Summary
Органоидные культуры, полученные пациентом, аденокарциномы поджелудочной железы представляют собой быстро устанавливаемую трехмерную модель, представляющую эпителиальные отсеки опухолевых клеток с высокой точностью, что позволяет проводить трансляционные исследования этой смертельной злокачественности. Здесь мы предоставляем подробные методы для установления и распространения органоидов, а также для выполнения соответствующих биологических анализов с использованием этих моделей.
Abstract
Аденокарцинома поджелудочной железы (PDAC) является одним из самых смертоносных злокачественных новообразований. Недавно были описаны методы органоидной культуры следующего поколения, позволяющие трехмерное (3D) моделирование этого заболевания. Модели органоидов, полученных из пациента (PDO), могут быть изолированы как из хирургических образцов, так и из небольших биопсий и быстро формироваться в культуре. Важно отметить, что органоидные модели сохраняют патогенные генетические изменения, обнаруженные в опухоли пациента, и являются прогностическими реакции пациента на лечение, что позволяет проводить трансляционные исследования. Здесь мы предоставляем комплексные протоколы для адаптации рабочего процесса культуры тканей для изучения 3D, матрицы встроенных, органоидных моделей. Мы подробно методы и соображения для изоляции и распространения первичных органов PDAC. Кроме того, мы описываем, как заказ органоидных средств массовой информации готовится и качество контролируется в лаборатории. Наконец, мы описываем анализы для ниже по течению характеристики органоидных моделей, таких как изоляция нуклеиевых кислот (ДНК и РНК), и тестирование на наркотики. Важно отметить, что мы предоставляем критические соображения для внедрения органоидной методологии в исследовательской лаборатории.
Introduction
Аденокарцинома поджелудочной железы (PDAC) является смертельной болезнью, характеризующейся поздней диагностикой у большинства пациентов, отсутствием эффективных методов лечения и, как следствие, низким 5-летним общим показателем выживаемости, которое остается менее 10%1. Только у 20% пациентов диагностировано локализованное заболевание, пригодное для лечебного хирургического вмешательства2,3. Остальные пациенты, как правило, лечатся с сочетанием химиотерапевтических средств, которые эффективны в меньшинстве пациентов4,5. Для удовлетворения этих насущных клинических потребностей, исследователи активно работают над стратегиями раннего обнаружения и разработки более эффективных методов лечения. Для ускорения клинического перевода важных открытий, ученые используют генетически модифицированные модели мыши, пациент производные ксенотрансплантатов, монослойных клеток линий, и, совсем недавно, органоидных моделей6.
Трехмерная эпителиальная органоидная культура с использованием фактора роста и wnt-ligand богатых условиях для стимулирования пролиферации непреобразованных клеток-прародителей были впервые описаны для мышиного кишечника7 и были быстро адаптированы к нормальной ткани поджелудочной железы человека8. В дополнение к нормальной протоковой ткани, органоидная методология позволяет для изоляции, расширения и изучения человека PDAC8. Важно отметить, что метод поддерживает создание органоидов из хирургических образцов, а также тонкой и основной биопсии иглы, что позволяет исследователям изучить все стадии заболевания9,10. Интересно, что органоиды, полученные из пациента, резюмируют хорошо описанные опухолевые транскриптомические подтипы и могут способствовать развитию платформ точной медицины9,11.
Текущие органоидные протоколы для PDAC позволяют успешно расширить более 70% образцов пациентов у пациентов с химио-наивными9. Здесь мы представляем стандартные методы, используемые нашей лабораторией для изоляции, расширения и характеристики органов PDAC, полученных от пациента. Другие методы PDAC органоидные были описаны12,13, но не сравнение этих методов была тщательно выполнена. Поскольку эта технология является относительно новой и быстро развивается, мы ожидаем, что эти протоколы будут продолжать развиваться и совершенствоваться; однако принципы обработки тканей и органоидной культуры будут по-прежнему полезны.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Вся коллекция тканей человека для использования в научных исследованиях была рассмотрена и одобрена нашим Внутренним наблюдательным советом (IRB). Все следующие протоколы выполняются в асептических условиях в лабораторной среде культуры тканей млекопитающих.
1. Подготовка средств массовой информации
- Кондиционированная подготовка СМИ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Человеческий органоидный сми поджелудочной железы требует обильных факторов роста и питательных веществ, а также условные добавки средств массовой информации, чтобы обеспечить достаточную стимуляцию роста для органоидного расширения. Обе условные среды, описанные ниже, готовятся из коммерчески доступных клеточных линий (см. Таблицу Материалов). Для получения полных протоколов и материалов, пожалуйста, обратитесь к веб-сайтам производителей.- Продукция R-spondin1 условных носителей в соответствии с протоколом производителя.
