Summary
Pasient-avledet organoid kulturer av bukspyttkjertelen ductal adenokarsinom er en raskt etablert 3-dimensjonal modell som representerer epitel tumor celle rom med høy troskap, slik at translational forskning på denne dødelige kreft. Her gir vi detaljerte metoder for å etablere og spre organoids samt å utføre relevante biologiske analyser ved hjelp av disse modellene.
Abstract
Bukspyttkjertelen ductal adenokarsinom (PDAC) er blant de mest dødelige ondartet. Nylig, neste generasjons organoid kultur metoder muliggjør 3-dimensjonale (3D) modellering av denne sykdommen har blitt beskrevet. Pasient-avledet organoid (PUD) modeller kan isoleres fra både kirurgiske eksemplarer, samt små biopsier og form raskt i kultur. Viktigere, organoid modeller bevare patogene genetiske forandringer oppdages i pasientens tumor og er prediktiv av pasientens behandling respons, og dermed muliggjør translational studier. Her gir vi omfattende protokoller for å tilpasse vev kultur arbeidsflyt for å studere 3D, matrise embedded, organoid modeller. Vi detaljerte metoder og betraktninger for å isolere og spre primære PDAC organoids. Videre beskriver vi hvordan skreddersydde organoid medier er forberedt og kvalitetskontrollert i laboratoriet. Til slutt beskriver vi analyser for nedstrøms karakterisering av organoid modeller som isolering av nukleinsyre syrer (DNA og RNA), og narkotika testing. Viktigere vi gir kritiske hensyn for å implementere organoid metodikk i et forskningslaboratorium.
Introduction
Bukspyttkjertelen ductal adenokarsinom (PDAC) er en dødelig sykdom preget av sen diagnose i de fleste pasienter, mangel på effektiv behandling, og en resulterende lav 5-års total overlevelse som forblir mindre enn 10%1. Bare 20% av pasientene er diagnostisert med en lokalisert sykdom egnet for helbredende kirurgisk inngrep2,3. De resterende pasientene behandles vanligvis med en kombinasjon av kjemoterapeutiske midler som er effektive i et mindretall av pasientene4,5. For å møte disse presserende kliniske behov, er forskerne aktivt jobber med tidlig oppdagelse strategier og utvikling av mer effektive terapier. For å akselerere klinisk oversettelse av viktige funn, er forskere sysselsetter genetisk konstruert mus modeller, pasient avledet xenotransplantater, monolag celler linjer, og, sist, organoid modeller6.
Tredimensjonale epitel organoid kultur ved hjelp av vekstfaktor og wnt-ligand rike forhold for å stimulere spredning av transformert stamceller ble først beskrevet for musen tarmen7 og ble raskt tilpasset normale menneskelige bukspyttkjertelen vev8. I tillegg til normal ductal vev, organoid metodikk tillater isolasjon, ekspansjon, og studiet av menneskelig PDAC8. Viktigere, metoden støtter etablering av organoids fra kirurgiske prøver, samt fine og Core nål biopsier, slik at forskerne å studere alle stadier av sykdommen9,10. Interessant, pasient-avledet organoids recapitulate godt beskrevet tumor transcriptomic under typer og kan muliggjøre utvikling av presisjon medisin plattformer9,11.
Gjeldende organoid protokoller for PDAC muliggjøre en vellykket utvidelse av mer enn 70% av pasientprøvene fra kjemoterapi-naive pasienter9. Her presenterer vi standard metoder som brukes av vårt laboratorium for å isolere, utvide og karakterisere pasient-avledet PDAC organoids. Andre PDAC organoid metoder har blitt beskrevet12,13 men ingen sammenligning av disse metoden har blitt grundig utført. Ettersom denne teknologien er relativt ny og fremme raskt, forventer vi at disse protokollene vil fortsette å utvikle seg og forbedre; men prinsippene for vev håndtering og organoid kultur vil fortsette å være nyttig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
All menneskelig vevs innsamling for forskningsbruk ble gjennomgått og godkjent av vårt Internal Review Board (IRB). Alle protokollene nedenfor utføres under aseptisk forhold i et miljø for pattedyr vev kultur laboratorium.
1. klargjøring av medier
- Conditioned Media forberedelse.
Merk: den menneskelige bukspyttkjertelen organoid Media krever rikelig vekstfaktorer og næringsstoffer så vel som betinget Media kosttilskudd for å gi tilstrekkelig vekst stimulering for organoid ekspansjon. Begge conditioned medier beskrevet nedenfor er utarbeidet fra kommersielt tilgjengelige cellelinjer (se tabell over materialer). For komplette protokoller og materialer, henvises det til produsentens nettsteder.- Produser R-spondin1-medier i henhold til produsentens protokoll.
