Summary
Patient-afledte organoid kulturer af pancreas duktalt adenokarcinom er en hurtigt etableret 3-dimensionel model, der repræsenterer epiteliale tumor celle rum med høj pålidelighed, muliggør Translationel forskning i denne dødbringende malignitet. Her giver vi detaljerede metoder til at etablere og udbrede organoider samt til at udføre relevante biologiske assays ved hjælp af disse modeller.
Abstract
Pancreatisk duktalt adenocarcinom (pdac) er blandt de mest dødbringende maligniteter. For nylig, næste generations organoid kultur metoder muliggør den 3-dimensionelle (3D) modellering af denne sygdom er blevet beskrevet. Patient afledte organoid-modeller (Bob) kan isoleres fra både kirurgiske prøver og små biopsier og dannes hurtigt i kulturen. Det er vigtigt, at organoid-modellerne bevarer de patogene genetiske ændringer, der påvises i patientens tumor, og er prædiktiv for patientens behandlingsrespons, hvilket muliggør translationelle undersøgelser. Her giver vi omfattende protokoller til tilpasning af vævskultur workflow for at studere 3D, matrix indlejret, organoid-modeller. Vi detaljeret metoder og overvejelser for isolering og formeringsmateriale primære PDAC organoider. Desuden beskriver vi, hvordan specialfremstillede organoid-medier forberedes og kvalitetskontrolleres i laboratoriet. Endelig beskriver vi assays for downstream karakterisering af organoide modeller såsom isolering af nukleinsyre (DNA og RNA), og Drug test. Vigtigst af alt giver vi kritiske overvejelser for at implementere organoid metodologi i et forskningslaboratorium.
Introduction
Pancreas duktalt adenocarcinom (pdac) er en dødelig sygdom karakteriseret ved sen diagnose hos de fleste patienter, en mangel på effektive terapier, og en resulterende lav 5-årige samlede overlevelse, der forbliver mindre end 10%1. Kun 20% af patienterne diagnosticeres med en lokaliseret sygdom, der egner sig til helbredende kirurgisk indgreb2,3. De resterende patienter behandles typisk med en kombination af kemoterapeutika, der er effektive hos et mindretal af patienter4,5. For at imødegå disse presserende kliniske behov arbejder forskerne aktivt på tidlige detekterings strategier og udvikling af mere effektive terapier. For at fremskynde klinisk oversættelse af vigtige opdagelser, er forskerne beskæftiger genmanipulerede musemodeller, patient afledte xenografts, enkeltlags celler linjer, og senest, organoid modeller6.
Tredimensionel epitelial organoid kultur ved hjælp af vækstfaktor og WNT-ligand rige betingelser for at stimulere spredningen af ikke-transformerede stamceller blev først beskrevet for musens tarm7 og blev hurtigt tilpasset til det normale humane pancreasvæv8. Ud over normal duktalt væv, organoid metodologi giver mulighed for isolation, ekspansion, og undersøgelse af humane pdac8. Vigtigere, metoden understøtter etableringen af organoider fra kirurgiske prøver, samt fine og centrale nåle biopsier, så forskerne kan studere alle stadier af sygdommen9,10. Interessant, patient-afledte organoider rekapitulere velbeskrevne tumor transkriptomic undertyper og kan muliggøre udvikling af præcisionsmedicin platforme9,11.
Nuværende organoid protokoller for PDAC muliggøre en vellykket udvidelse af mere end 70% af patientprøver fra kemo-naive patienter9. Her præsenterer vi de standardmetoder, som vores laboratorium har anvendt til at isolere, udvide og karakterisere patient afledte PDAC-organoider. Andre pdac organoid metoder er blevet beskrevet12,13 men ingen sammenligning af disse metode er blevet grundigt udført. Da denne teknologi er relativt ny og skrider hurtigt frem, forventer vi, at disse protokoller vil fortsætte med at udvikle sig og forbedre; men principperne for vævs håndtering og organoid kultur vil fortsat være nyttige.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Al indsamling af humane væv til forskningsbrug blev gennemgået og godkendt af vores interne revisions nævn (IRB). Alle følgende protokoller udføres under aseptiske forhold i et miljø med vævskultur i pattedyr.
1. forberedelse af medierne
- Konditioneret medie forberedelse.
Bemærk: den menneskelige bugspytkirtel organoid medier kræver rigelige vækstfaktorer og næringsstoffer samt konditioneret medier tilskud til at give tilstrækkelig vækststimulation for organoid ekspansion. Begge konditionerede medier, der er beskrevet nedenfor, er fremstillet af kommercielt tilgængelige cellelinjer (Se tabel over materialer). For komplette protokoller og materialer henvises til producentens websteder.- Producere R-spondin1 konditionerede medier i henhold til producentens protokol.