- Во-первых, расширить 293T клеток, выражающих R-спондин1 с использованием соответствующих методов отбора антибиотиков (Зеоцин) в присутствии обильные сыворотки (10%). При производстве условных носителей, снять и смыть антибиотик и сыворотку, так что нет антибиотиков и сыворотки присутствуют в окончательном условных средств массовой информации. Важно отметить, что условные носители должны быть стерилизованы после сбора (0,2 мкм) для предотвращения перекрестного загрязнения.
- Храните алицитированные кондиционированные носители при 4 градусах по Цельсию для краткосрочного использования (в течение 6 месяцев) или при -20 градусов по Цельсию для длительного хранения (более 6 месяцев). Следует избегать циклов замораживания-оттепели.
- Продукция L-Wnt-3A условных носителей в соответствии с протоколом производителя.
- Во-первых, расширить L-M (TK-) клетки, выражающие L-Wnt-3A с помощью соответствующих методов отбора антибиотиков (G-418) в присутствии обильной сыворотки (10%). При производстве условных носителей, снять и смыть антибиотик выбор так, что нет антибиотика присутствует в окончательном условных средств массовой информации; однако, поддерживать сыворотку на протяжении всей культивирования и кондиционирования. Важно отметить, что собранные кондиционированные носители должны быть стерилизованы (0,2 мкм) для предотвращения перекрестного загрязнения.
- Храните алицитированные условные носители при 4 градусах по Цельсию для краткосрочного использования или -20 градусов по Цельсию для долгосрочного хранения. Следует избегать циклов замораживания-оттепели.
- Для контроля качества, выполнить анализ TOPFLASH для проверки Wnt деятельности R-spondin1 и L-Wnt-3A условных носителей в одиночку и в сочетании в соответствии с ранее опубликованным протоколом14.
- Продукция R-spondin1 условных носителей в соответствии с протоколом производителя.
- Базальная подготовка средств массовой информации: Используйте базальные носители для подготовки полных органоидных носителей, а также стиральные шаги для органоидной работы. Дополнение передовых DMEM/F-12 с глутамина в окончательной концентрации 1x, HEPES (10 мМ), и пенициллин / streptomycin (100 U/mL). Храните базальные носители при 4 градусах Цельсия.
- Органоид Полная подготовка средств массовой информации: Дополнение базальных средств массовой информации с R-спондин1 условных средств массовой информации в окончательной концентрации 10% v/v, L-Wnt-3A условных носителей при окончательной концентрации 50% v/v, EgF человека (50 нг/мл), Человек FGF (100 нг/мл), Гастрин I (10 нм), Мышь Ноггин (100 нг/мл), A83-01 (5 000 нм), Добавка B27 (1x), никотинамид (10 мМ), N-ацетилцистеин (1,25 м/ мл) и Примоцин (100 мкг/мл).
- Для первичной органоидной изоляции, оттаятых органоидных культур и культур, начиная с одиночных клеток, включают ингибитор киназы Rho 27632 при конечной концентрации 10,5 мкм.
- Подготовьте органоид человека полный носителей на льду и хранить на 4 кВ для использования в течение одного месяца. По этой причине мы рекомендуем свежую еженедельную подготовку СРЕДСТВ массовой информации.
2. Изоляция органов PDAC
ПРИМЕЧАНИЕ: Оттепель подвальной мембраны экстракт (BME) решение (фактор роста уменьшается; см. Таблица материалов) на льду в 4 КК окружающей среды (холодильник или холодная комната) по крайней мере 12 ч до использования. Инкубировать пластины культуры тканей для культуры органоидов в инкубаторе 37 градусов по Цельсию, по крайней мере 12 ч до использования.
- Сбор и транспортировка хирургически удаленного образца опухоли для исследования в буферизированном растворе для хранения для поддержания жизнеспособности ткани. Используйте базальные носители или коммерчески доступные решения для хранения тканей.
- Приступить к изоляции органоидов как можно скорее после получения образца. Ткань может храниться в растворе хранения до 24 ч после операции и по-прежнему дают органоиды.
- Оказавшись в лаборатории, перенесите опухоль в тарелку культуры тканей 10 см и удалите раствор для хранения.
- При обработке ткани с металлическими щипками, фарш опухоли с #10 скальпелем на мелкие фрагменты 1 мм3 или меньше. Большие фрагменты займет больше времени, чтобы переварить; поэтому цель состоит в том, чтобы генерировать однородные размеры фрагментов тканей. Если ткань уже дезагрегирована или меньше 1 мм3 фрагмента, пропустите этот шаг.