- Først utvide 293T cellene uttrykker R-spondin1 ved hjelp av passende antibiotika (Zeocin) utvalgsmetoder i nærvær av rikelig serum (10%). Ved produksjon av conditioned Media, trekke og vaske bort antibiotika valg og serum slik at ingen antibiotika og serum er tilstede i den endelige conditioned Media. Viktigere, det betinget Media må filteret steriliseres etter samling (0,2 μm) for å hindre krysskontaminering.
- Oppbevar aliquoted medier ved 4 ° c for kortvarig bruk (innen 6 måneder) eller ved-20 ° c for langtidslagring (mer enn 6 måneder). Freeze-Tin sykluser bør unngås.
- Produser medier i L-wnt-3A i samsvar med produsentens protokoll.
- Først utvide L-M (TK-) celler som uttrykker L-wnt-3A ved hjelp av passende antibiotika (G-418) valg metoder i nærvær av rikelig serum (10%). Ved produksjon av conditioned Media, trekke og vaske bort antibiotika utvalg slik at ingen antibiotika er til stede i den endelige conditioned Media; men opprettholde serum gjennom dyrking og condition. Viktigere de innsamlede conditioned Media må filteret sterilisert (0,2 μm) for å hindre krysskontaminering.
- Oppbevar aliquoted ved 4 ° c for kortvarig bruk, eller-20 ° c for langtidsoppbevaring. Freeze-Tin sykluser bør unngås.
- For kvalitetskontroll, Utfør en TOPFLASH analysen for å teste wnt aktiviteten til R-spondin1 og L-wnt-3A conditioned Media alene og i kombinasjon i henhold til en tidligere publisert protokoll14.
- Produser R-spondin1-medier i henhold til produsentens protokoll.
- Basal Media forberedelse: Bruk basal Media for utarbeidelse av komplett organoid Media samt vasketrinn for organoid arbeid. Supplere avansert DMEM/F-12 med glutamin ved en endelig konsentrasjon på 1x, HEPES (10 mM) og penicillin/Streptomycin (100 U/mL). Oppbevar basal Media ved 4 ° c.
- Organoid komplett medie klargjøring: supplere de basale mediene med R-spondin1 conditioned Media ved en endelig konsentrasjon av 10% v/v, L-wnt-3A conditioned Media ved en endelig konsentrasjon på 50% v/v, humant EGF (50 ng/mL), humant FGF (100 ng/mL), humant gastrin I (10 nM), mus noggin (100 ng/mL), A83-01 (500 nM), B27-tillegg (1x), nikotinamid (10 mM), N-acetylcysteine (1,25 mM) og Primocin (100 μg/mL).
- For primær organoid isolasjoner, tint organoid kulturer og kulturer som starter med enkeltceller, inkluderer Rho kinase inhibitor Y-27632 ved en endelig konsentrasjon på 10,5 μM.
- Forbered den menneskelige organoid komplette medier på is og oppbevar ved 4 ° c for bruk innen en måned. Av denne grunn, anbefaler vi frisk ukentlig utarbeidelse av Media.
2. isolering av PDAC Organoids
Merk: Tin (BME)-løsningen for kjeller membran ekstrakt (vekstfaktor redusert; se tabell over materialer) på is i et miljø med 4 ° c (kjøleskap eller kaldt rom) i minst 12 timer før bruk. Ruge for organoid kultur i en 37 ° c inkubator i minst 12 timer før bruk.
- Samle og transportere en kirurgisk fjernet tumor prøve for forskning i en bufret lagringsløsning for å opprettholde levedyktigheten til vevet. Bruk basal Media eller en kommersielt tilgjengelig vevs lagringsløsning.
- Fortsett å isolere organoids så snart som mulig etter at prøven er mottatt. Tissue kan oppbevares inne lagringen løsning til 24 h stolpe-kirurgi og fremdeles utbytte organoids.
- En gang i laboratoriet, overføre tumor til en 10 cm vev kultur parabol og fjerne lagringsløsning.
- Mens håndtering av vev med metallisk tang, hakke på tumor med en #10 skalpell i små fragmenter av 1 mm3 eller mindre. Større fragmenter vil ta lengre tid å fordøye; Derfor sikte på å generere homogene vev fragment størrelser. Hvis vevet allerede er disaggregated eller i mindre enn 1 mm3 fragmenter, hopp over dette trinnet.