- Først udvide de 293T celler udtrykker R-spondin1 ved hjælp af passende antibiotika (Zeocin) udvælgelsesmetoder i nærværelse af rigelige serum (10%). Ved fremstilling af konditionerede medier, trække og vaske væk antibiotika udvælgelse og serum sådan, at ingen antibiotika og serum er til stede i den endelige konditioneret medier. Vigtigere er det konditionerede medier skal filtreres steriliseres efter opsamling (0,2 μm) for at forhindre krydskontaminering.
- Opbevar aliciterede konditionerede medier ved 4 °C til kort tids brug (inden for 6 måneder) eller ved-20 °C til langtidsopbevaring (mere end 6 måneder). Fryse-tø cyklusser bør undgås.
- Producere L-WNT-3A konditionerede medier i henhold til producentens protokol.
- Først udvider L-M (TK-) celler, som udtrykker L-WNT-3A ved hjælp af passende antibiotika (G-418) udvælgelsesmetoder i nærværelse af rigelige serum (10%). Ved fremstilling af konditionerede medier, trækkes og vaskes den antibiotika-selektion væk, således at der ikke findes antibiotika i de endelige konditionerede medier. Men, opretholde serum i hele dyrkning og konditionering. Vigtigere de indsamlede konditionerede medier skal filtreres steriliseret (0,2 μm) for at forhindre krydskontaminering.
- Opbevar det aliciterede konditionerede medie ved 4 °C til kort tids brug eller-20 °C til langtidsopbevaring. Fryse-tø cyklusser bør undgås.
- For kvalitetskontrol, udføre en TOPFLASH-analyse for at teste WNT-aktiviteten af R-spondin1 og L-WNT-3A-konditionerede medier alene og i kombination i henhold til en tidligere offentliggjort protokol14.
- Producere R-spondin1 konditionerede medier i henhold til producentens protokol.
- Basal Media forberedelse: Brug basal Media til fremstilling af komplette organoid medier samt vaske trin for organoid arbejde. Supplement Advanced DMEM/F-12 med glutamin i en endelig koncentration af 1x, HEPES (10 mM), og penicillin/streptomycin (100 U/mL). Opbevar basal mediet ved 4 °C.
- Organoid komplet medie forberedelse: supplere basal medierne med R-spondin1 konditionerede medier i en endelig koncentration på 10% v/v, L-WNT-3A konditionerede medier i en endelig koncentration på 50% v/v, Human EGF (50 ng/mL), humant FGF (100 ng/mL), humant gastrin I (10 nM), mus Noggin (100 ng/mL), A83-01 (500 nM), B27 supplement (1x), nicotinamid (10 mM), N-acetylcystein (1,25 mM), og Primocin (100 μg/mL).
- For primære organoid isoleringer, optøede organoid kulturer og kulturer begyndende med enkeltceller, omfatter Rho kinase inhibitor Y-27632 i en endelig koncentration på 10,5 μM.
- Forbered den menneskelige organoid komplette medier på is og opbevares ved 4 °C til brug inden for en måned. Derfor anbefaler vi en frisk ugentlig forberedelse af medierne.
2. isolering af PDAC-Organoider
Bemærk: tø opløsningen af kælderen membran ekstrakt (BME) (vækstfaktor reduceret; Se tabel over materialer) på is i et 4 °c-miljø (køleskab eller kølerum) i mindst 12 timer før brug. Inkubér vævskultur pladerne for organoid-kulturen i en 37 °C-inkubator i mindst 12 timer før brug.
- Indsamle og transportere en kirurgisk fjernet tumorprøve til forskning i en buffered opbevaring løsning for at opretholde levedygtigheden af vævet. Brug basal medier eller en kommercielt tilgængelig vævs opbevaringsløsning.
- Fortsæt med at isolere organoider så hurtigt som muligt efter modtagelse af præparatet. Væv kan opbevares i opbevaringsopløsningen op til 24 timer efter operationen og stadig give organoider.
- En gang i laboratoriet, overføre tumor til en 10 cm vævskultur skål og fjerne opbevaringsløsning.
- Mens du håndterer vævet med metalliske pincet, hakker tumoren med en #10 skalpel i små fragmenter af 1 mm3 eller mindre. Større fragmenter vil tage længere tid at fordøje; Derfor har til formål at generere homogene væv fragment størrelser. Hvis vævet allerede er disaggregeret eller i mindre end 1 mm3 fragmenter, springe dette trin.
