in Cancer. 2 (4), 176-190 (2016).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Tiriac, H., et al. Organoid Profiling Identifies Common Responders to Chemotherapy in Pancreatic Cancer. Cancer Discovery. 8 (9), 1112-1129 (2018).
- Tiriac, H., et al. Successful creation of pancreatic cancer organoids by means of EUS-guided fine-needle biopsy sampling for personalized cancer treatment. Gastrointestinal Endoscopy. , (2018).
- Seino, T., et al. Human Pancreatic Tumor Organoids Reveal Loss of Stem Cell Niche Factor Dependence during Disease Progression. Cell Stem Cell. 22 (3), 454-467 (2018).
- Huang, L., et al. Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell- and patient-derived tumor organoids. Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).
- Walsh, A. J., Castellanos, J. A., Nagathihalli, N. S., Merchant, N. B., Skala, M. C. Optical Imaging of Drug-Induced Metabolism Changes in Murine and Human Pancreatic Cancer Organoids Reveals Heterogeneous Drug Response. Pancreas. 45 (6), 863-869 (2016).
- Zhao, C. Wnt Reporter Activity Assay. Bio-Protocol. 4 (14), 1183 (2014).
- Conroy, T., et al. FOLFIRINOX or Gemcitabine as Adjuvant Therapy for Pancreatic Cancer. New England Journal of Medicine. 379 (25), 2395-2406 (2018).
- Jimeno, A., et al. A direct pancreatic cancer xenograft model as a platform for cancer stem cell therapeutic development. Molecular Cancer Therapeutics. 8 (2), 310-314 (2009).
- Neal, J. T., et al. Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment. Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).
- Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).