- Overfør vevs fragmentene til et 15 mL konisk rør som inneholder 10 mL basal medier. Bland ved invertere røret flere ganger. Sentrifuger røret ved 200 x g i 5 min. Etter spin, fjerne basal Media nøye for å unngå å miste vev fragmenter.
- Til røret som inneholder vevs fragmentene tilsett 9 mL basal Media og 1 mL 10x skånsom Kollagenase/Hyaluronidase løsning. For å unngå klumper av celler under fordøyelsen, supplere denne løsningen med 20 μL av 10 mg/mL DNAse I-løsning. Bland ved invertere røret flere ganger.
- Ruge enzymatisk fordøyelsen ved 37 ° c på en nutator eller rotator. For tilstrekkelig miksing under fordøyelsen, må vevet fragmenter hele tiden være å bevege seg gjennom løsningen.
Merk: timing for denne enzymatisk dissosiasjon av svulsten må fastsettes empirisk for hver prøve. En vellykket fordøyelse av svulsten er karakterisert ved nedgangen i størrelsen på vevs fragmentene til de ikke er klart merkes for det blotte øye. Samtidig vil tettheten av løsningen øke når mikroskopiske vevs fragmenter frigis. - Etter 30 min, Fjern den koniske slangen fra 37 ° c inkubator og Observer. Hvis vevs fragmentene fortsatt er godt synlig, Fortsett dissosiasjon ved 37 ° c med konstant miksing. Gjenta denne observasjonen hver 30 min til de fleste eller alle vev fragmenter har blitt dissosiert. Avhengig av stringens av miksing, samt størrelsen og mengden av tumor fragmenter, dette trinnet kan ta så lite som 30 min for små eksemplarer eller så lenge som 12 h for større tumor prøver.
- Når enzymatisk dissosiasjon er ferdig, sentrifuger røret ved 200 x g i 5 min. Etter spin bør en celle pellet være synlig og supernatanten skal være klar, noe som indikerer at alle celler har blitt spunnet ut av løsningen. Hvis det ikke er tilfelle, gjentar du spinn.
- Fjern forsiktig supernatanten for å unngå å miste celle pellet. Vask straks cellene med 10 mL basal medier ved å blande rørene forsiktig med inversjon. Sentrifuger røret ved 200 x g i 5 min. Fjern forsiktig basal mediene for å unngå å miste celler og gjenta dette vaske trinnet en gang til for totalt to vasker.
- Etter den andre vasken, Fjern alle de basale mediene nøye og plasser røret på isen i 5 min.
- På denne tiden, plasserer en alikvot av organoid komplette medier i en 37 ° c vannbad til pre-Warm.
- Bland cellen pellet med iskald BME mens du opprettholder røret på isen. Seeding tetthet bør være høy for organoid isolasjon. For en liten pellet (~ 50 μL volum) bruker 200 μL av BME, mens for en stor pellet (~ 200 μL volum) bruk 800 μL av BME. Bland cellene og BME på isen ved hjelp av en P200 pipette til løsningen vises homogen mens du unngår å lage bobler i løsningen.
- Spot en 100 μL kuppel i sentrum av en brønn av en pre-varmet 12 brønn plate ved hjelp av en P200 pipette. Gjenta dette til alle BME-løsningene er utlevert. Forsiktig overføre platen til 37 ° c inkubator for å la BME gel å stivne.
- Etter 10 min, hente platen og tilsett 1 mL pre-varmet organoid komplette medier per brønn. Dispensere mediene på siden av brønnen for å unngå forstyrrelse av BME kuppel.
- Observer celle fragmenter ved hjelp av en invertert vev kultur mikroskop med en 4X linse i brightfield.
Merk: enkeltceller og mikroskopiske vevs fragmenter skal være godt synlig. En vellykket isolasjon er preget av utseendet på mer enn 10 organoids etter 24 – 48 timer; kulturen skal confluent innen en uke. Som tumor eksemplarer er heterogene, noen organoid isolasjoner er mer utfordrende som bare noen få organoids vokse per brønn, som vist i figur 1. I dette tilfellet, tillate kulturen å fortsette for til to ukens å maksimere antallet av celler anvendelig for passaging. Å gjøre rede for medieforbruk og fordampning under kultur, topp opp kulturer med 200 μL av pre-varmet organoid komplett Media hver 5 dager.
3. Passaging av PDAC Organoids
- Hent platen fra vev kultur inkubator. Med en steril celle løfter, løft forsiktig BME kuppel slik at den flyter i hele Media. Unngå skraping bunnen av brønnen for ikke å fjerne noen monolag celler festet til plast, da disse er vanligvis fibroblaster.