- Vævs fragmenter overføres til et 15 mL konisk rør indeholdende 10 mL basal medie. Bland ved at invertere røret flere gange. Centrifuger røret ved 200 x g i 5 min. Efter spin, fjerne de basale medier omhyggeligt for at undgå at miste vævs fragmenter.
- Til røret indeholdende vævs fragmenter tilsættes 9 mL basal medie og 1 mL 10x blid Kollagenase/hyaluronidase opløsning. For at undgå sammenklumpning af celler under fordøjelsen suppleres denne opløsning med 20 μL 10 mg/mL DNAse I-opløsning. Bland ved at invertere røret flere gange.
- Den enzymatiske fordøjelse ved 37 °C inkubates på en nutator eller rotator. For tilstrækkelig blanding under fordøjelsen skal vævs fragmenterne konstant bevæge sig gennem opløsningen.
Bemærk: timing for denne enzymatiske dissociation af tumoren skal bestemmes empirisk for hver prøve. En vellykket fordøjelse af tumoren er karakteriseret ved faldet i størrelsen af vævs fragmenter, indtil de ikke er tydeligt mærkbare for det blotte øje. Samtidig vil opaciteten af opløsningen øges, når mikroskopiske vævs fragmenter frigives. - Efter 30 min., Fjern det koniske rør fra 37 °C inkubator og observere. Hvis vævs fragmenterne stadig er tydeligt synlige, fortsættes dissociationen ved 37 °C med konstant blanding. Gentag denne observation hver 30 min., indtil de fleste eller alle vævs fragmenter er blevet dissocieret. Afhængigt af strenghed af blanding samt størrelsen og mængden af tumor fragmenter, dette trin kan tage så lidt som 30 min for små prøver eller så længe 12 h for større tumorprøver.
- Når den enzymatiske dissociation er afsluttet, centrifugeres røret ved 200 x g i 5 minutter. Efter spin skal en celle pellet være synlig, og supernatanten skal være klar, hvilket indikerer, at alle celler er spundet ud af opløsningen. Hvis det ikke er tilfældet, gentages spin.
- Fjern forsigtigt supernatanten for at undgå at miste celle pellet. Vask straks cellerne med 10 mL basal medie ved forsigtigt at blande rørene med inversion. Centrifuger røret ved 200 x g i 5 min. Fjern forsigtigt de basale medier for at undgå at miste celler og Gentag dette vaske trin en gang til i alt to skyller.
- Efter den anden vask, fjerne alle de basale medier omhyggeligt og placere røret på is i 5 min.
- På dette tidspunkt, placere en alikvot organoid komplette medier i en 37 °C vandbad til præ-varm.
- Bland celle pellet med iskold BME, mens du vedligeholder røret på isen. Såning tæthed bør være høj for organoid isolation. For en lille pellet (~ 50 μL volumen) Brug 200 μL af BME, mens for en stor pellet (~ 200 μL volumen) bruge 800 μL af BME. Bland cellerne og BME på isen ved hjælp af en P200 pipette, indtil opløsningen virker homogen, samtidig med at du undgår at skabe bobler i opløsningen.
- Spot en 100 μL kuppel i midten af en brønd med en pre-opvarmet 12 brønd plade ved hjælp af en P200 pipette. Gentag dette, indtil alle BME-opløsningen er blevet dispenseret. Overfør forsigtigt pladen til 37 °C-inkubator for at gøre det muligt for GME gel at størkne.
- Efter 10 min, hente pladen og tilsæt 1 mL præ-varmet organoid komplette medier per brønd. Dispensere medierne på siden af brønden for at undgå afbrydelse af BME Dome.
- Overhold celle fragmenter ved hjælp af en inverteret vævskultur mikroskop ved hjælp af en 4X linse i brightfield.
Bemærk: enkeltceller og mikroskopiske vævs fragmenter skal være tydeligt synlige. En vellykket isolation er karakteriseret ved fremkomsten af mere end 10 organoider efter 24 – 48 h; kulturen skal være flydende inden for en uge. Da tumorprøver er heterogene, er nogle organoid isoleringer mere udfordrende, da kun nogle få organoider vokser pr. brønd, som vist i figur 1. I dette tilfælde tillader kulturen at fortsætte i op til to uger for at maksimere antallet af celler til rådighed for passaging. For at aflægge regnskab for medieforbrug og fordampning under kulturen, skal du supplere kulturerne med 200 μL præ-opvarmet organoid komplette medier hver 5.
3. passaging af PDAC Organoids
- Hent pladen fra vævskultur inkubator. Med en steril celle løfteren, løft forsigtigt BME Dome sådan, at den flyder i hele medierne. Undgå skrabning bunden af brønden for ikke at fjerne nogen enkeltlags celler knyttet til plastik, da disse er typisk fibroblaster.