- Перенесите фрагменты ткани в коническую трубку 15 мл, содержащую 10 мл базальных носителей. Смешайте путем инвертирования трубки несколько раз. Центрифуге трубки при 200 х г в течение 5 мин. После спина, удалить базальные средства массовой информации тщательно, чтобы избежать потери фрагментов ткани.
- К трубке, содержащей фрагменты тканей, добавляют 9 мл базальных носителей и 1 мл 10-x нежного коллагеназы/раствора гялуронидаза. Чтобы избежать слипания клеток во время пищеварения, дополнить этот раствор 20 л 10 мг/мл DNAse I раствором. Смешайте путем инвертирования трубки несколько раз.
- Инкубировать ферментативное пищеварение при 37 градусах Цельсия на nutator или ротаторе. Для адекватного смешивания во время пищеварения фрагменты тканей должны постоянно перемещаться через раствор.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сроки для этой ферментативной диссоциации опухоли должны быть определены эмпирически для каждого образца. Успешное переваривание опухоли характеризуется уменьшением размеров фрагментов тканей до тех пор, пока они не будут четко различимы невооруженным глазом. Одновременно, непрозрачность раствора будет увеличиваться по мере высвобости микроскопических фрагментов тканей. - После 30 минут, удалить коническую трубку из инкубатора 37 градусов и наблюдать. Если фрагменты ткани все еще хорошо видны, продолжайте диссоциацию при 37 градусах Цельсия при постоянном смешивании. Повторяйте это наблюдение каждые 30 минут, пока большинство или все фрагменты ткани не будут разобщены. В зависимости от строгости смешивания, а также размера и количества фрагментов опухоли, этот шаг может занять всего 30 минут для небольших образцов или до тех пор, как 12 ч для больших образцов опухоли.
- После завершения ферментативной диссоциации центрифуги яму при 200 х г в течение 5 мин. После спина, клеточные гранулы должны быть видны и супернатант должен быть ясным, указывая, что все клетки были выделены из раствора. Если это не так, повторите спина.
- Тщательно удалите супернатант, чтобы избежать потери клеточной гранулы. Немедленно промойте клетки с 10 мл базальных носителей, мягко смешивая трубки с инверсией. Centrifuge трубки на 200 х г в течение 5 мин. Тщательно удалить базальные носители, чтобы избежать потери клеток и повторить этот шаг стирки еще раз в общей сложности два моет.
- После второй стирки, удалить все базальные средства массовой информации тщательно и поместить трубку на лед в течение 5 минут.
- В это время, место aliquot органоидов полных носителей в 37 градусов по Цельсию водяной бане, чтобы предварительно тепло.
- Смешайте клеточные гранулы с холодным льдом BME при сохранении трубки на льду. Плотность посева должна быть высокой для органоидной изоляции. Для небольшого гранулы (объем 50 евро) используйте 200 л BME, в то время как для большого гранул (объем 200 л) используйте 800 л БМЭ. Смешайте клетки и BME на льду с помощью пипетки p200 до тех пор, пока раствор не станет однородным, избегая при этом создания пузырьков в растворе.
- Заметьте купол 100 л в центре колодца предварительно прогретой 12 хорошо пластины с помощью p200 пипетка. Повторяйте это до тех пор, пока все решения BME не будут распределены. Аккуратно перенесите пластину в инкубатор 37 градусов, чтобы гель BME затвердеть.
- После 10 минут, получить пластину и добавить 1 мл предварительно подогретого органоида полного носителя в скважине. Распределите средства массовой информации на стороне скважины, чтобы избежать нарушения купола BME.
- Наблюдайте за фрагментами клеток с помощью перевернутого микроскопа культуры тканей с помощью 4x-объектива в ярком поле.
ПРИМЕЧАНИЕ: Одиночные клетки и микроскопические фрагменты ткани должны быть хорошо видны. Успешная изоляция характеризуется появлением более 10 органоидов после 24-48 ч; культура должна быть совмещена в течение одной недели. Поскольку образцы опухоли неоднородны, некоторые органоидные изоляции являются более сложными, поскольку только несколько органоидов растут в хорошо, как показано на рисунке 1. В этом случае, позволяют культуре продолжать сяритоге в течение двух недель, чтобы максимизировать количество ячеек, доступных для прохождения. Для учета потребления средств массовой информации и испарения во время культуры, пополнить культуры с 200 Зл предварительно разогретого органоида полного средства массовой информации каждые 5 дней.
3. Пропуск органов PDAC
- Извлеките пластину из инкубатора культуры тканей. С стерильным подъемником клетки, аккуратно поднимите купол BME так, что он плавает в полном носителе. Избегайте соскабливания нижней части колодца, чтобы не удалить любые монослойные клетки, прикрепленные к пластику, так как это, как правило, фибробласты.