- Med en P1000 pipette, forsiktig overføre BME kuppel og media til en 15 mL konisk rør. Gjenta dette trinnet for hver organoid-inneholder godt.
- Vask forsiktig hver brønn som ble høstet med 1 mL kaldt basal Media, og Overfør til 15 mL rør som inneholder organoids.
- Bland godt løsningen og organoids med en P1000 pipette og spinn ned på 200 x g i 5 min. Etter spinning, en BME lag som inneholder organoids i suspensjon og en organoid pellet vil vises på bunnen av røret. Fjern forsiktig supernatanten, unngå tap av BME/organoid laget. Plasser røret på isen.
- Tilsett 10 mL iskald celle gjenvinnings løsning (CRS) til røret og bland godt ved inversjon. Dette vil depolymerize protein matriser av gelled BME ved 4 ° c. Ruge på isen i 30 min mens miksing hver 3 min ved inversjon. Plasser røret på en roterende mikser i et kaldt rom eller 4 ° c-kjøleskap i 30 minutter hvis det er tilgjengelig.
- Etter 30 min inkubasjons, spinn ned ved 200 x g i 5 min. Den organoid pellet bør være tydelig mens BME laget skal være borte. Hvis BME-laget er redusert i størrelse, men fortsatt synlig, ruge i ytterligere 30 min ved 4 ° c med miksing og gjenta spinn.
- Når BME har blitt depolymeriseres, fjerne CRS forlate bak organoid pellet. Vask organoids med 10 mL basal medier ved å blande med inversjon. Spinn ned på 200 x g i 5 min og fjern supernatanten. Plasser røret med organoid pellet på isen i minst 5 min.
- Hvis en enkelt celle forberedelse ønskes, ruge organoids med 3 mL Trypsin supplert med 30 μL av 10 mg/mL DNAse I løsning for å unngå klumper av celler under fordøyelsen.
- Ruge enzymatisk reaksjonen ved 37 ° c med mild inversjon miksing hver 2 min i opptil 10 min. Overvåk og Bekreft vellykket enkelt celle dissosiasjon under brightfield mikroskop.
- For å stoppe enzymatisk reaksjon, tilsett 10 mL iskald basal Media og spinn ned på 200 x g i 5 min.
- Vask celler med 10 mL basal medier ved å blande med forsiktig inversjon. Spinn ned på 200 x g i 5 min og fjern supernatanten og gjenta vasken en gang til. Plasser røret med celle pellet på isen i minst 5 min.
Merk: Vi anbefaler at du utfører dette trinnet hver 3-5 passasjer under regelmessig vedlikehold av organoids for å generere homogen kultur med et stort antall organoids.
- Legg iskald BME til cellen pellet og bland forsiktig på isen til løsningen er homogen ved hjelp av en P200 pipette. Mens du unngår å generere bobler i blandingen, pipette opp og ned minst 5 – 10x, plassere tuppen av pipette nær bunnen av røret for å hjelpe mekanisk bryte opp organoids. Som en rettesnor bruker du 4 – 6 ganger volumet på BME/celle pellet slik at kløyve raten ikke er mer enn 1:2 fra en passasje til den andre.
- Spot en 100 μL kuppel i sentrum av en brønn av en pre-varmet 12 brønn plate ved hjelp av en P200 pipette; Gjenta til alle BME-løsningene er utlevert. Forsiktig overføre platen til 37 ° c inkubator for å la BME gel å stivne. Etter 10 min, hente platen og tilsett 1 mL pre-varmet organoid komplette medier per brønn. Dispensere mediene på siden av brønnen for å unngå forstyrrelse av BME kuppel.
- Organoids bør reform og begynne å vokse innen 24 h. Organoid kulturer er vanligvis passert noensinne 7-10 dager avhengig av kultur tetthet og celle spredning. Om nødvendig, topp opp kulturer med 200 μL av pre-varmet organoid komplett Media hver 5 dager for å kompensere for vekstfaktor tømming og fordampning.
4. frysing og tine av PDAC Organoids
- For å fryse ned organoids, Fortsett å høste organoids og depolymerize BME som beskrevet i trinn 3.1 – 3.7.
- Til cellen pellet, tilsett 1 mL frysing Media, bland forsiktig, og overføre blandingen til en pre-merket cryovial.
- Plasser cryovial i en fryse beholder for å opprettholde en sikker konstant Temperaturreduksjon og plasser i en-80 ° c fryser. Etter 24 til 48 h, overføre frosne hetteglass til flytende nitrogen lagring. Organoids kan embryo for måneder å år benytter denne metoden.