- Med en P1000-pipette overføres BME-kuplen og mediet forsigtigt til et 15 mL konisk rør. Gentag dette trin for hver organoid-holdige brønd.
- Vask forsigtigt hver brønd, der blev høstet med 1 mL kolde basal medier, og Overfør til 15 mL røret indeholdende organoiderne.
- Bland opløsningen og organoider grundigt med en P1000-pipette, og drej den ned ved 200 x g i 5 minutter. Efter spinding vises et BME-lag indeholdende organoider i suspension og en organoid pellet i bunden af røret. Fjern forsigtigt supernatanten, og undgå tab af BME/organoid-laget. Anbring røret på is.
- Tilsæt 10 mL iskold celle genvindings opløsning (CRS) til røret og bland grundigt efter inversion. Dette vil depolymerisere protein matricer af den Gerede BME ved 4 °C. Inkuber på is i 30 minutter, mens du blander hver 3 min. ved inversion. Hvis det er muligt, Placer røret på en roterende mixer i et kølerum eller 4 °C køleskab i 30 min.
- Efter 30 min inkubation, spin ned på 200 x g i 5 min. Organoid pellet skal være synlige, mens BME lag skal være væk. Hvis BME-laget er faldet i størrelse, men stadig synligt, Inkuber i yderligere 30 min ved 4 °C med blanding og Gentag spin.
- Når BME er blevet depolymeriseret, Fjern CRS forlader organoid pellet. Organoider vaskes med 10 mL basal medie ved blanding med inversion. Spin ned på 200 x g i 5 min og Fjern supernatanten. Placer røret med organoid pellet på is i mindst 5 min.
- Hvis der ønskes en enkelt celle tilberedning, inkubaterer organoiderne med 3 mL trypsin suppleret med 30 μL 10 mg/mL DNAse I-opløsning for at undgå sammenklumpning af celler under fordøjelsen.
- Den enzymatiske reaktion inkubates ved 37 °c med blid inversion blanding hver 2 min i op til 10 min. Monitor og bekræfte vellykket enkelt celle dissociation under lysfelt mikroskop.
- For at stoppe den enzymatiske reaktion tilsættes 10 mL iskold basal Media og spinne ned ved 200 x g i 5 min.
- Vask celler med 10 mL basal medie ved at blande med blid inversion. Spin ned på 200 x g i 5 min og Fjern supernatanten og Gentag vask en gang til. Anbring røret med celle pellet på is i mindst 5 minutter.
Bemærk: Vi anbefaler at udføre dette trin hver 3-5 passager under regelmæssig vedligeholdelse af organoider til at generere homogen kultur med et stort antal organoider.
- Tilsæt iskold BME til celle pellet og bland forsigtigt på is, indtil opløsningen er homogen ved hjælp af en P200 pipette. Mens du undgår at generere bobler i blandingen, pipetter op og ned mindst 5 – 10x, placere spidsen af pipetten tæt på bunden af røret for at hjælpe mekanisk bryde op organoider. Som en vejledning skal du bruge 4 – 6x volumenet af BME/celle pellet sådan, at opsplitnings forholdet ikke er mere end 1:2 fra den ene passage til den anden.
- Spot en 100 μL kuppel i midten af en brønd af en præ-varmet 12 brønd plade ved hjælp af en P200 pipette; Gentag, indtil alle BME-opløsningen er blevet dispenseret. Overfør forsigtigt pladen til 37 °C-inkubator for at gøre det muligt for GME gel at størkne. Efter 10 min, hente pladen og tilsæt 1 mL præ-varmet organoid komplette medier per brønd. Dispensere medierne på siden af brønden for at undgå afbrydelse af BME Dome.
- Organoider bør reformere og begynde at vokse inden for 24 h. organoid kulturer er typisk urerne nogensinde 7-10 dage afhængigt af kultur tæthed og celle spredning. Hvis det er nødvendigt, supplere kulturerne med 200 μL præ-varmet organoid komplette medier hver 5 dage for at kompensere for vækstfaktor udtømning og fordampning.
4. frysning og optøning af PDAC-Organoider
- For at fastfryse organoider, Fortsæt med at høste organoider og depolymerisere BME som beskrevet i trin 3.1-3.7.
- Til celle pellet tilsættes 1 mL fryse medie, blandes forsigtigt og overføres blandingen til en præ-mærket cryovial.
- Kryovial placeres i en fryse beholder for at opretholde en sikker konstant temperatur nedgang og plads i en-80 °C fryser. Efter 24 til 48 h, overføre de frosne hætteglas til flydende kvælstof opbevaring. Organoider kan kryopræserverede for måneder til år ved hjælp af denne metode.