- С p1000 пипетка, тщательно передать купол BME и средства массовой информации на 15 мл конической трубки. Повторите этот шаг для каждого органоидов-содержащих хорошо.
- Аккуратно промыть каждую скважину, которая была собрана с 1 мл холодных базальных носителей, и передать в трубку 15 мл, содержащую органоиды.
- Тщательно смешать раствор и органоиды с пипеткой p1000 и вращаться вниз на 200 х г в течение 5 минут. После вращения в нижней части трубки появится слой BME, содержащий органоиды в суспензии и органоидные гранулы. Тщательно удалите супернатант, избегая потери bME/органоидного слоя. Поместите трубку на лед.
- Добавьте в трубку 10 мл раствора восстановления ледяных клеток (CRS) и тщательно перемешайте путем инверсии. Это позволит деполимеризировать белковые матрицы гелеобразного BME при 4 градусах Цельсия. Инкубировать на льду в течение 30 минут, смешивая каждые 3 мин инверсией. При наличии, поместите трубку на вращающийся миксер в холодную комнату или холодильник 4 градусов по Цельсию в течение 30 минут.
- После 30 мин инкубации, спина вниз на 200 х г в течение 5 мин. Органоидные гранулы должны быть очевидными в то время как слой BME должны исчезнуть. Если слой BME уменьшен в размерах, но все еще виден, инкубировать еще 30 минут при 4 градусах Цельсия с смешиванием и повторным спином.
- После того, как BME был деполимеризирован, удалить CRS оставив после органоидных гранул. Вымойте органоиды с 10 мл базальных носителей путем смешивания с инверсией. Спин вниз на 200 х г в течение 5 минут и удалить супернатант. Поместите трубку с органоидными гранулами на лед, по крайней мере 5 мин.
- Дополнительно, если препарат одной клетки желательно, инкубировать органоиды с 3 мл трипсина дополнены 30 Л Л 10 мг /мЛ DNAse I решение, чтобы избежать слипания клеток во время пищеварения.
- Инкубация ферментатической реакции при 37 градусах Цельсия с нежной инверсией, смешивающей каждые 2 мин в течение 10 мин. Монитор и подтвердите успешную одноклеточную диссоциацию под ярким микроскопом.
- Чтобы остановить ферментативную реакцию, добавьте 10 мл ледяных базальных носителей и вращайтесь при 200 х г в течение 5 мин.
- Вымойте клетки с 10 мл базальных носителей путем смешивания с нежной инверсии. Спин вниз на 200 х г в течение 5 минут и удалить супернатант и повторить мыть еще раз. Поместите трубку с клеточной гранулой на лед, по крайней мере 5 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем выполнять этот шаг каждые 3-5 проходов во время регулярного обслуживания органоидов для создания однородной культуры с большим количеством органоидов.
- Добавить ледяной BME в клетку гранулы и аккуратно перемешать на льду, пока раствор не станет однородным с помощью пипетки p200. Избегая генерации пузырьков в смеси, пипетка вверх и вниз, по крайней мере 5-10x, размещение кончик пипетки близко к нижней части трубки, чтобы помочь механически разбить органоидов. В качестве руководства используйте 4-6x объем bME/cell гранулы так, что соотношение расщепления не более 1:2 от одного прохода к другому.
- Заметьте купол 100 л в центре колодца предварительно прогретой 12 хорошо пластины с помощью пипетки p200; повторить до тех пор, пока все решения BME не будут отменены. Аккуратно перенесите пластину в инкубатор 37 градусов, чтобы гель BME затвердеть. После 10 минут, получить пластину и добавить 1 мл предварительно подогретого органоида полного носителя в скважине. Распределите средства массовой информации на стороне скважины, чтобы избежать нарушения купола BME.
- Органоиды должны реформировать и начать расти в течение 24 ч. Органоидные культуры, как правило, проходят когда-либо 7-10 дней в зависимости от плотности культуры и пролиферации клеток. При необходимости пополнить культуры с 200 ЗЛ предварительно разогретого органоида полных носителей каждые 5 дней, чтобы компенсировать истощение фактора роста и испарения.
4. Замораживание и таяние органов PDAC
- Чтобы заморозить органоиды, приступить к сбору органоидов и деполимеризации BME, как описано в шагах 3.1-3.7.
- К клеточной грануле добавьте 1 мл замораживающих носителей, аккуратно перемешайте и перенесите смесь на предварительно обозначенный криовиал.
- Поместите криовиал в замораживающий контейнер для поддержания безопасного постоянного снижения температуры и поместите в морозильную камеру -80 градусов. После 24 до 48 ч перенесите замороженные флаконы на хранение жидкого азота. Органоиды могут быть криоконсервированы в течение нескольких месяцев до нескольких лет, используя этот метод.