- For å tine organoids, Hent den frosne cryovial fra lagring av flytende nitrogen. Transport den frosne hetteglasset på tørr is til vevet kultur rommet.
- Plasser den frosne cryovial i vannbadet på 37 ° c for raskt å tine organoids og overføre innholdet i hetteglasset til et 15 mL konisk rør som inneholder 9 mL basal medier varmet til romtemperatur.
- Spinn ned på 200 x g i 5 min og fjern supernatanten. Plasser røret med organoid pellet på isen i minst 5 min.
- Fortsett til resuspend i BME og plate organoids som beskrevet i trinn 3.9 – 3.11.
Merk: Organoid kulturer gjenopprette langsomt etter en fryse/tine syklus, derfor kulturer kan dyrkes i opptil to uker før passaging.
5. karakterisering av PDAC Organoids
Merk: karakterisering av organoids bør utføres på en etablert kultur etter flere passasjer for å redusere risikoen for forurensning fra ikke-epitel celletyper som fibroblaster og immunceller.
- Nukleinsyre syre ekstraksjon fra PDAC organoids
- Plate organoids på en 12 brønn plate dedikert til nukleinsyre syre utvinning. Plate ikke mer enn 100 μL av BME per brønn. For tilstrekkelig DNA/RNA-utbytte, skal platen være minst 2 – 4 brønner per kultur. Grow organoids i inntil 5 dager til kulturer er nær confluent men blottet for overdreven celle rusk som akkumuleres i lengre sikt kulturer.
- Hente platen fra 37 ° c inkubator og fjerne alle spor av organoid komplette medier, slik at bare BME kuppel som inneholder organoids på tallerkenen.
- Tilsett 900 μL av syre fenol-reagens (se tabell av materialer) til hver brønn og bland godt med en P1000 pipette til løsningen blir homogen. BME vil bli fullstendig oppløst i syre-og organoids vil lyse etter en kort 5 min inkubasjons.
FORSIKTIG: syre fenol er en farlig kjemikalie som kan forårsake kjemiske brannskader. Håndter med forsiktighet ved hjelp av egnede beskyttelser og teknikk. - Overfør den homogene oppløsningen til et 2 mL rør og tilsett 200 μL av kloroform. Ruge 5 min og sentrifuge ved 12 000 x g i 15 min ved 4 ° c.
- Fortsett til RNA-og DNA-ekstraksjon i henhold til produsentens protokoll. RNA kan trekkes ut fra den vandige fasen mens DNA kan trekkes ut fra den Interphase og organiske fasen. Når renset og kvantifisert, RNA og DNA isolert fra ulike brønner av samme kultur kan samles for å øke utbyttet.
Merk: (1) selv om vi på det sterkeste anbefaler å bruke denne nukleinsyre syre utvinnings metoden for RNA, er det mange gode metoder for å isolere DNA fra kulturperler celler. (2) for å fastslå tilstedeværelsen av tumorceller innenfor organoid kulturen, anbefaler vi sekvensering av DNA ved hjelp av din foretrukne neste generasjons sekvensering metode for å identifisere mutasjoner innen PDAC Hallmark gener (KRAS, TP53, SMAD4, CDKN2A).
- Pharmacotyping av PDAC organoids
- Isoler enkeltceller fra organoids som beskrevet ovenfor i trinn 3.1 – 3.8. For å maksimere celle nummer, høste minst 10 confluent brønner av en 12 brønn plate
- Resuspend enkeltceller i 1 mL humant organoid komplett medium. Tilstedeværelsen av små celle klumper (~ 2 – 10 celler) er akseptabelt, men større celle klumper vil negativt påvirke nedstrøms analysen.
- Telle celler ved hjelp av en automatisert celle teller og post celle levedyktighet. Beregn det totale antall celler og levedyktige celler til stede i 1 mL suspensjon.
- For terapeutisk testing, plate 1 000 levedyktige celler per brønn av en 384 brønn plate. For en 384 brønn plate anslår vi at vi vil bruke 400 000 levedyktige celler (beregnet for 400 brønner).
- Forbered celler for plating ved å blande på is 800 μL av BME med 7,2 mL organoid komplette medier som inneholder cellene. Hold blandingen på is og plate 20 μL per brønn av en 384 brønn plate. Bruk en 12-kanals pipette og reservoar holdt på isen for å effektivt plate cellene. For å unngå overdreven fordampning fra platen, kan de ytre brønnene brukes som et reservoar (60 μL PBS eller vann per brønn), men dette vil føre til tap av 76 eksperimentelle brønner.