- At tø organoider, hente den frosne cryovial fra flydende kvælstof opbevaring. Transport af det frosne hætteglas på tøris til vævskultur rummet.
- Den frosne kryovial i 37 °C-vandbad skal placeres, så organoiderne hurtigt tø, og indholdet af hætteglasset overføres til et 15 mL konisk rør, der indeholder 9 mL basal medie opvarmet til stuetemperatur.
- Spin ned på 200 x g i 5 min og Fjern supernatanten. Placer røret med organoid pellet på is i mindst 5 min.
- Fortsæt med at resuspendere i BME og plade organoiderne som beskrevet i trin 3.9-3.11.
Bemærk: Organoid kulturer genvinde langsomt efter en fryse/tø cyklus, derfor kulturer kan dyrkes i op til to uger før passaging.
5. karakterisering af PDAC-Organoider
Bemærk: karakterisering af organoider bør udføres på en etableret kultur efter flere passager for at mindske risikoen for kontaminering fra ikke-epiteliale celletyper såsom fibroblaster og immunceller.
- Nukleinsyre ekstraktion fra PDAC organoider
- Plade organoider på en 12 brønd plade dedikeret til nukleinsyre ekstraktion. Plade ikke mere end 100 μL BME per brønd. For tilstrækkelig DNA/RNA-udbytte, plade mindst 2 – 4 brønde per kultur. Vokse organoider i op til 5 dage, indtil kulturer er tæt på flydende men blottet for overdreven celle snavs, der ophobes i længere sigt kulturer.
- Hent pladen fra 37 °C inkubator og fjern fuldstændigt alle spor af organoid komplette medier, så kun BME Dome indeholdende organoider på pladen.
- Tilsæt 900 μL syre phenol reagens (Se tabel over materialer) til hver brønd og bland grundigt ved hjælp af en P1000 pipette, indtil opløsningen bliver homogen. BME opløses fuldstændigt i syre phenol reagens og organoider vil lyse efter en kort 5 min inkubation.
Forsigtig: syre phenol er et farligt kemikalie, der kan forårsage kemiske forbrændinger. Håndteres med omhu ved hjælp af passende beskyttelse og teknik. - Den homogene opløsning overføres til et 2 mL rør, og der tilsættes 200 μL chloroform. Inkuber 5 min og centrifugeres ved 12.000 x g i 15 minutter ved 4 °c.
- Fortsæt til RNA og DNA ekstraktion i henhold til producentens protokol. RNA kan udvindes fra den vandige fase, mens DNA kan udvindes fra Interphase og organisk fase. Når det er renset og kvantificeret, kan RNA og DNA isoleret fra forskellige brønde af samme kultur samles for at øge udbyttet.
Bemærk: (1) mens vi stærkt anbefaler at bruge denne nukleinsyre ekstraktionsmetode til RNA, er der mange gode metoder til isolering af DNA fra dyrkede celler. (2) for at fastslå tilstedeværelsen af tumorceller i organoid-kulturen, anbefaler vi sekvensering af DNA ved hjælp af din foretrukne næste generations sekvensering metode til at identificere mutationer inden PDAC Hallmark gener (KRAS, TP53, SMAD4, CDKN2A).
- Farmakotypning af PDAC-organoider
- Isoler enkeltceller fra organoider som beskrevet ovenfor i trin 3.1 – 3.8. For at maksimere celle nummer, høst mindst 10 konflydende brønde af en 12 brønd plade
- Resuspension enkeltceller i 1 mL humant organoid komplette medier. Tilstedeværelsen af små celle klumper (~ 2 – 10 celler) er acceptabel, men større celle klumper vil påvirke downstream-analysen negativt.
- Tæl celler ved hjælp af en automatiseret celle tæller og registrere cellens levedygtighed. Beregn det totale antal celler og levedygtige celler, som findes i 1 mL suspensionen.
- Til terapeutisk testning, plade 1.000 levedygtige celler pr brønd af en 384 brønd plade. For en 384 brønd plade anslår vi, at vi vil bruge 400.000 levedygtige celler (beregnet for 400 brønde).
- Forbered celler til plating ved at blande på is 800 μL BME med 7,2 mL organoid komplette medier, der indeholder cellerne. Hold blandingen på is og plade 20 μL pr. brønd af en 384 brønd plade. Brug en 12-kanals pipette og reservoir holdes på isen for effektivt at plade cellerne. For at undgå overdreven fordampning fra pladen, kan de yderste brønde bruges som et reservoir (60 μL PBS eller vand pr brønd), men dette vil føre til et tab af 76 eksperimentelle brønde.