- Для размораживания органоидов извлеките замороженный криовиал из хранилища жидкого азота. Транспорт замороженного флакона на сухом льду в комнату культуры тканей.
- Поместите замороженные криовиальные в 37 градусов по Цельсию водяной бане, чтобы быстро разморозить органоиды и перенести содержимое флакона в коническую трубку 15 мл, содержащую 9 мл базальных носителей, подогретых до комнатной температуры.
- Спин вниз на 200 х г в течение 5 минут и удалить супернатант. Поместите трубку с органоидными гранулами на лед, по крайней мере 5 мин.
- Приступить к повторной в BME и пластины органоидов, как описано в шагах 3.9-3.11.
ПРИМЕЧАНИЕ: Органоидные культуры медленно восстанавливаются после цикла замораживания/оттепели, поэтому культуры могут быть выращены на срок до двух недель до прохождения.
5. Характеристика органов PDAC
ПРИМЕЧАНИЕ: Характеристика органоидов должна быть выполнена на установленной культуре после нескольких проходов, чтобы уменьшить риск заражения от неэпителиальных типов клеток, таких как фибробласты и иммунные клетки.
- Удаление нуклеиновой кислоты из органов PDAC
- Органоиды плиты на 12 хорошо пластины, посвященной добыче нуклеиновой кислоты. Плита не более 100 л BME на скважину. Для адекватного выхода ДНК/РНК, пластины по крайней мере 2-4 скважины на культуру. Выращивайте органоиды в течение 5 дней, пока культуры близки к слиянию, но лишены чрезмерного мусора клеток, который накапливается в более долгосрочных культурах.
- Извлеките пластину из инкубатора 37 градусов и полностью удалите все следы органоидных полных носителей, оставив только купол BME, содержащий органоиды на пластине.
- Добавьте 900 л кислотного реагента фенола (см. Таблицу Материалов)к каждому колодцу и тщательно перемешайте, используя пипетку p1000 до тех пор, пока раствор не станет однородным. BME будет полностью растворяется в кислотном реагенте фенола и органоиды будут лизировать после короткого 5 мин инкубации.
ВНИМАНИЕ: Кислотный фенол является опасным химическим веществом, которое может вызвать химические ожоги. Ручка с осторожностью, используя соответствующие средства защиты и техники. - Перенесите однородный раствор в трубку 2 мл и добавьте 200 л хлороформа. Инкубировать 5 мин и центрифугу при 12 000 х г в течение 15 мин при 4 градусах Цельсия.
- Переход к экстракции РНК и ДНК в соответствии с протоколом производителя. РНК может быть извлечена из водной фазы, в то время как ДНК может быть извлечена из межфазной и органической фазы. После очистки и количественной оценки, РНК и ДНК, изолированные от различных скважин одной культуры, могут быть объединены для повышения урожайности.
ПРИМЕЧАНИЕ: (1) Хотя мы настоятельно рекомендуем использовать этот метод удаления нуклеиновой кислоты для РНК, Есть много хороших методов для изоляции ДНК из культивированных клеток. (2) Чтобы установить наличие опухолевых клеток в органоидной культуры, мы рекомендуем секвенировать ДНК с помощью предпочтительного метода секвенирования следующего поколения для выявления мутаций в генах PDAC(KRAS, TP53, SMAD4, CDKN2A).
- Фармакотипирование органов PDAC
- Изолировать одиночные клетки от органоидов, как описано выше в шагах 3.1-3.8. Чтобы максимизировать количество клеток, собирайте не менее 10 сливочных колодцев 12 колодцев
- Resuspend одиночные клетки в 1 мл человеческого органоида полных носителей. Присутствие мелких клеточных скоплений (2–10 ячеек) является приемлемым, однако более крупные клеточные сгустки негативно повлияют на анализ вниз по течению.
- Подсчитайте ячейки с помощью автоматизированного счетчика ячеек и записывайте жизнеспособность клеток. Рассчитайте общее количество клеток и жизнеспособных клеток, присутствующих в 1 мл подвески.
- Для терапевтического тестирования, пластины 1000 жизнеспособных клеток на скважину из 384 хорошо пластины. Для 384 скважины, по нашим оценкам, мы будем использовать 400 000 жизнеспособных ячеек (рассчитанных на 400 скважин).
- Подготовьте клетки для покрытия путем смешивания на льду 800 Л Л BME с 7,2 мл органоидных полных носителей, содержащих клетки. Держите смесь на льду и пластине 20 л на колодец из 384 хорошо пластины. Используйте 12-канальный пипетку и резервуар, хранящиеся на льду, чтобы эффективно накрыть клетки. Чтобы избежать чрезмерного испарения из пластины, внешние скважины могут быть использованы в качестве резервуара (60 Л Л ПБС или воды на скважину), но это приведет к потере 76 экспериментальных скважин.