- Snurr platen ned ved 100 x g i 1 min i en sving bøtte. Dette gjør at den lille 20 μL volum og organoids å bosette seg på bunnen av platen.
- Plasser platen i 37 ° c vev kultur inkubator for å tillate organoids å danne. Etter 24 h, sjekk for tilstedeværelsen av organoids ved hjelp av et brightfield mikroskop.
- Fortsett til dosering terapeutiske forbindelser oppløst i DMSO på tallerkenen ved hjelp av et medikament skriver eller tilsvarende instrument. Test hver legemiddel dose i minst tre eksemplarer brønner. For å utføre en effektiv dose reaksjons analyse, Bestem doseringsområde for hvert legemiddel empirisk, Start med en lav, ineffektiv, dose og avslutning med en høy dose der maksimal effekt er observert. Eksempler på dose områder for kjemoterapeutiske forbindelser har nylig blitt publisert9.
- Utsett cellene til terapeutiske forbindelser for 3-5 dager.
- Alternativt, på slutten av analysen, bildet platen for å evaluere den terapeutiske effekten på organoid størrelse, antall og morfologi.
- Vurder levedyktighet med 20 μL per brønn av luminescence (se tabell over materialer) i henhold til produsentens protokoll. En luminometeret vil være nødvendig for datainnsamling og en grafisk programvare for dataanalyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å illustrere utfordringene forbundet med å isolere organoids fra PDAC, viser vi opprettelsen av en pasient avledet organoid kultur fra en liten hypocellular tumor prøve. Etter første plating var bare noen få organoids synlige per brønn, som vist i figur 1. Organoids fikk lov til å vokse seg større over span av 2 uke og ble passert i henhold til vår protokoll for å etablere en mer robust kultur, som vist i tidlig og sent passasje 1 representative bilder (figur 1). Det er viktig å merke seg at de større cystisk organoids observert i slutten primære isolere ble lett brytes ned i mindre fragmenter under blanding av organoids med iskald BME, som beskrevet i trinn 2,13.
For å demonstrere utfallet av pharmacotyping-protokollen, forberedte vi enkeltceller fra en etablert og raskt voksende representant PDAC-organoid som beskrevet i denne protokollen. 1 000 levedyktige celler ble belagt per brønn og lov til å utvinne over 24 h før cytotoksisk kjemoterapeutiske agenter, Gemcitabin og Paklitaksel, ble legemidlene dopet. Vi utførte en 9-punkts dose respons analysen i tre eksemplarer starter med en lav dose av 100 pM og slutter med en høy dose av 2 μM. Etter 5 dagers behandling ble representative bilder tatt for kjøretøy (DMSO), 2 μM Gemcitabin og 2 μM Paklitaksel behandlede brønner (figur 2). Umiddelbart etter å ha tatt bildene, celle levedyktighet ble vurdert ved hjelp av luminescence celle levedyktighet reagens og plottet ved hjelp av grafisk programvare (figur 2).
Figur 1: representative bilder er vist for en PDAC organoid isolasjon så vel som etter den første passasjen. Begge to tidlig (1 – 3 dager) og sen (7 – 10 dager) tid meningene er vist å illustrere organoid oppblomstringen over tid. Scale bar = 200 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: dose respons analyse. Venstre Representativ dose respons analyse innhentet ved hjelp av en etablert PDAC organoid kultur, med standardavvik av triplicates vist som feilfelt. Retten Bilder som illustrerer effekten på slutten av analysen av kjøretøyet (DMSO) behandling, samt 2 μM Gemcitabin og 2 μM Paklitaksel. Scale bar = 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her presenterer vi nåværende protokoller for å isolere, utvide og karakteriserer pasient-avledet PDAC organoids. Vår nåværende suksess rate på å etablere organoid kultur er over 70%; Derfor, disse metodene ennå ikke er perfeksjonert og forventes å forbedre og utvikle seg over tid. Viktig betraktning bør gis til utvalgsstørrelse, som PDAC har en lav neoplastic cellularitet. Følgelig vil små eksemplarer inneholde noen tumorceller, og vil bare generere en håndfull organoids. I tillegg får mange pasienter kjemoterapi og/eller chemoradiation neoadjuvant behandling før kirurgisk inngrep15. Hvis behandlingen er effektiv for en bestemt pasient, kan tumorvevet være blottet for levedyktige celler. Oppkjøp av kjemoterapi-naiv pasientprøver foretrekkes for første optimalisering av disse metodene, men dette er ikke alltid mulig. Interessant har vi funnet at iskemi tid etter kirurgisk fjerning av tumorvevet er ikke et viktig kriterium for vellykket organoid isolasjon, så lenge prøven er behandlet innen 24 timer.