- Drej pladen ned ved 100 x g i 1 minut i en gynge spand. Dette gør det muligt for de små 20 μL volumen og organoider at bosætte sig i bunden af pladen.
- Placer pladen i 37 °C-vævskultur inkubator, så organoider kan dannes. Efter 24 timer, kontrollere for tilstedeværelsen af organoider ved hjælp af en lysfelt mikroskop.
- Fortsæt til doserings terapeutiske forbindelser opløst i DMSO på pladen ved hjælp af en lægemiddel printer eller et tilsvarende instrument. Test hver lægemiddel dosis i mindst triplicat brønde. For at udføre en effektiv dosis-responsanalyse, bestemme dosisinterval for hvert lægemiddel empirisk, begyndende med en lav, ineffektiv, dosis og slutter med en høj dosis, hvor maksimal effekt er observeret. Eksempler på dosisintervaller for kemoterapeutika er for nylig blevet offentliggjort9.
- Eksponere cellerne for de terapeutiske forbindelser i 3 – 5 dage.
- Valgfrit, i slutningen af analysen, billede pladen til at evaluere den terapeutiske virkning på organoid størrelse, antal, og morfologi.
- Vurdere levedygtigheden ved hjælp af 20 μL pr. brønd af luminescens cellens levedygtighed reagens (Se tabel over materialer) i henhold til fabrikantens protokol. Et luminometer vil være nødvendigt for dataindsamling og en graftegning software til dataanalyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at illustrere de udfordringer, der er forbundet med isolerende organoider fra PDAC, viser vi etableringen af en patient afledt organoid-kultur fra en lille hypocellulær tumorprøve. Efter indledende plating var kun få organiske oider synlige pr. brønd, som vist i figur 1. Organoider fik lov til at vokse sig større i løbet af 2 uge og blev urerne i henhold til vores protokol til at etablere en mere robust kultur, som vist i den tidlige og sene passage 1 repræsentative billeder (figur 1). Det er vigtigt at bemærke, at de større cystiske organoider observeret i det sene primære isolat blev let opdelt i mindre fragmenter under blanding af organoider med iskold BME, som beskrevet i trin 2,13.
For at påvise resultatet af farmakotyping-protokollen forberedte vi enkeltceller fra en etableret og hurtigt voksende repræsentativ PDAC-organoid som beskrevet i denne protokol. 1.000 levedygtige celler blev belagt pr. brønd og fik lov til at komme over 24 timer, før cytotoksiske kemoterapeutika, Gemcitabin og paclitaxel, blev doseret. Vi udførte en 9-punkts dosisrespons analyse i triplicat begyndende med en lav dosis på 100 pM og sluttede med en høj dosis på 2 μM. Efter 5 dages behandling blev der taget repræsentative billeder for køretøjet (DMSO), 2 μM Gemcitabin og 2 μM paclitaxel-behandlede brønde (figur 2). Umiddelbart efter at have taget billederne, blev cellens levedygtighed vurderet ved hjælp af luminescens cellelevedygtighed reagens og afbildet ved hjælp af graftegning software (figur 2).
Figur 1: repræsentative billeder vises for en PDAC organoid isolation samt efter den første passage. Både tidligt (1 – 3 dage) og sene (7 – 10 dage) tidspunkter er vist at illustrere organoid vækst over tid. Scale bar = 200 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: analyse af dosisrespons. Venstre Repræsentativ dosisrespons analyse opnået ved hjælp af en etableret PDAC organoid-kultur, med standardafvigelse af triplicater vist som fejlstænger. Midlertidigt Billeder, som illustrerer effekten ved afslutningen af analysen af køretøjets (DMSO) behandling samt 2 μM Gemcitabin og 2 μM paclitaxel. Scale bar = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her præsenterer vi de nuværende protokoller for isolering, udvidelse og karakterisering af patient afledte PDAC organoider. Vores nuværende succesrate for at etablere organoid kultur er over 70%; Derfor er disse metoder endnu ikke blevet perfektioneret og forventes at forbedre og udvikle sig over tid. Der bør tages vigtige hensyn til stikprøvestørrelse, da PDAC har en lav neoplastisk cellularitet. Derfor vil små prøver indeholde få tumorceller, og vil kun generere en håndfuld organoider. Derudover får mange patienter kemoterapi og/eller kemo oradiationbaseret neoadjuverende behandling før kirurgisk indgreb15. Hvis behandlingen er effektiv for en bestemt patient, kan tumorvævet være blottet for levedygtige celler. Erhvervelse af kemo-naive patientprøver foretrækkes til indledende optimering af disse metoder, men det er ikke altid muligt. Interessant har vi konstateret, at iskæmi tid efter kirurgisk fjernelse af tumorvævet er ikke et vigtigt kriterium for vellykket organoid isolation, så længe prøven behandles inden for 24 h.