- Спин пластины вниз на 100 х г в течение 1 мин в качели ведро. Это позволяет небольшому объему и органоидам в 20 л и органоидам осесть в нижней части пластины.
- Поместите тарелку в инкубатор культуры тканей 37 градусов, чтобы органоиды формоваться. После 24 ч, проверьте наличие органоидов с помощью яркого поля микроскопа.
- Приступить к дозированию терапевтических соединений, растворенных в DMSO на тарелку с помощью принтера наркотиков или эквивалентного инструмента. Проверьте каждую дозу препарата, по крайней мере, в тройной скважины. Для выполнения эффективного анализа дозы-реакции, определить диапазон дозы для каждого препарата эмпирически, начиная с низкой, неэффективной, дозы и заканчивая высокой дозой, где наблюдается максимальный эффект. Примеры дозовых диапазонов для химиотерапевтических соединений были недавно опубликованы9.
- Выставлять клетки в терапевтические соединения в течение 3-5 дней.
- Дополнительно, в конце асссе, изображение пластины для оценки терапевтического влияния на размер, количество и морфологию органоидов.
- Оцените жизнеспособность с использованием 20 л на скважину реагента жизнеспособности люминесценционных клеток (см. Таблицу Материалов)в соответствии с протоколом производителя. Для сбора данных потребуется светинометр и программное обеспечение для обработки данных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Чтобы проиллюстрировать проблемы, связанные с изоляцией органоидов от PDAC, мы показываем создание пациента производных органоидной культуры из небольшой образец опухоли гипоцеллюлярной. После первоначального покрытия, только несколько органоидов были видны в хорошо, как показано на рисунке 1. Органоиды было разрешено расти больше в течение 2 недели и были проложены в соответствии с нашим протоколом, чтобы установить более надежную культуру, как показано в начале и поздно проход 1 представитель фотографии (Рисунок 1). Важно отметить, что более крупные кистозные органоиды, наблюдаемые в позднем первичном изоляте, были легко разбиты на более мелкие фрагменты во время смешивания органоидов с ледяным BME, как описано в шаге 2.13.
Чтобы продемонстрировать результаты протокола фармакотипирования, мы подготовили одиночные клетки из установленного и быстро растущего репрезентативного органаоида PDAC, как описано в этом протоколе. 1000 жизнеспособных клеток были покрыты на скважину и позволили восстановить более 24 ч до цитотоксических химиотерапевтических агентов, Гемцитабин и Paclitaxel, были дозированы. Мы выполнили 9-точечный дозответный асссе в тройном, начиная с низкой дозы 100 pM и заканчивая высокой дозой 2 мкм. После 5-дневного лечения, репрезентативные фотографии были сделаны для транспортного средства (DMSO), 2 ММ Gemcitabine, и 2 ММ Paclitaxel обработанных скважин(Рисунок 2). Сразу же после съемки, жизнеспособность клеток была оценена с помощью реагента жизнеспособности клеток люминесценции и построенс с помощью программного обеспечения для графиков(рисунок 2).
Рисунок 1: Изображения представителей показаны для органоидной изоляции PDAC, а также после первого прохода. Как ранние (1-3 дня), так и поздние (7-10 дней) временные точки показывают, что они иллюстрируют рост органов с течением времени. Шкала бар 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Анализ реакции дозы. (Слева) Представитель дозы ответ ный анализ, полученный с использованием установленных PDAC органоидной культуры, со стандартным отклонением трипликетов показано как ошибка баров. (Справа) Фотографии, иллюстрирующие эффект в конце ассеа транспортного средства (DMSO) лечения, а также 2 мкм Gemcitabine и 2 ММ Paclitaxel. Шкала бар 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы представляем текущие протоколы для изоляции, расширения и характеристики органов PDAC, полученных от пациента. Наш текущий показатель успеха создания органоидной культуры составляет более 70%; поэтому эти методы еще не усовершенствованы и, как ожидается, будут совершенствоваться и развиваться с течением времени. Важное внимание следует учитывать размер выборки, так как PDAC имеет низкую неопластическую клеточность. Следовательно, небольшие образцы будут содержать несколько опухолевых клеток, и будет генерировать только горстка органоидов. Кроме того, многие пациенты получают химиотерапию и /или химиотерапию на основе неоадъювантного лечения до хирургического вмешательства15. Если лечение эффективно для конкретного пациента, опухолевая ткань может быть лишена жизнеспособных клеток. Приобретение образцов химиотерапии наивных пациентов предпочтительнее для первоначальной оптимизации этих методов, но это не всегда возможно. Интересно, что время ишемии после хирургического удаления опухолевой ткани не является основным критерием для успешной органоидной изоляции, до тех пор, как образец обрабатывается в течение 24 ч.