Bukspyttkjertelen ductal adenokarsinom er en sykdom preget av en sterk desmoplastic reaksjon og deponering av en tett stromal matrise. Mens organoids er et utmerket verktøy for rask isolering og utvidelse av epitel rommet, recapitulate ikke modellen den komplekse stroma av PDAC. Andre metoder som pasient avledet xenotransplantater16 eller luft flytende grensesnitt kultur17 tillate en stromal kupé, men de kan være utfordrende å ekspandere raskt. Når du velger en modell system, bør forskeren nøye vurdere styrker og svakheter i hver6.
Den heterogene biologi av denne sykdommen påvirker organoid etablering som noen pasient-avledet organoids vokse svært godt i våre forhold, mens andre er mye tregere ved sammenligning. Protokollene ovenfor beskriver en wnt ligand rik betingelse for å isolere og utvide alle pasient-avledet organoids, men andre har vist at noen pasientens svulster er i stand til å vokse i fravær av wnt conditioned Media11,12. Ytterligere testing vil være nødvendig for å avgjøre om bruk av en rekke medie forhold forbedrer vellykket etablering av organoids, som nylig ble demonstrert for eggstokkene kreft organoids18. Dette multiplex tilnærmingen er imidlertid begrenset av lavt antall tumorceller som kan isoleres fra små pasientprøver. I tillegg kan normal transformert ductal organoids oppstå fra en organoid isolasjon, spesielt hvis tumorvevet er ved siden av normal vev9. For å redusere risikoen for normal organoid forurensning, større vevsprøver kan deles inn i mindre uavhengige fragmenter med morfologiske forskjeller som godt vascularized (blod er synlig) versus hypovascular regioner, og harde knuter versus bløtvev.
Metodene og protokollene som beskrives her er de nåværende standard tilnærmingene som brukes i vårt laboratorium for organoid isolering, og de bør testes og tilpasses for hvert laboratoriemiljø. For eksempel er enzymatisk dissosiasjon (trinn 2,6 til 2,9) av tumorvevet spesielt viktig å optimalisere. Små utstyrs forskjeller (nutator vs Rotator Mixer) kan føre til signifikant forskjellig timing for dette trinnet. Videre kan vevet dissosiasjon finjusteres ved å øke eller redusere konsentrasjonen av Kollagenase/Hyaluronidase blanding. Det må utvises forsiktighet for å ikke behandle alle prøvene på samme måte. For eksempel, i noen tilfeller organoids kan isoleres fra ascites væske fra avanserte PDAC pasienter uten mekanisk eller enzymatisk dissosiasjon.
DNA sekvensering er gjeldende gull standard for å bestemme tilstedeværelse eller fravær av tumor organoids som PDAC er drevet av hyppige mutasjoner i KRAS, TP53, SMAD4 og CDKN2A. Transcriptomic analyse kan avdekke ulike tumor under typer mens pharmacotyping kan avdekke pasientspesifikke terapeutiske sårbarheter9. Disse protokollene gjør det mulig for PDAC forskere å utvikle sitt eget bibliotek av pasient-avledet organoids og å profil biologi av disse modellene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi er takknemlige for støtte fra UC San Diego Moores Cancer Center Biorepository og tissue Technology delt ressurs, medlemmer av Lowy laboratoriet, og UC San Diego Department of Surgery, Division of kirurgisk onkologi. AML er sjenerøst støttet av NIH CA155620, en SU2C CRUK Lustgarten Foundation kreft i bukspyttkjertelen Dream Team Award (SU2C-AACR-DT-20-16), og givere til fondet å kurere kreft i bukspyttkjertelen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 channel pipette (p20, p100, or p200) with tips | |||
| 12 well plates | Olympus | 25-106 | |
| 15 ml LoBind conical tubes | Eppendorf | EP0030122208 | |
| 15 ml tube Rotator and/or nutator | |||
| 37 °C CO2 incubator | |||
| 37 °C water bath | |||
| 384 well plates | Corning | 4588 | Ultra low attachment, black and optically clear |
| A 83-01 | TOCRIS | 2939 | |
| ADV DMEM | ThermoFisher | 12634010 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Automated cell counter | |||
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | Reagent that depolymerizes the Basement Membrane Extract at 4 °C |
| CellTiterGlow | Promega | G7570 | Luminescence cell viability reagent |
| Chloroform | Sigma | C2432 | |
| Computer | |||
| CryoStor CS10 | StemCELL Tech | 07930 | Cell Freezing Solution |
| Cultrex R-spondin1 (Rspo1) Cells | Trevigen | 3710-001-K | |