Pancreas duktalt adenocarcinom er en sygdom karakteriseret ved en stærk desmoplastisk reaktion og aflejring af en tæt stromale matrix. Mens organoider er et glimrende værktøj til hurtig isolering og udvidelse af epitelial rum, den model ikke rekapitulere komplekse stroma af PDAC. Andre metoder såsom patient afledte xenografter16 eller luft flydende grænseflade kultur17 giver mulighed for en stromale rum, men de kan være udfordrende at ekspandere hurtigt. Når du vælger en model system, forskeren bør nøje overveje styrker og svagheder i hver6.
Den heterogene biologi af denne sygdom påvirker organoid etablering som nogle patient-afledte organoider vokse meget godt i vores betingelser, mens andre er meget langsommere ved sammenligning. Protokollerne ovenfor beskriver en WNT ligand rig tilstand for at isolere og udvide alle patient-afledte organoider, men andre har vist, at nogle patientens tumorer er i stand til at vokse i fravær af WNT konditioneret medier11,12. Yderligere testning vil være påkrævet for at afgøre, om anvendelse af en række medie forhold øger den vellykkede etablering af organoider, som det for nylig blev demonstreret for kræft i æggestokkene18. Denne multiplex tilgang er dog begrænset af det lave antal tumorceller, der kan isoleres fra små patientprøver. Desuden kan normale utransformerede duktalt organoider opstå fra en organoid isolation, især hvis tumorvævet støder op til normale væv9. For at reducere risikoen for normal organoid kontaminering, større vævsprøver kan opdeles i mindre uafhængige fragmenter ved hjælp af morfologiske forskelle såsom godt velvaskuleret (blod er synlig) versus hypovaskulære områder, og hårde knuder versus blødt væv.
De metoder og protokoller, der er beskrevet her, er de nuværende standard tilgange, som anvendes i vores laboratorium til organoid isolation, og de bør testes og tilpasses til hvert laboratoriemiljø. For eksempel, den enzymatiske dissociation (trin 2,6 til 2,9) af tumorvævet er særligt vigtigt at optimere. Små udstyrs forskelle (nutator vs rotator mixer) kan føre til betydeligt anderledes timing for dette trin. Desuden kan vævs dissociationen finjusteres ved at øge eller reducere koncentrationen af collagenase/hyaluronidase-blandingen. Der skal udvises forsigtighed for ikke at behandle alle prøver på samme måde. For eksempel kan organoider i nogle tilfælde isoleres fra ascites-væske fra avancerede PDAC-patienter uden mekanisk eller enzymatisk dissociation.
DNA sekvensering er den nuværende guld standard til at bestemme tilstedeværelsen eller fraværet af tumor organoider som PDAC er drevet af hyppige mutationer i KRAS, TP53, SMAD4 og CDKN2A. Transkriptomic analyse kan afsløre forskellige tumor undertyper, mens farmakotypning kan afdække patientspecifikke terapeutiske sårbarheder9. Disse protokoller gør det muligt for PDAC forskere at udvikle deres eget bibliotek af patient-afledte organoider og profilere biologi af disse modeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi er taknemmelige for støtte fra UC San Diego Moores Cancer Center Biorepository og tissue-teknologi fælles ressource, medlemmer af Lowy laboratorium, og UC San Diego Department of Surgery, division af kirurgisk onkologi. AML er generøst støttet af NIH CA155620, en SU2C CRUK Lustgarten Foundation pancreatic Cancer drøm team Award (SU2C-AACR-DT-20-16), og donorer til fonden til at helbrede kræft i bugspytkirtlen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 channel pipette (p20, p100, or p200) with tips | |||
| 12 well plates | Olympus | 25-106 | |
| 15 ml LoBind conical tubes | Eppendorf | EP0030122208 | |
| 15 ml tube Rotator and/or nutator | |||
| 37 °C CO2 incubator | |||
| 37 °C water bath | |||
| 384 well plates | Corning | 4588 | Ultra low attachment, black and optically clear |
| A 83-01 | TOCRIS | 2939 | |
| ADV DMEM | ThermoFisher | 12634010 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Automated cell counter | |||
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | Reagent that depolymerizes the Basement Membrane Extract at 4 °C |
| CellTiterGlow | Promega | G7570 | Luminescence cell viability reagent |
| Chloroform | Sigma | C2432 | |
| Computer | |||
| CryoStor CS10 | StemCELL Tech | 07930 | Cell Freezing Solution |
| Cultrex R-spondin1 (Rspo1) Cells | Trevigen | 3710-001-K | |