Аденокарцинома поджелудочной железы является заболеванием, характеризующимся сильной десмопластической реакцией и осаждением плотной стромальной матрицы. В то время как органоиды являются отличным инструментом для быстрой изоляции и расширения эпителиального отсека, модель не резюмирует сложную строму PDAC. Другие методологии, такие как пациент производных xenografts16 или воздуха жидкого интерфейса культуры17 позволяют стромальный отсек, однако они могут быть сложными для расширения быстро. Выбирая модельную систему, исследователь должен тщательно учитывать сильные и слабые стороны каждогоиз 6.
Неоднородная биология этого заболевания влияет на органоидное создание, поскольку некоторые органоиды, полученные из пациента, растут очень хорошо в наших условиях, в то время как другие гораздо медленнее по сравнению. Протоколы выше описывают Wnt лиганд богатое состояние, чтобы изолировать и расширить все пациента полученных органоидов, но другие показали, что опухоли некоторых пациентов способны расти в отсутствие Wnt обусловленных средств массовой информации11,12. Дальнейшее тестирование будет необходимо определить, если с помощью целого ряда условий средств массовой информации повышает успешное создание органоидов, как это было недавно продемонстрировано для органов рака яичников18. Этот мультиплексный подход, однако, ограничен низким числом опухолевых клеток, которые могут быть выделены из небольших образцов пациента. Кроме того, нормальные непреобразованные протокальные органоиды могут возникнуть в результате органоидной изоляции, особенно если опухолевая ткань примыкает к нормальной ткани9. Чтобы снизить риск нормального органоидного загрязнения, большие образцы тканей могут быть подразделены на более мелкие независимые фрагменты, используя морфологические различия, такие как также васкуляризированные (кровь видна) по сравнению с гиповаскулярными регионами, и твердые узлы против мягких тканей.
Описанные здесь методы и протоколы являются современными стандартными подходами, используемыми в нашей лаборатории для органоидной изоляции, и они должны быть протестированы и адаптированы для каждой лабораторной среды. Например, энзимативная диссоциация (шаги от 2,6 до 2,9) опухолевой ткани особенно важна для оптимизации. Небольшие различия оборудования (nutator против вращателя смеситель) может привести к значительно разные сроки для этого шага. Кроме того, диссоциация тканей может быть точно настроена за счет увеличения или снижения концентрации смеси Коллагеназы/гиалуронидаза. Необходимо проявлять осторожность, чтобы не относиться ко всем образцам одинаково. Например, в некоторых случаях органоиды могут быть выделены из асцитной жидкости от продвинутых пациентов PDAC без механической или ферментативной диссоциации.
Секвенирование ДНК является текущим золотым стандартом для определения наличия или отсутствия опухолевых органоидов, поскольку PDAC обусловлен частыми мутациями в KRAS, TP53, SMAD4 и CDKN2A. Транскриптомический анализ может выявить различные подтипы опухоли в то время как фармакотипирование может раскрыть пациента конкретных терапевтических уязвимостей9. Эти протоколы позволяют исследователям PDAC разработать свою собственную библиотеку органов, полученных из пациентов, и профилировать биологию этих моделей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарны за поддержку UC Сан-Диего Мурс онкологический центр Biorepository и ткани технологии Общие ресурсы, члены лаборатории Лоуи, и UC Сан-Диего Департамент хирургии, Отдел хирургической онкологии. AML щедро поддерживается NIH CA155620, SU2C CRUK Lustgarten Фонд поджелудочной железы Рак Dream Team Award (SU2C-AACR-DT-20-16), и доноры Фонда по лечению рака поджелудочной железы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 channel pipette (p20, p100, or p200) with tips | |||
| 12 well plates | Olympus | 25-106 | |
| 15 ml LoBind conical tubes | Eppendorf | EP0030122208 | |
| 15 ml tube Rotator and/or nutator | |||
| 37 °C CO2 incubator | |||
| 37 °C water bath | |||
| 384 well plates | Corning | 4588 | Ultra low attachment, black and optically clear |
| A 83-01 | TOCRIS | 2939 | |
| ADV DMEM | ThermoFisher | 12634010 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Automated cell counter | |||
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | Reagent that depolymerizes the Basement Membrane Extract at 4 °C |
| CellTiterGlow | Promega | G7570 | Luminescence cell viability reagent |