| DMEM | ATCC | 30-2002 | |
| DNase I | Sigma | D5025 | |
| Drug printer | Tecan | D300e | This is the drug printer we use in our laboratory |
| Excel | For data analysis | ||
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11150-10 | |
| FBS | ThermoFisher | 16000044 | |
| G-418 | ThermoFisher | 10131035 | |
| Gastrin I (human) | TOCRIS | 3006 | |
| Gentle Collagenase/hyaluronidase | STEMCELL Tech | 7919 | |
| GlutaMAX | ThermoFisher | 35050061 | Glutamine solution |
| GraphPad Prism | For data analysis | ||
| HEPES | ThermoFisher | 15140122 | |
| Laminar flow tissue culture hood | |||
| Luminometer | |||
| L-Wnt-3A expressing cells | ATCC | CRL-2647 | |
| MACS Tissue Storage Solution | Miltenyi biotec | 130-100-008 | |
| Matrigel Matrix | Corning | 356230 | Basement Membrane Extract (BME), growth factor reduced |
| Mr. Frosty Freezing Container | ThermoFisher | 5100-0001 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165 | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
| p1000 pipette with tips | |||
| p200 pipette with tips | |||
| PBS | ThermoFisher | 10010049 | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher | 15630080 | |
| primocin | InvivoGen | ant-pm-2 | |
| Rapid-Flow Filter Units (0.2 µm) | ThermoFisher | 121-0020 | |
| Recombinant Human FGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| Recombinant Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | |
| Sterile Disposable Scalpels, #10 Blade | VWR | 89176-380 | |
| Tissue culture centrifuge | |||
| Tissue Culture Dishes 10 cm | Olympus | 25-202 | |
| TRIZol | ThermoFisher | 15596018 | Acid Phenol solution |
| TrypLE Express | ThermoFisher | 12605010 | |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | |
| Zeocin | ThermoFisher | R25001 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).
- Khorana, A. A., Mangu, P. B., Katz, M. H. G. Potentially Curable Pancreatic Cancer: American Society of Clinical Oncology Clinical Practice Guideline Update Summary. Journal of Oncology Practice. 13 (6), 388-391 (2017).
- Winter, J. M., et al. 1423 pancreaticoduodenectomies for pancreatic cancer: A single-institution experience. Journal of Gastrointestinal Surgery. 10 (9), 1210-1211 (2006).
- Von Hoff, D. D., et al. Increased survival in pancreatic cancer with nab-paclitaxel plus gemcitabine. New England Journal of Medicine. 369 (18), 1691-1703 (2013).
- Conroy, T., et al. FOLFIRINOX versus gemcitabine for metastatic pancreatic cancer. New England Journal of Medicine. 364 (19), 1817-1825 (2011).
- Baker, L. A., Tiriac, H., Clevers, H., Tuveson, D. A. Modeling pancreatic cancer with organoids. Trends in Cancer. 2 (4), 176-190 (2016).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Tiriac, H., et al. Organoid Profiling Identifies Common Responders to Chemotherapy in Pancreatic Cancer. Cancer Discovery. 8 (9), 1112-1129 (2018).
- Tiriac, H., et al. Successful creation of pancreatic cancer organoids by means of EUS-guided fine-needle biopsy sampling for personalized cancer treatment. Gastrointestinal Endoscopy. , (2018).
- Seino, T., et al. Human Pancreatic Tumor Organoids Reveal Loss of Stem Cell Niche Factor Dependence during Disease Progression. Cell Stem Cell. 22 (3), 454-467 (2018).
- Huang, L., et al. Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell- and patient-derived tumor organoids. Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).
- Walsh, A. J., Castellanos, J. A., Nagathihalli, N. S., Merchant, N. B., Skala, M. C. Optical Imaging of Drug-Induced Metabolism Changes in Murine and Human Pancreatic Cancer Organoids Reveals Heterogeneous Drug Response. Pancreas. 45 (6), 863-869 (2016).
- Zhao, C. Wnt Reporter Activity Assay. Bio-Protocol. 4 (14), 1183 (2014).
- Conroy, T., et al. FOLFIRINOX or Gemcitabine as Adjuvant Therapy for Pancreatic Cancer. New England Journal of Medicine. 379 (25), 2395-2406 (2018).
- Jimeno, A., et al. A direct pancreatic cancer xenograft model as a platform for cancer stem cell therapeutic development. Molecular Cancer Therapeutics. 8 (2), 310-314 (2009).
- Neal, J. T., et al. Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment. Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).
- Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).