| DMEM | ATCC | 30-2002 | |
| DNase I | Sigma | D5025 | |
| Drug printer | Tecan | D300e | This is the drug printer we use in our laboratory |
| Excel | For data analysis | ||
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11150-10 | |
| FBS | ThermoFisher | 16000044 | |
| G-418 | ThermoFisher | 10131035 | |
| Gastrin I (human) | TOCRIS | 3006 | |
| Gentle Collagenase/hyaluronidase | STEMCELL Tech | 7919 | |
| GlutaMAX | ThermoFisher | 35050061 | Glutamine solution |
| GraphPad Prism | For data analysis | ||
| HEPES | ThermoFisher | 15140122 | |
| Laminar flow tissue culture hood | |||
| Luminometer | |||
| L-Wnt-3A expressing cells | ATCC | CRL-2647 | |
| MACS Tissue Storage Solution | Miltenyi biotec | 130-100-008 | |
| Matrigel Matrix | Corning | 356230 | Basement Membrane Extract (BME), growth factor reduced |
| Mr. Frosty Freezing Container | ThermoFisher | 5100-0001 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165 | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
| p1000 pipette with tips | |||
| p200 pipette with tips | |||
| PBS | ThermoFisher | 10010049 | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher | 15630080 | |
| primocin | InvivoGen | ant-pm-2 | |
| Rapid-Flow Filter Units (0.2 µm) | ThermoFisher | 121-0020 | |
| Recombinant Human FGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| Recombinant Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | |
| Sterile Disposable Scalpels, #10 Blade | VWR | 89176-380 | |
| Tissue culture centrifuge | |||
| Tissue Culture Dishes 10 cm | Olympus | 25-202 | |
| TRIZol | ThermoFisher | 15596018 | Acid Phenol solution |
| TrypLE Express | ThermoFisher | 12605010 | |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | |
| Zeocin | ThermoFisher | R25001 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).
- Khorana, A. A., Mangu, P. B., Katz, M. H. G. Potentially Curable Pancreatic Cancer: American Society of Clinical Oncology Clinical Practice Guideline Update Summary. Journal of Oncology Practice. 13 (6), 388-391 (2017).
- Winter, J. M., et al. 1423 pancreaticoduodenectomies for pancreatic cancer: A single-institution experience. Journal of Gastrointestinal Surgery. 10 (9), 1210-1211 (2006).
- Von Hoff, D. D., et al. Increased survival in pancreatic cancer with nab-paclitaxel plus gemcitabine. New England Journal of Medicine. 369 (18), 1691-1703 (2013).
- Conroy, T., et al. FOLFIRINOX versus gemcitabine for metastatic pancreatic cancer. New England Journal of Medicine. 364 (19), 1817-1825 (2011).
- Baker, L. A., Tiriac, H., Clevers, H., Tuveson, D. A. Modeling pancreatic cancer with organoids. Trends in Cancer. 2 (4), 176-190 (2016).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Tiriac, H., et al. Organoid Profiling Identifies Common Responders to Chemotherapy in Pancreatic Cancer. Cancer Discovery. 8 (9), 1112-1129 (2018).
- Tiriac, H., et al. Successful creation of pancreatic cancer organoids by means of EUS-guided fine-needle biopsy sampling for personalized cancer treatment. Gastrointestinal Endoscopy. , (2018).
- Seino, T., et al. Human Pancreatic Tumor Organoids Reveal Loss of Stem Cell Niche Factor Dependence during Disease Progression. Cell Stem Cell. 22 (3), 454-467 (2018).
- Huang, L., et al. Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell- and patient-derived tumor organoids. Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).
- Walsh, A. J., Castellanos, J. A., Nagathihalli, N. S., Merchant, N. B., Skala, M. C. Optical Imaging of Drug-Induced Metabolism Changes in Murine and Human Pancreatic Cancer Organoids Reveals Heterogeneous Drug Response. Pancreas. 45 (6), 863-869 (2016).
- Zhao, C. Wnt Reporter Activity Assay. Bio-Protocol. 4 (14), 1183 (2014).
- Conroy, T., et al. FOLFIRINOX or Gemcitabine as Adjuvant Therapy for Pancreatic Cancer. New England Journal of Medicine. 379 (25), 2395-2406 (2018).
- Jimeno, A., et al. A direct pancreatic cancer xenograft model as a platform for cancer stem cell therapeutic development. Molecular Cancer Therapeutics. 8 (2), 310-314 (2009).
- Neal, J. T., et al. Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment. Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).
- Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).