| Chloroform | Sigma | C2432 | |
| Computer | |||
| CryoStor CS10 | StemCELL Tech | 07930 | Cell Freezing Solution |
| Cultrex R-spondin1 (Rspo1) Cells | Trevigen | 3710-001-K | |
| DMEM | ATCC | 30-2002 | |
| DNase I | Sigma | D5025 | |
| Drug printer | Tecan | D300e | This is the drug printer we use in our laboratory |
| Excel | For data analysis | ||
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11150-10 | |
| FBS | ThermoFisher | 16000044 | |
| G-418 | ThermoFisher | 10131035 | |
| Gastrin I (human) | TOCRIS | 3006 | |
| Gentle Collagenase/hyaluronidase | STEMCELL Tech | 7919 | |
| GlutaMAX | ThermoFisher | 35050061 | Glutamine solution |
| GraphPad Prism | For data analysis | ||
| HEPES | ThermoFisher | 15140122 | |
| Laminar flow tissue culture hood | |||
| Luminometer | |||
| L-Wnt-3A expressing cells | ATCC | CRL-2647 | |
| MACS Tissue Storage Solution | Miltenyi biotec | 130-100-008 | |
| Matrigel Matrix | Corning | 356230 | Basement Membrane Extract (BME), growth factor reduced |
| Mr. Frosty Freezing Container | ThermoFisher | 5100-0001 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165 | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
| p1000 pipette with tips | |||
| p200 pipette with tips | |||
| PBS | ThermoFisher | 10010049 | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher | 15630080 | |
| primocin | InvivoGen | ant-pm-2 | |
| Rapid-Flow Filter Units (0.2 µm) | ThermoFisher | 121-0020 | |
| Recombinant Human FGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| Recombinant Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | |
| Sterile Disposable Scalpels, #10 Blade | VWR | 89176-380 | |
| Tissue culture centrifuge | |||
| Tissue Culture Dishes 10 cm | Olympus | 25-202 | |
| TRIZol | ThermoFisher | 15596018 | Acid Phenol solution |
| TrypLE Express | ThermoFisher | 12605010 | |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | |
| Zeocin | ThermoFisher | R25001 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).
- Khorana, A. A., Mangu, P. B., Katz, M. H. G. Potentially Curable Pancreatic Cancer: American Society of Clinical Oncology Clinical Practice Guideline Update Summary. Journal of Oncology Practice. 13 (6), 388-391 (2017).
- Winter, J. M., et al. 1423 pancreaticoduodenectomies for pancreatic cancer: A single-institution experience. Journal of Gastrointestinal Surgery. 10 (9), 1210-1211 (2006).
- Von Hoff, D. D., et al. Increased survival in pancreatic cancer with nab-paclitaxel plus gemcitabine. New England Journal of Medicine. 369 (18), 1691-1703 (2013).
- Conroy, T., et al. FOLFIRINOX versus gemcitabine for metastatic pancreatic cancer. New England Journal of Medicine. 364 (19), 1817-1825 (2011).
- Baker, L. A., Tiriac, H., Clevers, H., Tuveson, D. A. Modeling pancreatic cancer with organoids. Trends in Cancer. 2 (4), 176-190 (2016).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Tiriac, H., et al. Organoid Profiling Identifies Common Responders to Chemotherapy in Pancreatic Cancer. Cancer Discovery. 8 (9), 1112-1129 (2018).
- Tiriac, H., et al. Successful creation of pancreatic cancer organoids by means of EUS-guided fine-needle biopsy sampling for personalized cancer treatment. Gastrointestinal Endoscopy. , (2018).
- Seino, T., et al. Human Pancreatic Tumor Organoids Reveal Loss of Stem Cell Niche Factor Dependence during Disease Progression. Cell Stem Cell. 22 (3), 454-467 (2018).
- Huang, L., et al. Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell- and patient-derived tumor organoids. Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).
- Walsh, A. J., Castellanos, J. A., Nagathihalli, N. S., Merchant, N. B., Skala, M. C. Optical Imaging of Drug-Induced Metabolism Changes in Murine and Human Pancreatic Cancer Organoids Reveals Heterogeneous Drug Response. Pancreas. 45 (6), 863-869 (2016).
- Zhao, C. Wnt Reporter Activity Assay. Bio-Protocol. 4 (14), 1183 (2014).
- Conroy, T., et al. FOLFIRINOX or Gemcitabine as Adjuvant Therapy for Pancreatic Cancer. New England Journal of Medicine. 379 (25), 2395-2406 (2018).
- Jimeno, A., et al. A direct pancreatic cancer xenograft model as a platform for cancer stem cell therapeutic development. Molecular Cancer Therapeutics. 8 (2), 310-314 (2009).
- Neal, J. T., et al. Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment. Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).
- Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).
